лекция 07 --

1

Сканирующая зондовая микроскопия

СЗМ биологических объектов.

Содержание лекции

1. СЗМ-методы, используемые для исследований биологических объектов

2. Нуклеиновые кислоты

3. Белки

4. Вирусы

5. Липиды и мембраны

6. Белок-мембранные комплексы

7. Клетки

Ранние работы в контактном режиме

Рис. 4.1. АСМ-изображение пленки AE-TSA на стекле.

3

Рис. 4.2. 10 АСМ-изображений, демонстрирующих свертывание белка фибриногена под действием тромбина в

реальном времени.



5На воздухе или в жидкости?

Рис. 5.1. Cлева – вирус ХВК на графите сканированный в жидкости, справа. – вирус мятлика на слюде, на воздухе

6Быстрая АСМ

Рис. 1. Схематическое устройство

быстросканирующего АСМ. Z-пьезосканер (1),

объектный столик (2), кантилевер (3), противовес

Z-пьезосканера (4), X,Y- пьезосканер (5), подсветка

(6), шаговый двигатель (7), пьезоэлемент для

возбуждения колебаний кантилевера (8), объектив

(9), зеркало (10), четвертьволновая пластина (11),

поляризационный делитель (12), лазер (13), линза

(14), двухсекционный фотодиод (15), камера (16).

1) маленькие кантилеверы с высокой резонансной

частотой и низкой механической жесткостью;

2) высокоскоростной сканер;

3) система активной защиты сканера от вибраций,

возникающих при его быстрый движениях;

4) быстрая обратная связь в электронике

микроскопа.

3. Noriyuki Kodera, Daisuke Yamamoto, Ryoki Ishikawa, and Toshio Ando, Nature 468:

72-76 (2010).

7Нуклеиновые кислоты. Из чего они состоят?

Uracil (U) встречается в

РНК

Азотистые основанияРибоза и дезоксирибоза

Общая структура нуклеотидов:ДНК РНК

8Принцип комплементарности и пространственная структура ДНК.

Рис. 9.1. Эрвин Чаргаф

1. Процентное соотношение нуклеотидов зависит от вида организма,

2. ДНК, выделенные из разных тканей одного организма, не

отличаются по нуклеотидному составу,

3. Нуклеотидный состав для каждого организма не меняется с

возрастом,

4. Во всех организмах A=T, С=G.

Принцип комплементарности и пространственная структура ДНК

Рис. 9.1. Эрвин Чаргаф

1. Процентное соотношение нуклеотидов зависит от вида организма,

2. ДНК, выделенные из разных тканей одного организма, не

отличаются по нуклеотидному составу,

3. Нуклеотидный состав для каждого организма не меняется с

возрастом,

4. Во всех организмах A=T, С=G.

Рис. 9.2. Розалинд Франклин

Рис. 9.2. Рентгенограмма Розалинд Франклин,

подтверждающая спиральную структуру ДНК.

пар/виток 11 10,5 12

шаг, нм 2,4 3,6 4,6

Малая бороздка

Большая бороздка

Рис. 9.3. Джеймс Уотсон и Френсис Крик.

Рис. 9.4. Морис Уилкинс

10ДНК в АСМ

Рис. 10.1 АСМ изображение ДНК на поверхности APTES-слюды

при нанесении из растворов с разной ионной силой.

Рис. 10.2. ДНК в пропаноле, сухом гелии, в буферных растворах. [H.G. Hunsma

Biophys J. 1995 May; 68(5): 1672–1677.]

11Методы приготовления образцов ДНК в АСМ

С двухвалентными ионами

(Mg2+, Zn2+, Co2+, Ni2+, Li3+, Zr4+)

Силаны

(APS, APTES)

Наношаблоны:

•Напыление металлов

•Метод Ленгмюра

Блоджетт (заряженная

пленка органического

соединение на

поверхности воды)

•Нанесение

органического

монослоя слоя на спин-

коутере

слюда

ДНК и

Mg2+

слюда

APS

APS-слюдаДНК

12ДНК в быстрой АСМ

Рис. 18.1. (а) Одиночный кадр высокоскоростного АСМ-изображения ДНК, адсорбированной на APS-слюду, полученный

при скорости 3 кадра в секунду.

Наложенные последовательно полученные кадры положений ДНК на подложке. (б)-20 кадров; (в)-40 кадров (г)-60 кадров.

13Какие параметры ДНК измерить на АСМ-изображениях?

Рис. 13.1. Типичное изображение ДНК в АСМ. Сечение ДНК: ширина нити 20 нм, высота – 0,7 нм.

Рис. 12.2. Различные АСМ-изображение ДНК : одноцепочечной (сверху, слева), двухцепочечной (сверху,

справа), трехцепочечной (снизу, слева), комплекс двухцепочечной ДНК с белком.

1. Выделяется набор протяженных

молекул

2. Проводится автоматический анализ

3. Определяется персистентная длина

Рис. 12.3. График зависимости.

Персистентная длина:

Рис. 12.3. АСМ изображение ДНК с периодичностью 3-4 нм, получено в работе [D.

Klinov and S. Magonov, Applied physics letters, 84 (14), 2697-2699 (2004)]при помощт

суперострых кантилеверов (справа).

14ДНК в СТМ

Рис. 13.1. СТМ изображение ДНК на золоте (111), виден

период 4 нм, возможно это периодичность спирали ДНК.

Рис. 13.2. СТМ изображение ДНК на золоте (111),

виден период 4 нм, возможно это периодичность

спирали ДНК, видно, что ДНК уширена.

15ДНК в СТМ

Рис. 14.1. Инверсия контраста на

СТМ изображении ДНК.

16Исследования проводимости ДНК

Рис. 15.1. ДНК, закрепленная между двумя электродами.Рис. 15.2. Дырки туннелируют между парами C-G, а A-T пары

представляют для них потенциальный барьер.

Рис. 15.3. Зависимость переноса электронов от дины

последовательности ДНК и ее нуклеотидного состава.Рис. 15.4. Противоречивые результаты по

ихзмерению проводимости ДНК.

4. H.-W. Fink and C. Schonenberger Nature (1999) 398, p.407.

5. D. Porath et al. Nature (2000) 403, P. 635.

6. Kasumov et al. Science (2001) 291, p. 280.

7. С. Dekker, M.A.Ratner, Physics World, August 2001, p. 29.

Рис. 15.5. Постановка эксперимента и результаты измерения

сопротивления двух разных молекул ДНК при температуре

ниже 1К..

17ДНК в СС

Рис. 29.1. Растяжение молекулы ДНКРис. 29.2. Разделение комплементарных нитей молекулы ДНК

8. A. Noy, D.V. Vezenov, J.F. Kayyem, T.J. Meade, C. Lieber, Chem. Biol. 4 (1997) 519.

9. R. Krautbauer, M. Rief, H.E. Gaub, Nano Lett. 3 (2003) 493.

18РНК – общие проблемы работы с одноцепочечными НК

•Одноцепочечные НК всегда стремятся к образованию комплиментарных пар•РНК плавится труднее, чем ДНК•Добавление положительных ионов также компактизует НК

Методика Клейншмидта – покрыть НК основным белком цитохромом С

1) Необходимо расправить РНК. На 1-5 мкг/мл РНК:1) 4М мочевина2) 80% формамид3) Температура 70

2) Образовать комплекс с цитохромом С в расправленном состоянии (50-100 мкг/мл)

3) Нанести на поверхность раздела фаз (например, на поверхность капли на 30 минут) для формирования пленки

4) Перенести пленку на слюду

Рис. 20.1. Цитохром С – белок массой

12,4 кДа, IP-9,3, содержит гем.

19РНК – примеры наблюдения в АСМ

Рис. 21.1. АСМ изображение РНК, высвобождающейся из вируса ВТМ и свободная РНК ВТМ на слюде.

Drygin Yu. F., Bordunova O. A., Gallyamov M. O., Yaminsky I. V. Atomic force

microscopy examination of tobacco mosaic virus and virion RNA, FEBS Letters,

425, p. 217--221 (1998).

20Белки и аминокислоты

Неполярные аминокислотные остатки Полярные аминокислотные остатки

Ароматические аминокислотные остатки Положительно заряженные аминокислоты

Отрицательно

заряженные

аминокислоты

Рис. 22.1. Пептидная связь.

Рис. 22.2. Последовательность следования аминокислот –

первичная структура белка.

N-конец С-конец

21Белки: первичная, вторичная, третичная и четвертичная структура

четвертичная структура

третичная структура

вторичная структура

первичная

структура

Рис. 23.1. Иерархия структуры белка.

Рис. 23.2. Лайнус Полинг.

22Методы наблюдение отдельных молекул белков в АСМ

•Пробуйте разные подложки

•Используйте низкие концентрации

•Используйте короткие времена

адсорбции

•Проверяйте качество препаратов при

помощи гельэлектрофореза и

светорассеяния

•Увеличивайте ионную силу раствора

Рис. 26.1. Фибриноген на слюде (А, Б), графите (В, З, И) и

слюде, модифицированной ГМДС (Г, Д,).

23Какие параметры белковых молекул измерить?

У крупных белков измеряем линейные размеры

У мелких белков – высоту, а также объем и площадь поверхности

Рис. 27.1. Параметры крупных белков

Рис. 27.2. Сравнение объемов мелких белков позволяет различить мономеры и димеры.

24Исследования адсорбции белков на различные поверхности

Рис. 28.1. Ирвинг Ленгмюр и

его уравнение изотермы.

R.T.T. Gettens, J. of biomed. Mater. Res. Part A, 72A, 3, p. 246-257 (2005).

Рис 28.3. Кинетика адсорбции фибриногена на графит (а) при

концентрации 1 мкг/мл, (b) при концентрации 2 мкг/мл.

Рис 28.2. АСМ-изображения фибриногена на графите, использованные

для анализа адорбции.

Рис 28.3. Кинетика адсорбции фибриногена на слюду при

концентрации 0,5 мкг/мл.

25Исследование комплекса НК + белок

Рис. 30.1.Комплекс искусственно синтезированной ДНК с

дендримерами G6 образует длинные волокна, сплетенные

из нескольких молекул ДНК. Высота единичных нитей 0,7-

0,8 нм, а сами волокна высотой 5-6 нм.

Рис. 30.2.Комплекс искусственно синтезированной ДНК с

дендримерами (другого ряда) G3 образует структуры

подобные «бусинам на нитке»

Shifrina et al. Macromolecules, v. 42, # 24, 2009.

26

M. Lysetska, Biomacromolecules 2005, 6, 1252-1257

Исследование комплекса НК + белок

Рис. 31.1. изображения (A) ДНК 538 основания на слюде с добавлением ионов никеля (B) молекулы белка ORF80 на

слюде без добавления никеля. (C) ORF80 (100 nM) выдержанный с 3 nM ДНК. Видны отдельные молекулы ДНК на

которых сидят глобулярные белки. (D) Увеличенное изображение С. (E, F) Аналогичный эксперимент по смешению ДНК с

белком, но с увеличенным количеством белка 300 nM ORF80 (Стрелками показаны комплексы ORF80-DNA; мерная шкала

200 nm).

Fabien Montel et. al., Biophys. J., 93, p. 566–578

Исследование комплекса НК + белок

Рис. 26.1. изображения (A) нуклеосом на ДНК (B) Метод определения длины «рук» нуклеосом. (С) Строение нуклеосомы.

(D) Распределение длин рук – нормальное, нуклеосома находится в середине ДНК.

28ДНК в быстрой АСМ

Рис. 19.1. Последовательные АСМ-кадры разворачивания нуклеосомы,

полученные при скорости 1 кадр в секунду.

Рис. 19.2. Последовательные АСМ-кадры слайдинга октамера, полученные при

скорости 1 кадр в секунду.

Рис. 19.3. Последовательные АСМ-кадры выхода гистонового октамера

из нуклеосомы, полученные при скорости 1 кадр в секунду.

29Силовая спектроскопия белков

Рис. 32.1. Схема эксперимента по растяжению белка в СС. Рис. 32.2. Типичная силовая кривая при растяжении белка.Рис. 32.3. Силовая кривая растяжения белка (I27–I28)4.

M. Carrion-Vazquez et al. Progress in Biophys. And Mol. Biol., Volume 74, Issues 1–2, 2000,

Pages 63–91.

30Силовая спектроскопия белков

Ch. McAllister et al., J. Mol. Biol. (2005) 354, 1028–1042.

1. Очистить кантилевер от загрязнений:1. 1 час в 95 % этаноле2. 1 час под ультрафиолетовой лампой

2. Сколоть слюду3. Далее обе поверхности обрабатываем одинаково:

1. 30 минут в 167 мМ растворе APS2. Промыть, высушить3. 1 час в 10 % растворе глютаральдегида4. Промыть, высушить5. Наносим белки6. Промыть, высушить7. Наносим глицин8. Промыть, высушить.

31Вирусы – живые или нет?

Вирусы — это биологически активные частицы, состоящие из белковой оболочки

(капсида) и генетического материала в виде РНК или ДНК.

Рис. 4.1. Разные вирусы.

32Классификация вирусов

Симметрия капсида

икосаэдрическая спиральная

Оба типа симметрии реализуют энергетически

выгодное состояние.

Классификация по типу генома:

ДНК дезоксивирусы

РНК рибовирусы

двухцепочечная ДНК

одноцепочечная ДНК

двухцепочечная РНК

одноцепочечная РНК

33Триангуляционная сетка и вирусы

0 H:

K

1

1

11

2

2

3

3

3

4

16

16

4

4

4

5

25

255

6

6

7

7

7

7

8

8

9

9

13

13

12

9

9

2 2T h hk k

Рис. 6.1. Триангуляционная сетка.

Где h и k целые

34Вирусы с триангуляционным числом Т=1

В простейшем случае на одну грань икосаэдра приходится 3 белка, а вся оболочка состоит из 60 белков:

Т = 1

Собачий парвовирус

Рис. 7.1. Модель и ПЭМ-изображение собачено

парвовируса.


10

1

16

16

4

4

25

25

7

9

13

13

12

9

10

1

16

16

4

4

25

25

7

9

13

13

12

9

7

Вирус желтой мозаики репы состоит из 180 белковых субъединиц, объединенных в 20 гексамеров и в 12 пентамеров.

Рис. 8.1. Модель вируса желтой мозаики репы.

10

1

16

16

4

4

25

25

7

9

13

13

12

9

10

1

16

16

4

4

25

25

7

9

13

13

12

9

7

Рис. 8.2. Вирус желтой мозаики репы в ПЭМ (слева) и АСМ

(справа).


Вирус кустистости томата Вирус огуречной мозаики

Т = 3

Вирус Нодамура Вирус Норволк

37Вирусы со спиральной симметрией

Спирально-симметричные вирусы

характеризуются числом белковых

субъединиц на виток и смещением

вдоль оси

P p

Шаг спирали:

Рис. 12.1. Структура спирально-симметричного

вируса.

Рис. 11.2. Структура вируса табачной мозаики (ВТМ).

Рис. 11.3.Вирус табачной мозаики. Рис. 11.4 Вирус мозаики Альтернантеры.

38Вирусы в АСМ

Рис. 13.1. Первое АСМ-изображение вируса ВТМ.

Zenhausen F. et al., Ultramicroscopy, v. 42-44, № 6, p. 1168--1172 (1992).

Рис.13.2. Вирус мозаики костра. Рис. 13.3. Вирус мятлика.

39Вирусы со смешанной симметрией – бактериофаги и аденовирусы

Рис. 14.1. Аденовирус.

Аденовирус содержит двухцепочечную

линейную ДНК, капсид вируса имеет

икосаэдрическую симметрию с T=25 и имеет

12 пентонов. Пентон состоит из:

•Основания пентона

•Стебля

•Узелка (тример белок)

Диаметр вируса 90 нм.

Рис. 14.2. Первые изображения бактериофага Т4, полученные при сканировании на воздухе в

контактном режиме.

Kolbe W.F., Ogletree D.F., Salmeron M.B. Atomic force microscopy imaging of T4 bacteriophages on silicon substrates, Ultramicroscopy, v. 42-44, № 6, p. 1113--1117 (1992).

Рис. 14.3. Бактериофаг fd, постепенное увеличение числа адсорбированных частиц в

жидкости.

Lyubchenko Yu.L., Oden P.l., Lampner D., LindsayS.M., DunkerK.A. Atomic force microscopy of DNA and bacteriophage in air, water and propanol: the role of adhesion forces, Nucleic Acids Res., V. 21, № 5, p. 1117-1123 (1993).

Рис. 14.4. Фрагменты Бактериофаг овT4 фиксированные фотоактивируемым линкером.

Karrasch S., Dolder M., Schabert F., Ramsden J., Engel A. Covalent binding of biological samples to solid supports for scanning probe microscopy in buffer solution, Biophys. J., v. 65, № 6, p. 2437--2446 (1993).

40Вирусы с мембраной

Рис. 15.1.Вирус герпеса.

Вирус герпеса содержит двухцепочечную

линейную ДНК, капсид вируса имеет

икосаэдрическую симметрию с T=16 и

покрыт липопротеидной оболочкой.


Рис. 15.2. Вирус гриппа А.

Вирус гриппа содержит одноцепочечную

линейную (-)РНК, капсид вируса имеет

спиральную симметрию и покрыт

липопротеидной оболочкой.

Частицы полиморфны, их диаметр вируса

80-120 нм.

Рис. 15.3. Вирус иммунодефицита человека.

Вирус ВИЧ содержит две линейные молекулы (+)РНК и набор белков, в том числе

некоторые ферменты, капсид вируса имеет коническую форму и покрыт

липопротеидной оболочкой. Капсид окружен матриксом, состоящим из 2000 копий

белка p17, матричная оболочка высокоструктурирована и покрыта липидным бислоем.

Он образован молекулами, захваченными вирусом у клетки хозяина. В липидную

мембрану встроены 72 гликопротеиновых комплекса.


41Вирусы с мембраной – методы приготовления образцов

Рис. 16.1. А - АСМ-изображение отдельных частиц и агрегатов ВИЧ на стекле.

Агрегацию авторы связывают не только с особенностями сорбции на

подложку, но и с тем, что вирус при очистке подвергался центрифугированию.

Б - крупное изображение отдельного вириона ВИЧ на стекле. В - вирионы на

поверхности лимфоцита показаны стрелками. Г - увеличенное изображение

большого скопления вирусов на поверхности клетки.

Kuznetsov Yu. G., Victoria J. G., Robinson W. E., McPherson A. Atomic Force Microscopy Investigation of Human Immunodeficiency Virus (HIV) and HIV-Infected Lymphocytes, J. of Virology, vol. 77, № 22, p. 11896--11909 (2003).

42Вирусы и клетки

Рис. 17.1. Бактериофаг Т4 – схема и ПЭМ-изображение Т4 на клетке.

Yu. G. Kuznetsov, A. McPherson, MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY REVIEWS, Vol. 75, No. 2, p. 268–285, 2011.

Рис. 17.2. Вирусы на поверхности клеток. А,B - Moloney

murine leukemia virus, C – цианофаг – вирус,

поражающий цианобактерии, D – ВИЧ на лимфоцитах.

Рис. 17.3. Вирусы на поверхности мембран. А-PBCV-1, B

– гигантский мимивирус.

43Вирусы и клетки – исследования методом силового картирования

Liashkovich I. et al., J. Cell Sci., v. 121, p. 2287--2292 (2008).Roos W. H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., v. 106, p. 9673--9678 (2009).

Рис. 18.1. Схема и результаты эксперимента по индентированию вируса герпеса. А - Упругое

сжатие капсида под воздействием небольших сил до 4,4 нН. B - вирион ломается при

воздействии АСМ-зондом с силой около 7 нН. C - дальнейшее сжатие сломанного капсида

происходит очень легко: приложением совсем небольшой силы в 1 нН можно сжать капсид на

20 нм. D - Для сравнения в работе исследовали также капсиды с высвободившейся НК;

силовые кривые показывают, что пустой капсид мягче интактного вириона.

Рис. 18.2. Деформация капсида вируса герпеса под действием индентирования: до (A) и после

(B) индентирования. C - Соответствующие высотные профили, построенные вдоль

направления, показанного на рисунках А и В стрелками. D и E - Увеличенные изображения

центральной части вириона; АСМ позволяет идентифицировать капсомеры, смещенные в

результате деформации.

44

Клетки: смотреть в воде или на воздухе?

Рис. 27.1. Пролет над поверхностью, покрытой бактериями.

45Сканирование клеток на воздухе

Рис. 28.1. Рис. 5. Escherichia coli. Размер кадра

4,0 х 5,1 мкм2.

Рис. 28.2. Helicobacter pylori. Бактерии

покрывают поверхность подложки

монослойными островками. Размер кадра 3,9 х

3,9 мкм2.

Рис. 28.3. Lactobacillus. Края бактерии

повторяют форму зонда.

Приготовление образцов:

1. Суспензия с концентрацией 100 бактерий на

мл в дистиллированной воде,

2. Нанести 4 мкл на свежесколотую слюду на

1-2 минуты до высыхания

3. Смотреть сразу же.

46Исследования бактерий

Для исследования в жидкости бактерии из суспензии в дистиллированной воде

наносят аналогичным способом на:

1. поли-L-лизин

2. Лак (раствор нитроцеллюлозы и дибутилфталата в этилацетате и бутилацетате)

3. Агарозу

4. Микро-структурированные подложки

Рис. 29.1. АСМ-изображения кремниевой подложки и бактерий,

фиксированных на ней (изображение получено на воздухе).

Рис. 29.2. АСМ-изображение бактерий в лунках при сканировании в

жидкости и профиль отмеченного столбца.

Рис. 29.3. Наблюдение за делением бактерии в лунке. Отделившаяся

бактерия не фиксирована в лунке и удаляется зондом из области

сканирования.

L.Kailas et al., Ultramicroscopy, 109 (2009) 775–780.

47Еще раз о бактериях

A. Kempe et al. / Precambrian Research 140 (2005) 36–54.

Рис. 30.1. АСМ-изображение палеонтологических клеток.

48Сканирование клеток на воздухе

Рис. 31.1. Эритроциты в мазке, подвергнутые электропорации. Эритроциты после воздействия тока сохраняют

свою форму, но на поверхности появляются микроскопические поры.

Рис. 31.2. Эхтноцит – патологическая форма

эритроцита.

49Сканирование срезов клеток

Рис. 32.1. Поверхность эпоксидного блока, препарат печени мыши.

Рис. 32.2. Поверхность эпоксидного блока, препарат меристема корешка риса.

А. Роскошная и др. Тезисы конференции «Современные достижения

бионаноскопии», Москва-2011.

Рис. 32.3. Микротом.

Микротом – прибор, предназначенный для

приготовления срезов фиксированной и не

фиксированной биологической ткани, а также

небиологических образцов.

Микротомы, позволяющие получать срезы

толщиной 10-100 нм получили

название ультрамикротомов.

Рис. 32.4. Поверхность среза эпоксидного блока, препарат хряща.

50Сканирование срезов клеток

Методика приготовления срезов:

1. Слабо растущие клетки обработать 1% глутаральдегидом в PBS (pH 7.2)

при 0–4 C в течение 15 минут.

2. Промыть PBS.

3. Обработать в 1% тетроксиди осмия на 30 минут.

4. Промыть PBS

5. Обезвоживание обработками 1 раз в 30%, 50%, 70%, 95% и в чистом

этаноле 2 раза.

6. Обезвоживание в пропилен оксиде – 2 раза.

7. Инфильтрация в смеси 50% эпоксидной смолы (Epon 812 или epoxy resin

618) и 50% пропилен оксида в течение 2 часов на мешалке.

8. Инфильтрация 6 часов с чистой эпоксидной смолой при 37 С на мешалке.

9. Охладить при комнатной температуре.

10. Нарезать на микротоме, предпочтительно при помощи алмазного ножа на

срезы и перенести их на слюду так, как показано на рис. 33.1.

Рис. 33.1. Приготовление срезов.X. Li et al., Ultramicroscopy 108

(2008) 826–831

51Сканирование клеток в жидкости

Рис. 34.2. АСМ-изображения живого астроцита. Представлены типичные изображения. А –

Топографическое изображение живого астроцита в жидкости. Б – Соответствующее

изображение сигнала ошибки обратной связи. В – Профиль высоты астроцита, измеренный с

помощью АСМ вдоль белой линии на топографическом изображении. Г – Профиль сигнала

ошибки обратной связи вдоль той же линии.

Ю.М. Ефремов и др., Acta Naturae, 3(10), с. 81-87. - 2011.

52Силовое картирование клеток

Рис. 35.1. Модуль Юнга клеток до (синий) и

после (красный) воздействия ингибитора

формина SMIFH2 (20 мкм, 14 ч).

•Использовали кантилеверы, модифицированные микросферами диаметром 9 мкм,•Аппроксимировали по модели Герца,•Использовали эпителиальные клетки рака простаты DU-145, PC3, PC3-MM2 и LNCap, а также клетки Vero из эпителия почки африканской зеленой мартышки.

Ю. Ефремов, Тезисы конференции «Современные достижения бионаноскопии», Москва-2011.Ю.М. Ефремов и др., Acta Naturae, 3(10), с. 81-87. - 2011.

Рис. 35.2. Силовое картирование астроцита. А – Изображение живого астроцита (сигнал ошибки обратной связи) и

сетка, в точках которой снимались силовые кривые. Б – Карта значений модуля Юнга в точках сетки, значения

цветовой шкалы в кПа. Более светлые квадраты соответствуют большим значениям жесткости. B – Силовая

кривая, снятая в точке над краем клетки, часть кривой совпадает с кривой над подложкой. Зелеными

треугольниками отмечены точки контакта с поверхностью, синим треугольником отмечена точка упора в подложку.

Г – Силовая кривая, снятая в точке над ядром клетки. Д – Силовая кривая, снятая в точке над подложкой.

Диапазон смещения сканера на всех кривых составлял 2 мкм.

53Взаимодействие клеток друг с другом – исследование методом силовой спектроскопии

P.-H. Puech et al., Ultramicroscopy 106 (2006) 637–644

Рис. 36.1. (А) технология модификации зонда, (И) сканирование силы

адгезии.

Методика:

1. Зонд модифицировали лектином.

2. Надавливали несколько секунд на клетку меланомы и поднимали ее с

поверхности.

3. При помощи оптики проверяли, что клетка на кантилевере присутствует.

4. Зонд помещали над клетками эндотелия в интересующем месте.

Прикладывали силу (100-200 пН) на определенное время (2-3 сек)

5. Зонд отводили от поверхности и следили за явлениями адгезии.Рис. 36.2. Кривые адгезии. Полученные при различных

условиях.

54Подведем итоги…

Рис. 37.2. Поверхность эпоксидного блока, препарат меристема корешка риса.

Рис. 37.1. Эритроциты.

Рис.37.3. Вирус мозаики костра.

Рис. 37.4. Гуляющий миозин.

Рис.37.5. ДНК, порезанная рестриктазой.

55Сканирующая зондовая микроскопия биологических

объектов

Documents

лекция 07 --