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第 2 节 大肠杆菌表达系统

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IL 11 MNCVCRLVLVVLSLWPDTAVAPGPPPGPPRVSPDPRAELDSTVLLTRSLLADTRQLAAQLRDKFPADGDHNLDSLPTLAMSAGALGALQLPGVLTRLRADLLSYLRHVQWLRRAGGSSLKTLEPELGTLQARLDRLLRRLQLLMSRLALPQPPPDPPAPPLAPPSSAWGGIRAAHAILGGLHLTLDWAVRGLLLLKTRL

1) 分子量、等电点2) 信号肽3) 糖基化4) 蛋白酶裂解位点5) 有无二硫键（根据 C 的数量初步判断）

1 了解要目的基因蛋白质的一级结构http://www.expasy.ch

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分子量、等电点

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信号肽

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糖基化

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蛋白酶裂解位点

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• 2 分析基因的限制性内切酶谱，确定插入质粒的限制性内切酶位点

atgaactgtgtttg ccgcctggtc ctggtcgtgc tgagcctgtg gccagataca gctgtcgccc ctgggccacc acctggcccc cctcgagttt ccccagaccc tcgggccgag ctggacagca ccgtgctcct gacccgctct ctcctggcgg acacgcggca gctggctgca cagctgaggg acaaattccc agctgacggg gaccacaacc tggattccct gcccaccctg gccatgagtg cgggggcact gggagctcta cagctcccag gtgtgctgac aaggctgcga gcggacctac tgtcctacct gcggcacgtg cagtggctgc gccgggcagg tggctcttcc ctgaagaccc tggagcccga gctgggcacc ctgcaggccc gactggaccg gctgctgcgc cggctgcagc tcctgatgtc ccgcctggcc ctgccccagc cacccccgga cccgccggcg cccccgctgg cgcccccctc ctcagcctgg gggggcatca gggccgccca cgccatcctg ggggggctgc acctgacact tgactgggcc gtgaggggac tgctgctgct gaagactcgg

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http://www.restrictionmapper.org/

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3 选择合适的表达系统

• 查看表达载体图谱及特性

• 插入位点是否合适

• 融合标签是否合适

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目的基因 (IL 11) 引物设计 ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲xxxxxx atgaactgtgtttg ccgcctggtc ctggtcgtgc tgagc

ctgtg gccagataca gctgtcgccc ctgggccacc acctggcccc cctcgagttt ccccagaccc tcgggccgag ctggacagca ccgtgctcct gacccgctct ctcctggcgg acacgcggca gctggctgca cagctgaggg acaaattccc agctgacggg gaccacaacc tggattccct gcccaccctg gccatgagtg cgggggcact gggagctcta cagctcccag gtgtgctgac aaggctgcga gcggacctac tgtcctacct gcggcacgtg cagtggctgc gccgggcagg tggctcttcc ctgaagaccc tggagcccga gctgggcacc ctgcaggccc gactggaccg gctgctgcgc cggctgcagc tcctgatgtc ccgcctggcc ctgccccagc cacccccgga cccgccggcg cccccgctgg cgcccccctc ctcagcctgg gggggcatca gggccgccca cgccatcctg ggggggctgc acctgacact tgactgggcc gtgaggggac tgctgctgct gaagactcgg xxxxxx ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲

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cDNA

PCR

EcoRIXhoI

PCR 扩增基因RNA

设计表达引物

准备模板

PCR

纯化 酶切 纯化

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PCR 技术克隆基因

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PCR 反应组分

• 94 ° C 2’• 94 ° C 30’’• 55 ° C 45’’• 72 ° C 1’• 72 ° C 10’

50μl volume

Distilled Water X μl

10X buffer 5 μl

2.5 mM dNTP 4 μl

25 Mm MgCl2 3 μl

Template 1 μl

Forward Primer 1 μl

Reverse Primer 1 μl

Taq 酶 0.25 μl

加热盖

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热起动

DMSO

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酶切反应• 1μl 10 x buffer （ H ， M ， L ）• 1 μl 限制性内切酶• 4 μl DNA (PCR 产物 , 质粒 )

• 4 μl 灭菌水

• Mix

• 37℃， 1-2 h

双酶切EcR I, Xho I

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琼脂糖电泳检测质粒是否切开

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纯化酶切后的 PCR 产物、质粒酚氯仿抽提 , 或用 kit 纯化

酚 / 氯仿抽提法纯化 DNA 的步骤如下：1 、 向酶切样品中加入灭菌水至总体积为 100 µL ；2 、 加入等体积的酚 / 氯仿，涡漩；3 、 10,000 rpm ， 5min ；4 、 转移上清至新的离心管中（应避免吸取中间层的蛋白）；5 、 加入上清体积 1/10 的 3M 乙酸钠（ pH5.2 ）和两倍总体积的 100 ％的乙醇，冰浴 30 min 。6 、 4℃离心， 10,000 rpm ， 10 min ；7 、 去上清，加 100 µL 70 ％乙醇，洗涤沉淀；8 、 10,000 rpm 离心 2 min ，去乙醇；9 、 再离心 1 min ，去乙醇；10 、真空干燥，完全去除乙醇以后，重溶于 10 µL 灭菌水中， –20℃保存，备用。

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连接反应 10 μl

• X μl 载体• X μl DNA

• X μl ddWater

• 1μl 10X T4 连接酶 buffer

• 1μl PEG

• 1μl T4 DNA 连接酶

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PCR 筛选，酶切确认，提取质粒测序

目的基因克隆酶切 质粒提取、酶切

连接、转化克隆质粒

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转化宿主细胞 1 l 重组载体 +10 l 水50 l 感受态细胞（冰浴中）

冰水中 30 min

42℃水浴 75 sec

加入 1 ml LB 液体培养基混匀 , 37℃水浴， 1 h

6,000 rpm ， 2 min

去掉大部分上清液留 100 l 左右 , 悬起细胞涂平板

LB 平板抗生素

半开盖，37 15min℃

37 ℃ ，倒置平板过夜

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挑选菌落 , 保种 , PCR 检测 , 或测序

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1. 大肠杆菌染色体 DNA 分子量很大。在提取质粒过程中，染色体 DNA 往往断裂成线状大分子；质粒的分子量较小，是共价闭合环状的超螺旋 DNA 。

2. 当细胞用碱裂解时 (pH l2.0—12.6) ，线状 DNA 发生变性，共价闭环的质粒 DNA 不发生变性。

3. 在高盐浓度下将裂解液 pH 恢复至中性时，变性了的染色体 DNA 交织成网状而发生沉淀，可以用离心的方法除去染色体 DNA 沉淀物。共价闭环的质粒 DNA 不发生沉淀 , 留在离心上清液中。

4. 用有机溶剂沉淀出质粒 DNA 。

提取质粒原理及方法

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1. 培养细胞 , 加抗生素

2. 收集细胞 , 14,000 × g , 1 min.

3. 悬浮细胞 于 0.3 ml of Solution I [15 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA, 100 μg/ml RNase A].

碱变性 Add 0.3 ml of Solution II (0.2 N NaOH, 1% SDS) , gently mix, Incubate at room temperature for 5 min. Note: The appearance of the suspension should change from very turbid to almost translucent.

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4. 高盐、复中， Slowly add 0.3 ml of 3 M potassium acetate (pH 5.5), mixing gently during addition. A thick white precipitate of protein and E. coli genomic DNA will form.

Place the sample on ice for 5 to 10 min.

5. 离心 Centrifuge for 10 min at 14,000 × g.

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6. 沉淀 Gently transfer the supernatant to the tube containing isopropanol. Avoid any white precipitate material. Mix by gently inverting tube a few times and place on ice for 5 to 10 min.

7. 收集 DNA ， Centrifuge the sample for 15 min at 14,000 × g at room temperature.

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8. 洗涤 , 70% ethanol to each tube. Invert the tube several times to wash the pellet. Centrifuge for 5 min at 14,000 × g at room temperature.

9. 去上清液

10. 风干 5 to 10 min at room temperature and dissolve the DNA in 40 μl TE.

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SDS-PAGE 检测表达情况

试表达

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cDNA

PCR

EcoRI/XhoI双酶切

pBR322 ori

pGEX 4T14900bp

EcoR I Xho I

Bal I

转化宿主菌BL21

BL21(DE3)JM109

纯化 纯化

EcoRIXhoI

HHR3

pGEX 4T14900bp

T4DNA 连接酶

RNA

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工作进程第一天 , PCR 扩增基因 摇质粒菌第二天 , 提质粒 纯化 PCR 产物和质粒 酶切 , 纯化 连接第三天 , 转化第四天 , 挑菌株检测 , 保种 过夜培养第五天 , 转培养 , 诱导表达第六天 , SDS-PAGE 检测

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各种类型原核表达系统的构成和特点

融合表达 外源基因与载体上的一段蛋白质编码基因形成一个读框 , 表达出融合蛋白

融合表达特别注意： * 表达读框与载体上的标签要一致，不能移码！！！ *如果表达后要切去标签，需要在构建载体前检查目

的蛋白中有无相同的蛋白酶裂解位点。

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pGEXpGEX 2T

复制子筛选标记可控启动子终止子多克隆位点

谷胱甘肽巯基转移酶基因 (GST),外源基因与 GST 融合表达成为一个杂和蛋白。

可以用蛋白酶切下来。

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pET 表达载体

His Tag

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非融合表达 独立的外源基因表达 ,更接近天然的蛋白

质

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6 大肠杆菌表达系统的问题

缺点 1 ）缺乏翻译后修饰，如糖基化

2 ）常形成包涵体，复性效果差

3 ）蛋白质易被降解

4 ） 内毒素难以除尽

优点

1 ）简单 ,经济 ,快速

2 ）适合于制备抗体 , 供下游研究