Download pdf - CURSO microbiología

ulaientífica

1

CURSO TEÓRICO –

ulaientífica

CURSO TEÓRICO PRÁCTICO DE VALIDACIÓN

DE MÉTODOS MICROBIOLOGICOS

Dra. Estefania Escartin [email protected] Técnica SPM Controler

Jordina Faurat [email protected] de la Unidad de Garantía de Calidad. Laboratorios de Sanidad Animal del DAAM

PROGRAMA

PROGRAMA PRIMER DÍA

09:00 09:30 Bienvenida

ulaientífica

09:00-09:30 Bienvenida

09:30-10:30 Concepto de validación. Planificación y diseño experimental: métodos microbiológicos de aguas (NMP+ FM), requisitos normativos (7/2006/CEE, RD 140/2003, ISO 17025) medios de cultivo (tradicionales y cromogénicos), cepas y materiales de referencia (cualitativas y cuantitativas: crioviales, lentículas, bioball).

10:30-11:00 Pausa

11:00-14:30 Práctica: Explicación práctica del ensayo:11:00 14:30 Práctica: Explicación práctica del ensayo: •Preparación del MRC: explicación mediante video con crioviales y lentículas.• Explicación siembra muestra agua potable por NMP (Colilert y enterolert) •Explicación siembra con muestra de agua de mar FM

•Desarrollo del ensayo en el laboratorio:•Práctica de preparación e inoculación de la muestra y del MRC. Desarrollo del método (NMP y filtración por membrana). Incubación.

ulaientífica

2

PROGRAMA

PROGRAMA SEGUNDO DÍA

09:00 10:30 Expresión y evaluación de los resultados en análisis

ulaientífica

09:00- 10:30 Expresión y evaluación de los resultados en análisismicrobiológicos.

10:30-11:00 Pausa

11:00- 13:00 Validación de métodos cuantitativos (exactitud, precisión,sensibilidad y especificidad)

13:00-14:00 Práctica de lectura de placas y confirmación bioquímica. De losparámetros de lectura a las 24± 2 horas de los dos métodos.parámetros de lectura a las 24± 2 horas de los dos métodos.

PROGRAMA

PROGRAMA TERCER DÍA

ulaientífica

09:00-10:30 Cálculo incertidumbres (concepto y estimación de incertidumbre,expresión de resultados en el informe de análisis). Aseguramiento de la calidad delos resultados (actividades de control, evaluación de resultados y gráficos decontrol).

10:30-11:00 Pausa

11:00-13:30 Práctica de recuento y confirmación bioquímica de parámetros delectura a las 48± 2 horas de los dos métodos. Acabar con la confirmación bioquímicadel día anterior.

13:30- 14:00 Exposición de resultados por grupos.

14:00 -14:30 Clausura y entrega de certificados

ulaientífica

3

ulaientífica

CONCEPTOS GENERALES MICROBIOLOGÍA

5

INTRODUCCIÓN

La realización de análisis de control microbiológico es unaherramienta que tiene una repercusión decisiva en el ámbito de la

ulaientífica

ulaientífica

Los laboratorios que realizan análisis de control microbiológicodeben utilizar métodos de ensayo que aseguren la fiabilidad delos resultados.

Los métodos de ensayo utilizados:

H d i l it i té i lid

herramienta que tiene una repercusión decisiva en el ámbito de lasalud pública, la tecnología alimentaria y el Medio Ambiente.

6

Han de reunir los criterios técnicos que aseguren su validez

Han de poder ser reproducibles

Han de ser realizados con una serie de garantías que permitanobtener resultados comparables con independencia dellaboratorio que los ejecute.

ulaientífica

4

CONCEPTO DE VALIDACIÓN

ISO 17025 punto 5.4.5.1

La validación es la confirmación mediante examen y la

ulaientífica

ulaientífica

La validación es la confirmación mediante examen y laaportación de evidencias objetivas que demuestren elcumplimiento de ciertos requisitos para el uso específico previsto

ISO/TR 13843:2000

Proceso que nos proporciona la evidencia de que un método escapaz de servir al propósito para el que ha sido diseñado es

7

capaz de servir al propósito para el que ha sido diseñado, esdecir, en el caso de los métodos microbiológicos, para detectar ocuantificar un determinado microorganismo o grupo demicroorganismos con unas adecuadas sensibilidad yespecificidad o precisión y exactitud.

Existe la obligación de validar métodos.

REQUISITOS NORMATIVOS

ulaientífica

ulaientífica

g

ISO 17025 5.4.5.2. “El laboratorio debe validar los métodos nonormalizados, los métodos diseñados/desarrollados internamente,los métodos normalizados utilizados fuera de su campo deaplicación previsto, y las ampliaciones y modificaciones de métodosnormalizados, con el fin de comprobar que son apropiados para eluso previsto ”

8

uso previsto.

ISO 17025 5.4.2 “El laboratorio debe confirmar que puede realizarcorrectamente los métodos normalizados antes de efectuar losensayos.”

ulaientífica

5

G-ENAC-04 Rev.3 “Los laboratorios deben mantener los datosb lid ió d l i t d i l (Kit )


ulaientífica

ulaientífica

sobre validación de los sistemas de ensayo comerciales (Kits)que utilicen. Si no se dispone de datos sobre validación o siestos no son plenamente aplicables, el laboratorio seráresponsable de completar la validación del método”.

Verificación periódica – Aseguramiento de la calidad de losresultados de ensayo

9

resultados de ensayoIncluso cuando se haya realizado la validación, el laboratoriotendrá que verificar periódicamente que se cumplan losparámetros documentados (comprobar que siguen satisfaciendolos requisitos establecidos). El aseguramiento de la calidad debeser tanto interno como externo (intercomparaciones)

G-ENAC-04 Rev.3

La validación de los métodos de ensayo debe reflejar las condiciones reales de ensayo


ulaientífica

ulaientífica

La validación de los métodos de ensayo debe reflejar las condiciones reales de ensayo.

NT 32 Rev.1 y Rev.2 – Actividades de Validación

El laboratorio debe justificar la selección del número y tipo de matrices en función delalcance de acreditación.

Las actividades de validación deben realizarse sobre muestras naturales o, en su defecto,con muestras inoculadas, preferiblemente no esterilizadas para que exista microbiotainterferente.Si se considera necesario investigar la influencia de la microbiota acompañante interferente a

10

Si se considera necesario investigar la influencia de la microbiota acompañante interferente aconcentraciones superiores o muy superiores al microrganismo diana, se deberá inocular lamuestra con diversas cepas de especies distintas a la diana a esas concentraciones.

Para demostrar que una versión modificada de un método cumple las mismasespecificaciones que el método original, deben realizarse comparaciones utilizandoreplicados. El diseño experimental y el análisis de los resultados tienen que serestadísticamente válidos.

ulaientífica

6

SELECCIÓN DE MÉTODOS DE ENSAYO

ISO 17025:2005 Apartado 5.4.2 “El laboratorio debe utilizarmétodos de ensayo que satisfagan las necesidades del cliente y

ulaientífica

ulaientífica

sean apropiados para el uso previsto”

Requisitos RD 140/2003 y Directiva 2006/7/CE

“ cuando el cliente no especifique el método a utilizar, el laboratorio debe seleccionar

debe tenerse en cuenta el ámbito de aplicación

11

p q ,los métodos apropiados que hayan sido publicados en normas internacionales,regionales o nacionales, por organizaciones técnicas reconocidas o en libros orevistas científicas especializadas o especificados por el fabricante de equipos”

En caso de elegir un procedimiento de ensayo interno, se aconseja que se partade métodos de referencia que sean ampliamente aceptados, conocidos yaplicados en el sector


Requisitos RD/140/2003

ulaientífica

ulaientífica

12

ulaientífica

7



ulaientífica

ulaientífica

13



ulaientífica

ulaientífica

14

ulaientífica

8


ulaientífica

ulaientífica

Sin perjuicio de lo dispuesto en el Real Decreto 140/2003, de 7 de febrero,por el que se establecen los criterios sanitarios de la calidad del agua deconsumo humano, y como alternativos al método descrito en la parte A desu anexo IV, se podrán utilizar, asimismo, los métodos incluidos en elanexo de esta orden, para el análisis microbiológico de los parámetros:

15

anexo de esta orden, para el análisis microbiológico de los parámetros:«bacterias coliformes» y «Escherichia coli».


ulaientífica

ulaientífica

Parte B.Método de detección y recuento de bacterias coliformes y de Escherichia coli enaguas de consumo por filtración de membrana utilizando agar cromogénico paracoliformes (ACC).

En el estudio de equivalencia se empleó el medio Chromocult Coliform Agar, fabricado por la casa comercial Merck.

Parte CParte C.Método de detección y recuento de bacterias coliformes y de Escherichia coli en aguas de consumo por el NMP (número más probable) en medio líquido utilizando la tecnología del sustrato definido® (DST).

En el estudio de equivalencia se empleó la placa Quanti-Tray® de 51 pocillos y el sustrato definido Colilert 18®.

ulaientífica

9


ulaientífica

ulaientífica

17


ulaientífica

ulaientífica

18

ulaientífica

10

PROCESO DE VALIDACIÓN

Planificación

ulaientífica

ulaientífica

Diseño experimental

Desarrollo práctico

19

Evaluación de los resultados

Informe de validación

PLANIFICACIÓN DE LA VALIDACIÓN

Definir las responsabilidades: Relación de las personas que llevaran acabo la validación y del responsable de su evaluación y aprobación

ulaientífica

ulaientífica

cabo la validación y del responsable de su evaluación y aprobación.Éstos deberán tener una cualificación adecuada.

Definir el método a validar; analito, técnica, matrices.... Ha de existir undocumento (PNT) que describa con el suficiente grado de detalle elprocedimiento a seguir para asegurar su correcta realización y surepetibilidad

Definir el procedimiento de validación a seguir y los registros que seannecesarios. Todos los datos primarios han de poder ser auditables.

20

Definir los objetivos y los requisitos que solicitamos al método,identificar los parámetros de validación a estudiar y definir sus criteriosde aceptación.

Identificar las cepas y materiales de referencia, que se utilizaran.

ulaientífica

11

DISEÑO EXPERIMENTAL

Una vez definidos los parámetros a estudiar es necesario detallarcomo se llevará a cabo este estudio;

ulaientífica

ulaientífica

que muestras se utilizaran,

como se prepararan las muestras contaminadas artificialmente,

que microorganismos que puedan interferir se estudiarán

cuantas muestras se utilizaran

cuantas repeticiones se realizaran

21

a partir de que dilución se sembrara muestra,........

Una vez realizadas las pruebas y experimentos establecidos(desarrollo practico) se realizaran los cálculos pertinentes para

EVALUACIÓN DE LOS RESULTADOS

ulaientífica

ulaientífica

(desarrollo practico) se realizaran los cálculos pertinentes paradeterminar los parámetros de validación y se evaluaran losresultados obtenidos.

Se comprobará que los resultados cumplen los criterios deaceptación establecidos previamente, en caso contrario cuando

22

aceptación establecidos previamente, en caso contrario cuandolos resultados difieren de lo esperado se estudiara la posibilidadde realizar una modificación (del método o de los requisitosestablecidos) y se indicaran las razones que la justifican.

ulaientífica

12

INFORME DE VALIDACIÓN

Finalmente, una vez concluido todo el proceso de validación se emitirá un informe ocertificado de validación firmado por las personas responsables.

ulaientífica

ulaientífica

p p p

El contenido del informe de validación puede ser:

Declaración formal sobre la idoneidad del método para el uso que se pretendehacer del mismo.

Planificación: Responsabilidades, objetivos y requisitos del método.

Resultados obtenidos y su evaluación.

Fechas de inicio y final de la validación.

Id tifi ió d l t / t i l d f i tili dIdentificación de los patrones y/o materiales de referencia utilizados

Identificación de todos los registros relacionados con el proceso de validación,todo el proceso ha de poder ser auditable, incluido el procedimiento devalidación utilizado.

Todos los registros relacionados con el proceso de validación deben incluir fechas,personal, patrones y/o materiales de referencia y equipos utilizados de manera quepuedan ser reproducibles.

CEPAS Y MATERIALES DE REFERENCIA

Cepas de referencia: Microorganismos definidos por lo menos al nivel delgenero y especie, catalogados y descritos según sus características ypreferiblemente de origen conocido [ISO:11133-1:2000]

ulaientífica

ulaientífica

preferiblemente de origen conocido. [ISO:11133-1:2000]

Material de referencia: Material o sustancia uno o más de cuyaspropiedades tienen valores suficientemente homogéneos y claramenteestablecidos como para poder ser utilizados en la calibración de un aparato,la evaluación de un método de medida o la asignación de valores amateriales. (Guía ISO 30:1992)

Material de referencia certificado: Material de referencia, acompañado deun certificado, en el cual uno o más valores de sus propiedades han sidocertificados mediante un procedimiento que establece su trazabilidad a unarealización exacta de la unidad en que se expresan los valores de dichaspropiedades. Cada valor certificado se acompaña de una incertidumbre y elnivel de confianza correspondiente. (Guía ISO 30:1992).

ulaientífica

13

Cepas de referencia: cultivo procedente de una colección nacional ointernacional reconocida. Garantizan identidad del microorganismo pero

id d


ulaientífica

ulaientífica

no cantidad.

CECT: Colección Española de Cultivos Tipo.ECCO: European Culture Collection Organization.ATCC: American Type Culture Collection.

Control de calidad de los medios de cultivo

WDCM (World Data Centre for

Microbiology)

Control de calidad de los medios de cultivo.

Validar métodos

Evaluar la calidad de los resultados

Utilizadas para


Cepas de referencia:

ulaientífica

ulaientífica

ulaientífica

14

Material de referencia certificado: muestras que tienen un valor conocido ycertificado de un numero concreto de microorganismos de un determinado


ulaientífica

ulaientífica

certificado de un numero concreto de microorganismos de un determinadotipo, obtenido mediante la aplicación de un determinado método.

Validar métodos.

Evaluar la calidad de los resultados

Utilizados para


Material de referencia:

ulaientífica

ulaientífica

ulaientífica

15


Material de referencia certificado

ulaientífica

certificado


Material de referencia certificado

ulaientífica

certificado

ulaientífica

16

G-ENAC-04 (rev.3)

CEPAS DE REFERENCIA

ulaientífica

Para demostrar la trazabilidad, el laboratorio debe utilizar cepas de referenciade microorganismos obtenidos de una colección nacional o internacionalreconocida.

... se reconstruirían y someterán a los controles de pureza y ensayosbioquímicos que sean necesarios. Serán subcultivadas una sola vez paraobtener las cepas de reserva, de las que se obtendrán las cepas de trabajo

…las cepas de reserva deben conservarse utilizando una técnica quet l t í ti d d ( lt l d li fili d ) Simantenga las características deseadas .... (ultracongeladas o liofilizadas). Si

las cepas de reserva se han descongelado, no deben volver a congelarse yreutilizarse

Las cepas de trabajo no deben ser subcultivadas para sustituir las cepas dereserva. Se conservaran en refrigeración

CEPA DE REFERENCIA“cultivo de microorganismo obtenido de una colección nacional o internacional reconocida”

CEPAS DE REFERENCIA

ulaientífica

ulaientífica

CEPA DE RESERVA CEPA DE RESERVA CEPA DE RESERVA“cultivos de referencia mantenidos por un laboratorio”

Descongelación/Reconstitución(subcultivada una sola vez)

Control de pureza y ensayos bioquímicosReconstitución (subcultivada una sola vez)

Especificar tiempo y condiciones de almacenamientoControl de pureza y ensayos bioquímicos

NO tienen determinada ninguna carga de microorganismos: se considera un carga inicial de 108

CEPA DE TRABAJO CEPA DE TRABAJO CEPA DE TRABAJO CEPA DE TRABAJO“subcultivos de microorganismos derivados de las cepas de reserva para ser utilizados en las operaciones del día a día”

Es obligatorio su uso para el control de calidad de medios de cultivoSe pueden usar para la: Validación de métodos y la evaluación de la calidad de los ensayos

Especificar tiempo y condiciones de almacenamiento

ulaientífica

17

Anexo B de la norma ISO 11133-1: Conservación y mantenimiento de cepas

CEPAS DE REFERENCIA

ulaientífica

CEPA DE REFERENCIA

CEPA DE RESERVA

Control de pureza Ensayos bioquímicos

Conservación Controles

Liofilización,Congelación –24ºC, 2-3 añosCongelación a –70ºC , 5 años

Nitrógeno líquido

Liofilización (asegurar su viabilidad y evitar que cambien)

Control de pureza

CULTIVO DE RESERVA

g q

A temperatura adecuada (de 18ºC a 25ºC o de 2ºC a 8ºC),

1 mes

Ensayos bioquímicos

CULTIVO DE TRABAJO

Control de pureza

ESTANDARIZACIÓN DE SUSPENSIONES BACTERIANAS

Para el control de calidad de los medios de cultivo, y para la validación demétodos (muestras contaminadas artificialmente) es necesario disponer de

ulaientífica

( ) pcepas estandarizadas de microorganismos.

La manera mas fácil de estandarizar una suspensión de microorganismos espor determinación de la turbidez en un espectrofotómetro o por comparacióncon la escala Mc Farland.

Si l ió d i i iSiempre que se prepare la suspensión de un mismo microorganismo en unmismo medio y a la misma turbidez medida a una longitud de ondaaproximada, se obtendrá aproximadamente el mismo número demicroorganismos.

ulaientífica

18

Encontrar la relación entre la transmitancia y el número del recuento demicroorganismos

ESTANDARIZACIÓN DE SUSPENSIONES BACTERIANAS

ulaientífica

PREPARACIÓN DE UNA SUSPENSIÓN ESTANDARIZADA

Sembrar el microorganismo en un tubo de agar de triptona-soja inclinado yincubar entre 30-35 ºC durante 24 horas.

Realizaremos 10 suspensiones de Staphylococcus aureus en agua depeptona 0.1%.

La ajustamos al 70% de transmisión en un espectrofotómetro regulado a una

microorganismos.

La ajustamos al 70% de transmisión en un espectrofotómetro regulado a unalongitud de onda de 580nm. Si la lectura es superior al 70%, recoger máscrecimiento y si es inferior, diluir la suspensión con agua de peptona. Lasuspensión así preparada contiene aproximadamente 108 ufc/mL.

Diluimos hasta obtener la dilución 10-6 y realizamos el recuento de viables(por duplicado) de cada suspensión.

ulaientífica

EXPRESIÓN Y EVALUACIÓN DE LOS

RESULTADOS DE RESULTADOS

ulaientífica

19

MÉTODOS DE DETECCIÓN Y RECUENTO

EXPRESIÓN DE RESULTADOSISO 7218:2008

ulaientífica

ulaientífica

MÉTODOS DE DETECCIÓN Y RECUENTORecuento en placa Recuento en medio líquido

Método general Método posterior a la identificación

Método de cálculo

Método NMP

NMP de microorganismos por gramo o mililitro

Nº de microorganismos N por (mililitro o gramo)2 dos cifras significativasC it i d d dCriterio de redondeo:Si la ultima cifra es < 5 redondear a la baja

Si es > 5 redondear a la alta

Preferiblemente se expresará como: a x 10b ufc/g o mla = numero entre 1,0 y 9,9

b= potencia de 10 adecuada

Métodos de investigación

EXPRESIÓN DE RESULTADOS

ulaientífica

ulaientíficaPresencia o ausencia en volumen de muestra ensayada

g

Detección

ulaientífica

20

CÁLCULO DE RESULTADOS

ISO 81992:2008

ulaientífica

Condiciones generales:

número total de colonias entre 10 y 200 por filtro

número de colonias típicas entre 10 y 100 por filtro

Número de colonias sospechosas inoculadas pera su identificación oNúmero de colonias sospechosas inoculadas pera su identificación o confirmación de cada filtro: 5

ISO 81992:2008, apdo. 8.4.2. Cálculo de resultados. Caso general

Una de las placas debe contener un mínimo de 10 colonias (totales, típicas o que cumplan los criterios


ulaientífica

p ( , p q pde identificación, según proceda)

stot

s VVZC ×=

Cs es el número estimado de ufc en el volumen de referencia de la muestras Vs

Z es la suma de todas las colonias contadas sobre las placas o membranas derivadas de las diluciones d1 d2 di o derivadas de volúmenes independientes de la porción delas diluciones d1, d2, …, di o derivadas de volúmenes independientes de la porción de ensayo (muestra o dilución)

Vs es el volumen de referencia seleccionado para expresar la concentración de microorganismos de la muestra

ulaientífica

21

Vtot es el volumen total calculado de la muestra de origen inoculado en lasmembranas contadas. Es la suma de los volúmenes separados de la porción de


ulaientífica

p pensayo (muestra o dilución) o bien, se calcula a partir de la ecuación:

Vtot = (n1·V1·d1) + (n2·V2·d2) + ... + (ni·Vi·di)

donde

n1, n2, ... , ni es el número de placas contadas para las diluciones d1, d2, …, di

V1, V2, …, Vi es el volumen de ensayo utilizado en las diluciones d1, d2, …, di

41

, , , y , , ,

d1, d2, …, di es la dilución utilizada para el volumen de ensayo V1, V2, …, Vi (d=1para la muestra inicial, d=0.1 para la dilución 1/10, etc …)

Ejercicio 1: Filtramos 100 y 10 ml de muestra por duplicado y obtenemos los siguientes resultados:


ulaientífica

• 100 ml: 66 y 80 ufc/placa• 10 ml: 4 y 7 ufc/placa

Calcular y expresar los resultados de la muestra ensayada.

ulaientífica

22

ISO 81992:2008. Método de cálculo: después de la identificación

Se identifica un número determinado n de colonias sospechosas (mínimo 5)


ulaientífica

Se identifica un número determinado n de colonias sospechosas (mínimo 5) Tras la confirmación, se calcula para cada una de las placas la proporción de colonias presuntivas que cumplen los criterios de confirmación

x es el número estimado de colonias confirmadas por placak l ú d l i l l it i d fi ió t l l i

znk×=x

k es el número de colonias que cumplen los criterios de confirmación entre las colonias sembradas nn es el número de colonias positivas presuntivas sembradas para confirmarz es el número total de colonias positivas presuntivas contadas en la placa.No se deben redondear los resultados confirmados x.

En la fórmula del método general remplazar Z por X =∑ x.

Ejercicio 2 : Filtramos 100 y 10 ml de muestra por duplicado y obtenemos los siguientes resultados:


ulaientífica

100 ml: 66 y 80 ufc/placa10 ml: 4 y 7 ufc/placa

De las 66 colonias, se confirman 5, de las cuales 4 cumplieron los criterios.



De las 4 colonias se confirman 4 de las cuales 4 cumplieron los criteriosDe las 4 colonias, se confirman 4, de las cuales 4 cumplieron los criterios.

Calcular y expresar los resultados de la muestra ensayada.

ulaientífica

23

Todas las placas contienen menos de 10 colonias

ISO 81992:2008. Método de cálculo: casos especiales


ulaientífica

Todas las placas contienen menos de 10 colonias

Para recuentos inferiores a 10 colonias la precisión disminuye

ISO/TR 13843: Límite de determinación: concentración media más baja departículas ,“x” ,por porción analítica para la que la incertidumbre estándar relativa(RSD) esperada sea igual a un valor especificado.

Para una distribución de Poisson, x se calcula mediante la siguiente ecuación:

RSD Wdonde (w)

12 ==x

Se considera un límite de precisión relativa aceptable cuando la RSD=0.5

El límite inferior de determinación corresponde a 4 colonias (x = 4, cuando w=0.5)



ulaientífica

A) Si todas las placas contienen menos de 10 colonias, pero el número total decolonias en todas las placas disponibles es mayor o igual a 4, el resultado secalcula como en el caso general.

N número estimado de microorganismos por V filtrado.

B) Si el resultado total está entre 1 y 3, la precisión es tan baja que se informa dellt d d t t d l l li dresultado como detectado en el volumen analizado.

Hay microorganismos presentes, pero a un nivel inferior a (4 x d ) por V filtrado.

ulaientífica

24



ulaientífica

Ninguna placa contenga colonias

< 1/Vtot ufc por volumen de muestra o “cero” en el volumen de muestraanalizado.

Más de 100 colonias típicas

p

> 100/di ufc por volumen de muestra analizado, siendo di la mayor de lasdiluciones realizadas.

Ejemplo 3: Si hemos filtrado 100 ml de la muestra inicial y contamos 2


ulaientífica

Ejemplo 4: Si hemos filtrado 100 ml de la muestra inicial y contamos >100 coloniastípica y menos de 200 en total

¿Como se expresaran los resultados del ensayo?

ulaientífica

25

ulaientífica

CONCEPTOS ESTADÍSTICOS BÁSICOS

Los resultados de los experimentos analíticos son variables aleatorias.

VARIABLES ESTADISTICAS

ulaientífica

ulaientífica

Variables aleatorias

Cualitativas

Cuantitativas

Continuas; puede tomar cualquiervalor dentro de un intervalo

Discretas; solo puede tomar valoresenteros

50

Los resultados de los recuentos microbiológicos son variables aleatorias discreta, es decir, números enteros.

ulaientífica

26

Distribución binomial; se cumple cuando la concentración demicroorganismos es muy elevada

DISTRIBUCIONES DE PROBABILIDAD

ulaientífica

ulaientífica

Variables discretas

g y

Distribución binomial negativa; se describe como una distribución deagrupamiento o sobredispersión. La distribución de losmicroorganismos en la naturaleza se ajusta a este tipo dedistribución.

Distribución de Poisson; se describe como una distribución espacialtotalmente aleatoria de los elementos que la forman, no existeningún tipo de interferencia entre ellos. Este modelo se cumplecuando se consigue una homogeneización perfecta.

51

Variables continuas

Distribución normal; se conoce la varianza de la población

Distribución t de Student; cuando se estima la varianza de la población.Cuando el número de valores es superior a 30 esta distribución seaproxima a la normal.

La estimación del valor medio y de la varianza de la población a partir dela media aritmética y la desviación estándar respectivamente es propio de

TRANSFORMACIÓN DE LOS RESULTADOS

ulaientífica

ulaientífica

la media aritmética y la desviación estándar respectivamente, es propio devariables aleatorias continuas que siguen una distribución normal.

El objetivo de la utilización de la estadística en la validación de métodos espoder hacer comparaciones de los datos obtenidos, para poder evaluar silas diferencias entre los resultados obtenidos y los resultados dereferencia son significativas o si se pueden justificar sólo por variacionesaleatorias. Para ello se utilizaran las pruebas de significación o test dealeatorias. Para ello se utilizaran las pruebas de significación o test dehipótesis, los cuales requieren para su aplicación que dichos datos siganuna distribución normal.

ulaientífica

27

Para poder utilizar toda la teoría relacionada con la ley normal esnecesario realizar las siguientes transformaciones de los resultados

TRANSFORMACIÓN DE LOS RESULTADOS

ulaientífica

ulaientífica

necesario realizar las siguientes transformaciones de los resultadosde los recuentos (X).

log x cuando no existan resultados nulos

log (x+1) cuando existan resultados nulos

Una vez aplicados los cálculos estadísticos es necesario volver atransformar el resultado final para llegar a las conclusiones, y queéstas se expresen en el mismo tipo de variable que los datosiniciales.

ulaientífica

VALIDACIÓN MÉTODOS CUANTITATIVOS

ulaientífica

28

NT-32 Rev.2

COMPROBACIÓN DE FUNCIONAMIENTO MÉTODOS CUANTITATIVOS

ulaientífica

ulaientífica

Métodos normalizados (métodos de referencia). Tipo I

Métodos alternativos (métodos que han sido validados). Tipo II

(disponer de evidencias de su validación)

55

Métodos basados en métodos de referencia. Tipo III

ISO17025 “el laboratorio debe confirmar que puede aplicar correctamente los métodos normalizados antes de utilizarlos

para los ensayos”

Mét d Ti I Ti II Ti III


ulaientífica

ulaientíficaRecuperación (exactitud- veracidad)

Métodos Tipo I, Tipo II y Tipo III

Se han de determinar las características de funcionamiento delmétodo en el propio laboratorio y verificar que cumplan loscriterios establecidos.

56

Reproducibilidad (precisión)

ulaientífica

29

Precisión proximidad entre resultados de mediciones

PRECISIÓN

ulaientífica

ulaientífica

independientes del mismo mesurando. (ISO 5725)

57

PRECISIÓN Y EXACTITUD

Veracidad grado de concordancia entre el promedio de

ulaientífica

ulaientífica

g puna serie de mediciones y el valor del mesurando. (ISO5725)

SESGO% RECUPERACIÓN

58

ulaientífica

30

EXACTITUD

Exactitud: Grado de concordancia entre el resultado d di ió l l d f i t d

ulaientífica

de una medición y el valor de referencia aceptado.

PRECISIÓN VERICIDAD+

59

EXACTITUD

ulaientífica

ulaientífica

60

ulaientífica

31


Tipo y nº de t i

ulaientífica

ulaientífica

Muestras naturales

contaminadas

matrices

Nivel de contaminación

61

Muestras naturales

contaminadas artificialmente

Intervalo de trabajo

i) A t t d ( i i )

CLASIFICACIÓN DE MATRICES

ulaientífica

ulaientífica

i) Aguas tratadas (consumo, piscina, …)ii) Aguas no tratadas (río, pozo, …)iii) Aguas de mariv) Aguas residuales o reutilizadasv) …

62

ulaientífica

32

El intervalo de trabajo de un método es el intervalo de concentraciónen el que puede obtenerse una exactitud y precisión adecuadas al


ulaientífica

ulaientífica

e e que puede obte e se u a e act tud y p ec s ó adecuadas aobjetivo del método.

NT 32 rev.1: En los métodos microbiológicos se tiene que tener encuenta que independientemente del nivel de contaminación de lamuestra, mediante diluciones seriadas siempre se realiza un recuentoen placa dentro de un intervalo de medida establecido (por ejemplo de10 200 f / l d 10 100 f / l ú ISO 81992 2008)

63

10 a 200 ufc/placa o de 10 a 100 ufc/placa, según ISO 81992:2008).

El estudio se considera adecuado realizarlo en el intervalo de medidaen el que se lleva a cabo el recuento en placa.

Exactitud: Grado de concordancia entre el resultado de una medición y elvalor de referencia aceptado. (ISO3534-1)

COMPROBACIÓN DE FUNCIONAMIENTO EXACTITUD

ulaientífica

ulaientífica

El valor de referencia se puede obtener a partir de:

Materiales microbiológicos de referencia certificados

Muestras de referencia (muestras procedentes de ejerciciosinterlaboratorio con un valor asignado para los microorganismosanalizados).

Muestras analizadas con métodos de referencia

64

Muestras analizadas con métodos de referencia.

Cepas de referencia procedentes de colecciones de cultivo tipo, con lasque se pueden preparar muestras contaminadas artificialmente

Es necesario disponer de un número mínimo de valores de referencia queasegure la exactitud en todo el rango de medida.

ulaientífica

33

Método de cálculo: puede expresarse matemáticamente a partir de la


ulaientífica

ulaientífica

Método de cálculo: puede expresarse matemáticamente a partir de larecuperación.

Recuperación = Valor de ensayo / Valor de referencia

Recuperación = 10 (X-Xref) (siendo X valores en unidades logarítmicas)

65

p ( g )


Inocular una muestra natural que no contenga el microorganismo aensayar

ulaientífica

ulaientífica

Ensayar la muestra inoculada según el procedimiento de ensayo (óptimo10 resultados)

Simultáneamente determinar la cantidad de inóculo mediante siembra enPCA e incubación a 37ºC durante 24 horas (óptimo 10 replicados)

Transformar los resultados en logaritmo (log10 en ufc/g o ml)

Calcular el valor medio de cada conjunto de resultados

x = valor medio en logaritmo (log10 en ufc/g o ml) de los resultados obtenidoscon el método a controlar

xref = valor medio en logaritmo (log10 en ufc/g o ml) de los resultadosobtenidos con PCA

Calcular el % de recuperación =100 x 10(x-xref)

ulaientífica

34

Ejercicio 1: Inoculación de muestras

Para calcular y evaluar la recuperación del método de coliformes esnecesario inocular una muestra de leche, a partir de una suspensión de

ulaientífica

ulaientífica

, p pE.coli (ATCC 25922).

El nivel de inoculación requerido es de 150 ufc/ml.

• ¿Como prepararíamos el inoculo?

•¿Como obtendríamos el valor del inoculo?¿Como obtendríamos el valor del inoculo?

•¿Cómo calcularíamos la recuperación?

• Si el fabricante establece una productividad superior al 80 %, ¿Qué valorde recuperación podríamos esperar?


Preparación de inóculos

ulaientífica

ulaientífica

108 ufc/ml 103 ufc/ml 1 ml

9 ml

1 ml

9 ml

1 ml

9 ml

1 ml

9 ml

1 ml

9 ml

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5100 µl

Resultados placa 122 140 110 ufc/100 µlResultado suspensión 1240 ufc/ml

ulaientífica

35

Ejercicio 1: Inoculación de muestras

Si la suspensión 10-5 es del orden de 1240 ufc/ml. Suponemos que la

ulaientífica

ulaientífica

p p qsuspensión 10-4 es del orden de 12400 ufc/ml .

• Para contaminar 10 ml de leche a un nivel de 150 ufc/ml necesitamos

1240 1

150 x

X = 1,20 ml de la suspensión 10-5 o 120 µl de la suspensión 10-4X 1,20 ml de la suspensión 10 o 120 µl de la suspensión 10


Inoculación de muestras

ulaientífica

ulaientífica

104 ufc/ml

9 ml 10 ml

120 µl

120 µl

120 µl

10 ml

µ

Medio selectivo

PCA

ulaientífica

36

Ejercicio 2: Estudio de la recuperación de un método de recuento

Determinar la recuperación del procedimiento de ensayo PNT-E-24 analizando 10 vecesuna muestra inoculada con una cepa de referencia El valor del inoculo se determina a

ulaientífica

ulaientífica

una muestra inoculada con una cepa de referencia. El valor del inoculo se determina apartir de la siembra en PCA.

PCA PNT-E-24

1 40 42

2 36 42

3 39 40

4 42 36

5 36 39

6 36 34

7 39 36

8 44 41

9 39 39

10 36 38

Grado de concordancia entre ensayos independientes obtenidosbajo unas condiciones establecidas (ISO 3534 1)

COMPROBACIÓN DE FUNCIONAMIENTO PRECISIÓN

ulaientífica

ulaientífica

bajo unas condiciones establecidas. (ISO 3534-1)

NOTA: La precisión depende sólo de la distribución de erroresaleatorios y no tienen ninguna relación con el valor verdaderoo el valor especificado.(ISO 5725-1, 3.12:94) (ISO 3534-1,3.14:83)

72

Repetibilidad.

Reproducibilidad.

Precisión intermedia.

ulaientífica

37

Condiciones de repetibilidad: No se varia ningún factor, mismo


ulaientífica

ulaientífica

día, mismo instrumento, mismo analista.

Condiciones de reproducibilidad: Se varían todos los factores,diferente día, diferente analista, diferente laboratorio, etc.

73

Condiciones de precisión intermedia (reproducibilidadintralaboratorio): Dentro del mismo laboratorio se varia uno ovarios factores, por ejemplo distinto día, distinto analista.

La precisión suele expresarse como imprecisión y calcularse comod i ió tá d d l lt d d l C t


ulaientífica

ulaientífica

desviación estándar de los resultados de los ensayos. Cuantomayores la desviación estándar menor es la precisión.

Sr (desviación estándar de repetibilidad)

S ( desviación estándar de reproducibilidad)

74

SR( desviación estándar de reproducibilidad)

ulaientífica

38

Se realizará el estudio de precisión intermedia del laboratorio en elintervalo de medida en el que se lleva a cabo el recuento en placa y


ulaientífica

ulaientífica

intervalo de medida en el que se lleva a cabo el recuento en placa ypreferiblemente sobre muestras naturales o, en su defecto conmuestras inoculadas.

La reproducibilidad se expresará a partir de la desviación estándar dereproducibilidad y ésta se determinará para clase de matriz y especiede microorganismo (o grupo de microorganismo) objeto del ensayo.

75

El laboratorio debe justificar la selección del número y tipo de matricesen función del alcance de la acreditación. (Anexo B UNE-ENISO16140).

Procedimiento para cada clase de matriz a validar: (ISO/TS19036:2006)


ulaientífica

ulaientífica

19036:2006)

• 10 muestras contaminadas naturalmente o inoculadas

• Ensayar cada muestra por duplicado incluyendo entre ellas lamáxima variación posible dentro del laboratorio; distinta

b t di ti t li t di ti t l t d di di ti t H

76

submuestra, distinto analista, distinto lote de medio, distinto pHmetro, y/o los equipos utilizados según la forma de trabajo dellaboratorio.

ulaientífica

39

Muestra


ulaientífica

ulaientífica

Analista 1

(condición A)

Analista 2

(condición B)

Suspensión inicial Suspensión inicialContaminación artificial

(si es necesario)

77

Análisis Análisis

Cálculo de la desviación estándar de reproducibilidad:

Transformar los resultados a (log10(ufg/g)) o (log10(ufg/ml))


ulaientífica

ulaientífica

Transformar los resultados a (log10(ufg/g)) o (log10(ufg/ml))

Calcular la desviación estándar según la siguiente fórmula:

∑=

−=

n

i

iBiAR

Yyn

S1

2

2

)(1

ij el resultado transformado en (log10(ufg/g)) o (log10(ufg/ml))

i el índice de la muestra i=1 hasta 10

78

j el índice de las condiciones de reproducibilidad j= A o B

Por ejemplo; y1A resultado de la muestra 1 bajo las condiciones A

La desviación estándar se expresará en unidades de (log10(ufg/g)) o (log10(ufg/ml))

Evaluación del resultado: comparar el resultado obtenido con el criterio de aceptación / rechazo establecido para el método según la legislación, norma, requisito del cliente,…

ulaientífica

40

Se analizan 10 muestras de rutina por duplicado introduciendo la máximavariación posible; distinta submuestra, distinto analista, distinto lote de medio,distinto incubador etc y se obtienen los siguientes resultados

Ejercicio 3: Determinación de la reproducibilidad

ulaientífica

ulaientífica

distinto incubador, etc. y se obtienen los siguientes resultados.

X1 (ufc/g) X2(ufc/g)

M1 78 85

M2 68 59

M3 48 52

M4 65 62

M5 72 69

M6 58 64

79

M7 72 68

M8 65 72

M9 56 61

M10 68 74

Calcular la reproducibilidad de laboratorio y verificar que cumple con el criterio deaceptación/rechazo (límite de reproducibilidad R=0.45 en unidades de log 10)

Validación de una modificación al método

por comparación con el método de referencia

VALIDACIÓN DE MODIFICACIONES

ulaientífica

ulaientífica

por comparación con el método de referencia

Objetivo; demostrar estadísticamente que el resultado obtenido con elmodificación no difieren significativamente del resultado del método dereferencia.

Dos opciones:

A) A partir de distintas muestras analizadas simultáneamente con el método de

80

A) A partir de distintas muestras analizadas simultáneamente con el método dereferencia y con el método modificado.

B) A partir de ensayar una muestra repetidamente con el método de referenciay simultáneamente con el método modificado

ulaientífica

41

Opción A) A partir de distintas muestras analizadas simultáneamente con el método dereferencia y con el método alternativo. Método de la diferencia media


ulaientífica

ulaientífica

Ensayar distintas muestras (mínimo 10 de cada tipo de matriz) simultáneamente con elmétodo de referencia y con el método alternativo.

Transformar los resultados de recuento a validar a logaritmo (log10(ufc/g o ml)

Calcular la diferencia para cada par de valores correspondientes.

Calcular el valor medio (d) y la desviación típica (Sd) del conjunto de diferencias.

Recuperación relativa= (10d)

81

Recuperación relativa= (10 )

Prueba de Hipótesis; Ho : d= 0

nSdd

t cal =

Si tcal < t n-1,α=0,05 no hay diferencias significativas

Se utiliza un método de rutina PNT-E-010 basado en norma al cual se han modificado las

Ejercicio 4: Validación de una modificación

ulaientífica

ulaientífica

condiciones de incubación; verificar que no hay diferencias significativas.

Opción A) A partir de distintas muestras analizadas simultáneamente con el método dereferencia y con el método modificado.

Ref.muestra M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10

82

PNT-E-10 5,20E+02 1,85E+02 6,50E+03 2,39E+03 2,43E+04 1,89E+05 3,80E+01 2,11E+03 1,50E+05 2,28E+03

Norma 4,50E+02 1,52E+02 7,00E+03 2,29E+03 2,50E+04 1,88E+05 2,90E+01 2,10E+03 1,38E+05 2,10E+03

ulaientífica

42

B) A partir de ensayar una muestra repetidamente con el método de referencia ysimultáneamente con el método alternativo.


ulaientífica

ulaientífica

Ensayar la muestra 10 veces con el método de referencia y simultáneamente 10 vecescon el método alternativo.

Transformar los resultados de recuento obtenidos a logaritmo (log10(ufc/g) (log10(ufc/ml)

Calcular el valor medio X y la desviación estándar S de los valores obtenidos con elmétodo a validar.

Calcular el valor medio Xref y la desviación estándar Sref de los valores obtenidos con elmétodo de referencia

83

método de referencia.

Prueba de Hipótesis de varianzas: Ho: S2=S2ref

Si Fcal < Fν1=n1-1, ν2=n2-1 ,α=0,05 no hay diferencias significativas en las varianzas.

22

cal SSF21=

Prueba de Hipótesis Ho: X = X ref

VALIDAR MODIFICACIONES

ulaientífica

ulaientífica

+

−=

21

refcal

11

xx

nnS

t

)( 222

+SS ref

Varianzas iguales Varianzas distintas

( ) ( ) 11 22 SS

+

−=

2

2

1

2

refcal

xx

nS

nS

tref

84Si tcal < t ν, α=0,05 no hay diferencias significativas

( ) ( )11

)(

222

4

121

421

−×+

−×

=

nnS

nnS

nnref

effν( ) ( )

−+

×−+×−=

211

21

22

21

nnSnSn

S ref

212 −+= nnν

ulaientífica

43

Se utiliza un método de rutina PNT-E-010 basado en norma al cual se han modificado las condiciones de incubación; verificar que no hay diferencias significativas.

Opción B) A partir de ensayar una muestra repetidamente con el método sin modificar de referencia

Ejercicio 5: Validación de una modificación al método

ulaientífica

ulaientífica

Opción B) A partir de ensayar una muestra repetidamente con el método sin modificar de referenciay simultáneamente con el método modificado

ReferenciaMuestra

MétodoNormalizado PNT-E-010

M1 182 187

M2 193 161

M3 147 152

M4 184 175

M5 203 172

85

M6 161 204

M7 197 201

M8 172 163

M9 198 170

M10 194 204

Verificar que no hay diferencias significativas y calcular la exactitud relativa del métodoconsiderando como criterio de aceptación que la recuperación este comprendida dentro delintervalo 90-100%.

ESTIMACIÓN DE LAula

ientífica

ESTIMACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE EN

ENSAYOS MICROBIOLÓGICOS

86

ulaientífica

44

INCERTIDUMBRE DE LOS RESULTADOS

El resultado del número de microorganismos presentes en la muestra tiene que poderexpresarse de manera general como:

ulaientífica

ulaientífica

Valor 1 ± Valor 2

Valor 1; es la mejor estimación que podemos proporcionar de la cantidad demicroorganismos presentes en la muestra.

Valor 2; es la incertidumbre del resultado final relacionado con la dispersión de

87

Valor 2; es la incertidumbre del resultado final, relacionado con la dispersión deresultados que se obtendrían al repetir el análisis un número determinado de veces.

Incertidumbre de medida: parámetro, asociado al resultado de una medida, quecaracteriza la dispersión de los valores que se podrían atribuir razonablemente almesurando ( ISO/TS 19036:2003).

Factores que afectan al resultado del análisis


ulaientífica

ulaientífica

Muestreo

Muestra para el laboratorio

Equipos, medios de cultivo y reactivos Sesgo

Submuestreo / primera dilución

Resultado

88

ISO/TS 19036:2003: Microbiology of food and animal feeding stuffs-Guidelines for the estimation of measurement uncertainty for quantitative determinations

Matriz AnalistaErrores aleatorios

ulaientífica

45


ISO/TS 19036:2006: Microbiology of food and animal feeding stuffs-Guidelines for the estimation of measurement uncertainty for quantitative determinations

ulaientífica

ulaientífica

Incertidumbre expandida

K: Factor de cobertura=2 (nivel de confianza del 95%)

S Des iación estándar de reprod cibilidad

∑+=

CSKU 2

R188610.

89

SR : Desviación estándar de reproducibilidad

0.18861/∑C : es la componente de la varianza debida a la distribución de Poisson

∑C : es la suma de las colonias contadas en todas las placas.


La ecuación se puede simplificar para recuentos elevados:

ulaientífica

ulaientífica

Incertidumbre expandida

El valor limite de la suma de la suma de colonias contadas viene dado por la siguiente ecuación:

RSKU ×=

2lim S1.75 C =

90

Si ∑ C> C lim se puede usar la ecuación simplificada

2R

lim S

ulaientífica

46

Posibilidades de estimación de la desviación estándar de reproducibilidad (SR):


ulaientífica

ulaientífica

1ª opción: intralaboratorio

2ª opción: estudio interlaboratorio de validación del método

3ª opción: ejercicio interlaboratorio de aptitud

91

p j p

EXPRESIÓN DE LA INCERTIDUMBRE EN EL INFORME DE ANALISIS

La desviación estándar de reproducibilidad se expresa en unidades de log10

ulaientífica

ulaientífica

La desviación estándar de reproducibilidad se expresa en unidades de log10

Existen diferentes posibilidades de expresión de los resultados en el informede análisis :

y ± U (log)

y log [ y – U , y + U]

x ufc/ g o ufc/ml [ 10 y – U , 10 y + U]

92

x ufc/ g o ufc/ml [ -(1-10-u ) x100%, +(-1+10 u ) x 100%]

Siendo y el resultado en unidades de log 10

ulaientífica

47

Report on the relationship between analytical results, measurement uncertainty, recovery factors and the provisions of eu food and feed legislation, with particular reference to


ulaientífica

ulaientífica

community legislation concerning. 2004http://europa.eu.int/comm/food/food/chemicalsafety/contaminants/report-sampling_analysis_2004_en.pdf

31 620 a 316 200± 0.55100 000

316 200 a 3 162 000± 0.561 000 000

3 162 000 a 31 620 000± 0.5710 000 000

Rango aceptable de recuentos en valor absoluto

Incertidumbre expandida U (log10)

Recuento (log10)Recuento (valor absoluto)

93

32 a 316± 0.52100

3 162 a 31 620± 0.5410 000

316 a 3 162± 0.531 000

3 a 32± 0.5110

Para métodos que requieren previa confirmación, se aceptan valores de ± 1 log 10

Ejercicio 6 : Estimación de la incertidumbre

Estimar la incertidumbre de los siguientes resultados e indicar como se expresaría elresultado con la incertidumbre en el informe de ensayo. Incluir todas las posibilidades.

ulaientífica

ulaientífica

Ejemplo 1: SR = 0.15 K=2


10210-3

810-4

RecuentoDilución

3 placas = 9 ,9, 910-1

2

RecuentoDilución

94


410—2

910-1

210—2

RecuentoDilución

ulaientífica

48

ulaientífica

ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD DE LOS

RESULTADOS

95

ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD DE LOS RESULTADOS

UNE-EN ISO/IEC 17025 “El laboratorio debe establecer un control de calidad para

ulaientífica

ulaientífica

UNE EN ISO/IEC 17025 El laboratorio debe establecer un control de calidad pararealizar el seguimiento de la validez de los ensayo”

G-ENAC-04 Rev.3

El laboratorio debe disponer de un programa de controles periódicos … uso demuestras inoculadas, recuentos cruzados entre analistas, análisis duplicados, uso demateriales de referencia...

96

Los laboratorios deben participar regularmente en ensayos de aptitud....para detectardesviaciones y verificar la validez de todo el sistema de calidad.

ulaientífica

49

NT 32 Rev.2

Las actividades de control de la calidad deben realizarse en la medida de lo posible con muestrasnaturales tanto positivas (contaminadas naturalmente o inoculadas) como negativas.


ulaientífica

ulaientífica

CONTROL INTERNO

Control de las condiciones de trabajo Control de la precisión

Control de la recuperaciónControl del límite de detección

CONTROL EXTERNO

Participación en intercomparaciónes

97

Siembra por duplicado de placasControl de medios de cultivo

Control ambientalCualificación del personal

Calibración/verificación de equipos

Conjunto de acciones de

evaluación de la calidad

NT 32 Rev.2

Todas las actividades de aseguramiento de la calidad deberán planificarse de forma quei l d d t ió d l i d d d t i l t b j


ulaientífica

ulaientífica

se incluya una adecuada representación de la variedad de matrices con las que trabajael laboratorio.

PROGRAMA DE CONTROL DE CALIDAD DE LOS RESULTADOS

La periodicidad de las actividades de control de calidad deberá establecerse considerandodiversos factores como pueden ser:

98

La robustez del método utilizado en función de los controles específicos incluidos en el mismo.

La frecuencia con la que el laboratorio ejecuta dichos análisis

Los resultados históricos de control de calidad y la evaluación de los mismos

El conjunto de acciones de evaluación de la calidad utilizados en el laboratorio.

ulaientífica

50

Método analítico Tipo de control Periodicidad Criterios de aceptación/rechazo

PROGRAMA DE CONTROL DE LA CALIDAD

ulaientífica

ulaientífica

Esterilidad: Blanco En cada serie No crecimiento

Control eficacia positivo - Productividad

Trimestral Crecimiento característico

Control eficacia negativo – Selectividad

Trimestral No crecimiento

Control del límite de detección Trimestral Mismo LD que en la validación

Participación ejercicio interlaboratorio

Anual No estar excluido

Esterilidad: Blanco En cada serie No crecimiento

Investigación de salmonela

99

Control eficacia positivo - Productividad

Trimestral Pr > 90%

Control eficacia negativo – Selectividad

Trimestral No crecimiento

Control de duplicados de placa En cada serie ISO 14461-2

Control de duplicados de muestra En cada serie r= 2,8 Sr

Control de la recuperación Trimestral R > 90 %

Participación ejercicio interlaboratorio

Anual -2<Z<2

Recuento S.aureus

Control de la precisión (repetibilidad); muestras naturales contaminadas naturalmente o naturales sin contaminar inoculadas con materiales de referencia

ACTIVIDADES DE CONTROL DE LA CALIDAD

ulaientífica

ulaientífica

Ensayar por duplicado muestras de rutina en condiciones de repetibilidad

Transformar los resultados logaritmo (log10(ufc/g o ml)

Calcular la diferencia de logaritmos

Evaluación: verificar que la diferencia de logaritmos se encuentra dentro de los límitesestablecidos como criterio de aceptación/rechazo.

100

Límite de repetibilidad (r)= 2.8 Sr diferencia absoluta entre dos resultados de ensayoobtenidos en condiciones de repetibilidad que se espera que esté con una probabilidadmáxima del 95 %

Los resultados obtenidos pueden utilizarse en la validación del método (ej. verificación denuevas matrices).

ulaientífica

51

Los resultados obtenidos al analizar por duplicado una muestra son:

Ejercicio 7: Control de la precisión.

ulaientífica

ulaientífica

Muestra A: 195 ufc/g y 160 ufc/g

Si disponemos de la información de R=0,10, ¿ cual es la conclusión?

¿Que resultado indicaremos en el informe de ensayo?

101

Control de la recuperación; muestras inoculadas con materiales dereferencia o cepas de referencia


ulaientífica

ulaientífica

p

Inocular una muestra natural que no contenga el microorganismo a ensayar

Ensayar la muestra inoculada según el procedimiento de ensayo

Simultáneamente determinar la cantidad de inóculo mediante siembra en PCA eincubación a 37ºC durante 24 horas

Transformar los resultados en logaritmo (log10 en ufc/g o ml)

Calcular el valor medio de cada conjunto de resultados

102

x = valor medio en logaritmo (log10 en ufc/g o ml) de los resultados obtenidos con elmétodo a controlar

xref = valor medio en logaritmo (log10 en ufc/g o ml) de los resultados obtenidos conPCA

Calcular el % de recuperación =100 x 10(x-xref)

Evaluación: verificar que el % de recuperación se encuentra dentro de loslímites establecidos como criterio de aceptación/rechazo.

ulaientífica

52

Control del límite de detección; con muestras inoculadas con cepas de referencia


ulaientífica

ulaientífica

Inocular una muestra que no contenga el microorganismo diana, a unaconcentración próxima al límite de detección

Ensayar la muestra inoculada según el procedimiento de ensayo (óptimo 10replicados)

Simultáneamente determinar la cantidad de inóculo mediante siembra en PCA eincubación a 37ºC durante 24 horas (óptimo 10 replicados)

103

Evaluación: verificar que se ha detectado la presencia del microorganismo en lamuestra, siempre y cuando la concentración inoculada esté por encima del límite dedetección

Control de las condiciones de trabajo; proporciona información sobre la esterilidadde los medios y materiales auxiliares utilizados y, en general, sobre la buena prácticaen la realización de los ensayos


ulaientífica

ulaientífica

en la realización de los ensayos.

Dos opciones:

Ensayar una muestra problema estéril (muestra blanco)

Ensayar una suspensión que no contenga muestra pero que haya seguido losmismas etapas que las suspensiones de las muestras (control de esterilidad)

104

Evaluación: verificar que no exista crecimiento o, si procede, establecer criteriospara la desviación permitida (dependiendo del fin de la determinación puedepermitirse una contaminación reducida).

ulaientífica

53

Control ambiental; Controlar los niveles de biocontaminación del aire y de lassuperficies de trabajo


ulaientífica

ulaientífica

p j

Control ambiental: exposición de placas con medio de cultivo abiertas endistintas áreas del laboratorio durante un tiempo determinado.

Control de superficies: control con laminocultivos en distintas superficies dellaboratorio.

105

Evaluación: Establecer los recuentos máximos aceptables y las medidas a tomar encaso de sobrepasar los límites.

Control de los medios de cultivo;


ulaientífica

ulaientífica

En el laboratorio de microbiología, muchos análisis y procedimientos dependen deque el medio de cultivo sea constante y proporcione resultados reproducibles.

Control del medio de cultivo para:1. aceptabilidad de cada lote de medio2. que el medio es “adecuado al objetivo”3. que el medio puede dar resultados constantes

106

Evaluación: en función de las características del medio (líquido o sólido) y lafinalidad del método (cuantitativo, cualitativo o semicuantitativo) se estableceráncriterios de productividad y selectividad con criterios predeterminados deaceptación/rechazo.

ulaientífica

54

Participación en intercomparaciones; permite una evaluación del sesgo.


ulaientífica

ulaientífica

Se recomienda participar en intercomparaciones de reconocido prestigio yque permitan cubrir todo el rango de matrices con las que trabaja ellaboratorio.

Los resultados pueden ser utilizados para la validación del método.

107

Evaluación: No estar excluido por el organizador, generalmente el valor deZ-score ha de estar incluido dentro del intervalo de (+2 y -2)


Guía sobre la participación en intercomparaciones (G-ENAC-14 Rev.1)

Evaluación del proveedor: Aspectos técnicos a considerar

ulaientífica

ulaientífica

item suministrado (garantía de homogeneidad y estabilidad para el fin previsto)

condiciones de transporte

instrucciones para la realización del ensayo

metodología estadística utilizada

informe final

108

Evaluación de la participación en el ejercicio de intercomparación:

Calidad del ítem (nivel de concentración, presencia de interferencias, límites de deteccióndeclarados, datos del estudio de homogeneidad/estabilidad)

Contenido del informe (datos de los participantes, valor asignado, dispersión de losresultados, incertidumbre, evaluación del rendimiento (Z-score o Número E), evaluaciónrealizada, gráficos, incidencias)