10
The Occurrence of Mycoplasmas in the Lungs of Swine in Gran Canaria (Spain) P. Assunc°a¬ o 1 *, C. De la Fe 1 , B. Kokotovic 2 , O. Gonza¨lez 3 , and J.B. Poveda 1 1 Unidad de Epidemiolog|¨a y Medicina Preventiva, Facultad de Veterinaria, Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, Trasmontan¬ a s/n. 35416, Arucas, Spain; 2 Department of Veterinary Diagnostics and Research, Danish Institute for Food and Veterinary Research, DK-1790 Copenhagen V, Denmark; 3 Departamento de I+D Laboratorios Syva, Le¨ on, Spain *Correspondence: E-mail: [email protected] Assunc°a¬o, P., De la Fe, C., Kokotovic, B., Gonza¨lez, O. and Poveda, J.B., 2005. The occurrence of mycoplasmas in the lungs of swine in Gran Canaria (Spain). Veterinary Research Communications, 29(6), 453^462 ABSTRACT The study was conducted to investigate the mycoplasmal £ora in the lungs of pigs with enzootic pneumonia at Gran Canaria (Spain). From 54 pneumonic lungs collected at an abattoir, 85 isolates were cultivated. On the basis of cultural and biochemical characteristics, the isolates were preliminarily identi¢ed as Mycoplasma species. Using di¡erent species-speci¢c PCRs, 40, 27, 11 and 7 of the isolates were identi¢ed as M. hyorhinis, M. hyopneumoniae, M. hyosynoviae and M. £occulare, respectively. Nine of the M. hyopneumoniae cultures were found to be in mixed culture with M. £occulare as demonstrated by PCR. By use of a M. £occulare antiserum it was possible to eliminate M. £occulare from M. hyopneumoniae mixed cultures. This study is the ¢rst report on isolation of porcine mycoplasmas at Gran Canaria (Spain). Keywords: PCR, isolation, mycoplasma, diagnostic, porcine enzootic pneumonia Abbreviations: dNTP, deoxynucleoside triphosphatase; EP, enzootic pneumonia; NCTC, National Collection of Type Cultures; PCR, polymerase chain reaction; PRDC, porcine respiratory disease complex INTRODUCTION Enzootic pneumonia (EP) is a chronic respiratory disease that causes considerable economic losses to the pig industry worldwide (Kobisch and Friis, 1996). EP has been described as a multifactorial disease the consequences of which are greatly in£uenced by environmental and management factors (Done, 1991). Owing to the description of a new respiratory syndrome in which several infectious agents are involved, the tendency now is to speak more of a porcine respiratory disease complex (PRDC), in which Mycoplasma hyopneumoniae is one of the most important pathogens involved. (Calsamiglia et al ., 2000; Thacker, 2001) Conventional laboratory diagnosis of M. hyopneumoniae is based on cultivation of the organism in arti¢cial media and serological identi¢cation of the isolates. However, Veterinary Research Communications, 29 (2005) 453^462 # 2005 Springer. Printed in the Netherlands 453

The Occurrence of Mycoplasmas in the Lungs of Swine in Gran Canaria (Spain)

  • Upload
    ulpgc

  • View
    1

  • Download
    0

Embed Size (px)

Citation preview

��� ���������� ��� ������ �� ��� ����� ����� ������ ������� �� ����

�� ������� �� � �� �� � ���� �� ����������� �� ����� ����� � !��� ���� �������� �� �������� �� � � �������� ����������� �������� �� ������������ ������������� ��� ����� �� ���� �������� ��������� � �!�" #$%�&� '������ (���) *+������� �,���������� +�� ������� ��� -������.� +����. /�������� ,�� ���� ��� ���������� -������.�+01�234 ����.� �� �� +����5) #+��������� �� /6+ ��7��������� (���� ��� ���(���8�������������9 �1���9 ��������:7�������"�� �"��

������� �� ��� �� � ��� ��� ���������� ��� ����� ���� �� � ���� � !���� �""#� $%� ����&&���� �'()��*��(� �� �%� ���+� �' �,��� �� �&� ��&� -.*��/� ���������� -������. ������������� ������0#�102�

��.$3��$

$%� ��� ) ,� ��� ���� �� �������+�� �%� ()��*��(� 4�& �� �%� ���+� �' *�+� ,��% ��������*���(��� � �&� ��&� -.*��/� �&�( #0 *���(���� ���+� �������� � � 5����&� 6# �������,�&� �������� � �� �%� 5��� �' �����&� � 5���%�(��� �%&���&������� �%� ������� ,�&� *&���(��&��)� ����7� ��������� �*������ 8���+ �9�&��� �*�����:�*���7� ��3�� 0"� �;� �� � ; �' �%� �������,�&� � ����7� ��" .���.������" .������������" .���������� � �" ;��������� &��*�������)� <����' �%��" .���������� �����&�� ,�&� '��� �� 5� �� (�=� �����&� ,��%�" ;�������� � �(����&�� 5) ��3� �) ��� �' �" ;�������� �����&�( �� ,� *����5�� �� ���(���� �" ;�������� '&�( �".���������� (�=� �����&��� $%�� ��� ) �� �%� 7&�� &�*�&� �� �������� �' *�&���� ()��*��(� ��&� ��&� -.*��/�

0��<����9 ��3� ��������� ()��*��(� �+������� *�&���� �������� *���(���

'77����������9 <$�� ��=)�������� � �&�*%��*%���> ?�� �������� *���(���> <�$�� <��������������� �' $)*� �����&��> ��3� *��)(�&�� �%�� &������> �3��� *�&���� &��*�&��&) �������(*��=

@<$3��8�$@�<

?������� *���(��� -?�/ �� �%&���� &��*�&��&) ����� �%� ����� ����� �&5�������(�� ������ �� �%� *�+ �� ���&) ,�&� ,� � -��5���% � �&���� �AA2/� ?� %� 5��� ���&�5� � (����'���&�� ����� �%� �����B������ �' ,%��% &� +&���) ��4����� 5) ����&��(���� � (�+�(��� '���&� -����� �AA�/� �,��+ �� �%� ���&�*���� �' ��, &��*�&��&) �)� &�(� �� ,%��% ����&� ��'������� +���� &� ������� � �%� ��� ���)��, �� �� �*�� (�&� �' *�&���� &��*�&��&) ����� ��(*��= -�3��/� �� ,%��%�������� .���������� �� ��� �' �%� (��� �(*�&��� *�%�+��� ������� �-���(�+�� �� ���� �"""> $%���&� �""�/����������� �5�&��&) �+����� �' �" .���������� �� 5�� �� ���������� �'

�%� �&+���( �� &��7��� (� � � ��&���+��� � ����7����� �' �%� �������� C�,���&�

���������� -������. ������������� �A -�""#/ 0#�102�� �""# .*&��+�&� �&���� �� �%� <��%�&�� �

0#�

�%� *&�(&) �������� �' �" .���������� �� �� ���� � ��(�:�����(��+� (���)5����� �' �%� '��� ���� ���&� �' �%� �&+���(� � () 5� ��(*����� '�&�%�& 5)�%� *&������ �' �������� .���.���� � �������� ;�������� �� �%� �������+�� �(*��� -��5���%� �"""/� �" .���.���� �� ������� ,��% �9�&��� ���& �&�� ����� ��+*���(���� *��)��&������ � &�%&���� -�&��� � ������&� �AA0/� 5�� �� ���'&�B�����) 5� '��� �� �%� &��*�&��&) �&�� �' %���%) *�+���" ;�������� �� 5� '��� �� ��� ������� � ��&(� � *���(���� ���+� �' *�+�� � %� �� **&���*�%�+���� �*5������� -�&���� �A;0> .�&���& �� ���� �AA�/� @� ����� �� �%���()��*��(���" .����������� ,%��% �� �%� *&�(&) +��� �' ���:*�&����� &�%&���� ��+&�,��+ *�+� -3��� � ������ �A;"/� �� ���������) 5� '��� �� �%� ��,�&&��*�&��&) �&�� � ����� &) ��� �& �' *&�:�=�����+ *���(���� ������� -�&�����A;�/�D��% �%� ���� �' ��3 ���%����+)� ��, **&��%�� �� �+����� �' *�&����

()��*��(� %�� �(�&+� � @� �%� *�� '�, )�&�� ����&� ���:���* �& ����� ��3*&������� %�� 5��� ���&�5� '�& &*� � �*���7� � ����7����� �' �" .������1���� -E������ �� ���� �AA#> ��(�����& �� ���� �AA6> ���(�+�� �� ���� �AAA> F�& �� ������ �"""> ��&�% �� ���� �""�/ � ,��� ��" .���.������" ;�������� -.��(�� �� ���� �AA0>�&�� �� ���� �"""/ � �" .���������� -�%&��� �� ���� �AA2/�$%� �( �' �%�� ��� ) ,� �� ������ � �� � ����') ()��*��(� '&�( ���+� �' *�+�

,��% ?� � �%�&�5) �%� ��+%� �� ����&&���� �' *�&���� ()��*��(� �� �&���&� -.*��/�

E�$?3@�G �<�E?$C��.

(���� ��� ������� ���������

� ���� �' #0 ���+� �%� �%�,� ������� ���������� ,��% ?� ,�&� �������� '&�( #0 *�+���"1�0 ,���� �� � 5���+ ���+%��&� � �&� ��&� 5����& �� �%� *�&�� '&�(!��&) �� ��+��� �""�� $%� ��(�� ,�&� �&��� '&�( � ���� �" �9�&��� %�& ���&�( ��% �' �%� ���+�� ����&� �(*��� ,�&� ���� ,��% ���&��� �,5�> �%� ��(5�& �'�(*��� ���� ,� &���� �� �%� �=������� �' �%� ?� �������� $%� ���� ��(5�& �'�(*��� *&������ ,� �0�� � �����&� (� ��( ,� *&�*&� ���& ��+ �� �&��� -�A;#/,��% �%� (� �7������ �%� �%� (� ��( ������� �=��������) %�&�� ��&�( -�"H/ � (*������� -"�# (+I(�/ ,� ��� ����� �' *���������� $%� �����&��+ *&��� �&� ,� �'����,�� .(*��� ,�&� �������� �� ��B�� (� ��( � ����5�� � �;�� �� &����&) �%��& � �� &*( '�& �0 %� $%� �����&�� ,�&� �%�� 7���&� �%&��+% "�0# �(7���&� -���� ��� �&5�&� E@� 8.�/ � ����5�� '�&�%�& ����� *C �%�+� �� �%�(� ��(,� ����5��� .�5��B�����)� �"" �� ��B���� �' �%� �����&�� ,�&� +&�,� �� ���� (� ��( ,��%��� ���5������ �� � �&�5�� �(��*%�&� �� �& �& �� �5��&�� �����*(����' ��������� $%� ������� ,�&� ����� �%&�� ��(�� *&��& �� '�&�%�& �=(������� �� �%��(� ��(�� � ��B��� �' ��% �����&� ,� *��+� �� ����(5� +& -�=�� / �� �%����%� 5����� �' 5���&�� +&�,�%�

0#0

�=�������� �, �������� ��� 7���.����� ��������

$%� '����,��+ �%&���&������ �' +&�,��+ �����&�� ,�&� �5��&�� �&��+ �%� ����������*�&�� J -�/ �%�+� �' *C �� �%� �����&� (� ��(� -��/ (�&*%���+) �' ��������> � -���/*&������ �' K7�( � �*��L �� ���� (� ��( -�&���� �A;#> �&(��&��+ � �&���� �A6�>��5���% � �&���� �AA2/� .���������) �� �+������ ,� *�&'�&(� � ���&�5� 5) �&���-�A;#5/� $���� '�& ���������� �' +������� &+����� � �&� ,�&� *�&'�&(� � ���&�5� 5) ���� -�AA6/ '��& *����� �' �%� ������� -#1�" *��+��/ �� ��B�� (� ��(���� 5���%�(��� ����� ,�&� �&&�� ��� �� �&�*������

/�����>������ �, �������� 7� ��-

�<� �(*��� ,�&� *&�*&� '&�( 5&��% �����&�� �' ��% �' �%� �5���� ������� � �%� �)*� ��&��� �' �" .���.���� -�$.:;� <�$� �"��"/� �" .���������� -!� <�$��"��"/��" ;�������� -E.0�� <�$� �"�0�/ � �" .���������� -.�2� <�$� �"�2;/ � ���&�5� 5) $�� � �����+��� -�AA;/� ���+��������� � *&�(�&� -$5�� @/ � ��3��� ������ ��� '�& �*���7� � ����7����� �' �" ;��������� �" .���������� ��� �".���.���� ,�&� � ���&�5� 5) .��(�� � �����+��� -�AA0/� E������ � �����+���-�AA#/ � �&�� � �����+��� -�"""/� &��*�������)���& �*���7� � ����7����� �' �" .���������� -�%&��� �� ���� �AA2/� # �� �(*�� �'

�<� ,� (*��7� �� �# �� &������ (�=��&� ��������+ �"" *(�� �' ��% *&�(�&-$5�� @/� "�2 ((��IG �' ��% �' �%� '��& <$��� � 8 �' ��? *��)(�&�� -����B��������/� 0 ((��IG E+���� � ��# �� �' ����� &������ 5�9�& -�2" ((��IG-<C0/�.�0� 2;" ((��IG $&��:C��� *C 6�6� "��H $,��� �"/� $%� �%�&(� *&�7�� '�&�%� &������ ����� � � ������ ����&���� ���* � A0�� '�& � (�� '����,� 5) �#

$��G? @���+��������� � *&�(�&� ��� '�& �*���7� � ����7����� �' ()��*��( �������

E)��*��( ���+��������� � �(*������*����� *&�(�&� ���� 3�'�&����

�" .���������� #�: ��� ��$ $�� ��� $$� ��� ��� � :�� 20A 5* E������ �� ���#�: $�$ �$$��$ ��� $$$ $�� ��� � :�� -�AA#/

�" .���.���� #�: �$� �$� ��� ��� ��� ��$ �$ :�� �02 5* �&�� �� ���#�: ��$ ����$$�$$ �$� ������ :�� -�"""/

�" .���������� #�: ��� $$� ��� ���$�� ��� $� :�� �A6 5* �%&��� �� ���#�: $�� �$� ��$ ��� $��$$� � :�� -�AA2/

�" ;�������� #�: ��� ���$�� $�$ $$$��$ $$$��$ � :�� 0"" 5* .��(�� �� ���#�: $�$ $�� �$$ ��� �������$$ $�� � :�� -�AA0/

0##

�)���� ���������+ �' ����&���� ���* � A0�� '�& � (��� ������+ � #0�� '�& � (��� �=������� � ;��� '�& ��# (��� � 7�� �=������� ���* � ;��� '�& �" (�� ,� �������� � ���� ��3 &������� ,�&� *�&'�&(� �� E���&�)���& �& ���� �%�&(��)���&

-?**�� �&'� C(5�&+� ��&(�)/� ���B���� �' (*��7� �(*��� -# ��/ ,�&� ��)�� 5) �����&�*%�&���� �� ��#H +&��� +��� $%� +�� ,� ����� ,��% ��%� ��( 5&�(� �-"�# ��I(�/� � *%���+&*%� �� �& 8F ����(�������

(����� ����� �

G�B�� �����&�� �' �� ��� �� ��&��� ,�&� (�=� ,��% � �B�� ����(� �' ���&��� %�&����&�( ��������+ #H()�:�������� -.�+(� .� G����� E�� 8.�/� '&���� � 16"�� '�& �0%� � �%�� �)�*%����� �� $����& �&)� �� 0# '����,��+ �%� (��'���&�&L�����&�������� .�&��� ,�&� ���&� � 0���

����>������ �,E� %)�*���(���� ,�� �=�� ������� <��. E� 4�����&�

�����&�� ��������+ 5��% �" .���������� � �" ;�������� ,�&� (�=� ,��% ��B�� *&� �' &55�� %)*�&�((��� �����&�( *&� ��� +���� �" ;�������� -!������� � ��*�5���%� �/ � ����5�� � �;�� '�& � %� .�5��B�����)� �%� (�=��&��,�&� ����&�'�+� � �#"" '�& # (�� � � (� �' ��*�&���� ,� �������� ���� � (��' �����&� (� ��(� '&�( ,%��% �":'�� ��&�� �������� �� �"16 ,�&� *&�*&� � $%������&�� ,�&� ����5�� � �;�� ����� ����5�� �����& �%�'� �' �%� (� ��( ����&&� � ,�&� �%�� ����� ,��% 5��%�" .���������� � �" ;�������� �*���7� ��3�

3?.8G$.

E)��*��(� ,�&� �(����&�� �� 0� -;6H/ �' �%� #0 �=(��� *���(���� ���+�� ����� �' 6# ������� ,�&� �������� > ;0 ,�&� �� :*&� ����+ � �� ,�&� ����:*&� ����+� 8���+ �*�����:�*���7� ��3�� 0" ������� -0;H/ ,�&� � ����7� � �".���.����� �; ������� -��H/ ,�&� � ����7� � �" .����������� �� ������� -��H/,�&� � ����7� � �" .���������� � ; ������� -6H/ ,�&� � ����7� � �" ;��������-��+�&� �/� ���&��� �" .���.���� ,� '��� �� �" -�;H/� �" .���������� �� �6-��H/��" ;�������� �� �� -�0H/ � �" .���������� �� 6 -�#H/ �' �%� �=(��� ���+��<� ()��*��(� � �� ,�&� �(����&�� �� �� -��H/ ���+��8� �& �%� ��� ������ ��� � +&�,�% �' �" .���.���� ����&&� '��& 01�� )� �'

����5����� �' �" .���������� '��& 21�� )�� �' �" .���������� '��& �#10� )�� �' �" ;�������� '��& 2"12# )� �' ����5�����@������ �' �" .���.���� � �" .���������� �����*� �)*��� -K'&�� :�++L/ �����)

(�&*%���+) �� ���� (� ��(� ,%��� ������� �'�" .���������� � �" ;���������%�,� �)*��� �������� ,��% �� ����&� &�� $%� K7�( � �*��L *%���(���� ,��5��&�� �=��������) (��+�" .���������� ��������

0#2

��+�&� �� 3������ �' �%� �9�&��� �*�����:�*���7� ��3 **��� �� ()��*��( �����&��J �".����������� (*��7����� �' 202 5* '&+(��� -�/> �" .���.����� (*��7����� �' �02 5*'&+(��� -�/> �" ;��������� (*��7����� �' 0"" 5* '&+(��� -�/> �" .�����������(*��7����� �' �A6 5* '&+(��� -�/� E� (������& (&��&> �M� *������� ����&��> �1���+���� ����&��� ���) �%� ��3 &������ �' �6�" .���������� 7�� ������� -�/ '&�( ���� �'�; ������� &� &�*&������ > �"�" .���.���� 7�� ������� -�/ '&�( ���� �' 0" 7�� �������> �' 0�" ;�������� 7�� ������� -�/ '&�( ���� �' ; 7�� �������> � �' 6 �" .���������� 7�� ������� -�/ '&�( ���� �' �� 7�� �������

0#;

$%� ��5��&�� ���������� ����� �%�,� �%� �" ;�������� ������� **&����) ���� ��� ������� ���%�& +������ �& &+�������" .���������� ������� ���� ������� &+����� 5����� +������� ,%��� �" .���.���� ������� ���� ������� +������ 5�� ��� &+������ $%����������� �' +������ ,� �5����� '�& 2 � (5�+���� '�& # �" .�����������������> �%� &�(����+ �2�" .���������� ������� **&����) � ��� ������� +�������@� �& �& �� �=(��� *����5�� ��:�=������� �' ����&� �������� �*����� �� ���+��

*&�(&) �����&�� ��% �' �%� ������� ,� ����� ,��% �� �%� ���5�� ��3 ��)�� $%���)��� &����� �%� ��:�=������� �'�" .���������� � �" ;�������� �� A *&�(&)�����&�� -��+�&� �/� ,%��� �%� &�(����+ *&�(&) �����&�� ������� ���+���������1� �*������D��% �%� ��� �' � �����&�(��" ;��������,� �������'��) ���(���� '&�(�" .���������� �����&�� -��+�&� �/�

��+�&� �� 3������ �' �%� �" ;�������� ��3 **��� �� �" .���������� �����&��� ,%�&� �����" .���������� 7�� ������� ,�&� �� (�=� �����&� ,��%�" ;�������� -�/� 3������ �' �%��";�������� -�/ � �" .���������� -�/ ��3� **��� ���" .���������� �����&�� '��& �%���(*������� *&������ ,��% �����& +���� �" ;��������� �(*��7����� �' 0"" 5* -� � �/� 20A 5* -�/ '&+(���� E� (������& (&��&> �M� *������� ����&��> �1� ��+���� ����&��

0#6

�@.�8..@�<

?� %� ,�&� ,� � ���&�5����� � �� ������� ,��% �����(��� ������ �� �,���*&� ������ -��5���% � �&���� �AA2/� ���������� �' �" .���������� '&�( 7�� ���� �' ?� �� ����� �%����+��+ ��� '�& (�) �+������ �5�&��&��� (���) 5������' �%� '��� ���� ���&����� &�B��&�(���� �' �%� �&+���( � ��� 5����� �� �� �'������&+&�,� 5) ����� &) ��� �&�� ���% � �" .���.���� -��5���% � �&���� �AA2>���(�+�� �� ���� �AAA/� C�,���&� �������� �' �%� 5���&��( �� � &��7��� (� ��( ����� ���) &������ '�& �+������ *�&*���� 5�� �� ��� � �� ��*���5�� ��&���+ *���� '�&�*� �(����+��� �������+������ �%� ��� ) �' +������ �&����� �� ���&� *�*�������������� *&� ������� � �� ���@� �%� *&����� ��� )� ���������� '&�( #0 *���(���� ���+� %� &����� �%� *&������

�' '��& *�&���� �������� �*����� � �&� ��&�� $%� (��� '&�B�����) ������ �*����� �� �%�� ��� ) ,��" .���.����� '����,� 5)�" .������������" .���.����,� �(����&�� �� �;H �' �%� *���(���� ���+�� @� ��(��& ��&��)�� �&��� -�A;�/ � E�*%�&��� � C� +�� -�A6#/ '��� �%�� +��� �� 2�H � #"H �' �%� ���+��=(��� � &��*�������)� @� ��& ��� )� �%� *&������ �' �" .���������� ,� ���� ����H �' �%� *���(���� ���+�� ,%��% �� �� +&��(��� ,��% *&������ &�*�&�� �' 7� ��+�%�� +��� �� �6H � �"H �' �%� ���+� -�&���� �A;�> E�*%�&��� � C� +��� �A6#/��" .���������� ,� �(����&�� �� �#H �' �%� ���+�� �� ����&&���� �' **&�=�:(���) �"H �� �%� ���+� ,� *&�������) ���� '�& �" .���������� -�&��� �A;�> �&��� ������ �AA�/� ���%��+% �" ;�������� �� ����� �&� (�&� �N���� �� ������ �%� �".���������� -.��(�� �� ���� �AA0/� ,� �(����&�� �%� *&������ �' �%�� (��&�:�&+���( �� �0H �' �%� *���(���� ���+��@� �%�� ��� )� 5���%�(��� ����� ,�&� *�&'�&(� '�& *&���(��&) � ����7����� �' �%�

()��*��( �������� 8� �& �%� ��� ������ ��� � ���������� �' +������ � &+�����,� **&��� '�& ���" .���.���� � �" .���������� �������� &��*�������)� 8����������' +������ ,� ��� ������ (��+ �" ;�������� ��&���� ,%��� �%� ���� )��� � ������������ &������ ,��% �" .���������� ��&���� �&�������)� !����� � �����+���-�A;6/ �%�,� �%� 5��% �*����� *������� %�=������ ������) � ,�&� 5�� ��(��5����� +������� C�,���&� �� @�� ��A� ������ �, (�������� @��������� � -3���� �&��� �� �A60/ �%�� *&�5� �� ����� ����� �&� � K��� �7�� L '�& 5��% �*������ $%� �N������� �=*�&����� �� �������+ +������ '�&(������� 5)�" .���������� � �";�������� �� �%�� ��� ) *&�55�) �&��� '&�( � ����N����� *����� �' �%� ������� ���%� +&�,��+ (� ��(� �& ���� ,��� 5� &���� �� (� �7������ �' �%� �����&� (� ��(�%� &� ������&) �� �& �& �� *�&'�&( �%� �����@� �%� *&����� ��� )� �*���7� � ����7����� �' ()��*��( ������� ,� �%����

����+ ��3� ,%��% %� 5��� �%�,� �� 5� � ���=*������� &���5�� � '�� ���&����� ���%� �& ������ ��&���+��� (��%� � -���(�+�� �� ���� �AAA� �"""/� ��3 ,� �%�,�*&�����&�) ���'�� '�& � ����7����� �' (�=� �����&�� �' �" .���������� � �";��������� ,%��% &� 5��% ���,:+&�,��+� �� :*&� ����+ �*����� �%� ��� �%�, ��(���&���+��� �&���:&�������) -�&���� �A;;> 3� � 3���� �A6�> ��5���% � �&���� �AA2/�@� �� ���� ,��% �����(���� +&�,�% �' �%��� �,� �*�������" .���������� ���� 5��5���� �� *�&� �����&� '��& ��(*���� ���(������ �' �" ;�������� 5) �%� ��� �' ��(*������� *&������ ,��% �*���7� ���:�" ;�������� &55�� %)*�&�((��� ��&�(�

0#A

@� �����&� (� ��( ��������+ �,��� ��&�(� �1� ,���� &� �����) ��� � ���5��&�� +&�,�% �' �" .����������� ,%��� �" ;�������� ��� � �10 ,���� -�&�����A;#> ��5���% � �&���� �AA2/� $%� ��� �' (� ��( ��������+ ���) %�&�� ��&�( ���%�� ��� ) *&����+� �%� �������� ��(�� ,%��% ,� 5��� �12 ,���� '�& �".���������� � **&�=�(���) A ,���� '�& �" ;��������� $%��� &������ &� ��+&��(��� ,��% �%� �5��&����� �' 3� � 3��� -�A6�/ �� �%� &������ ��'�&��&��) �'(� � ��������+ ���) %�&�� ��&�(� C�,���&� �� �*��� �' �%� *&����+� ������ +&�,�%��(�� �%� +&�,�% &�� ,� ��+��7����) �(*&��� '��& �%&�� *��+�� �� �%�� (� ��(�'��& ,%��% �� �' �%��" .���������� ������� +&�, �� �1� )�� @� ����&��� ,� %��'��� �%� *����� �'�" .���������� ��&��� �� +&�,�% �� (� ��( ��������+���) %�&�� ��&�( �� ����� �&5�) (�&� �N���� �' �%� ��&��� ,�&� �&�+����) ������ I+&�,� �� (� ��( ��������+ �,��� ��&�( -�� ������� �� ��*�5���%� �/� ����%�&*����5�� ����&�5����� �� �%� ���+ �������� ��(� ,� �%� ��� �' %�+% �������&���� �'(*������� �� �%� �����&� (� ��(� ����� �� %� 5��� &�*�&�� �&���& �%� �%�� ���5�����%� � ��%�5���&) �9��� �� �%� +&�,�% �' �" .���������� � �" ;�������� -�&�����A;�� �A;#/� @� �%� *&����� ��� )� �%� ����� �' (*������� � ��� **&����)��4����� �%� +&�,�% �' �" .���������� �� ��B�� (� ��(� 5�� �����*(��� �'�������� �� �%� ���� (� ��( ����&&� ���) ,%�� �%� ���5����� ,� ��(*�����)&�(��� '&�( �%� (� ��(� ��& �%� �)*� ��&�� �' �" ;��������� E. 0�� �� ,�������&) �� &�(��� (*������� '&�( 5��% ��B�� � ���� (� ��( �� �& �& �� +�� �%��&+���( �� +&�,� $%� (*������� ���� 9��� ()��*��( +&�,�% �� *������+� ������%� (��%���( 5) ,%��% (*������� %�� �&� (��&�5�� +&�,�% �� ��%�5����� �' �)��%�����' �%� ���� ,�� � ()��*��(� ��� �%� ���� ,��� @� �%�� ���(� �����) �%� (*�������() ��� %�� ��(� ������ ��%�5���&) (��%���(� �%� &� ��� &���� �� �)��%�����' �%� ���� ,�����& *&�(&) �������� �' ()��*��(� '&�( *�&���� ���+�� �"H ���*������ �'

+&��� ������ �� *&�*&� �� 5&��% � �������� �� �"16 &� ( � 5) ��&�� �&��'�& �'"�� (� (����� �� ��5�� ��������+ ��6 (� �' 5&��% -�&���� �A;#/� @� �%�� ��� )� ,� ��� 7��&���� �' �����&�� '��& �0 % �� �& �& �� &�(��� 5���&�� ����(������ $%��*&��� �&� %� 5��� ��� �� ��& �5�&��&) '�& �������� �' ()��*��(� '&�( ��(��*����� ��%�& �%� �,��� � ���(� (�&� *&����� � ��(*��& �%� �%� �& ������(��%� ���+)� ����� �� ���,� �� �� ,�&� ,��% +&���& ��(5�& �' �(*����@� %� 5��� &�*�&�� �&���& �%� � �(��*%�&� ,��% #1�"H ��� () 5� ������&)

'�& �����*(��� �' �" .���������� � �" ;�������� �������� �� ���� (� ��(-�&���� �A;#> ��5���% � �&���� �AA2/� D� %�� �5���� �������� �' �� ()��*�(������� � ����� ��+ �" .���������� � �" ;�������� ,��%��� �%� *&������ �' ���

�� �����+ �%� ��� �� ��� �� ��*���5�� '�& �����*(��� �' �������� �' �%��� �,��*������@� ����������� '��& �9�&��� ()��*��( �*����� %�� 5��� ������ '&�( *���(�:

��� ���+� �' *�+� '�& �%� 7&�� ��(� �� �&� ��&� -.*��/ ����+ (� ��( ��������+�=��������) %�&�� ��&�(�

02"

���<�DG?��?E?<$.

$%�� ,�&�,� ��**�&�� 5) G5�&��&��� .OF� .�� � *&� �' �%� K�������� *& �?��� &������ � � � �&� ������ � @� ���&�� � ���P� +���� � �������� .�����1�����L� $%�� &���&�% ,� ��(*���� �� *&��� '��7�(��� �' �%� &�B��&�(���� '�& ��������� �L� �%� �+&���D� �%�� �& ��?� ?���� '�& &������+ �%� ?�+���% ��+�+� �' �%� (����&�*��

3?�?3?<�?.

�%&���� ��� ���������� ��� C+� �&�:������ $� � �&���� <���� �AA2� @ ����7����� �' ��������.���������� �� ������� �(*��� 5) ��3� @�J ���% ���+&��� �' �%� @���&������ �&+������� '�&E)��*��(���+)� �&�� �� ���&� � /B��������� �� �6

�&(��&��+� ��C� � �&���� <���� �A6�� @������� �'�������� ;�������� '&�( �,��� �� �%� 8���� .�����'������ C������ �, ���������� -������.� ��� �"�"1�"��

��(�����&� ����� 3��+�� E�� ����&� E�� ������&� ����� ���5���� �� � ��&�%%�9 C�� �AA6� ����������' �������� .���������� �� 5&���%������& ��+� 4�� � �' *�+� 5) ��3� C������ �, �������������7���� �� �� �A601�A66

���(�+��� E�� ��Q��� �� � $&�+�� ��� �AAA� �**������� �' ����� ��3 ��) �� �������������.���������� '&�( ��� �,5�� C������ �, ���������� +�� ������ /������ ������ !!� �021�#�

���(�+��� E�� �������� !�?� � ��Q��� ��� �"""� ��&&������ 5��,��� �%� *&������ �' ��������*���(���� ������� � �������� �' �������� .���������� �� 5&���%�� �,5� 5) ��3����������� �����7���� �� "�� �AA1�"�

�&��� !�� ��& ��� E� � ��� .�� �"""� ��+����� � �9�&�������� �' �������� .����������� �������� .���.���� ��'������� �� *�+� 5) ��3 (*��7����� �' �%� *�2 � *02 +����� C������ �,�������� �����7���� �� #� ��A"1��A2

����� .�C�� �AA�� ?���&��(���� '���&� 9�����+ �%� ����&��) �' *���(��� �� *�+�� ���������� -������!�#� #6�1#62

�&���� <���� �A;�� E)��*��(� �������� '&�( �%� &��*�&��&) �&�� �' ����% *�+�� '��� �����������(������������ !�� 2A1;A

�&���� <���� �A;0� E)��*��( ���*���(���� � �������� ;�������� �� ��(*&���� *�%�+������)��� ���� '��� ����������� (������������ !$� #";1#�6

�&���� <���� �A;#� .�(� &���((�� ����� �����&���+ *&�(&) �������� �' �������� ������������ �������� ;��������� � ��&��)� D�����5 ����������������� �"� ��;1��A

�&���� <���� �A;#5� $%� .�. � �+������ ����� **��� �� *�&���� ()��*��(�� '��� �����������(������������ !�� 0;010;2

�&���� <���� �A;;� �������� ����������� � �������� ;�������� �� �%� +&�,�% *&���*������ �����'��� ����������� (������������ !#� �261�;#

�&���� <��� � ������&� ����� �AA0��������� .���.���� �� �%� ������+) �' ��&������ (��+ *�+����� '�������������� (������������ $� A�1A6

�&���� <���� �%&���� �� � G&���� C�� �AA���������� .���������� �������� '&�( �%� �**�& &��*�&��&)�&�� � ������� �' *�+�� '��� ����������� (������������ �� 0�#10�A

��5���%� E�� �"""� E)��*��( ������ �� *�+� 1 �� ������ ����� �����+ �&��5��� �&�. /����������� �� ���������� (������ ��� ����� E��5��&��� ����&��� 0�010�6

��5���%� E� � �&���� <���� �AA2� .,��� ()��*��(����� -���� (������>?�� �� ���.��?�� �� �ABE��/������������ ��� ��F������� !$� �#2A1�2"#

��&�%� ��$�� C��� $�� .����� ?�3�� $%�%�&� ?�G�� $%�%�&� ��!� � E������ ����� �""�� 8�� �' �������� .���������� ����� *��)(�&�� �%�� &������ �� ���&(��� �%� �*��(� �(*���+ ������� �,���� C������ �, ���������� +�� ������ /������ ������ !$� 02�102A

!������ ��$�� D����&�*� �� � �&���� <���� �A;6� 8��������� �' +������ 5) �������� ����������� � �������� ;��������� '��� ����������� (������������ !�� �;A1�6�

E������� !���� ��&+��&R(� ��� D��+&��� �� � !�%������ ��?�� �AA#� ��������� �' ��������.���������� �� ���� �,5� '&�( *�+� 5) �� ����� (*��7����� �' �%� �2. &3<� +���� C������ �,�������� �����7���� �� � 6A�16A;

02�

E�*%�&���� E�3� � C� +��� 3�$�� �A6#� $%� ����&&���� �' ()��*��(� �� �%� ���+� �' *�+� �� <�,S��� � D�< G������ ���������� C������� � �A01�A;

���� � !���� �AA6� ����%�(��� �%&���&������ �� ()��*��( � ����7������ @�J 3� E���� � 3� <��%���-� �/����.��� �� ��������� @���� �� �������� ���������� -C�(� �&��� @��� $���,� <!/� 2A1;6

3���� .� � �&��� �� ?���� �A60� $%� ()��*��(�� @�J <�3� �&��+ � !��� C��� -� �/� @�� ��A� �������, (�������� @��������� �� -D����(� � D������� ����(�&�/� ;0"1;A�

3�� G�C� � 3���� 3���� �A6�� ��(*&���� �' �������� .���������� ��&��� 5) ��&���+�� (��%� ��'������ C������ �, ���������� -������.� ��� �"61�"A0

3���� 3��� � ������ !�3�� �A;"� �������� .���������� &�%&���� �' �,���� C������ �, '���������������� �������� '����������� !$"� �#�#1�#�6

.��(��� ��D�� �%�� 3�� O���+� $��� � 3��� 3���� �AA0� ��9�&�������� �'�������� .������������" ;��������� � �" .���.���� �� �%� 5��� �' (*��7����� �' �2� &3<� +��� ��B������ '������C������ �, ���������� -������.� $$� 6�160

.�&���&� E�� �5����� ��� ��5���%� E� � <������� !�� �AA�� @((�����+��� � *�%���+��� &������� ��*�+���� �=*�&�(�����) ��'���� ,��% �" .���������� � I�& �" ;��������" ���������� /����� ���� /�����.��� �� !� �0�1�#�

$%���&� ?�G�� �""�� @((�����+) �' �%� *�&���� &��*�&��&) ����� ��(*��=� �.� ���������� ������� �,D���. '�����" ���� '���� ��������� !"� ##�:#2#

$��� .�� ��+���� ��� 3���%�+���� ��E�� @ ���� ��� E����� ��� ����&�� �� � G��&�� ��� �AA;� ����������'�������� � �������� �� �%��* (��� �(*��� 5) *��)(�&�� �%�� &����������������� �����7���� ��$�� �;1��

F�& ��� ?�� .���& � ��� G55�� � ��� ����� � !�E� � ��5���%� E�� �"""� � ����� ��3 ��) '�& �%� �������� �' �������� .���������� �� �&�%��5&���%���& ,�%��+� '&�( *�+ %�& �� ���������������7���� �� "�� ��10"

-����*�� J �6E) �""0/

02�