Upload
independent
View
9
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
ulaientífica
1
CURSO TEÓRICO –
ulaientífica
CURSO TEÓRICO PRÁCTICO DE VALIDACIÓN
DE MÉTODOS MICROBIOLOGICOS
Dra. Estefania Escartin [email protected] Técnica SPM Controler
Jordina Faurat [email protected] de la Unidad de Garantía de Calidad. Laboratorios de Sanidad Animal del DAAM
PROGRAMA
PROGRAMA PRIMER DÍA
09:00 09:30 Bienvenida
ulaientífica
09:00-09:30 Bienvenida
09:30-10:30 Concepto de validación. Planificación y diseño experimental: métodos microbiológicos de aguas (NMP+ FM), requisitos normativos (7/2006/CEE, RD 140/2003, ISO 17025) medios de cultivo (tradicionales y cromogénicos), cepas y materiales de referencia (cualitativas y cuantitativas: crioviales, lentículas, bioball).
10:30-11:00 Pausa
11:00-14:30 Práctica: Explicación práctica del ensayo:11:00 14:30 Práctica: Explicación práctica del ensayo: •Preparación del MRC: explicación mediante video con crioviales y lentículas.• Explicación siembra muestra agua potable por NMP (Colilert y enterolert) •Explicación siembra con muestra de agua de mar FM
•Desarrollo del ensayo en el laboratorio:•Práctica de preparación e inoculación de la muestra y del MRC. Desarrollo del método (NMP y filtración por membrana). Incubación.
ulaientífica
2
PROGRAMA
PROGRAMA SEGUNDO DÍA
09:00 10:30 Expresión y evaluación de los resultados en análisis
ulaientífica
09:00- 10:30 Expresión y evaluación de los resultados en análisismicrobiológicos.
10:30-11:00 Pausa
11:00- 13:00 Validación de métodos cuantitativos (exactitud, precisión,sensibilidad y especificidad)
13:00-14:00 Práctica de lectura de placas y confirmación bioquímica. De losparámetros de lectura a las 24± 2 horas de los dos métodos.parámetros de lectura a las 24± 2 horas de los dos métodos.
PROGRAMA
PROGRAMA TERCER DÍA
ulaientífica
09:00-10:30 Cálculo incertidumbres (concepto y estimación de incertidumbre,expresión de resultados en el informe de análisis). Aseguramiento de la calidad delos resultados (actividades de control, evaluación de resultados y gráficos decontrol).
10:30-11:00 Pausa
11:00-13:30 Práctica de recuento y confirmación bioquímica de parámetros delectura a las 48± 2 horas de los dos métodos. Acabar con la confirmación bioquímicadel día anterior.
13:30- 14:00 Exposición de resultados por grupos.
14:00 -14:30 Clausura y entrega de certificados
ulaientífica
3
ulaientífica
CONCEPTOS GENERALES MICROBIOLOGÍA
5
INTRODUCCIÓN
La realización de análisis de control microbiológico es unaherramienta que tiene una repercusión decisiva en el ámbito de la
ulaientífica
ulaientífica
Los laboratorios que realizan análisis de control microbiológicodeben utilizar métodos de ensayo que aseguren la fiabilidad delos resultados.
Los métodos de ensayo utilizados:
H d i l it i té i lid
herramienta que tiene una repercusión decisiva en el ámbito de lasalud pública, la tecnología alimentaria y el Medio Ambiente.
6
Han de reunir los criterios técnicos que aseguren su validez
Han de poder ser reproducibles
Han de ser realizados con una serie de garantías que permitanobtener resultados comparables con independencia dellaboratorio que los ejecute.
ulaientífica
4
CONCEPTO DE VALIDACIÓN
ISO 17025 punto 5.4.5.1
La validación es la confirmación mediante examen y la
ulaientífica
ulaientífica
La validación es la confirmación mediante examen y laaportación de evidencias objetivas que demuestren elcumplimiento de ciertos requisitos para el uso específico previsto
ISO/TR 13843:2000
Proceso que nos proporciona la evidencia de que un método escapaz de servir al propósito para el que ha sido diseñado es
7
capaz de servir al propósito para el que ha sido diseñado, esdecir, en el caso de los métodos microbiológicos, para detectar ocuantificar un determinado microorganismo o grupo demicroorganismos con unas adecuadas sensibilidad yespecificidad o precisión y exactitud.
Existe la obligación de validar métodos.
REQUISITOS NORMATIVOS
ulaientífica
ulaientífica
g
ISO 17025 5.4.5.2. “El laboratorio debe validar los métodos nonormalizados, los métodos diseñados/desarrollados internamente,los métodos normalizados utilizados fuera de su campo deaplicación previsto, y las ampliaciones y modificaciones de métodosnormalizados, con el fin de comprobar que son apropiados para eluso previsto ”
8
uso previsto.
ISO 17025 5.4.2 “El laboratorio debe confirmar que puede realizarcorrectamente los métodos normalizados antes de efectuar losensayos.”
ulaientífica
5
G-ENAC-04 Rev.3 “Los laboratorios deben mantener los datosb lid ió d l i t d i l (Kit )
REQUISITOS NORMATIVOS
ulaientífica
ulaientífica
sobre validación de los sistemas de ensayo comerciales (Kits)que utilicen. Si no se dispone de datos sobre validación o siestos no son plenamente aplicables, el laboratorio seráresponsable de completar la validación del método”.
Verificación periódica – Aseguramiento de la calidad de losresultados de ensayo
9
resultados de ensayoIncluso cuando se haya realizado la validación, el laboratoriotendrá que verificar periódicamente que se cumplan losparámetros documentados (comprobar que siguen satisfaciendolos requisitos establecidos). El aseguramiento de la calidad debeser tanto interno como externo (intercomparaciones)
G-ENAC-04 Rev.3
La validación de los métodos de ensayo debe reflejar las condiciones reales de ensayo
REQUISITOS NORMATIVOS
ulaientífica
ulaientífica
La validación de los métodos de ensayo debe reflejar las condiciones reales de ensayo.
NT 32 Rev.1 y Rev.2 – Actividades de Validación
El laboratorio debe justificar la selección del número y tipo de matrices en función delalcance de acreditación.
Las actividades de validación deben realizarse sobre muestras naturales o, en su defecto,con muestras inoculadas, preferiblemente no esterilizadas para que exista microbiotainterferente.Si se considera necesario investigar la influencia de la microbiota acompañante interferente a
10
Si se considera necesario investigar la influencia de la microbiota acompañante interferente aconcentraciones superiores o muy superiores al microrganismo diana, se deberá inocular lamuestra con diversas cepas de especies distintas a la diana a esas concentraciones.
Para demostrar que una versión modificada de un método cumple las mismasespecificaciones que el método original, deben realizarse comparaciones utilizandoreplicados. El diseño experimental y el análisis de los resultados tienen que serestadísticamente válidos.
ulaientífica
6
SELECCIÓN DE MÉTODOS DE ENSAYO
ISO 17025:2005 Apartado 5.4.2 “El laboratorio debe utilizarmétodos de ensayo que satisfagan las necesidades del cliente y
ulaientífica
ulaientífica
sean apropiados para el uso previsto”
Requisitos RD 140/2003 y Directiva 2006/7/CE
“ cuando el cliente no especifique el método a utilizar, el laboratorio debe seleccionar
debe tenerse en cuenta el ámbito de aplicación
11
p q ,los métodos apropiados que hayan sido publicados en normas internacionales,regionales o nacionales, por organizaciones técnicas reconocidas o en libros orevistas científicas especializadas o especificados por el fabricante de equipos”
En caso de elegir un procedimiento de ensayo interno, se aconseja que se partade métodos de referencia que sean ampliamente aceptados, conocidos yaplicados en el sector
SELECCIÓN DE MÉTODOS DE ENSAYO
Requisitos RD/140/2003
ulaientífica
ulaientífica
12
ulaientífica
7
SELECCIÓN DE MÉTODOS DE ENSAYO
Requisitos RD/140/2003
ulaientífica
ulaientífica
13
SELECCIÓN DE MÉTODOS DE ENSAYO
Requisitos RD/140/2003
ulaientífica
ulaientífica
14
ulaientífica
8
SELECCIÓN DE MÉTODOS DE ENSAYO
ulaientífica
ulaientífica
Sin perjuicio de lo dispuesto en el Real Decreto 140/2003, de 7 de febrero,por el que se establecen los criterios sanitarios de la calidad del agua deconsumo humano, y como alternativos al método descrito en la parte A desu anexo IV, se podrán utilizar, asimismo, los métodos incluidos en elanexo de esta orden, para el análisis microbiológico de los parámetros:
15
anexo de esta orden, para el análisis microbiológico de los parámetros:«bacterias coliformes» y «Escherichia coli».
SELECCIÓN DE MÉTODOS DE ENSAYO
ulaientífica
ulaientífica
Parte B.Método de detección y recuento de bacterias coliformes y de Escherichia coli enaguas de consumo por filtración de membrana utilizando agar cromogénico paracoliformes (ACC).
En el estudio de equivalencia se empleó el medio Chromocult Coliform Agar, fabricado por la casa comercial Merck.
Parte CParte C.Método de detección y recuento de bacterias coliformes y de Escherichia coli en aguas de consumo por el NMP (número más probable) en medio líquido utilizando la tecnología del sustrato definido® (DST).
En el estudio de equivalencia se empleó la placa Quanti-Tray® de 51 pocillos y el sustrato definido Colilert 18®.
ulaientífica
9
SELECCIÓN DE MÉTODOS DE ENSAYO
ulaientífica
ulaientífica
17
SELECCIÓN DE MÉTODOS DE ENSAYO
ulaientífica
ulaientífica
18
ulaientífica
10
PROCESO DE VALIDACIÓN
Planificación
ulaientífica
ulaientífica
Diseño experimental
Desarrollo práctico
19
Evaluación de los resultados
Informe de validación
PLANIFICACIÓN DE LA VALIDACIÓN
Definir las responsabilidades: Relación de las personas que llevaran acabo la validación y del responsable de su evaluación y aprobación
ulaientífica
ulaientífica
cabo la validación y del responsable de su evaluación y aprobación.Éstos deberán tener una cualificación adecuada.
Definir el método a validar; analito, técnica, matrices.... Ha de existir undocumento (PNT) que describa con el suficiente grado de detalle elprocedimiento a seguir para asegurar su correcta realización y surepetibilidad
Definir el procedimiento de validación a seguir y los registros que seannecesarios. Todos los datos primarios han de poder ser auditables.
20
Definir los objetivos y los requisitos que solicitamos al método,identificar los parámetros de validación a estudiar y definir sus criteriosde aceptación.
Identificar las cepas y materiales de referencia, que se utilizaran.
ulaientífica
11
DISEÑO EXPERIMENTAL
Una vez definidos los parámetros a estudiar es necesario detallarcomo se llevará a cabo este estudio;
ulaientífica
ulaientífica
que muestras se utilizaran,
como se prepararan las muestras contaminadas artificialmente,
que microorganismos que puedan interferir se estudiarán
cuantas muestras se utilizaran
cuantas repeticiones se realizaran
21
a partir de que dilución se sembrara muestra,........
Una vez realizadas las pruebas y experimentos establecidos(desarrollo practico) se realizaran los cálculos pertinentes para
EVALUACIÓN DE LOS RESULTADOS
ulaientífica
ulaientífica
(desarrollo practico) se realizaran los cálculos pertinentes paradeterminar los parámetros de validación y se evaluaran losresultados obtenidos.
Se comprobará que los resultados cumplen los criterios deaceptación establecidos previamente, en caso contrario cuando
22
aceptación establecidos previamente, en caso contrario cuandolos resultados difieren de lo esperado se estudiara la posibilidadde realizar una modificación (del método o de los requisitosestablecidos) y se indicaran las razones que la justifican.
ulaientífica
12
INFORME DE VALIDACIÓN
Finalmente, una vez concluido todo el proceso de validación se emitirá un informe ocertificado de validación firmado por las personas responsables.
ulaientífica
ulaientífica
p p p
El contenido del informe de validación puede ser:
Declaración formal sobre la idoneidad del método para el uso que se pretendehacer del mismo.
Planificación: Responsabilidades, objetivos y requisitos del método.
Resultados obtenidos y su evaluación.
Fechas de inicio y final de la validación.
Id tifi ió d l t / t i l d f i tili dIdentificación de los patrones y/o materiales de referencia utilizados
Identificación de todos los registros relacionados con el proceso de validación,todo el proceso ha de poder ser auditable, incluido el procedimiento devalidación utilizado.
Todos los registros relacionados con el proceso de validación deben incluir fechas,personal, patrones y/o materiales de referencia y equipos utilizados de manera quepuedan ser reproducibles.
CEPAS Y MATERIALES DE REFERENCIA
Cepas de referencia: Microorganismos definidos por lo menos al nivel delgenero y especie, catalogados y descritos según sus características ypreferiblemente de origen conocido [ISO:11133-1:2000]
ulaientífica
ulaientífica
preferiblemente de origen conocido. [ISO:11133-1:2000]
Material de referencia: Material o sustancia uno o más de cuyaspropiedades tienen valores suficientemente homogéneos y claramenteestablecidos como para poder ser utilizados en la calibración de un aparato,la evaluación de un método de medida o la asignación de valores amateriales. (Guía ISO 30:1992)
Material de referencia certificado: Material de referencia, acompañado deun certificado, en el cual uno o más valores de sus propiedades han sidocertificados mediante un procedimiento que establece su trazabilidad a unarealización exacta de la unidad en que se expresan los valores de dichaspropiedades. Cada valor certificado se acompaña de una incertidumbre y elnivel de confianza correspondiente. (Guía ISO 30:1992).
ulaientífica
13
Cepas de referencia: cultivo procedente de una colección nacional ointernacional reconocida. Garantizan identidad del microorganismo pero
id d
CEPAS Y MATERIALES DE REFERENCIA
ulaientífica
ulaientífica
no cantidad.
CECT: Colección Española de Cultivos Tipo.ECCO: European Culture Collection Organization.ATCC: American Type Culture Collection.
Control de calidad de los medios de cultivo
WDCM (World Data Centre for
Microbiology)
Control de calidad de los medios de cultivo.
Validar métodos
Evaluar la calidad de los resultados
Utilizadas para
CEPAS Y MATERIALES DE REFERENCIA
Cepas de referencia:
ulaientífica
ulaientífica
ulaientífica
14
Material de referencia certificado: muestras que tienen un valor conocido ycertificado de un numero concreto de microorganismos de un determinado
CEPAS Y MATERIALES DE REFERENCIA
ulaientífica
ulaientífica
certificado de un numero concreto de microorganismos de un determinadotipo, obtenido mediante la aplicación de un determinado método.
Validar métodos.
Evaluar la calidad de los resultados
Utilizados para
CEPAS Y MATERIALES DE REFERENCIA
Material de referencia:
ulaientífica
ulaientífica
ulaientífica
15
CEPAS Y MATERIALES DE REFERENCIA
Material de referencia certificado
ulaientífica
certificado
CEPAS Y MATERIALES DE REFERENCIA
Material de referencia certificado
ulaientífica
certificado
ulaientífica
16
G-ENAC-04 (rev.3)
CEPAS DE REFERENCIA
ulaientífica
Para demostrar la trazabilidad, el laboratorio debe utilizar cepas de referenciade microorganismos obtenidos de una colección nacional o internacionalreconocida.
... se reconstruirían y someterán a los controles de pureza y ensayosbioquímicos que sean necesarios. Serán subcultivadas una sola vez paraobtener las cepas de reserva, de las que se obtendrán las cepas de trabajo
…las cepas de reserva deben conservarse utilizando una técnica quet l t í ti d d ( lt l d li fili d ) Simantenga las características deseadas .... (ultracongeladas o liofilizadas). Si
las cepas de reserva se han descongelado, no deben volver a congelarse yreutilizarse
Las cepas de trabajo no deben ser subcultivadas para sustituir las cepas dereserva. Se conservaran en refrigeración
CEPA DE REFERENCIA“cultivo de microorganismo obtenido de una colección nacional o internacional reconocida”
CEPAS DE REFERENCIA
ulaientífica
ulaientífica
CEPA DE RESERVA CEPA DE RESERVA CEPA DE RESERVA“cultivos de referencia mantenidos por un laboratorio”
Descongelación/Reconstitución(subcultivada una sola vez)
Control de pureza y ensayos bioquímicosReconstitución (subcultivada una sola vez)
Especificar tiempo y condiciones de almacenamientoControl de pureza y ensayos bioquímicos
NO tienen determinada ninguna carga de microorganismos: se considera un carga inicial de 108
CEPA DE TRABAJO CEPA DE TRABAJO CEPA DE TRABAJO CEPA DE TRABAJO“subcultivos de microorganismos derivados de las cepas de reserva para ser utilizados en las operaciones del día a día”
Es obligatorio su uso para el control de calidad de medios de cultivoSe pueden usar para la: Validación de métodos y la evaluación de la calidad de los ensayos
Especificar tiempo y condiciones de almacenamiento
ulaientífica
17
Anexo B de la norma ISO 11133-1: Conservación y mantenimiento de cepas
CEPAS DE REFERENCIA
ulaientífica
CEPA DE REFERENCIA
CEPA DE RESERVA
Control de pureza Ensayos bioquímicos
Conservación Controles
Liofilización,Congelación –24ºC, 2-3 añosCongelación a –70ºC , 5 años
Nitrógeno líquido
Liofilización (asegurar su viabilidad y evitar que cambien)
Control de pureza
CULTIVO DE RESERVA
g q
A temperatura adecuada (de 18ºC a 25ºC o de 2ºC a 8ºC),
1 mes
Ensayos bioquímicos
CULTIVO DE TRABAJO
Control de pureza
ESTANDARIZACIÓN DE SUSPENSIONES BACTERIANAS
Para el control de calidad de los medios de cultivo, y para la validación demétodos (muestras contaminadas artificialmente) es necesario disponer de
ulaientífica
( ) pcepas estandarizadas de microorganismos.
La manera mas fácil de estandarizar una suspensión de microorganismos espor determinación de la turbidez en un espectrofotómetro o por comparacióncon la escala Mc Farland.
Si l ió d i i iSiempre que se prepare la suspensión de un mismo microorganismo en unmismo medio y a la misma turbidez medida a una longitud de ondaaproximada, se obtendrá aproximadamente el mismo número demicroorganismos.
ulaientífica
18
Encontrar la relación entre la transmitancia y el número del recuento demicroorganismos
ESTANDARIZACIÓN DE SUSPENSIONES BACTERIANAS
ulaientífica
PREPARACIÓN DE UNA SUSPENSIÓN ESTANDARIZADA
Sembrar el microorganismo en un tubo de agar de triptona-soja inclinado yincubar entre 30-35 ºC durante 24 horas.
Realizaremos 10 suspensiones de Staphylococcus aureus en agua depeptona 0.1%.
La ajustamos al 70% de transmisión en un espectrofotómetro regulado a una
microorganismos.
La ajustamos al 70% de transmisión en un espectrofotómetro regulado a unalongitud de onda de 580nm. Si la lectura es superior al 70%, recoger máscrecimiento y si es inferior, diluir la suspensión con agua de peptona. Lasuspensión así preparada contiene aproximadamente 108 ufc/mL.
Diluimos hasta obtener la dilución 10-6 y realizamos el recuento de viables(por duplicado) de cada suspensión.
ulaientífica
EXPRESIÓN Y EVALUACIÓN DE LOS
RESULTADOS DE RESULTADOS
ulaientífica
19
MÉTODOS DE DETECCIÓN Y RECUENTO
EXPRESIÓN DE RESULTADOSISO 7218:2008
ulaientífica
ulaientífica
MÉTODOS DE DETECCIÓN Y RECUENTORecuento en placa Recuento en medio líquido
Método general Método posterior a la identificación
Método de cálculo
Método NMP
NMP de microorganismos por gramo o mililitro
Nº de microorganismos N por (mililitro o gramo)2 dos cifras significativasC it i d d dCriterio de redondeo:Si la ultima cifra es < 5 redondear a la baja
Si es > 5 redondear a la alta
Preferiblemente se expresará como: a x 10b ufc/g o mla = numero entre 1,0 y 9,9
b= potencia de 10 adecuada
Métodos de investigación
EXPRESIÓN DE RESULTADOS
ulaientífica
ulaientíficaPresencia o ausencia en volumen de muestra ensayada
g
Detección
ulaientífica
20
CÁLCULO DE RESULTADOS
ISO 81992:2008
ulaientífica
Condiciones generales:
número total de colonias entre 10 y 200 por filtro
número de colonias típicas entre 10 y 100 por filtro
Número de colonias sospechosas inoculadas pera su identificación oNúmero de colonias sospechosas inoculadas pera su identificación o confirmación de cada filtro: 5
ISO 81992:2008, apdo. 8.4.2. Cálculo de resultados. Caso general
Una de las placas debe contener un mínimo de 10 colonias (totales, típicas o que cumplan los criterios
CÁLCULO DE RESULTADOS
ulaientífica
p ( , p q pde identificación, según proceda)
stot
s VVZC ×=
Cs es el número estimado de ufc en el volumen de referencia de la muestras Vs
Z es la suma de todas las colonias contadas sobre las placas o membranas derivadas de las diluciones d1 d2 di o derivadas de volúmenes independientes de la porción delas diluciones d1, d2, …, di o derivadas de volúmenes independientes de la porción de ensayo (muestra o dilución)
Vs es el volumen de referencia seleccionado para expresar la concentración de microorganismos de la muestra
ulaientífica
21
Vtot es el volumen total calculado de la muestra de origen inoculado en lasmembranas contadas. Es la suma de los volúmenes separados de la porción de
CÁLCULO DE RESULTADOS
ulaientífica
p pensayo (muestra o dilución) o bien, se calcula a partir de la ecuación:
Vtot = (n1·V1·d1) + (n2·V2·d2) + ... + (ni·Vi·di)
donde
n1, n2, ... , ni es el número de placas contadas para las diluciones d1, d2, …, di
V1, V2, …, Vi es el volumen de ensayo utilizado en las diluciones d1, d2, …, di
41
, , , y , , ,
d1, d2, …, di es la dilución utilizada para el volumen de ensayo V1, V2, …, Vi (d=1para la muestra inicial, d=0.1 para la dilución 1/10, etc …)
Ejercicio 1: Filtramos 100 y 10 ml de muestra por duplicado y obtenemos los siguientes resultados:
CÁLCULO DE RESULTADOS
ulaientífica
• 100 ml: 66 y 80 ufc/placa• 10 ml: 4 y 7 ufc/placa
Calcular y expresar los resultados de la muestra ensayada.
ulaientífica
22
ISO 81992:2008. Método de cálculo: después de la identificación
Se identifica un número determinado n de colonias sospechosas (mínimo 5)
CÁLCULO DE RESULTADOS
ulaientífica
Se identifica un número determinado n de colonias sospechosas (mínimo 5) Tras la confirmación, se calcula para cada una de las placas la proporción de colonias presuntivas que cumplen los criterios de confirmación
x es el número estimado de colonias confirmadas por placak l ú d l i l l it i d fi ió t l l i
znk×=x
k es el número de colonias que cumplen los criterios de confirmación entre las colonias sembradas nn es el número de colonias positivas presuntivas sembradas para confirmarz es el número total de colonias positivas presuntivas contadas en la placa.No se deben redondear los resultados confirmados x.
En la fórmula del método general remplazar Z por X =∑ x.
Ejercicio 2 : Filtramos 100 y 10 ml de muestra por duplicado y obtenemos los siguientes resultados:
CÁLCULO DE RESULTADOS
ulaientífica
100 ml: 66 y 80 ufc/placa10 ml: 4 y 7 ufc/placa
De las 66 colonias, se confirman 5, de las cuales 4 cumplieron los criterios.
De las 80 colonias, se confirman 5, de las cuales 3 cumplieron los criterios.
De las 7 colonias, se confirman 5, de las cuales 4 cumplieron los criterios.
De las 4 colonias se confirman 4 de las cuales 4 cumplieron los criteriosDe las 4 colonias, se confirman 4, de las cuales 4 cumplieron los criterios.
Calcular y expresar los resultados de la muestra ensayada.
ulaientífica
23
Todas las placas contienen menos de 10 colonias
ISO 81992:2008. Método de cálculo: casos especiales
CÁLCULO DE RESULTADOS
ulaientífica
Todas las placas contienen menos de 10 colonias
Para recuentos inferiores a 10 colonias la precisión disminuye
ISO/TR 13843: Límite de determinación: concentración media más baja departículas ,“x” ,por porción analítica para la que la incertidumbre estándar relativa(RSD) esperada sea igual a un valor especificado.
Para una distribución de Poisson, x se calcula mediante la siguiente ecuación:
RSD Wdonde (w)
12 ==x
Se considera un límite de precisión relativa aceptable cuando la RSD=0.5
El límite inferior de determinación corresponde a 4 colonias (x = 4, cuando w=0.5)
CÁLCULO DE RESULTADOS
ISO 81992:2008. Método de cálculo: casos especiales
ulaientífica
A) Si todas las placas contienen menos de 10 colonias, pero el número total decolonias en todas las placas disponibles es mayor o igual a 4, el resultado secalcula como en el caso general.
N número estimado de microorganismos por V filtrado.
B) Si el resultado total está entre 1 y 3, la precisión es tan baja que se informa dellt d d t t d l l li dresultado como detectado en el volumen analizado.
Hay microorganismos presentes, pero a un nivel inferior a (4 x d ) por V filtrado.
ulaientífica
24
ISO 81992:2008. Método de cálculo: casos especiales
CÁLCULO DE RESULTADOS
ulaientífica
Ninguna placa contenga colonias
< 1/Vtot ufc por volumen de muestra o “cero” en el volumen de muestraanalizado.
Más de 100 colonias típicas
p
> 100/di ufc por volumen de muestra analizado, siendo di la mayor de lasdiluciones realizadas.
Ejemplo 3: Si hemos filtrado 100 ml de la muestra inicial y contamos 2
CÁLCULO DE RESULTADOS
ulaientífica
Ejemplo 4: Si hemos filtrado 100 ml de la muestra inicial y contamos >100 coloniastípica y menos de 200 en total
¿Como se expresaran los resultados del ensayo?
ulaientífica
25
ulaientífica
CONCEPTOS ESTADÍSTICOS BÁSICOS
Los resultados de los experimentos analíticos son variables aleatorias.
VARIABLES ESTADISTICAS
ulaientífica
ulaientífica
Variables aleatorias
Cualitativas
Cuantitativas
Continuas; puede tomar cualquiervalor dentro de un intervalo
Discretas; solo puede tomar valoresenteros
50
Los resultados de los recuentos microbiológicos son variables aleatorias discreta, es decir, números enteros.
ulaientífica
26
Distribución binomial; se cumple cuando la concentración demicroorganismos es muy elevada
DISTRIBUCIONES DE PROBABILIDAD
ulaientífica
ulaientífica
Variables discretas
g y
Distribución binomial negativa; se describe como una distribución deagrupamiento o sobredispersión. La distribución de losmicroorganismos en la naturaleza se ajusta a este tipo dedistribución.
Distribución de Poisson; se describe como una distribución espacialtotalmente aleatoria de los elementos que la forman, no existeningún tipo de interferencia entre ellos. Este modelo se cumplecuando se consigue una homogeneización perfecta.
51
Variables continuas
Distribución normal; se conoce la varianza de la población
Distribución t de Student; cuando se estima la varianza de la población.Cuando el número de valores es superior a 30 esta distribución seaproxima a la normal.
La estimación del valor medio y de la varianza de la población a partir dela media aritmética y la desviación estándar respectivamente es propio de
TRANSFORMACIÓN DE LOS RESULTADOS
ulaientífica
ulaientífica
la media aritmética y la desviación estándar respectivamente, es propio devariables aleatorias continuas que siguen una distribución normal.
El objetivo de la utilización de la estadística en la validación de métodos espoder hacer comparaciones de los datos obtenidos, para poder evaluar silas diferencias entre los resultados obtenidos y los resultados dereferencia son significativas o si se pueden justificar sólo por variacionesaleatorias. Para ello se utilizaran las pruebas de significación o test dealeatorias. Para ello se utilizaran las pruebas de significación o test dehipótesis, los cuales requieren para su aplicación que dichos datos siganuna distribución normal.
ulaientífica
27
Para poder utilizar toda la teoría relacionada con la ley normal esnecesario realizar las siguientes transformaciones de los resultados
TRANSFORMACIÓN DE LOS RESULTADOS
ulaientífica
ulaientífica
necesario realizar las siguientes transformaciones de los resultadosde los recuentos (X).
log x cuando no existan resultados nulos
log (x+1) cuando existan resultados nulos
Una vez aplicados los cálculos estadísticos es necesario volver atransformar el resultado final para llegar a las conclusiones, y queéstas se expresen en el mismo tipo de variable que los datosiniciales.
ulaientífica
VALIDACIÓN MÉTODOS CUANTITATIVOS
ulaientífica
28
NT-32 Rev.2
COMPROBACIÓN DE FUNCIONAMIENTO MÉTODOS CUANTITATIVOS
ulaientífica
ulaientífica
Métodos normalizados (métodos de referencia). Tipo I
Métodos alternativos (métodos que han sido validados). Tipo II
(disponer de evidencias de su validación)
55
Métodos basados en métodos de referencia. Tipo III
ISO17025 “el laboratorio debe confirmar que puede aplicar correctamente los métodos normalizados antes de utilizarlos
para los ensayos”
Mét d Ti I Ti II Ti III
COMPROBACIÓN DE FUNCIONAMIENTO MÉTODOS CUANTITATIVOS
ulaientífica
ulaientíficaRecuperación (exactitud- veracidad)
Métodos Tipo I, Tipo II y Tipo III
Se han de determinar las características de funcionamiento delmétodo en el propio laboratorio y verificar que cumplan loscriterios establecidos.
56
Reproducibilidad (precisión)
ulaientífica
29
Precisión proximidad entre resultados de mediciones
PRECISIÓN
ulaientífica
ulaientífica
independientes del mismo mesurando. (ISO 5725)
57
PRECISIÓN Y EXACTITUD
Veracidad grado de concordancia entre el promedio de
ulaientífica
ulaientífica
g puna serie de mediciones y el valor del mesurando. (ISO5725)
SESGO% RECUPERACIÓN
58
ulaientífica
30
EXACTITUD
Exactitud: Grado de concordancia entre el resultado d di ió l l d f i t d
ulaientífica
de una medición y el valor de referencia aceptado.
PRECISIÓN VERICIDAD+
59
EXACTITUD
ulaientífica
ulaientífica
60
ulaientífica
31
COMPROBACIÓN DE FUNCIONAMIENTO MÉTODOS CUANTITATIVOS
Tipo y nº de t i
ulaientífica
ulaientífica
Muestras naturales
contaminadas
matrices
Nivel de contaminación
61
Muestras naturales
contaminadas artificialmente
Intervalo de trabajo
i) A t t d ( i i )
CLASIFICACIÓN DE MATRICES
ulaientífica
ulaientífica
i) Aguas tratadas (consumo, piscina, …)ii) Aguas no tratadas (río, pozo, …)iii) Aguas de mariv) Aguas residuales o reutilizadasv) …
62
ulaientífica
32
El intervalo de trabajo de un método es el intervalo de concentraciónen el que puede obtenerse una exactitud y precisión adecuadas al
COMPROBACIÓN DE FUNCIONAMIENTO MÉTODOS CUANTITATIVOS
ulaientífica
ulaientífica
e e que puede obte e se u a e act tud y p ec s ó adecuadas aobjetivo del método.
NT 32 rev.1: En los métodos microbiológicos se tiene que tener encuenta que independientemente del nivel de contaminación de lamuestra, mediante diluciones seriadas siempre se realiza un recuentoen placa dentro de un intervalo de medida establecido (por ejemplo de10 200 f / l d 10 100 f / l ú ISO 81992 2008)
63
10 a 200 ufc/placa o de 10 a 100 ufc/placa, según ISO 81992:2008).
El estudio se considera adecuado realizarlo en el intervalo de medidaen el que se lleva a cabo el recuento en placa.
Exactitud: Grado de concordancia entre el resultado de una medición y elvalor de referencia aceptado. (ISO3534-1)
COMPROBACIÓN DE FUNCIONAMIENTO EXACTITUD
ulaientífica
ulaientífica
El valor de referencia se puede obtener a partir de:
Materiales microbiológicos de referencia certificados
Muestras de referencia (muestras procedentes de ejerciciosinterlaboratorio con un valor asignado para los microorganismosanalizados).
Muestras analizadas con métodos de referencia
64
Muestras analizadas con métodos de referencia.
Cepas de referencia procedentes de colecciones de cultivo tipo, con lasque se pueden preparar muestras contaminadas artificialmente
Es necesario disponer de un número mínimo de valores de referencia queasegure la exactitud en todo el rango de medida.
ulaientífica
33
Método de cálculo: puede expresarse matemáticamente a partir de la
COMPROBACIÓN DE FUNCIONAMIENTO EXACTITUD
ulaientífica
ulaientífica
Método de cálculo: puede expresarse matemáticamente a partir de larecuperación.
Recuperación = Valor de ensayo / Valor de referencia
Recuperación = 10 (X-Xref) (siendo X valores en unidades logarítmicas)
65
p ( g )
COMPROBACIÓN DE FUNCIONAMIENTO EXACTITUD
Inocular una muestra natural que no contenga el microorganismo aensayar
ulaientífica
ulaientífica
Ensayar la muestra inoculada según el procedimiento de ensayo (óptimo10 resultados)
Simultáneamente determinar la cantidad de inóculo mediante siembra enPCA e incubación a 37ºC durante 24 horas (óptimo 10 replicados)
Transformar los resultados en logaritmo (log10 en ufc/g o ml)
Calcular el valor medio de cada conjunto de resultados
x = valor medio en logaritmo (log10 en ufc/g o ml) de los resultados obtenidoscon el método a controlar
xref = valor medio en logaritmo (log10 en ufc/g o ml) de los resultadosobtenidos con PCA
Calcular el % de recuperación =100 x 10(x-xref)
ulaientífica
34
Ejercicio 1: Inoculación de muestras
Para calcular y evaluar la recuperación del método de coliformes esnecesario inocular una muestra de leche, a partir de una suspensión de
ulaientífica
ulaientífica
, p pE.coli (ATCC 25922).
El nivel de inoculación requerido es de 150 ufc/ml.
• ¿Como prepararíamos el inoculo?
•¿Como obtendríamos el valor del inoculo?¿Como obtendríamos el valor del inoculo?
•¿Cómo calcularíamos la recuperación?
• Si el fabricante establece una productividad superior al 80 %, ¿Qué valorde recuperación podríamos esperar?
COMPROBACIÓN DE FUNCIONAMIENTO EXACTITUD
Preparación de inóculos
ulaientífica
ulaientífica
108 ufc/ml 103 ufc/ml 1 ml
9 ml
1 ml
9 ml
1 ml
9 ml
1 ml
9 ml
1 ml
9 ml
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5100 µl
Resultados placa 122 140 110 ufc/100 µlResultado suspensión 1240 ufc/ml
ulaientífica
35
Ejercicio 1: Inoculación de muestras
Si la suspensión 10-5 es del orden de 1240 ufc/ml. Suponemos que la
ulaientífica
ulaientífica
p p qsuspensión 10-4 es del orden de 12400 ufc/ml .
• Para contaminar 10 ml de leche a un nivel de 150 ufc/ml necesitamos
1240 1
150 x
X = 1,20 ml de la suspensión 10-5 o 120 µl de la suspensión 10-4X 1,20 ml de la suspensión 10 o 120 µl de la suspensión 10
COMPROBACIÓN DE FUNCIONAMIENTO EXACTITUD
Inoculación de muestras
ulaientífica
ulaientífica
104 ufc/ml
9 ml 10 ml
120 µl
120 µl
120 µl
10 ml
µ
Medio selectivo
PCA
ulaientífica
36
Ejercicio 2: Estudio de la recuperación de un método de recuento
Determinar la recuperación del procedimiento de ensayo PNT-E-24 analizando 10 vecesuna muestra inoculada con una cepa de referencia El valor del inoculo se determina a
ulaientífica
ulaientífica
una muestra inoculada con una cepa de referencia. El valor del inoculo se determina apartir de la siembra en PCA.
PCA PNT-E-24
1 40 42
2 36 42
3 39 40
4 42 36
5 36 39
6 36 34
7 39 36
8 44 41
9 39 39
10 36 38
Grado de concordancia entre ensayos independientes obtenidosbajo unas condiciones establecidas (ISO 3534 1)
COMPROBACIÓN DE FUNCIONAMIENTO PRECISIÓN
ulaientífica
ulaientífica
bajo unas condiciones establecidas. (ISO 3534-1)
NOTA: La precisión depende sólo de la distribución de erroresaleatorios y no tienen ninguna relación con el valor verdaderoo el valor especificado.(ISO 5725-1, 3.12:94) (ISO 3534-1,3.14:83)
72
Repetibilidad.
Reproducibilidad.
Precisión intermedia.
ulaientífica
37
Condiciones de repetibilidad: No se varia ningún factor, mismo
COMPROBACIÓN DE FUNCIONAMIENTO PRECISIÓN
ulaientífica
ulaientífica
día, mismo instrumento, mismo analista.
Condiciones de reproducibilidad: Se varían todos los factores,diferente día, diferente analista, diferente laboratorio, etc.
73
Condiciones de precisión intermedia (reproducibilidadintralaboratorio): Dentro del mismo laboratorio se varia uno ovarios factores, por ejemplo distinto día, distinto analista.
La precisión suele expresarse como imprecisión y calcularse comod i ió tá d d l lt d d l C t
COMPROBACIÓN DE FUNCIONAMIENTO PRECISIÓN
ulaientífica
ulaientífica
desviación estándar de los resultados de los ensayos. Cuantomayores la desviación estándar menor es la precisión.
Sr (desviación estándar de repetibilidad)
S ( desviación estándar de reproducibilidad)
74
SR( desviación estándar de reproducibilidad)
ulaientífica
38
Se realizará el estudio de precisión intermedia del laboratorio en elintervalo de medida en el que se lleva a cabo el recuento en placa y
COMPROBACIÓN DE FUNCIONAMIENTO PRECISIÓN
ulaientífica
ulaientífica
intervalo de medida en el que se lleva a cabo el recuento en placa ypreferiblemente sobre muestras naturales o, en su defecto conmuestras inoculadas.
La reproducibilidad se expresará a partir de la desviación estándar dereproducibilidad y ésta se determinará para clase de matriz y especiede microorganismo (o grupo de microorganismo) objeto del ensayo.
75
El laboratorio debe justificar la selección del número y tipo de matricesen función del alcance de la acreditación. (Anexo B UNE-ENISO16140).
Procedimiento para cada clase de matriz a validar: (ISO/TS19036:2006)
COMPROBACIÓN DE FUNCIONAMIENTO PRECISIÓN
ulaientífica
ulaientífica
19036:2006)
• 10 muestras contaminadas naturalmente o inoculadas
• Ensayar cada muestra por duplicado incluyendo entre ellas lamáxima variación posible dentro del laboratorio; distinta
b t di ti t li t di ti t l t d di di ti t H
76
submuestra, distinto analista, distinto lote de medio, distinto pHmetro, y/o los equipos utilizados según la forma de trabajo dellaboratorio.
ulaientífica
39
Muestra
COMPROBACIÓN DE FUNCIONAMIENTO PRECISIÓN
ulaientífica
ulaientífica
Analista 1
(condición A)
Analista 2
(condición B)
Suspensión inicial Suspensión inicialContaminación artificial
(si es necesario)
77
Análisis Análisis
Cálculo de la desviación estándar de reproducibilidad:
Transformar los resultados a (log10(ufg/g)) o (log10(ufg/ml))
COMPROBACIÓN DE FUNCIONAMIENTO PRECISIÓN
ulaientífica
ulaientífica
Transformar los resultados a (log10(ufg/g)) o (log10(ufg/ml))
Calcular la desviación estándar según la siguiente fórmula:
∑=
−=
n
i
iBiAR
Yyn
S1
2
2
)(1
ij el resultado transformado en (log10(ufg/g)) o (log10(ufg/ml))
i el índice de la muestra i=1 hasta 10
78
j el índice de las condiciones de reproducibilidad j= A o B
Por ejemplo; y1A resultado de la muestra 1 bajo las condiciones A
La desviación estándar se expresará en unidades de (log10(ufg/g)) o (log10(ufg/ml))
Evaluación del resultado: comparar el resultado obtenido con el criterio de aceptación / rechazo establecido para el método según la legislación, norma, requisito del cliente,…
ulaientífica
40
Se analizan 10 muestras de rutina por duplicado introduciendo la máximavariación posible; distinta submuestra, distinto analista, distinto lote de medio,distinto incubador etc y se obtienen los siguientes resultados
Ejercicio 3: Determinación de la reproducibilidad
ulaientífica
ulaientífica
distinto incubador, etc. y se obtienen los siguientes resultados.
X1 (ufc/g) X2(ufc/g)
M1 78 85
M2 68 59
M3 48 52
M4 65 62
M5 72 69
M6 58 64
79
M7 72 68
M8 65 72
M9 56 61
M10 68 74
Calcular la reproducibilidad de laboratorio y verificar que cumple con el criterio deaceptación/rechazo (límite de reproducibilidad R=0.45 en unidades de log 10)
Validación de una modificación al método
por comparación con el método de referencia
VALIDACIÓN DE MODIFICACIONES
ulaientífica
ulaientífica
por comparación con el método de referencia
Objetivo; demostrar estadísticamente que el resultado obtenido con elmodificación no difieren significativamente del resultado del método dereferencia.
Dos opciones:
A) A partir de distintas muestras analizadas simultáneamente con el método de
80
A) A partir de distintas muestras analizadas simultáneamente con el método dereferencia y con el método modificado.
B) A partir de ensayar una muestra repetidamente con el método de referenciay simultáneamente con el método modificado
ulaientífica
41
Opción A) A partir de distintas muestras analizadas simultáneamente con el método dereferencia y con el método alternativo. Método de la diferencia media
VALIDACIÓN DE MODIFICACIONES
ulaientífica
ulaientífica
Ensayar distintas muestras (mínimo 10 de cada tipo de matriz) simultáneamente con elmétodo de referencia y con el método alternativo.
Transformar los resultados de recuento a validar a logaritmo (log10(ufc/g o ml)
Calcular la diferencia para cada par de valores correspondientes.
Calcular el valor medio (d) y la desviación típica (Sd) del conjunto de diferencias.
Recuperación relativa= (10d)
81
Recuperación relativa= (10 )
Prueba de Hipótesis; Ho : d= 0
nSdd
t cal =
Si tcal < t n-1,α=0,05 no hay diferencias significativas
Se utiliza un método de rutina PNT-E-010 basado en norma al cual se han modificado las
Ejercicio 4: Validación de una modificación
ulaientífica
ulaientífica
condiciones de incubación; verificar que no hay diferencias significativas.
Opción A) A partir de distintas muestras analizadas simultáneamente con el método dereferencia y con el método modificado.
Ref.muestra M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10
82
PNT-E-10 5,20E+02 1,85E+02 6,50E+03 2,39E+03 2,43E+04 1,89E+05 3,80E+01 2,11E+03 1,50E+05 2,28E+03
Norma 4,50E+02 1,52E+02 7,00E+03 2,29E+03 2,50E+04 1,88E+05 2,90E+01 2,10E+03 1,38E+05 2,10E+03
ulaientífica
42
B) A partir de ensayar una muestra repetidamente con el método de referencia ysimultáneamente con el método alternativo.
VALIDACIÓN DE MODIFICACIONES
ulaientífica
ulaientífica
Ensayar la muestra 10 veces con el método de referencia y simultáneamente 10 vecescon el método alternativo.
Transformar los resultados de recuento obtenidos a logaritmo (log10(ufc/g) (log10(ufc/ml)
Calcular el valor medio X y la desviación estándar S de los valores obtenidos con elmétodo a validar.
Calcular el valor medio Xref y la desviación estándar Sref de los valores obtenidos con elmétodo de referencia
83
método de referencia.
Prueba de Hipótesis de varianzas: Ho: S2=S2ref
Si Fcal < Fν1=n1-1, ν2=n2-1 ,α=0,05 no hay diferencias significativas en las varianzas.
22
cal SSF21=
Prueba de Hipótesis Ho: X = X ref
VALIDAR MODIFICACIONES
ulaientífica
ulaientífica
+
−=
21
refcal
11
xx
nnS
t
)( 222
+SS ref
Varianzas iguales Varianzas distintas
( ) ( ) 11 22 SS
+
−=
2
2
1
2
refcal
xx
nS
nS
tref
84Si tcal < t ν, α=0,05 no hay diferencias significativas
( ) ( )11
)(
222
4
121
421
−×+
−×
=
nnS
nnS
nnref
effν( ) ( )
−+
×−+×−=
211
21
22
21
nnSnSn
S ref
212 −+= nnν
ulaientífica
43
Se utiliza un método de rutina PNT-E-010 basado en norma al cual se han modificado las condiciones de incubación; verificar que no hay diferencias significativas.
Opción B) A partir de ensayar una muestra repetidamente con el método sin modificar de referencia
Ejercicio 5: Validación de una modificación al método
ulaientífica
ulaientífica
Opción B) A partir de ensayar una muestra repetidamente con el método sin modificar de referenciay simultáneamente con el método modificado
ReferenciaMuestra
MétodoNormalizado PNT-E-010
M1 182 187
M2 193 161
M3 147 152
M4 184 175
M5 203 172
85
M6 161 204
M7 197 201
M8 172 163
M9 198 170
M10 194 204
Verificar que no hay diferencias significativas y calcular la exactitud relativa del métodoconsiderando como criterio de aceptación que la recuperación este comprendida dentro delintervalo 90-100%.
ESTIMACIÓN DE LAula
ientífica
ESTIMACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE EN
ENSAYOS MICROBIOLÓGICOS
86
ulaientífica
44
INCERTIDUMBRE DE LOS RESULTADOS
El resultado del número de microorganismos presentes en la muestra tiene que poderexpresarse de manera general como:
ulaientífica
ulaientífica
Valor 1 ± Valor 2
Valor 1; es la mejor estimación que podemos proporcionar de la cantidad demicroorganismos presentes en la muestra.
Valor 2; es la incertidumbre del resultado final relacionado con la dispersión de
87
Valor 2; es la incertidumbre del resultado final, relacionado con la dispersión deresultados que se obtendrían al repetir el análisis un número determinado de veces.
Incertidumbre de medida: parámetro, asociado al resultado de una medida, quecaracteriza la dispersión de los valores que se podrían atribuir razonablemente almesurando ( ISO/TS 19036:2003).
Factores que afectan al resultado del análisis
INCERTIDUMBRE DE LOS RESULTADOS
ulaientífica
ulaientífica
Muestreo
Muestra para el laboratorio
Equipos, medios de cultivo y reactivos Sesgo
Submuestreo / primera dilución
Resultado
88
ISO/TS 19036:2003: Microbiology of food and animal feeding stuffs-Guidelines for the estimation of measurement uncertainty for quantitative determinations
Matriz AnalistaErrores aleatorios
ulaientífica
45
INCERTIDUMBRE DE LOS RESULTADOS
ISO/TS 19036:2006: Microbiology of food and animal feeding stuffs-Guidelines for the estimation of measurement uncertainty for quantitative determinations
ulaientífica
ulaientífica
Incertidumbre expandida
K: Factor de cobertura=2 (nivel de confianza del 95%)
S Des iación estándar de reprod cibilidad
∑+=
CSKU 2
R188610.
89
SR : Desviación estándar de reproducibilidad
0.18861/∑C : es la componente de la varianza debida a la distribución de Poisson
∑C : es la suma de las colonias contadas en todas las placas.
INCERTIDUMBRE DE LOS RESULTADOS
La ecuación se puede simplificar para recuentos elevados:
ulaientífica
ulaientífica
Incertidumbre expandida
El valor limite de la suma de la suma de colonias contadas viene dado por la siguiente ecuación:
RSKU ×=
2lim S1.75 C =
90
Si ∑ C> C lim se puede usar la ecuación simplificada
2R
lim S
ulaientífica
46
Posibilidades de estimación de la desviación estándar de reproducibilidad (SR):
INCERTIDUMBRE DE LOS RESULTADOS
ulaientífica
ulaientífica
1ª opción: intralaboratorio
2ª opción: estudio interlaboratorio de validación del método
3ª opción: ejercicio interlaboratorio de aptitud
91
p j p
EXPRESIÓN DE LA INCERTIDUMBRE EN EL INFORME DE ANALISIS
La desviación estándar de reproducibilidad se expresa en unidades de log10
ulaientífica
ulaientífica
La desviación estándar de reproducibilidad se expresa en unidades de log10
Existen diferentes posibilidades de expresión de los resultados en el informede análisis :
y ± U (log)
y log [ y – U , y + U]
x ufc/ g o ufc/ml [ 10 y – U , 10 y + U]
92
x ufc/ g o ufc/ml [ -(1-10-u ) x100%, +(-1+10 u ) x 100%]
Siendo y el resultado en unidades de log 10
ulaientífica
47
Report on the relationship between analytical results, measurement uncertainty, recovery factors and the provisions of eu food and feed legislation, with particular reference to
INCERTIDUMBRE DE LOS RESULTADOS
ulaientífica
ulaientífica
community legislation concerning. 2004http://europa.eu.int/comm/food/food/chemicalsafety/contaminants/report-sampling_analysis_2004_en.pdf
31 620 a 316 200± 0.55100 000
316 200 a 3 162 000± 0.561 000 000
3 162 000 a 31 620 000± 0.5710 000 000
Rango aceptable de recuentos en valor absoluto
Incertidumbre expandida U (log10)
Recuento (log10)Recuento (valor absoluto)
93
32 a 316± 0.52100
3 162 a 31 620± 0.5410 000
316 a 3 162± 0.531 000
3 a 32± 0.5110
Para métodos que requieren previa confirmación, se aceptan valores de ± 1 log 10
Ejercicio 6 : Estimación de la incertidumbre
Estimar la incertidumbre de los siguientes resultados e indicar como se expresaría elresultado con la incertidumbre en el informe de ensayo. Incluir todas las posibilidades.
ulaientífica
ulaientífica
Ejemplo 1: SR = 0.15 K=2
Ejemplo 2: SR = 0.25 K=2
10210-3
810-4
RecuentoDilución
3 placas = 9 ,9, 910-1
2
RecuentoDilución
94
Ejemplo 3: SR = 0.11 K=2
410—2
910-1
210—2
RecuentoDilución
ulaientífica
48
ulaientífica
ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD DE LOS
RESULTADOS
95
ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD DE LOS RESULTADOS
UNE-EN ISO/IEC 17025 “El laboratorio debe establecer un control de calidad para
ulaientífica
ulaientífica
UNE EN ISO/IEC 17025 El laboratorio debe establecer un control de calidad pararealizar el seguimiento de la validez de los ensayo”
G-ENAC-04 Rev.3
El laboratorio debe disponer de un programa de controles periódicos … uso demuestras inoculadas, recuentos cruzados entre analistas, análisis duplicados, uso demateriales de referencia...
96
Los laboratorios deben participar regularmente en ensayos de aptitud....para detectardesviaciones y verificar la validez de todo el sistema de calidad.
ulaientífica
49
NT 32 Rev.2
Las actividades de control de la calidad deben realizarse en la medida de lo posible con muestrasnaturales tanto positivas (contaminadas naturalmente o inoculadas) como negativas.
ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD DE LOS RESULTADOS
ulaientífica
ulaientífica
CONTROL INTERNO
Control de las condiciones de trabajo Control de la precisión
Control de la recuperaciónControl del límite de detección
CONTROL EXTERNO
Participación en intercomparaciónes
97
Siembra por duplicado de placasControl de medios de cultivo
Control ambientalCualificación del personal
Calibración/verificación de equipos
Conjunto de acciones de
evaluación de la calidad
NT 32 Rev.2
Todas las actividades de aseguramiento de la calidad deberán planificarse de forma quei l d d t ió d l i d d d t i l t b j
ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD DE LOS RESULTADOS
ulaientífica
ulaientífica
se incluya una adecuada representación de la variedad de matrices con las que trabajael laboratorio.
PROGRAMA DE CONTROL DE CALIDAD DE LOS RESULTADOS
La periodicidad de las actividades de control de calidad deberá establecerse considerandodiversos factores como pueden ser:
98
La robustez del método utilizado en función de los controles específicos incluidos en el mismo.
La frecuencia con la que el laboratorio ejecuta dichos análisis
Los resultados históricos de control de calidad y la evaluación de los mismos
El conjunto de acciones de evaluación de la calidad utilizados en el laboratorio.
ulaientífica
50
Método analítico Tipo de control Periodicidad Criterios de aceptación/rechazo
PROGRAMA DE CONTROL DE LA CALIDAD
ulaientífica
ulaientífica
Esterilidad: Blanco En cada serie No crecimiento
Control eficacia positivo - Productividad
Trimestral Crecimiento característico
Control eficacia negativo – Selectividad
Trimestral No crecimiento
Control del límite de detección Trimestral Mismo LD que en la validación
Participación ejercicio interlaboratorio
Anual No estar excluido
Esterilidad: Blanco En cada serie No crecimiento
Investigación de salmonela
99
Control eficacia positivo - Productividad
Trimestral Pr > 90%
Control eficacia negativo – Selectividad
Trimestral No crecimiento
Control de duplicados de placa En cada serie ISO 14461-2
Control de duplicados de muestra En cada serie r= 2,8 Sr
Control de la recuperación Trimestral R > 90 %
Participación ejercicio interlaboratorio
Anual -2<Z<2
Recuento S.aureus
Control de la precisión (repetibilidad); muestras naturales contaminadas naturalmente o naturales sin contaminar inoculadas con materiales de referencia
ACTIVIDADES DE CONTROL DE LA CALIDAD
ulaientífica
ulaientífica
Ensayar por duplicado muestras de rutina en condiciones de repetibilidad
Transformar los resultados logaritmo (log10(ufc/g o ml)
Calcular la diferencia de logaritmos
Evaluación: verificar que la diferencia de logaritmos se encuentra dentro de los límitesestablecidos como criterio de aceptación/rechazo.
100
Límite de repetibilidad (r)= 2.8 Sr diferencia absoluta entre dos resultados de ensayoobtenidos en condiciones de repetibilidad que se espera que esté con una probabilidadmáxima del 95 %
Los resultados obtenidos pueden utilizarse en la validación del método (ej. verificación denuevas matrices).
ulaientífica
51
Los resultados obtenidos al analizar por duplicado una muestra son:
Ejercicio 7: Control de la precisión.
ulaientífica
ulaientífica
Muestra A: 195 ufc/g y 160 ufc/g
Si disponemos de la información de R=0,10, ¿ cual es la conclusión?
¿Que resultado indicaremos en el informe de ensayo?
101
Control de la recuperación; muestras inoculadas con materiales dereferencia o cepas de referencia
ACTIVIDADES DE CONTROL DE LA CALIDAD
ulaientífica
ulaientífica
p
Inocular una muestra natural que no contenga el microorganismo a ensayar
Ensayar la muestra inoculada según el procedimiento de ensayo
Simultáneamente determinar la cantidad de inóculo mediante siembra en PCA eincubación a 37ºC durante 24 horas
Transformar los resultados en logaritmo (log10 en ufc/g o ml)
Calcular el valor medio de cada conjunto de resultados
102
x = valor medio en logaritmo (log10 en ufc/g o ml) de los resultados obtenidos con elmétodo a controlar
xref = valor medio en logaritmo (log10 en ufc/g o ml) de los resultados obtenidos conPCA
Calcular el % de recuperación =100 x 10(x-xref)
Evaluación: verificar que el % de recuperación se encuentra dentro de loslímites establecidos como criterio de aceptación/rechazo.
ulaientífica
52
Control del límite de detección; con muestras inoculadas con cepas de referencia
ACTIVIDADES DE CONTROL DE LA CALIDAD
ulaientífica
ulaientífica
Inocular una muestra que no contenga el microorganismo diana, a unaconcentración próxima al límite de detección
Ensayar la muestra inoculada según el procedimiento de ensayo (óptimo 10replicados)
Simultáneamente determinar la cantidad de inóculo mediante siembra en PCA eincubación a 37ºC durante 24 horas (óptimo 10 replicados)
103
Evaluación: verificar que se ha detectado la presencia del microorganismo en lamuestra, siempre y cuando la concentración inoculada esté por encima del límite dedetección
Control de las condiciones de trabajo; proporciona información sobre la esterilidadde los medios y materiales auxiliares utilizados y, en general, sobre la buena prácticaen la realización de los ensayos
ACTIVIDADES DE CONTROL DE LA CALIDAD
ulaientífica
ulaientífica
en la realización de los ensayos.
Dos opciones:
Ensayar una muestra problema estéril (muestra blanco)
Ensayar una suspensión que no contenga muestra pero que haya seguido losmismas etapas que las suspensiones de las muestras (control de esterilidad)
104
Evaluación: verificar que no exista crecimiento o, si procede, establecer criteriospara la desviación permitida (dependiendo del fin de la determinación puedepermitirse una contaminación reducida).
ulaientífica
53
Control ambiental; Controlar los niveles de biocontaminación del aire y de lassuperficies de trabajo
ACTIVIDADES DE CONTROL DE LA CALIDAD
ulaientífica
ulaientífica
p j
Control ambiental: exposición de placas con medio de cultivo abiertas endistintas áreas del laboratorio durante un tiempo determinado.
Control de superficies: control con laminocultivos en distintas superficies dellaboratorio.
105
Evaluación: Establecer los recuentos máximos aceptables y las medidas a tomar encaso de sobrepasar los límites.
Control de los medios de cultivo;
ACTIVIDADES DE CONTROL DE LA CALIDAD
ulaientífica
ulaientífica
En el laboratorio de microbiología, muchos análisis y procedimientos dependen deque el medio de cultivo sea constante y proporcione resultados reproducibles.
Control del medio de cultivo para:1. aceptabilidad de cada lote de medio2. que el medio es “adecuado al objetivo”3. que el medio puede dar resultados constantes
106
Evaluación: en función de las características del medio (líquido o sólido) y lafinalidad del método (cuantitativo, cualitativo o semicuantitativo) se estableceráncriterios de productividad y selectividad con criterios predeterminados deaceptación/rechazo.
ulaientífica
54
Participación en intercomparaciones; permite una evaluación del sesgo.
ACTIVIDADES DE CONTROL DE LA CALIDAD
ulaientífica
ulaientífica
Se recomienda participar en intercomparaciones de reconocido prestigio yque permitan cubrir todo el rango de matrices con las que trabaja ellaboratorio.
Los resultados pueden ser utilizados para la validación del método.
107
Evaluación: No estar excluido por el organizador, generalmente el valor deZ-score ha de estar incluido dentro del intervalo de (+2 y -2)
ACTIVIDADES DE CONTROL DE LA CALIDAD
Guía sobre la participación en intercomparaciones (G-ENAC-14 Rev.1)
Evaluación del proveedor: Aspectos técnicos a considerar
ulaientífica
ulaientífica
item suministrado (garantía de homogeneidad y estabilidad para el fin previsto)
condiciones de transporte
instrucciones para la realización del ensayo
metodología estadística utilizada
informe final
108
Evaluación de la participación en el ejercicio de intercomparación:
Calidad del ítem (nivel de concentración, presencia de interferencias, límites de deteccióndeclarados, datos del estudio de homogeneidad/estabilidad)
Contenido del informe (datos de los participantes, valor asignado, dispersión de losresultados, incertidumbre, evaluación del rendimiento (Z-score o Número E), evaluaciónrealizada, gráficos, incidencias)