Penentuan Aktivitas Enzim α-Amilase

LAPORAN PRAKTIKUM

Oleh :

Kelompok 4

1. Fitria Retno Sari (131510501063)

2. Yuni Y. (131510501080)

3. Eri Pratiwi . (131510501070)

4. Pitri Lailatul Q. (131510501088)

5. Erviana Dwi C. (131510501103)

6. Angga Wibowo. (131510501160)

7. Miftauhul Imron . (131510501091)

8. M Rizqy Maulana (131510501078)

10.Moch Rosy W (131510501066)

11.Mu’amal Fanani (131510501054)

PROGRAM STUDI AGROTEKNOLOGI

LABORATORIUM FISIOLOGI TUMBUHAN

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS JEMBER

2014

BAB 1. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Negara Indonesia merupakan satu-satunya negara di

dunia yang memiliki tingkat keanekaragaman tanaman yang

sangat tinggi, mulai dari berbagai jenis tanaman pangan

hingga tanaman penggangu atau gulma. Keanekaragam

tanaman di Indonesia ini disebabkan karena Indonesia

merupakan satu-satunya negara mega biodersity di

permukaan bumi ini. Namun meski demikian,

keanekaragaman tanaman di Indonesia akan berkurang jika

penduduknya kurang memahami atau tidak bijaksana dalam

membudidayakan tanaman.

Dalam membudidayakan suatu tanaman, seorang harus

menguasai atau setidaknya mengerti tentang anatomi dan

morfologi tanaman. Hal ini bertujuan untuk mendukung

proses-proses penting yang berlangsung di dalam tubuh

tanaman. Dengan mengetahui struktur dari sebuah tanaman

maka dapat pula diketahui proses metabolisme dari

tanaman yang sedang atau hendak dibudidayakan.

Setiap tanaman pasti melakukan proses metabolisme

seperti proses fotosintesis, proses respirasi, proses

transpirasi dan proses-proses lainnya dalam menunjang

tumbuh dan kembangnya. Selain proses-proses tersebut

tanamanjuga merupakan tempat melakukan interkonversi

gula dan pati yang terjadi pada organ daun. Senyawa-

senyawa seperti senyawa glukosa merupakan hasil dari

proses fotosintesis. Akan tetapi, pati pada tanaman

tidak terbentuk dari hasil proses fotosintesis,

melainkan reaksi-reaksi tersebut terbentuk akibat

adanya aktivitas enzim-enzim yang terdapat dalam daun.

Enzim dapat diartikan sebagai suatu molekul protein

yang dimanfaatkan sebagai katalisator yang ada di dalam

tubuh makhluk hidup, enzim tersebut merupakan senyawa

yang digunakan untuk membantu mempercepat proses

reaksi kimia pada bahan tertentu tanpa ikut bereaksi.

Oleh karena itu, pada semua proses fisiologis sel pada

tanaman selalu memerlukan enzim yang bertujuan untuk

mempercepat proses-proses metabolisme yang ada di dalam

tubuh tanaman.

Reaksi enzimatis pada jaringan tumbuhan utamanya

dipengaruhi oleh beberapa faktor. Faktor-faktor

tersebut diantaranya adalah temperatur, suhu, substrat,

konsentrasi enzim, inhibitor dan aktivator. Apabila

semua faktor pendukung enxim dalam kondisi optimal maka

reaksi enzim yang terjadi juga akan optimal. Enzim yang

merupakan katalisator memiliki sifat-sifat sebagai

berikut, sebagai katalisator pada umumnya enzim akan

ikut bereaksi, tetapi setelah reaksi selesai maka enzim

akan kembali pada bentuk semula, dengan begitu enzim

dapat digunakan kembali pada reaksi lainnya.

Salah satu enzim yang ada dalam tanaman adalah

enzim amilase. Enzim amilase ini umumnya diketahui

berfungsi mengubah pati menjadi glukosa. Enzim ini

tidak hanya pada tanaman saja, namun makhluk hidup lain

yaitu manusia dan hewan yang juga mempunyai enzim

amilase di dalam sistem tubuhnya. Pada saat ini enzim

banyak digunakan untuk skala industri karena enzim

amilase dapat diaplikasikan secara luas dalam berbagai

bidang bioteknologi.

1.2 Tujuan

1. Untuk mengetahui aktivitas enzim α-Amilase

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA

Negara indonesia merupakan satu-satunya negara di

dunia yang memiliki tingkat keanekaragaman tanaman yang

sangat tinggi, mulai dari berbagai jenis tanaman pangan

hingga tanaman penggangu atau gulma. Banyaknya

tananaman pangan tersebut maka potensi untuk

mengembangkan bahan industri yang dapat menghasilkan

enzim α-amilase. Enzim α-amilase in banyak dihasilkan

dari tanaman-tanaman yang memiliki sari pati. Contoh

tanaman yang memiliki kandungan pati tinggi dalam biji

atau buahnya diantaranya adalah tanaman jagung, tanaman

sagu, tanaman sorgum dan tanaman singkong (Trismilah

dan Budiasih, 2009).

Menurut Kotting (2010), senyawa pati yang sering

ditemukan di bagian tanaman-tanaman tertentu merupakan

salah satu dari senyawa karbohidrat yang banyak

tersimpan di dalam tanaman. Zat utama yang merupakan

penyusun senyawa pati adalah polimer glukosa amilosa

dan amilopektin. Kedua zat tersebut berada di dalam

tubuh tanaman dan disimpan untuk digunakan kembali pada

saat bahan untuk melakukan proses fotosintesis telah

habis. Pada tanaman tingkat tinggi senyawa pati

berfungsi sebagai kontrol kerja enzim α-amilase dan

enzim β-amilase. Syafi’i (2009), menambahkan bahwa

kadar pati yang terdapat di dalam tanaman dapat

mengalami penurunan. Penurunan tersebut diakibatkan

oleh proses pemanasan yang sangat lama. Proses

pemanasan yang terlalu lama menyebabkan pati terpecah

menjadi gula secara sederhana seperti glukosa dan

maltosa. Pemecahan pati tersebut dilakukan oleh enzim

α-amilase dan enzim β-amilase. Aktifitas enzim α-

amilase dan enzim β-amilase sangat tinggi ketika proses

pemanasan berlangsung sehingga senyawa pati pun

terpecah menjadi monosakarida.

Menurut Sloane (1994), enzim merupakan suatu

katalis dari organik yang masuk ke dalam protein

globular. Enzim umumnya mampu menurunkan energi

aktivasi yang terjadi di dalam sel. Hal inilah yang

menyebabkan reaksi pada sel hidup dapat berlangsung

pada kondisi normal. Kebanyakan enzim hanya bekerja

untuk satu substrat saja, hal ini menjadi suatu bukti

bahwa setiap enzim mampu membedakan substratnya sendiri

dengan substrat lain yang berkaitan erat. Sedangkan

menurut Sumardjo (2009), enzim adalah suatu kelompok

protein yang menjalankan dan mengatur perubahan kimia

dalam sistem biologi pada makhluk hidup. Enzim banyak

dihasilkan dari tanaman atupun hewan, dimana enzim ini

melangsungkan berbagai reaksi kimia seperi hidrolisis,

reduksi, oksidasi, pemutusan rantai karbon, dan masih

banyak yang lainnya. Enzim dapat mengalami kerusakan

seperti halnya protein. Hal itu bisa terjadi jika

adanya pemanasan, gelombang ultrasonil, radiasi UV

atupun pengaruh penambahan asam maupun basa tertentu.

Enzim yang mengalami kerusakan atau denaturasi lama

kelamaan akan menjadi tidak produktif alias tidak dapat

bekerja dengan baik.

Enzim yang banyak ditemukan pada senyawa pati

adalah enzim α-amilase. Enzim α-amilase mampu

menghidrolisis pati dan glikogen melalui pemotongan

internal ikatan α-1,4-glikosida secara acak, dan

kemudian akan menghasilkan oligosakarida seperti

maltosa dan glukosa. (Lestari dkk., 2011). Hidrolisis

enzimatis dapat dilakukan dalam pembuatan sirup

glukosa, dapat dilakukan dengan menggunakan dua tahap

yaitu likuifikasi pada tahap pertama dan sekarifikasi

pada tahap kedua. Likuifikasi yaitu enzim α-amilase (EC

3.2.1.1) yang digunakan untuk memecah molekul pati dari

sisi bagian dalam rantai pati pada ikatan (1,4)-α-glikosida menjadi molekul BM yang lebih kecil dan

meliputi maltosa, glukosa, oligosakarida, dan deskrin.

Konsentrasi enzim akan mempengaruhi jumlah substrat

yang berhubungan dengan enzim. Lama sakarifikasi akan

mempengaruhi lama dan singkatnya hubungan yang terjadi

antara substrat dan enzim (Yunianta dkk., 2010).

Garcia (2013), menambahkan suatu pernyataan

berdasarkan penelitiannya bahwa aktivitas enzim yang

melibatkan sukrolisis dan amilolisis dapat digunakan

untuk membuktikan adanya jalur metabolik potensial.

Pada penelitian tersebut, ditemukan karbohidrat yang

didalamnya terdapat kandungan sukrosa, glukosa,

fruktosa serta pati. Menurut Askurrahman (2010), salah

satu faktor yang mempengaruhi kecepatan dan metabolik

enzim adalah suhu. Peningkatan suhu dapat meningkatkan

afinitas enzim terhadap katalisator dan aktivator. Hal

itu menyebabkan reaksi akan berlangsung cepat. Selain

itu, peningkatan suhu juga dapat menambah energi

kinetik dari enzim maupun substrat yang lama kelamaan

akan menyebabkan enzim dan substrat bergerak dengan

cepat dan akhirnya akan saling bertabrakan. Besarnya

frekuensi tabrakan antar enzim dan substrat akan

memperbesar terbentuknya produk. Das (2011),

menambahkan bahwa enzim amilase merupakan salah satu

dari sekian banyak enzim yang digunakan dalam bidang

industri karena dalam sistem sel, amilase berperan

penting dalam biokonversi pati dan substrat berbasis

pati, sehingga enzim amilase disini sangat berpengaruh

terhadap proses hidrolisis dalam dalam pengolahan pati

skala industri.

BAB 3. METODOLOGI PRAKTIKUM

3.1 Waktu dan Tempat

Pratikum Fisiologi Tumbuhan dilaksanakan pada Kamis

tanggal 22 Oktober 2014 dari pukul 15.15 sampai selesai

di laboratorium Fisiologi Tumbuhan, Fakultas Pertanian,

Universitas Jember.

3.2 Bahan dan Alat

3.2.1 Bahan

1. Benih kecambah

2. Buffer phosphat 0,1 M dengan pH 7,55

3. Starch soluble 1 %

4. Larutan DNS

5. Enzim CE, enzim α-amilase

3.2.2 Alat

1. Tabung reaksi dan rak

2. Oven

3. Spektrofotometer

4. Mikropipet

3.3 Cara Kerja

1. Mengambil 100 µl soluble starch 1% masukkan dalam

tabung reaksi.

2. Menambahkan KPI pH 7,55 sebanyak 390 µl

3. Menambahkan 10 µl Enzim CE

4. Menginkubasi pada suhu 35-40˚C selama 30 menit

5. Menambahkan DNS sebanyak 500 µl

6. Mendidihkan selama 5 menit

7. Mendinginkan

8. Mengukur absorbansinya pada panjang gelombang 575

nm.

BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

Tabel 4.1.1 Hasil Pengukuran Absorbansi Enzim Amilase

Jenis

Enzim

Kelompok 1 Kelompok 2 Kelompok

3

Kelompok

4CE 2,6815 3,000 2,9245 2,8735E 1,388 1,4925 1,2415 1,613

4.2 Pembahasan

Kinetika enzim (Km) merupakan suatu studi reaksi

kimia yang dikatalisis oleh enzim. Pada kinetika enzim

laju reaksi diukur dan dampak dari berbagai kondisi

reaksinya. Kinetika enzim juga mempengaruhi bidang

biokimia yang terkait dengan pengukuran kuantitatif

dari kecepatan reaksi yang dikatalisis enzim dan

pemeriksaan sistematik faktor-faktor yang dapat

mempengaruhi kecepatan enzim.

Dalam penelitiannya Putra (2009), menyatakan bahwa

penentuan kinetika enzim diukur berdasarkan plot grafik

hubungan antara konsentrasi Substrat (S) dengan

kecepatan aktivitas enzim (V), sehingga tingkat reaksi

enzim dapat diketahui dengan menggunakan rumus Vmaks dan

Kmaks. Dalam analisis Michaelis-Menten, Kmaks dikenal

dengan Km yang hingga saat ini digunakan sebagai salah

satu parameter dalam kinetika enzim. Km tersebut

merupakan konsentrasi substrat yang sudah terisi

setengahnya ketika kecepatan enzim telah mencapai Vmaks.

Pada

tabel berikut dapat kita tentukan seberapa besar nilai

kinetika enzim (Km) nya.

S(Konsentrasi)

Vo(Kecepatan)

3

5

10

30

50

10,4

14,5

22,533,840,5

Tabel 4.2.1 Contoh Aktivitas Enzim Amilase

Tabel si atas merupakan satu dari sekian banyak

contoh soal untuk mengetahui nilai dari kinetika enzim

melalui konsentrasi substrat (S) dan kecepatan enzim

(V). Analisis tabel diatas menggunakan analisis

Michaelis-menten dan tabel akan dirubah dan

dikonversikan ke dalam tabel dan grafik 4.2.2 yang

menerangkan tentang hubungan regresi dan korelasi antar

konsentrasi (S) denagan kecepatan (V).

S

(konsentras

i)

V

(kecepatan)

1/[S] 1/V

3 10,4 0.3333 0.09615 14,5 0.2000 0.068910 22,5 0.1000 0.044430 33,8 0.0333 0.029650 40,5 0.0200 0.0247

Tabel 4.2.2 Analisis Data Menggunakan Analisis

Michaelis-Menten

Grafik 4.2.1. Hubungan Antara 1/[S] dan 1/V.

Penentuan nilai Vmaks dan Km didasarkan atas

persamaan garis regresi grafik hubungan antara 1/[S]

0.02

0.0333 0.

10.2

0.333300000000001

0

0.1

1/[S]

1/V

dan 1/V (Tabel 4.2.2), seperti ditunjukkan pada grafik

4.2.2 melalui analisis Michaelis-Menten. Berdasarkan

pada grafik 4.2.2. dapat diketahui bahwa garis regresi

1/[S] dan 1/V adalah Y= a (0.0215) + b (0.23)x maka

diperoleh 1/Vmaks = 0,0215, dan nilai Vmaks = 46,51.

Sedangkan nilai Km/Vmaks = 0.23 sehingga nilai Km=10,69.

Tinggi rendahnya hasil kinetika enzim dipengaruhi oleh

kadar substrat, kadar enzim, pH, suhu, kovaktor,

vitamin dan inhibitor.

Menurut Page (1981), kinetika enzim merupakan

pengukuran dari suatu laju reaksi enzim dan dampak dari

berbagi kondisi reaksi enzimatis. Dengan mempelajari

kinetika enzim ini dapat mengetahui mekanisme katalitik

enzim, peran enzim dalam metabolisme, skema aktivitas

enzim dikendalikan dan skema suatu bahan dapat

menghambat kerja enzim. Manfaat kinetika enzim adalah

untuk mengetahui dan memahami fungsi katalitik dari

suatu proses biologis. Manfaat lain yang tidak kalah

penting adalah untuk memahami suatu fenomena biologi

seperti pengaruh faktor lingkungan seperti cahaya,

suhu, kelembaban dan sebagainya terhadap kinerja enzim.

Selain itu, kinetika enzim juga digunakan sebagai

prosedur pemurnian enzim.

Enzim amilase adalah enzim yang mengkatalisis

pemecahan pati menjadi gula. Enzim amilase terbagi

menjadi 3 macam yaitu α-amilase, β-amilase, γ-amilase.

Enzim α-amilase mampu menghidrolisis pati dan glikogen

melalui pemotongan internal ikatan α-1,4-glikosida

secara acak, menghasilkan oligosakarida seperti maltosa

dan glukosa. Dalam kehidupan manusia, enzim α-amilase

digunakan dalam dunia industri pangan, tekstil,

fermentasi, obat-obatan, kertas dan gula yang

dimanfaatkan guna pengkatan produksi dan efisiensi

setiap proses produksi (Lestari dkk., 2011).

Menurut Herawati (2010), senyawa pati merupakan

sumber dari enzim amilase. Kandungan pati yang banyak

terdapat pada pada biji-bijian, umbi-umbian, sayuran

dan buah-buahan. Tanaman yang mengandung pati otomatis

juga mengandung enzim amilase. Contoh tanaman yang

mengandung enzim amilase antara lain adalah jagung,

kentang, labu, pisang, ubi jalar, gandum, barley,

beras, sagu, sorgum, ubi kayu, dan ganyong.

Enzim merupakan senyawa protein yang merupakan

biokatalisator reaksi kimia pada sistem biologi, dimana

enzim ini dapat mengkatalis (mempercepat) reaksi kimia

di dalam sel maupun jaringan-jaringan makhluk hidup.

Berbagai macam jenis enzim memiliki karakteristik yang

berbeda-beda. Kecepatan kerja masing-masing enzim pun

otomatis juga berbeda, Kecepatan kerja enzim dalam

reaksi kimia inilah diukur dengan kinetika enzim.

Jenis enzim ada dua, yaitu enzim buatan (Crude

Enzim) dan enzim asli. Crude enzim atau CE adalah

campuran antara protein enzim dan protein non enzim

yang membutuhkan proses pemurnian. Salah satu contoh

crude enzim adalah Riboflafin deoksiribosa protein. Enzim ini

dapat dilakukan pemurnian dengan memakai larutan

amonium sulfat, hal ini digunakan untuk memisahkan

enzim asparaginase dengan protein lainnya. Enzim asli

atau murni merupakan enzim yang yang berasal dari

protein enzim asli tanpa ada campuran dari bahan atau

larutan kimia lainnya. Enzim murni juga tidak

memerlukan pemurnian terlebih dahulu jika hendak

dimanfaatkan untuk berbagai jenis kebutuhan seperti

untuk pembuatan ragi, keju dan bahan lainnya yang

memerlukan katalisis dari suatu enzim.

Gambar 4.2.2 Hasil Pengukuran Absorbansi

Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan, data

yang di dapat untuk nilai enzim pada masing-masing

I II III IV0

0.51

1.52

2.53

3.5 Hasil pengukuran absorbansi enzim amilase

CEE

Jumlah percobaan

Absorbansi pada λ 575 nm

kelompok terlihat berbeda-beda. Gabungan data golongan

dapat dilihat dari gambar 4.2.1. Pada kelompok 1 nilai

untuk enzim yang buatan CE sebesar 2,6815 dan untuk

nilai enzim murni E sebesar 1,388. Hasil dari kelompok

2 menunjukkan nilai untuk enzim yang buatan CE sebesar

3,000 dan untuk nilai enzim murni E sebesar 1,4925.

Berbeda halnya dengan kelompok 3 nilai untuk enzim yang

buatan CE sebesar 2,9245 dan untuk nilai enzim murni E

sebesar 1,2415 dan sedangkan hasil dari kelompok 4

nilai untuk enzim yang buatan CE sebesar 2,8735 dan

untuk nilai enzim murni E sebesar 1,613.

Dari masing-masing data kelompok diketahui bahwa

nilai terbesar untuk enzim buatan terdapat pada

kelompok 2 sebesar 3,000, sedangkan nilai terkecil

untuk enzim buatan terdapat pada kelompok 1 yaitu

2,6815. Untuk nilai enzim murni tertinggi terdapat pada

kelompok 4 dengan nilai sebesar 1,613, sedangkan untuk

nilai enzim murni terendah terdapat pada kelompok 3

yaitu senilai 1,2415. Dari data tersebut juga dapat

diketahui bahwa nilai enzim CE lebih besar dibandingkan

jika dibandingkan dengan nilai enzim E. Besar kecilnya

nilai absorbansi diukur menggunakan spektrofotometer

dan bisa juga dilihat dari kepekatan larutan yang

dihasilkan. Faktor-Faktor yang mempengaruhi absorbansi

enzim antara lain pH, enzim, kandungan substrat dan

kandungan dari enzim itu sendiri.

BAB 5. KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

1. Enzim merupakan senyawa protein yang mengkatalisis

(mempercepat) reaksi rekasi kimia

2. Enzim amilase adalah endoenzim ekstraseluler yang

secara acak menghidrolisis molekul pati untuk

menghasilkan produk berupa dekstrin dan polimer

progresif yang lebih kecil yang tediri dari unit

glukosa.

3. kinetika enzim merupakan pengukuran dari suatu

laju reaksi enzim dan dampak dari berbagi kondisi

reaksi enzimatis.

4. Tinggi rendahnya hasil kinetika enzim dipengaruhi

oleh kadar substrat, kadar enzim, pH, suhu,

kovaktor, vitamin dan inhibitor.

5. Pengukuran akivitas enzim α-amilase dengan

spektrofotometer didapatkan hasil absorbansi yang

berbeda-beda.

6. Jenis enzim ada dua, yaitu enzim buatan (Crude

Enzim) dan enzim asli.

5.2 Saran

Sebaiknya pada proses perlakuan enzim dilakukan

dengan hati-hati untuk, perlu adanya koordinasi

terlebih dahulu jika ada pergantia asisten sementara

agar praktika dapat menyesuaikan diri dengan baik.

DAFTAR PUSTAKA

Askurrahman. 2010. Isolasi dan Karakterisasi LinamaraseHasil Isolasi dari Umbi Singkong (Manihot esculentaCrantz). Agrointek, 4(2) : 138-145

Das, S. 2011. Biotechnological Applications ofIndustrially Important Amylase Enzyme. Pharma and BioSciences, 2(1) : 486-496

Garcia, C.C., M. Guarnieri, dan E. Paccini. 2013.Inter-Conversion of Carbohydrate Reserves fromPollen Maturation to Rehydration in A Chili Pepper.American Journal of Plant Sciences, 4 : 1181-1186

Kotting, O., J. Kossmann, S,C. Zeeman, dan J.R. Llolyd.2010. Regulation of Starch Metabolism : The age ofenlightenment. Current opinion in Plant Biology, 13 : 1321-1329

Lestari P., N. Richana., A. Darwis, K. Syamsu dan U.Murdiyatmo. 2011. Purifikasi dan Karakterisasi α-Amilase Termostabil dari Bacillus stearothermophilus TII-12. AgroBiogen, 7(1) : 56-62.

Page D. 1981. Prinsip-Prinsip Biokimia. TerjemahanSoendoro, 1989. Jakarta : Erlangga.

Putra, G.P.G. 2009. Penentuan Kinetika Enzim

Poligalakturonase (Pg) Endogenous dari Pulp BijiKakao. Biologi, 13(1) : 21-24

Sloane, E. 1994. Anatomi dan Fisologi Untuk Pemula. Terjemahanoleh Palupi Widyastuti, 1995. Jakarta : EGC

Sumardjo, D. 2009. Pengantar Kimia. Jakarta : EGC

Syafi’i, I., Harjono, dan E. Martati. 2009.Detoksifikasi Umbi Gadung (Dioscorea hispida Denst)dengan Pemanasan dan Pengasaman Pada PembuatanTepung. Teknologi Pertanian, 10(1) : 62-68

Trismilah, Dan B. Wahyuntari. 2009. PemanfaatanBerbagai Jenis Pati Sebagai Sumber Karbon untukProduksi α-Amilase Ekstraseluler Bacillus sp SW2. Sainsdan Teknologi Indonesia, 11(3) : 169-174

Yunianta, T. Sulistyo, Apriliastuti, T. Estiasih, danS. N. Wulan. 2010. Hidrolisis Secara Sinergis PatiGarut (Marantha arundinaceace L.) oleh Enzim α-Amilase, Glukoamilase, dan Pullulanase untukProduksi Sirup Glukosa. Teknologi Pertanian, 11(2):78-86.

DOKUMENTASI

Ganbar 1. Proses pemipetanstarch dengan alat mikro

pipetet

Gambar 2. Proses pemanasantabung reaksi yang

terdapat enzim α-amilasedidalamnya

Gambar 3. Prosespendinginan

Gambar 4. Proses inkubasididalam oven

Gambar 5. Pengukurandengan spektrofotometer

Gambar 6. Hasil yangtertera pada

spektrofotometer