MAKALAH KIMIA ANALISIS

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)

DOSEN PENGAMPU :DIAN NUGRAHENI, S.Pd, M.Sc

DISUSUN OLEH :INDRIYANTI WIDYARATNA

NIM. 352014710960

PROGRAM STUDI FARMASIFAKULTAS ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS DARUSSALAM GONTORNGAWI

2015

A. PENDAHULUANKromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dikenal juga dengan istilah High

Performance Liquid Chromatography (HPLC). KCKT merupakan perangkat peralatan yang penting dalam perkembangan dunia analisis bahan baku maupun bahan pencemar. Fungsi utama KCKT pada dasarnya adalah kemampuannya dalam memisahkan berbagai komponen penyusun dalam suatu sampel. Kinerja tinggi dari kromatografi awalnya ditentukan oleh ketinggian tekanannya, namun perkembangan teknologi telah menghasilkan produk kromatografi cair berkinerja tinggi dengan tekanan yang tidak terlalu tinggi.

KCKT merupakan teknik pemisahan yang masih menjadi idola didunia analisis saat ini. KCKT digunakan secara luas dalam pemisahan dan pemurnian berbagai sampel dalam berbagai bidang seperti farmasi, lingkungan, industri makanan dan minuman, industri polimer dan berbagai bahan baku. KCKT lebih banyak digunakan untuk keperluan identifikasi (analisis kualitatif), kecuali jika KCKT ini dihubungkan dengan sebuah spektrometri massa (Mass Spectrometer) atau MS, maka penggunaannya akan lebih memungkinkan dalam analisis kuantitatif.

Secara umum KCKT digunakan dalam kondisi-kondisi berikut:

1. Pemisahan berbagai senyawa organik maupun anorganik, ataupun spesimen biologis

2. Analisis ketidakmurnian (impurities)3. Analisis senyawa-senyawa yang tak mudah menguap (non-volatil)4. Penentuan molekul-molekul netral, ionik maupun zwitter ion5. Isolasi dan pemurnian senyawa6. Pemisahan senyawa-senyawa dengan struktur kimia yang mirip7. Pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah kecil (trace elements)

Komponen KCKT

B. DEFINISIKromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut dengan High

Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif.

KCKT paling sering digunakan untuk : 1. Menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-

asam nukleat, dan protein-protein dalam cairan fisiologis; 2. Menetukan kadar senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil samping proses

sintesis, atau produk-produk degradasi dalam sediaan farmasi. Komatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan teknik pemisahan senyawa

dengan cara melewatkan senyawa melalui fase diam (stationary phase) dengan menggunakan fase gerak (mobile phase) mengaliri semua ini. Senyawa dalam kolom akan keluar dari kolom atas dasar kepolaran yang berbeda, sehingga akan mempengaruhi kekuatan interaksi senyawa dengan fase diam dan fase gerak

Dari kromatogram dapat diidentifikasi waktu retensi (tR) dan luas area/tinggi puncak. Kedua hal ini berguna untuk :

1. Analisis kualitatif digunakan informasi tR, 2. Analisis kuantitatif digunakan informasi luas 3. Area/tinggi puncak kromatogramPada HPLC terdapat kolom terbuka yaitu :1. Low pressure (tekanan rendah)2. High pressure (tekanan tinggi 76 bar biasanya memakai satuan kpa/kilo paskal).Pada HPLC terdapat oven untuk pemanas karena pada partikel kecil, cairan

ditekan terjadi gesekan maka digunakan pendingin dan tekanan tinggi (cairan ditekan menggunakan pompa kemudian didorong, jika ditarik cairan masuk). Tekanan harus 76 bar, antara fase diam dan fase gerak terjadi gesekan sehingga temperatur meningkat maka harus diturunkan (dengan pendingin liebig/ ion exchange) karena ikatannya bisa lepas dan bisa juga terjadi bleeding.

Temperatur pada HPLC digunakan untuk menjaga temperatur dalam kolom konstan sehingga KD tetap.

C. PRINSIP DASARKerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan

kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya untuk sampai ke detektor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya terpisah.

Urutan skala polaritas : golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon < senyawa terhalogenasi < golongan eter < golongan ester < golongan keton < golongan alkohol < golongan asam.

D. MANFAAT KCKTKromatografi Cair Kinerja Tinggi sering kali digunakan untuk beberapa kepentingan, seperti :1. Pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa

biologis 2. Analisis ketidakmurnian (impurities) 3. Analisis senyawa tidak mudah menguap (non volatile) 4. Penentuan molekul-moleku netral, ionik, maupun zwitter ion 5. Isolasi dan pemurnian senyawa 6. Pemisahan senyawa-senyawa yg strukturnya hampir sama 7. Pemisahan senyawa-senyawa dlm jml sekelumit (trace elements) 8. Menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu

E. KELEBIHAN DAN KEKURANGAN KCKTBanyak analisa yang mengutamakan penggunaan KCKT dalam proses kerja

mereka, hal ini dikarenakan KCKT mempunyai beberapa kelebihan dibanding metode Kromatografi lainnya, diantaranya :

1. Cepat : Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat diselesaikari sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit (uncomplicated), waktu analisi kurang dari 5 menit bisa dicapai

2. Selektif : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana interaksi selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi dengan zat padat; pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa diam. Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan rasa diam dan rasa gerak pada KCKT memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang diinginkan.

3. Peka : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam- macam zat. Detektor-detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram (10-12 gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll dapat juga digunakan dalam KCKT.

4. Kolom dapat dipakai lagi : Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom KCKT dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang sama sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan.

5. Ideal untuk molekul besar dan ion : zat – zat yang tidak bisa dianalisis dengan KG karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk menganalisis psesies ionik. KCKT dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk mengalissis zat – zat tersebut.

6. Mudah memperoleh kembali sampel : Umumnya setektor yang digunakan dalam KCKT tidak menyebabkan destruktif (kerusakan) pada komponen sampel yang diperiksa, oleh karena itu komponen sampel tersebut dapat dengan mudah sikumpulkan setelah melewati detector. Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk kromatografi penukar ion memerlukan prosedur khusus.

Namun, terdapat pula beberapa kekurangan KCKT yang membuatnya tidak efisien untuk digunakan, yaitu :

1. Sulit untuk mengidentifikasi senyawa, kecuali jika HPLC dihubungkan dengan spektrometer massa

2. Jika sampel yang digunakan sangat kompleks, maka resolusi (pemisahan) yang baik sulit diperoleh

3. Mahal4. Sampel yang digunakan jumlahnya sedikit5. Perlu tenaga ahli untuk mengoperasikan

F. RESOLUSI

Merupakan tingkat pemisahan komponen dalam suatu campuran dengan metode kromatografi direfleksikan dalam kromatogram yang dihasilkan Untuk hasil pemisahan yang baik, puncak-puncak dalam kromatogram harus terpisah secara sempurna dari puncak lainnya dengan sedikit tumpang tindih (overlap) atau tidak tumpang tindih.

Resolusi adalah ukuran dari pemisahan efektif puncak analit yang berdekatan.Resolusi dua puncak dibantu oleh faktor termodinamika, yang menimbulkan partisi dan pemisahan (yaitu-K), dan itu adalah balas oleh kinetika, yang dapat menimbulkan dispersi tambahan puncaknya, membuat puncak yang dinyatakan baik jika dipisahkan antar dua puncaknya.

G. INSTRUMENT KCKTKomponen utama dalam KCKT adalah juga komponen dalam kromatografi

lainnya yaitu wadah/kemasan fase gerak, fase gerak, pompa KCKT, kolom, fase diam, detektor, dan perangkat komponen pendukung lainnya.

1. Wadah Fase Gerak

Wadah fase gerak dalam KCKT harus terbuat dari bahan yang bersih dan inert. Wadah ini dapat menampung sekurang-kurangnya 1-2 liter fase gerak, dan

terlebih dahulu harus dibebasgaskan. Kehadiran gas dalam wadah fase gerak ini akan menimbulkan gelembung gas pada pompa dan detektor yang akan sangat mengacaukan hasil analisis.

2. Fase Gerak

Fase gerak dalam KCKT harus berupa pelarut, buffer, ataupun reagen dengan tingkat kemurnian yang sangat tinggi, yaitu suatu cairan yang berderajat KCKT (HPLC grade). Adanya pengotor dalam fase gerak akan menyebabkan gangguan pada sistem kromatografi. Partikel-partikel kecil yang terdapat dalam fase gerak yang kurang murni dapat mengakibatkan kekosongan kolom KCKT.

Fase gerak atau dikenal juga dengan istilah eluen umumnya merupakan campuran pelarut yang berperan dalam daya elusi dan resolusi analisis. Daya elusi dan resolusi KCKT ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat-sifat komponen dalam sampel.

Secara umum ada 2 tipe fase gerak:a. Fase gerak/eluen isokratik, yaitu eluen dengan komposisi pelarut yang

tidak berubah selama percobaan kromatografib. Fase gerak/eluen gradien, yaitu fase gerak dengan komposisi pelarut

yang berubah selama masa kromatografi

Ada begitu banyak pilihan fase gerak yang dapat kita gunakan (pelarut/larutan) serta kemungkinan gradiennya akan menghasilkan kesempatan untuk mengoptimalkan pemisahan-pemisahan campuran kompleks dari segi resolusi maupun waktu. Secara normal elusi isokratik akan lebih mudah dikerjakan daripada elusi gradien.

Seringkali campuran pelarut merupakan fase gerak yang lebih baik daripada cairan murni, namun pekerjaan optimasi berbagai komposisi pelarut untuk fase gerak secara coba-coba tentu tidak mudah dilakukan.

Berdasarkan kepolaran fase gerak dibandingkan fase diamnya, fase gerak dibedakan menjadi:a. Fase normal, yaitu fase diam lebih polar dari fase gerak. Kemampuan elusinya

akan meningkat seiring peningkatan polaritas fase gerak.b. Fase terbalik, yaitu bila fase diam kurang polar dibanding fase geraknya.

Kemampuan elusi akan menurun seiring peningkatan kepolaran fase geraknya.c. Deret eluotrofik yang merupakan deretan nama-nama pelarut yang disusun

berdasarkan kepolarannya, akan sangat membantu kita dalam pemilihan fase gerak.

Dalam KCKT dengan fase terbalik, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran larutan buffer-metabol atau campuran air-asetonitril. Sedangkan dalam fase normal sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut terklorinasi atau menggunakan pelarut jenis-jenis alkohol.

3. PompaPompa KCKT harus terbuat dari bahan yag inert terhadap fase gerak.

Bahan pompa dapat terbuat dari: gelas, baja tahan karat, teflon maupun batu nilam.

Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan hingga 5000 psi dan mamp mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 3 ml/menit. Untuk keperluan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan hingga 20 ml/menit. Ada 2 tipe pompa:a. Pompa dengan tekanan konstanb. Pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Pompa tipe ini lebih umum

digunakan.

4. KolomAda 2 jenis kolom pada KCKT, yaitu kolom konvensional dan kolom

mikrobor. Untuk mengetahui perbedaan kolom konvensional dan kolom mikrobor klik disini.

Dalam beberapa hal kolom mikrobor lebih menguntungkan, diantaranya:a. Kolom mikrobor mengkonsumsi fase gerak hanya 80% dari konsumsi

kolom konvensional. Hal ini disebabkan karena kolom mikrobor mempunyai kecepatan alir yang lebih lambat (10-100 ul/menit)

b. Aliran fase gerak pada mikrobor yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal untuk digabungkan dengan spektrometer massa

c. Sensitivitas kolom mikrobor lebih tinggi karena pelarut yang lebih pekat, sehingga cocok digunakan dalam analisis sampel berskala kecil, seperti sampel klinis.

Perbedaan kolom konvensional dan mikrobor akan dijelaskan disini :I. Fase Diam

Kebanyakn fase diam berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tak dimodifikasi atau polimer-polimer stiren dan divinil benzena.

II. DetektorDetektor KCKT dikelompokkan menjadi dua golongan yaitu detektor yang

bersifat universal, yaitu detektor yang dapat mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif. Contoh detektor yang bersifat universal adalah detektor indeks bias dan spektrometri massa. Dan jenis detektor lainnya adalah detektor spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, fluoresensi dan elektrokimia.

Detektor yang ideal akan mempunyai karakteristik berikut:1. Mempunyai respon terhadap analit yang cepat dan reproduksible2. Mempunyai sensitivitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi analit pada kadar

yang sangat kecil3. Stabil dalam pengoperasiannya4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran

pita. Untuk kolom konvensional 8 ul atau lebih kecil dan 1 ul atau lebih kecil pada kolom mikrobar.

5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi analit pada kisaran yang luas

6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerakDetektor merupakan bagian integral dari peralatan analitik kromatografi cair

ini. Ada beberapa jenis detektor yang digunakan, dengan pemilihan yang umumnya didasarkan pada persyaratan sensitivitas, jenis senyawa yang ada dalam sampel, dan faktor-faktor lain seperti biaya. Detektor yang paling umum didasarkan pada indeks bias dari eluat kolom, karena hampir semua zat terlarut akan menghasilkan larutan dengan indeks bias yang berbeda dengan indeks bias pelarut murni. Detektor ini mampu menginderai perbedaan tersebut dan menghasilkan sinyal-sinyal listrik yang proporsional yang kemudian diperkuat dan direkam untuk menghasilkan kromatogram. Batasan utamanya adalah sensitivitas; batasan pendeteksian akan bervariasi sesuai dengan keadaan, yang umumnya sekitar satu mikrogram zat terlarut.

a. Detektor SpektrofotometriDeteksi spektrofotometri umumnya hanya dalam daerah ultraviolet. Idealnya,

spektrofometri yang nyata dengan pemilihan panjang gelombang yang sempurna akan memberikan fleksibilitas yang maksimal untuk mendeteksi berbagai macam zat terlarut dengan sensitivitas yang sangat baik.

b. Detektor fluorometriMerupakan detektor yang didasarkan atas fluoresens.

c. Detektor elektrokimiaLazimnya, larutan efluen dari dalam kolom memasuki sebuah sel dimana

larutan tersebut mengalir diatas permukaan sebuah elektroda yang diberi potensial pada satu harga, dimana komponen-komponen sampel mengalami reaksi transfer elektron.

5. Perangkat Pendukung LainnyaPerangkat pendukung lain yang digunakan dalam KCKT dapat berupa

komputer, integrator dan rekorder.

H. JENIS-JENIS KCKTDilihat dari jenis fase diam dan fase gerak, KCKT (kolomnya) dibedakan

menjadi:a. Kromatografi fase normal.

Kromatografi dengan kolom konvensional dimana Fase diam : normal (bersifat polar), misalnya Silika gel Fase gerak : bersifat non polar

b. Kromatografi fase terbalikFase diam : sifatnya non polar, misalnya Silika gel direaksikan dengan klorosilanFase gerak : bersifat polarKeuntungan kromatografi fase terbalik :

- Senyawa yang polar akan lebih baik pemisahannya- Senyawa ionic dapat dipisahkan - Air dapat digunakan sebagi pelarut

DAFTAR PUSTAKA

Shafaati and B.J.Clark.J Pharm. Biomed. 1996 Anal.14,1547-1554

Christian G.D., 2003, Analytical Chemistry, Sixth, John Wiley & Sons Inc,New York

Mulja.Muhammad, Suharman,1995, Analisis Instrumental, Airlangga University Press, Surabaya

Sastrohamidjojo,Harjono, 2005, Kromatografi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta

Skoog,DA,Holler,FJ,and West DM,1994, Analytical Chemistry, Six Edition,Hardcourt Grace College,Florida

Underwood,A.L, 1996, Analisis Kimia Kuantitatif, 554, Penerbit Erlangga, Jakarta

Watson, D.G.,1999,Pharmaceutical Analysis, Churchill Livingstone,Edinburg