第七章 食品中有害有毒物质

食品中的有毒有害物质：

食品中内源性有害成分

（过敏原、有害糖苷类、凝集素、皂素等）食品中外源性有害成分

（重金属、农药残留、二噁英、兽药等）食物中的真菌毒素

7.1 农药7.1.1 农药残留概述农药残留物是指由于喷施农药后存留在环境和农

产品、食品、饲料、药材中的农药及其降解代谢产物、杂质，还包括环境背景中存有的污染或持久性农药的残留物再次在商品中行成的残留。

农药残留物量是指农药本体物及其代谢物的残留量的总和，并构成不同程度的毒性。

农药的残留毒性（残毒）：残留农药在食物上达到一定的浓度（即残留量）后，人或其它高等动物长期进食这些食物，就会使农药在体内积累起来，引起慢性中毒。

农药的残毒的三个来源：施用农药后药剂对作物的直接污染；作物对污染环境中农药的吸收；生物富集与食物链。

农药的残毒所造成的污染是多方面的。在农药残留的分析过程中，分离技术往往占主导

地位。由于各种色谱检测器的选择性，针对不同类型的有机化合物常需要不同的前处理技术。

7.1.2 农药的分类• 根据防治对象的不同，常将防治害虫的农药称为

杀虫剂，防治红蜘蛛的称为杀螨剂，防治作物病菌的称为杀菌剂，防治杂草的称为除草剂，防治鼠类的称为杀鼠剂。

• 根据化学组成和结构可分为无机农药、有机农药（例如有机氯、有机磷、有机砷、有机氟等）。

• 主要介绍有机氯杀虫剂、有机磷杀虫剂、拟除虫菊酯杀虫剂的残留分析技术。

7.1.3 有机氯杀虫剂的残留分析有机氯农药（ Organochlorine pesticides, OCPs)

是具有杀虫活性的氯代烃的总称。OCPs 分为三种类型：六六六； DDT 及其类似物；

环戊二烯衍生物。这三类不同的氯代烃均为神经毒性物质，正常环境下不易分解。易通过食物链在生物体脂肪中富集和积累。

从 20 世纪 70 年代开始，许多工业化国家相继限用或禁用 DDT 、六六六及狄氏剂。

有机氯杀虫剂的残留分析方法在农药残留中是研究最早的。

在有机氯农药（ OCPs ）分析领域最为广泛使用的检测技术是气相色谱 /电子捕获检测器（ GC-ECD ），它具有灵敏度高、分离效果好、定量准确等特点，是一种经典的分析方法。色谱柱通常是弱极性至中级性柱，检测器一般用 ECD 。

DDT1874 年 Baeyer首次合成。

Müller发现它的杀虫作用，获瑞士专利，并于 1

948 年获诺贝尔医学奖。

对温血动物急毒性低，对大白鼠的口服急性毒性LD50 为 250-500mg/kg ，但 DDT以及主要的代谢物 DDE容易在动物脂肪中积累。

H

CCl3

Cl Cl

Cl

ClCl

ClCl

Cl

六六六（ BHC）六六六的工业品是多种异构体的混合物，其活性组分 γ-BHC仅占 15%左右，其余均为无效组分。广谱性杀虫剂。 γ-BHC 积累体内的危险性很小，对大白鼠口服急性毒性 LD50 为 76-200mg/kg ，积累在动物脂肪、奶中的 BHC能很快排出体外。但工业品中 β-BHC

积累的可能性和慢性中毒性很大。

γ-BHC

ClCl

Cl

Cl

ClCl

艾氏剂

艾氏剂具有较高的蒸气压，可以以颗粒剂的形式作为土壤杀虫剂。大鼠口服急性毒性 LD50 为 67

mg/kg ，由于它在血液中有较高的溶解度，因此容易扩散到所有的组织中，特别是脂肪组织。

有机氯杀虫剂残留的分析方法

• 有关有机氯杀虫剂的残留分析方法在农药残留中是研究最早的，对于仅有 BHC和 DDT农药的前处理可用浓硫酸磺化法处理，对同时含有艾氏剂、狄氏剂等多种有机氯杀虫剂时，一般采用氟罗里硅土柱净化。选用的色谱柱通常是弱极性至中极性柱。检测器一般用 ECD和MSD。

水果、蔬菜中多种有机氯残留农药的毛细管气相色谱测定方法：

1. 样品的提取与净化 水果、蔬菜类样品置于组织捣碎机中高速捣碎，

作为试验样品。称取样品 20g于 250ml具塞三角烧瓶中，加入 100ml 石油醚－丙酮（ 4：1 ），振荡 30min。用布氏漏斗抽滤，以适量石油醚洗涤残渣，滤液合并于 500ml分液漏斗中，用水洗涤除去丙酮。上层石油醚经无水硫酸钠脱水收集于三角瓶中，旋转蒸发浓缩至5ml。

• 在 2cm（ ID）×25cm玻璃层析柱中，于底部加入少许玻璃棉，依次加入 1cm高的无水硫酸钠， 5gFlorisil和 1cm无水硫酸钠。先以40ml无水乙醚－石油醚液（ 15： 85）预洗柱子，弃掉淋出液。把浓缩的样液移入柱内，以适量无水乙醚－石油醚液（ 15： 85）洗脱，收集全部洗脱液，于 40℃水浴上减压浓缩至40ml，以石油醚定容，供色谱分析。

2. 色谱条件 色谱柱： 50m ×0.25mm（内径）；膜厚0.20um，固定相为 CP-Sil 19CB，弹性石英毛细管柱。

氮气作为流动相，进样温度 250℃，检测器温度300℃，采用不分流进样方式，进样量 1uL，进样0.75min后吹扫。

柱温程序：柱温 100℃，恒温4min以后以8℃/min的速率程序升温至 240℃，继续恒温 20min至样品全部流出。

近几年来有机氯农药残留分析结果：海鸟蛋，海豹，鱼粉，鱼油：毒杀芬

地表水，橄榄油：硫丹

淡水鱼： DDE

饮用水： 16 种 OCPs

水果蔬菜： 9~24 种 OCPs

药材： 7~18 种 OCPs

7.1.4 有机磷杀虫剂残留的分析 有机磷农药（ OPPs) 是含有 C-P键或 C-O-P 、 C-S-P 、 C-N-

P键的有机化合物。大部分不溶于水，而溶于有机溶剂。在中性和酸性条件下稳定，

不易水解，在碱性条件下易水解失效。 接触可造成中毒，它们的毒性依赖于其结构和功能团。例如，含 P=O键（如敌百虫、对氧磷）的毒性通常比含 P=S （如马拉硫磷）大。这些化合物主要是抑制生物体内胆碱酯酶的酶活性，导致乙酰胆碱这种传导介质代谢紊乱，产生迟发性神经毒性，引起运动失调、昏迷、呼吸中枢麻痹甚至死亡。

有机磷杀虫剂由于药效高，易被水、酶及微生物所降解，很少残留毒性等，因此目前在杀虫剂的使用方面，它仍然起主要作用。

目前正式商品化的有机磷农药有上百种，如敌敌畏、敌百虫、马拉硫磷等。敌敌畏（ DDV）• O， O- 二甲基 -O- （ 2 ， 2- 二氯）乙烯基磷酸酯• 无色液体，有芳香味，在水中约能溶 1% ，能与大部分有机溶剂相溶。

• DDV 是一种触杀和胃毒杀虫剂。对蝇、蚊、飞蛾等击倒速度很快。

• 对雄大鼠的口服急性毒性 LD50 为 80mg/kg ，在温血动物体内很快降解。

敌百虫 • O， O- 二甲基 -1-羟基 -2 ， 2 ， 3- 三氯乙基磷酸酯

• 敌百虫是一种触杀和胃毒杀虫剂。对双翅目昆虫很有效。

• 敌百虫本身对乙酰胆碱酯酶抑制力很弱，但它在生理 pH条件下就能转变成强抑制剂 DDV 。

乐果 • O,O- 二甲基 -S- （ N-甲基氨基甲酰甲基）二硫

代磷酸酯• 第一个对哺乳动物低毒的有机磷内吸杀虫剂。• 乐果是一种触杀性和内吸性杀虫杀螨剂。• 乐果在贮存中不很稳定，特别在温度高和存在碱及二硫代磷酸二甲酯时会分解，主要是发生烷基化反应。铁可加速其分解。

检测方法• 检测有机磷的分析方法有波谱法、色谱法、酶抑制法三大类。

• 波谱法是跟据有机磷农药中某些官能团或水解、还原产物与特殊的显色剂在一定的条件下，发生氧化、磺酸化、酯化、配合等化学反应，产生特定波长的颜色反应来进行定性和定量测定，检测限在 μg级水平。

色谱法(1) 薄层色谱法是一种比较成熟的、广泛应用的微量快速检测方法，检出限达 0.1~0.01μg 。

(2) GC

AOAC 在 20 世纪 80 年代就对大部分有机磷农药建立了气相色谱分析方法，我国食品理化检验国家标准方法也采用了气相色谱检测有机磷杀虫剂。随着气相色谱仪的普及，对可能存在有机磷农药残留的样品，如食品、果蔬、饲料、水产品、土壤、水体及血液、化妆品等都建立了气相色谱分析方法。

(3) HPLC

对气相色谱不能检测的高沸点或热不稳定、易裂解变质的有机磷农药可以采用 HPLC 法检测。AOAC 中有近半数的有机磷农药都建立了 HPLC

法，研究报道也较多。 当使用 GC 或 HPLC发现违规的农药残留时，必须使用其它方法来确认。 可以利用 GC借助其在两根或多根极性不同的柱子上的保留时间来确认，也可以用 GC/MS 。

• 酶抑制法是利用有机磷杀虫剂的毒理性质建立的一种快速检测方法。

• 由于有机磷能抑制乙酰胆碱酯酶的活性，使该酶分解乙酰胆碱的速度减慢或停止，再利用一些特定的颜色反应来反映被抑制程度，从而达到检测目的。

• 操作简单、速度快，不需昂贵仪器，特别适合现场检测以及大批量样品的筛选。

• 灵敏度、重复性和回收率相对较差。

• 新方法：酶抑制 -生物芯片分析法。

茶叶中多种有机磷农药残留量测定方法： 提取 称取0.5g粉碎茶叶于试管中，加入 2ml蒸馏水

和无水硫酸钠，在混匀器上混匀，加入 2ml乙酸乙酯，混匀，离心，取上清液。残渣用乙酸乙酯和正己烷（ 1 ： 1 ）混合液再提取一次，合并两次提取液，过活性炭小柱，用乙酸乙酯：正己烷（ 1 ： 1 ）混合液洗脱，将洗脱液低温浓缩至0.5ml，供气相色谱分析。外标法峰面积定量。

色谱条件• 色谱柱： HP-1石英毛细管柱，氮磷检测器，流动相：氮气、氢气和空气。

• 程序升温： 60℃（保持 0.5min），以 10℃/min，至 250℃（保持 3min）。

• 进样口温度： 250℃。• 检测器温度： 300℃。• 不分流进样：进样量 1uL。

7.1.5 拟除虫菊酯的残留分析

• 拟除虫菊酯（ pyrethroids)是一类重要的杀虫剂，具有高效、广谱、低毒和生物降解等特性。

• 拟除虫菊酯在化学结构上具有共同的特点之一是分子结构中含有数个不对称碳原子，因而包含多个光学和立体异构体。它们具有不同的生物活性，即杀虫效果也不大相同。

拟除虫菊酯的检测 在植物样品中拟除虫菊酯的测定要点： 提取一般采用匀浆提取法，对于色素较深的样品，可在匀浆时加入活性炭再进行。也有用索氏提取器用乙醚提取的报道。

提取溶剂多用丙酮。 净化通常采取液液分配加柱层析法，层析柱填料多用氟罗里硅土和硅胶。

检测仪器一般用气相色谱带电子捕获检测器，但也有用 HPLC/UV的报道。

气相色谱测定一般采用非极性至弱极性柱。

除虫菊酯农药热稳定性较高，使用毛细管色谱柱在高温区段（ 250-280℃）有利于分离，杂质干扰较少，用 ECD检测灵敏度较高，可以满足食品中拟除虫菊酯农药残留量的测定。

将有机氯和拟除虫菊酯农药同时测定，在一般情况下，有机氯如 BHC、 DDT出峰在前，而拟除虫菊酯出峰在后。

水果、蔬菜中拟除虫菊酯残留量测定1. 前处理• 称取约 20g试样，至于锥形瓶中，加入适量丙酮，振荡 40min，过滤。用丙酮洗涤残渣，将滤液收集在 100ml 容量瓶中，并用丙酮定容。

• 吸取 5ml 提取液于具塞离心管中，加入 20ml2％硫酸钠溶液，用正己烷萃取两次。合并萃取液，并通过无水硫酸钠柱脱水并以少量正己烷洗涤柱。流出液合并后浓缩至 1ml。在微型层析柱的下端填入少量脱脂棉，依次装入 0.5cm高的无水硫酸钠、 1g硅胶和 1cm高的无水硫酸钠。用 5ml正己烷预淋洗层析柱，弃去流出液。将浓缩液倒入柱内，以二氯甲烷淋洗层析柱，收集洗脱液，浓缩至干，再以正己烷定容，供气相色谱测定。

2. 色谱条件色谱柱： HP-5MS石英毛细管柱氮气： 1ml/min柱温： 60℃（保持 0.5min），以 10℃/min，至

280℃（保持 20min）进样口温度： 260℃检测器 ECD温度： 280℃进样方式：不分流

7.1.6 多种类农药残留量测定方法目前国际上通常是使用一个前处理方法，用不同

的仪器系列测定，同时测定多达上百种的农药，特别是 GC/MS 方法的使用使得在色谱上难以分离的化合物用选择离子的方式进行分别测定，可在一次进样中测定 200 多种农药。

例：茶叶中多杂环类农药残留测定用 GC/ECD 检测怀疑含有的有机氯农药残留，再以 GC/MS-MS 进行确认及定量分析。

水果、蔬菜和牛奶中农药残留的气质联机分析1.提取 取 50g切碎的样品（或牛奶）于捣碎器中，加入 100ml 乙腈－乙醇（ 95： 5）混合液，捣碎 5min。加入 15g氯化钠，继续捣碎 5min。转移 40ml上层有机相于 200ml离心瓶中，加入 15g无水硫酸钠充分振荡，高速离心 5min。定量移取 30m至浓缩管中，通 N2 在 35℃下浓缩至 5ml。在固相萃取柱中加 2cm无水硫酸钠，用 5ml甲苯淋洗。将75ml 淋洗液储备管、 Envi-Carb固相萃取柱、 SAX固相萃取柱和 PSA固相萃取柱从上至下，按顺序相连，用乙腈 -甲苯（ 3 ： 1 ）预淋。将浓缩液转到储备管中，通氮气将样品推入Envi-Carb柱中。每次用 10ml 乙腈 -甲苯（ 3 ： 1 ）淋洗，共淋洗 4次，收集淋洗液于浓缩瓶中，并浓缩至 1ml。加入约 10ml 丙酮再浓缩至 2ml。

2. 仪器条件GC/MS-MS条件 离子阱温度 200℃ 进样口温度：升温程序为初始温度 53℃，初始时间 0.3min，升温速率 300℃/min，最终温度 250℃。

柱压： 10psi（ 1psi＝ 6894.76Pa） 分流阀：初始条件，打开； 0.45min，关闭； 2min，打

开；流比： 100 进样量： 5ulGC条件 初始温度 55℃，保持 2min，以 10℃/min 升至 230℃，保持 10min，以 20℃/min 升至 275℃，保持 19min。

7.2 兽药 在食用动物饲养过程中广泛使用药物，会造成药物残留在可

食用产品中。动物性食品的药物残留会对人类健康产生影响。 兽药的检测方法包括：筛查，检测和确认。 筛查方法是就某种基质中一定浓度的某种药物做出阳性或阴

性反应的试验方法：微生物抑制试验（用于对大批量样品进行抗生素筛查）、放射和酶免疫快速测试盒（对指定药物的筛查）。只能分类，不能确认是某种具体的化合物。

如果样品中确实存在违规的药物残留，就需要使用其它的分析方法来确认：薄层色谱法、 GC、 HPLC、 GC/MS和 HPLC/MS。

7.2.1 β-兴奋剂的残留分析 β-激动剂，在化学上属苯乙醇胺，为儿茶酚胺、肾上腺

素和去甲肾上腺素的化学类似物。一般可分为含取代基的苯胺型（如克伦特罗）和苯酚型（如沙丁胺醇）两大类。

它能与肌体绝大多数组织细胞膜上 β-受体发生作用。某些合成的 β-激动剂，当以高剂量饲养动物时，会导致营养物质从脂肪组织向肌肉组织的转移，使畜禽瘦肉增加。由于这种用法造成的可是用组织中的药物残留在毒理学等方面的种种问题，致使许多国家禁止在使用动物中使用该类药物。

测定方法• 检测 β-兴奋剂的样品种类很多，有饲料、尿、血浆、内脏（肝、肾）、肌肉、毛发、视网膜等。其中最能积累 β-兴奋剂的是内脏、视网膜。所以，在上述样品中，检测是否违法使用 β-兴奋剂作为生长促进剂的合适样品是肝脏。另外，尿样本前处理较简单，可实现快速检测。

1. 样品的前处理• 样品的前处理包括样品提取、酶解（酸解）、净化，如果采用 GC检测，还增加衍生化步骤。

• β-兴奋剂检测进行酸解、酶解的必要性：因为β-兴奋剂在样品中往往会与其它成分形成结合物，如在葡糖苷酸酶、硫酸酯蛋白相结合，所以样品在提取氏要用酸或酶水解。

• 酶解、酸解的条件选择：酶的品种、酶解的酶用量、酶解时间

提取• 提取的方法有液液萃取法、固相萃取法、超临界提取法。净化• 最常用的净化手段是固相萃取法（ SPE），也有

人采用免疫亲和色谱法、液液净化法。• 免疫亲和色谱法：用实验动物生产出特异性抗体，抗体纯化后被结合到琼脂糖胶上制成柱，样品上柱后， β-兴奋剂就与这些柱上的抗体结合在一起而保留下来，然后再用溶剂洗脱。现在已有商品化的可重复使用的 IAC柱。

衍生化 GC/MS、 GC/FTIR确证前，采用衍生化技

术以提高检测灵敏度。最常用的衍生化试剂有：三甲基硅烷（ TMS）、环状二甲基硅烷吗啉（ DMS）。另外还有碳酰氯（ COCl2 ）、甲基硼酸（MBA）、五氟一丙酐。

2. 检测• GC/MS 这是 β-兴奋剂检测非常有效、灵敏、准确的手段，电离方式有电子轰击 EI、化学离子化 CI两种方式。

采用 TMS作衍生化试剂、 EI 电离方式电离某些β-兴奋剂的碎片如下：克伦特罗： 86， 262 ， 243 ， 333 ， 277 ， 187沙丁胺醇： 86， 369， 350， 440， 384， 294特布他林： 86， 356， 336， 426， 370， 280

• HPLC 常用的检测器有紫外（ UV）、荧光、电化学等。• 免疫分析法 放射免疫分析法、酶免疫分析法 优点：一次可处理多个样品、有商品化试剂盒供应，检测灵敏度高

• 薄层色谱法• HPLC/MS• GC/FTIR

合成的 β-激动剂

瘦肉精——克伦特罗；盐酸克伦特罗；盐酸双氯醇胺；克喘素；氨哮素；氨必妥；氨双氯喘通；氨双氯醇胺。 化学名为“ 2-「（叔丁氨基）甲基」－ 4-氨基 -3 ，5-二氯苯甲醇盐酸盐”，是一种从天然儿茶酚胺衍生合成的化合物；也称羟甲叔丁肾上腺素 , 是一种强效兴奋剂。

上世纪 80 年代初，美国脂胺公司研究人员意外地发现，将一定量的盐酸克伦特罗加入饲料中，能够改变营养物质的代谢途径，促进动物肌肉特别是骨胳肌蛋白质的合成，同时抑制脂肪合成，从而促进动物生长，增加瘦肉率。根据试验得出，在饲料中添加适量的盐酸克伦特罗，可以提高饲料转化率、生长速率、瘦肉相对增加 10％以上，于是这项技术开始在养殖业中大行其道。

瘦肉精用于养殖的发现

作用机理

它的主要作用机理是作为一种强效激动剂，选择

性的作用于肾上腺素 β2受体上，激活腺苷酸环化酶

(cAMP)，使环磷腺苷增加，加强脂肪分解，促进蛋白质合成，实现动物营养再分配，故又将瘦肉精称作“生长促进剂 (growth promoter)”和营养“重分配剂 (repartitioning agent)”。

为提高猪肉的瘦肉率，瘦肉精作为饲料添加剂，使用剂量是人用药剂量的 10倍以上。它用量大、使用的时间长、代谢慢，所以屠宰后上市的猪肉中瘦肉精残留量很大。同时该药化学性质稳定，一般加热方法不能将其破坏。残留药物通过食物进入人体，大量积蓄使人中毒。如果一次摄入量过大，会导致严重中毒。

瘦肉精的危害

对人的危害的主要表现

反复使用会产生耐受性，对支气管扩张作用减弱及持续时间缩短。

克伦特罗还可通过胎盘屏障进入胎儿体内产生蓄积，从而影响子代。

易引起急性中毒：表现为心悸，面颈、四肢肌肉颤抖，头晕、乏力。心动过速，室性早博，心电图示S-T段压低与 T波倒置。

与糖皮质激素合用可引起低血钾，从而导致心律失常。

1998 年 5月，香港因内地供港猪肉内脏含 β-兴奋剂而发生中毒事件，事后在宁波供港猪场和基地牧场查出 β-兴奋剂等违禁药品 4000 多公斤。

动物性食品中毒案例一

2001 年 8月 22日，广东信宜市 510 人因食用残留盐酸克伦特罗的猪肉而中毒，其中 51

人出现严重的中毒现象。11月 7日广东省河源市 484

人，也都因食用含有盐酸克伦特罗的猪肉或猪肝而中毒。

动物性食品中毒案例二

项目 指标 (mg/kg) 项目 指标 (mg/kg)

挥发性盐氮 ≤15． 0 六六六 (以脂肪计 )

≤4． 0

汞 (以Hg计 ) ≤0． 05 滴滴涕 (以脂肪计 )

≤2． 0

铅 (以Pb计 ) ≤0． 5 敌敌畏 0

砷 (以总 As计 )

≤0． 5 β—兴奋剂 0

镉 (以Cd计 ) ≤0． 1 土霉素 ≤0． 1

铬 (以 Cr计 ) ≤1． 0 磺胺类 ≤0． 1

解冻失水率％ ) ≤8． 0 伊维菌素 ≤0． 02

金霉素 ≤0． 1 氯霉素 0

无公害猪肉理化指标

国家或地区 样品名称 最大允许量 µg/kg(µg/L)

中国农业部 猪尿动物性食品、鲜冻禽产品

马、牛肌肉肝、肾牛奶

1不得检出0.1µg/kg0.5µg/kg0.05µg/kg

香港 猪尿 ≤1

英国 食用组织 0.5

荷兰 肝 1.0

FDA/WHO 动物组织肉 /脂肪肝 /肾乳

0.20.60.05

欧盟和 Codex

牛奶肝肉

＜ 0.050.50.2

克伦特罗药物的允许量

但当前瘦肉精却屡禁不止，原因之一就是国内外检测 CLB的方法手段还不够完善，还没有建立宰前监测体系和准确迅速方便精确的检测方法，从而使不法分子有机可乘。

当前现状

感官识别

色谱检测技术

免疫分析技术 (IA)

综合化学法

电化学检测

瘦肉精的检测方法

一般含盐酸克伦特罗的猪肉色特别鲜红，脂肪非常薄，肉皮紧贴着瘦肉，瘦肉纤维比较疏松，肉皮与瘦肉之间几乎无肥肉 ( 肥膘厚度不到 1.5cm)

一般健康肉淡红色肉质弹性好 通过这种感官识别方法就可以快速简单定性对动物性食品中有无 CLB 作出初步判定。 缺点：只是一种经验的判断，不够准确

感官识别

项目 指标

色泽 红色、有光泽、无淤血、脂肪乳白色

组织状态 坚韧、有弹性、指压后凹隐立即恢复

粘度 外表微干或微湿润、不粘手

气味 有鲜猪肉正常气味、无异味

煮沸后肉汤 澄清透明、脂肪团聚于表面

肉也可见杂质 无

无公害猪肉感官指标

色谱检测技术高效液相色谱 (HPLC)

毛细管区带电泳法 (CE)

高效液相色谱质 -谱联用法 (HPLC-MS)

气相色谱 -傅立叶红外联用法 (GC- FTIR)

薄层色谱法 (TLC)

气相色谱质谱联用法 (GC- MS)

方法 优点 缺点

HPLC法

精确度高、检测限低(1-15ng/g)、假阳性率低

过程繁琐、时间长、仪器贵重、难于操作

GC-MS法

高效快速、高灵敏度、可定性定量、假阳性率低 , 检测限 0.25μg/kg

过程繁琐、时间长、仪器贵重、难于操作

CE法 灵活、多参数可调、操作简便、所需样品少、最低检测限 0.5ng/ml

检测时间长、仪器复杂

色谱检测技术

克伦特罗在碳糊电极和铂碳电极表面有不可逆氧化波产生，可直接采用电化学方法进行测定。但是，电化学系统仪器和毛细管电泳仪均不是一般实验室常备检测仪器，不利于大量样品中克伦特罗残留测定。

电化学检测技术

综合化学法

根据 CLB 的化学结构， CLB 可显芳香第一胺类的鉴别反应，也可以显氯化物的鉴别反应。 该法仪器与试剂廉价，无复杂的样品前处理，操作简单，适合基层防疫工作者初选 CLB 残留的方法。但最低检测限较高，灵敏度低。

免疫分析技术 (IA)

免疫分析是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的新型分析技术。 免疫反应具有很高的选择性和灵敏性，因此，免疫分析技术无论作为兽药残留分析的检测手段还是样本净化方法都能使分析过程特别是前处理步骤大大简化。

免疫分析技术 (IA)

酶免疫分析技术 (EIA)

放射免疫分析技术 (RIA)

荧光免疫分析法 (简称荧免法， FIA)

胶体金免疫技术 (DIGFA)

根据检测 CLB标记物的不同主要有：

放射免疫分析法具有特异性强，灵敏度高，准确、快速，操作简便，易于标准化等优点；目前国外已有很多 RIA试剂盒投放市场，这些试剂盒可检测一种或多种 β-兴奋剂。 但是由于放射免疫分析法需要较昂贵的液体闪烁仪或放射仪，且放射性同位素对工作人员有一定的伤害，废弃物又不易处理，这些不利因素限制了该法的广泛应用。

放射免疫

荧光免疫分析法 (FIA) 克服了放射免疫法中的核辐射缺点。其检测限 10ng/ml 。 荧免法检测药物残留具有特异性高，稳定性好，对样品处理要求简单，一次可检测多个样品等优点。 缺点是对温度的强烈依赖性和荧光强度取决于激发波长，因此在药物分析方面应用较少。

荧光免疫

金标免疫分析技术采用胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。最大特点是单份测定、简单快速、特异敏感， 10min 左右就可以看到颜色鲜明的测试结果。其检测灵敏度为5～ 10 ng/ml。 但其大批量测定时费用高于现有的酶标记法。

胶体金免疫分析技术 (GICA)

酶免疫分析

酶免疫分析技术 (EIA)

传统酶联免疫分析 (显色底物 )

荧光酶免疫分析 (荧光底物 )

化学发光酶免疫分析 (化学发光底物 )

7.2.2 抗生素

广义抗生素包括微生物的抗生素（抗细菌、抗真菌、抗立克次体、抗衣原体和抗病毒等）和抗肿瘤抗生素。

常用的抗生素（或临床抗生素）主要是指抗微生物感染的抗生素。

抗生素的分类作用机理分类 化学分类 代表性药物

杀菌性抗生素

破坏细菌细胞壁合成的抗生素

青霉素类 青霉素头孢菌素类 头孢噻吩磷霉素类 磷霉素万古霉素类 万古霉素

影响细菌核酸合成的抗生素 利福霉素类 利福平

损伤细菌细胞膜的抗生素 多黏菌素类 多黏菌素 B

抑菌性抗生素

抑制细菌蛋白质合成的抗生素

氨基苷类 庆大霉素四环族类 四环素大环内酯类 红霉素氨胺苯醇类 氯霉素林可霉素类 克林霉素

7.2.2.1 β-内酰胺类抗生素β-内酰胺类抗生素包括了种类繁多的天然和半合

成化合物，所有这些化合物都具有 β-内酰胺环的共同结构。

第一个被发现的是青霉素 G。β-内酰胺类是破坏细菌细胞壁的繁殖期杀菌性抗

生素。由于它们对细菌的选择性作用强，而对人几乎没有毒性，所以是一类高效低毒的抗生素。但是青霉素类会使一些敏感个体产生十分剧烈的过敏反应。

青霉素青霉素 G penicillin G, 又名苄青霉素 benzyl penicillin

具有青霉素的基本结构 ,其侧链为苄基，故称苄青霉素。

药动学：青霉素 G在室温下粉剂稳定，水溶液不稳定。口服易被胃酸破坏，吸收极少；肌肉注射吸收快而全，分布于细胞外液，脑膜炎时可透入脑脊液；由肾小管主动分泌而排泄，此过程受丙磺舒影响。

作用机制：青霉素类的 β-内酰胺环与抗菌活性有关，而噻唑环与过敏反应有关。青霉素与青霉素结合蛋白（ PBPs）结合后，青霉素的 β-内酰胺环抑制PBPs中转肽酶的交叉联结反应，阻碍细胞壁粘肽生成，使细胞壁缺损；另外青霉素还可激活细菌的自溶酶，从而使细菌体破裂死亡。

抗菌作用：青霉素 G主要对 G+细菌和 G-球菌有效，特别是繁殖旺盛的细菌；此外，对螺旋体、防线菌也有很强的作用。

临床应用：主治 G+菌感染，对 G-球菌感染如淋病、流脑也有良效；对梅毒、回归热、钩端螺旋体感染也有特效。

不良反应： 1.局部刺激症状如注射部位疼痛、硬结较常发

生； 2. 过敏反应，特别是过敏性休克。过敏反应重

在预防，过敏性休克一旦发生要积极抢救；肌肉或静脉注射肾上腺素，同时采取其他措施，如吸氧、输液、人工呼吸、气管切开等。

各国对食品中，特别是在牛奶中，对 β- 内酰胺类抗生素都制定了比较严格的最大残留量。

中国 : 牛奶中氨苄青霉素的 MRL 为 4ng/g 。目前对于一些常见的青霉素类抗生素残留最常用、

最便捷的检测方法是 ELISA ，但化学检测方法作为最终评判越来越受到重视，如采用大气压电离源 (APCI 、 ESI 等） HPLC-MS 具有测定小于 10-9级 β- 内酰胺类残留的能力。

HPLC/MS法测定牛奶中青霉素类方法： 牛奶在 3-4℃， 13800r/min高速离心 30min，去除蛋白。取上清液与等体积的 0.1M磷酸缓冲溶液（ pH9.2 ）混匀。加入正己烷混匀后离心，将水相转移至Bakerbond C18 SPE柱，分别用 2％氯化钠、水吝惜， 50mM磷酸缓冲液与乙腈（ 1 ： 1 ）混合液洗脱。洗脱液经氮气浓缩，用甲酸调节 pH值至 6-7 ，用水定容至 1ml。

色谱条件： YMC ODS-AQ色谱柱，流动相为水和乙腈，以不同的配比进行梯度洗脱。

质谱：锥体电压为 18-20V，碰撞能量 10-24ev。

7.2.2.2 四环族抗生素四环族抗生素属快效抑菌剂。其作用机制主要

是抑制细菌肽链的增长和蛋白质的合成，并可引起细菌细胞膜通透性改变，从而抑制 DNA

的复制。四环素类有天然品四环素、土霉素及半合成品

多西环素、米诺环素。其中米诺环素的抗菌作用最强，多西环素其次，四环素和土霉素最差。

对于四环素类化合物的检测，主要采用液相色谱法，如 EEC 方法中采用金属螯合物形式纯化样品，经液相色谱分析的技术路线，即用 0.5g/L C

uSO4溶液对琼脂糖树脂进行螯合反应后，用 pH4.

0琥珀酸溶液冲洗制得。同时用相同琥珀酸提取组织样品中四环素残留物，经螯合柱富集浓缩后，用 EDTA/琥珀酸溶液洗脱，洗脱液再经 XAD-2

柱进行离子交换型吸附，用甲醇洗脱，经蒸除溶剂，溶解残渣等步骤制得分析样品，用 HPLC/U

V 检测。

在前处理过程中，也可采用氨基键合的固相萃取柱方式提取、净化样品，用 HPLC 后接 AlCl3溶液进行柱后衍生化，经荧光检测。

值得注意的是，四环素类在高 pH值条件下，极易与金属离子结合，给色谱分析造成负面影响，因此在 HPLC 分析中，经常用磷酸盐等缓冲溶液控制酸度，但由于这类缓冲溶液具有较强的离子抑制作用，不适合 HPLC-MS 法。

在 HPLC-MS 分析时，常用于控制酸度的是甲酸、乙酸、草酸等具有一定挥发性的酸性物质。

氯霉素是一种广谱抗生素药。它的抗菌作用是通过在生物体内将硝基还原成亚硝基，而后亚硝基不可逆地同线粒体细胞结合，抑制了细菌细胞形成所必需的蛋白质的合成。

由于氯霉素对造血系统的不良反应，临床上仅限用于其它抗生素无效或不适用的病例。

接触CAP可导致一些个体产生变态过敏性反应，产生皮疹、发烧，并有可能肠出血。

当使用 CAP时，易感人群可患再生障碍性贫血，这是一种潜在的致死的血液失调，并可能发展成为白血病。

7.2.2.3 氯霉素（ CAP)

FAO/WHO 在 1994 年的第四十二届食品添加剂联合专家委员会会议上作出：“由氯霉素引起的再生障碍性贫血与剂量无关，因此不能通过制定最高残留量来加以限制”的结论，因此建议是“不设定”。

美国和加拿大不允许氯霉素用于最终为人类食用的动物身上，仅批准用于宠养动物疾病的治疗。

欧盟的 96/23 指令中把氯霉素列入禁用药。日本规定所有最终为人类所使用的动物源性食品

中氯霉素残留量必须为零。

• 提取：样品中氯霉素的提取，通常采用加入溶剂后均质的方法。所用溶剂有乙酸乙酯、乙腈、 10％三氯乙酸溶液。也有其它方法，如加水均质后，经 Extralut柱，用二氯甲烷洗脱提取；或在样品中先加入 β－葡糖苷酸酶，于 37℃下酶解 90min再用乙酸乙酯提取。

• 净化：提取液经浓缩后加入水后，用己烷洗涤除去脂肪等脂溶性杂质。经液液分配初步净化的提取液往往达不到测定要求的纯度，需经柱层析净化。较多用的是硅胶柱和 C18 小柱，也有用离子交换树脂 XAD-2 和活性炭；硅胶柱和凝胶柱（ Sephadex G-25)。洗脱液有乙腈－水（ 80：20）、乙醚－甲醇（ 70： 30）、丙酮－己烷（ 2 ：1 ）等。

测定：目前国内外主要使用的方法有： HPLC-UV,

HPLC/MS, GC-ECD, GC/MS, HPTLC, ELISA 和放射免疫法等。

HPLC 法：色谱柱常用 C18 和 C8柱，流动相通常用甲醇－水、 0.01M乙酸钠缓冲液（ pH4.3 ）－乙腈， UV 检测器。

HPLC/MS 法： HPLC条件同上GC 法：包括 GC-ECD 法和 GC/MS 法。测定之

前需衍生化。用非极性或弱极性色谱柱， ECD 、MS-EI 、阴离子化学电离（ NCI ）检测器。

HPTLC 法：薄层板： Si60 ；流动相：乙酸乙酯－己烷（ 2 ： 1 ），荧光衍生化；测定波长 366nm 。

ELISA 法：国外已有商品试剂盒供应，检测限低，特异性高。

放射免疫法：灵敏度高

• 蛋、奶、肉： GC-ECD

• 牛奶、牛组织： LC/MS

• 蛋： HPLC

• 肉： ELISA筛选， LC 定量， GC/MS确认

7.3 毒素• 生物毒素（ Biotoxin)是一大类生物活性物

质的总称，包括动物毒素、植物毒素和微生物毒素。

• 生物毒素已经对食品安全和人类健康构成了威胁，因此，食品 /饲料中生物毒素的研究也日益显现出其必要性和迫切性。

7.3.1 真菌毒素• 真菌毒素（ Mycotoxins ）是某些丝状真菌产生的

具有生物毒性的次级代谢产物，这些毒性真菌包括曲霉、青霉、镰刀霉、链格孢酶、棒孢酶和毛壳酶等。

• 最先被分离纯化的真菌毒素是麦角生物碱（ Ergot

Alkaloid, 1875) 和青霉酸（ Penicillic Acid, 1913) 。然而，对真菌毒素的真正研究却是从 1962 年黄曲霉毒素的发现开始的。

黄曲霉毒素（ Aflatoxin)• 黄曲霉和寄生曲酶是产生黄曲霉毒素的主要菌种，其他曲霉、毛霉、青霉、根霉等也可以产生黄曲霉毒素。

• 黄曲霉毒素最常见于花生及花生制品，玉米、棉子和一些坚果类食品中，主要有黄曲霉毒素 B1 ， B2 ，G1 及 G2 等 10多种。其中以黄曲霉毒素 B1 存在量最大且毒性最大。

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OO

O O

OCH3B1

黄曲霉毒素是已被证实的致癌物，其中黄曲霉毒素 B1 、 M1 是强致癌物。

黄曲霉毒素作用机理是影响细胞膜，抑制 RNA 合成并干扰某些酶的感应方式。

中毒症状无特异表现，临床可表现为发育迟缓、腹泻、肝肿大、肝出血、肝硬化、肝坏死、脂肪渗透和胆道增生等。

1993 年 WHO 的癌症研究机构将其划定为 1 类致癌物。它是致癌力最强的生物毒素，人类原发性肝癌的主要致病因素之一。

黄曲霉毒素分析

• 食品中黄曲霉毒素的测定，主要有 TLC, ELI

SA, HPLC 等方法。• TLC 法灵敏度和重现性较差； ELISA 重现性差，易受样品基质干扰； HPLC 法灵敏度和准确度高，重现性好，因此已成为黄曲霉毒素分析的主要手段。

HPLC法测定黄曲霉毒素，一般使用灵敏度和选择性较好的荧光检测器。在反相色谱中， B1 和G1两种异构体荧光强度很弱，需进行衍生化，提高其荧光强度，灵敏度才能满足一般食品法规的限量。

衍生化的方法一般有柱前和柱后两类，柱前衍生一般使用三氟乙酸，柱后衍生有碘液、过溴化吡啶溴以及电化学等方法。

• 样品提取与净化 样品加入氯化钠和甲醇－水（ 7 ： 3 ），均质 2min，过滤。取滤液加适量水，再次过滤后，上免疫亲和柱，用水洗柱，最后用甲醇洗脱黄曲霉毒素，用水定容，供HPLC测定。

• HPLC条件 色谱柱C18； 流动相：甲醇－乙腈－水（ 1 ： 1 ： 3 ） 柱后衍生试剂：碘液 衍生化温度和时间： 70℃， 55s 激发波长： 360nm 发射波长：大于 520nm

7.3.2 海洋藻类毒素 海洋藻类毒素是由海洋中的微藻或海洋细菌产生的一

类生物活性物质的总称。由于这些毒素通常是通过海洋贝类或鱼类等生物媒介造成人类中毒的，因此这些毒素常被称作贝毒或鱼毒。

常见的贝毒有麻痹性贝毒， 腹泻性贝毒，记忆缺失性贝毒，神经性贝毒等。

我国浙江、福建、广东等地曾多次发生贝类中毒，导致中毒的贝类有蚶子、花蛤、香螺、织纹螺等常食用的贝类。

麻痹性贝毒麻痹性贝毒是分布最广，危害最大的一类毒素。

它是由甲藻产生的一类四氢嘌呤毒素的总称。 主要症状表现为面部、肢端麻木，严重的会因呼

吸肌麻痹而导致死亡。

腹泻性贝毒腹泻性贝毒毒素主要来自甲藻中的鳍藻属和原甲藻属。

主要症状为呕吐和腹泻，长期毒性效应可能导致癌症。

记忆缺失性贝毒记忆缺失性贝毒的活性成分为软骨藻酸。 中毒者表现出肠道症状和神经紊乱，严重的有短暂

的记忆丧失现象。

神经性贝毒 神经性贝毒是到目前为止危害范围较小的一类毒素。表现出神经中毒的症状。

腹泻性贝毒检测 腹泻性贝毒的分析主要采用荧光化合物 ADAM标记－反相高效液相色谱分析的方法。由于 ADAM不稳定，而且不易获得，因此又有了一些改进的方法，包括采用不同的衍生剂和提取方法。但由于目前样品前处理及色谱过程，对 DSP结构类似物不能有效分离，因此HPLC法测定 DSP效果不是很理想。目前 HPLC-MS技术已用于 DSP的分析，成为 DSP液相色谱法的重要补充。

麻痹性贝类毒素检测 麻痹性贝毒（ PSP）是一类四氢嘌呤化合

物，这类毒素通常是非结晶、高极性、难挥发的物质，检测方法主要采用液相色谱法。由于 PSP本身生色基团很弱，不易被检测，因此检测前须氧化修饰，将 PSP分子的环结构氧化成荧光生色基团。 LC/MS和毛细管电泳 /质谱（ CE/MS）联用技术已用于麻痹性贝毒分析。

神经性贝毒检测 神经性贝毒（ NSP）色谱分析包括薄层层

析法（ TLC）和 HPLC。 TLC不够灵敏，目前已很少应用。 HPLC法由于流出物背景干扰，在检测灵敏度和选择性方面存在问题。近年来， HPLC-MS联用技术开始应用于神经性贝毒分析。

河豚毒素 (Tetrodotoxin) • 河豚 (Spheroides vermicularis)又名钝鱼，它

的某些脏器及组织中均含有毒素，是一种神经毒，其毒性稳定（ 220℃），经炒煮、盐淹和日晒等均不能被破坏，可使神经中枢和神经末梢发生麻痹。中毒症状始发于使用后 10秒，先是口腔麻木和刺痛，继发为虚弱、麻痹、血压降低和脉搏快而弱，如不及时治疗可出现死亡。

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N

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O-

HO

HH2N+

HO OH

OH

Tetrodotoxin

治疗：1 、尽快排除毒物：催吐、洗胃、导泻。2 、应用吸附剂减少毒物的吸收。3 、补液、利尿，可给予葡萄糖、维生素Ｃ、辅酶Ａ、ＡＴＰ等，促进毒素的排泄。4 、使用肾上腺皮质激素，如地塞米松，提高组织对毒素的耐受性。5 、对症治疗：防治呼吸衰竭。 河豚毒素中毒目前无特殊解毒剂，但由于毒素存在体内解毒和排泄很快，如果发病后８小时未死亡，多能恢复，因此，一旦发现中毒，应尽快给予各种排毒和对症处理的措施，让病人度过危急期。

河豚毒素测定方法小鼠生物试验法免疫化学测定法毛细管等速电泳电压检测法荧光法 TLC/火焰离子检测法 TLC/快原子轰击质谱法 HPLC

HPLC/MS

HPLC-MS测定河豚鱼中河豚鱼毒素1. 前处理 将河豚鱼肉或皮中的河豚鱼毒素用乙醇－乙酸－水（ 75： 1 ： 14）提取，过滤后，提取液经旋转蒸发浓缩，用离子交换树脂净化，用 10％乙酸溶液洗脱。洗脱液经浓缩后用活性炭净化，用乙醇－乙酸－水（ 20： 1 ： 79）洗脱。洗脱液经浓缩后用水定容后供HPLC-MS测定。

2. 测定HPLC－MS条件：色谱柱： Shimpack CLC-ODS柱流动相： 0.06M七氟丁酸－ 0.001M乙酸铵

（ pH5.0）流速： 0.5mL/min样品不经柱前衍生加速电压： 20kV