第十一章 微生物的应用

第十一章 微生物的应用前面十章阐述了微生物学基本理论的各个方面，它们是许多专业必须的基本知识。

微生物的应用则涉及人类经济生活的重要产业部门。

分别由应用微生物学的各个分枝系统介绍。

本书仅讲述农业和环境保护中有益微生物的几个应用问题，主要阐明有关原理。

第一节 微生物接种剂土壤中固有的有益微生物作用包括两个方面 :

一是促进和刺激植物生长的细菌和真菌等微生物 .其机制包括从大气中固氮、增加铁、磷等矿质元素的吸收，合成促进细胞繁殖的植物激素等。

二是可以抑制土壤中的有害微生物的生长而起间接作用的微生物。

间接作用的机制则是有益微生物的生长阻止了有害微生物的生长，称为抗生现象，或是由于有益微生物耗尽了某种营养，或由于它释放出了某种物质抑制了有害微生物的生长。

而农业生产中采用有益微生物接种是调节土壤生物学过程的途径之一，有益于植物生长，甚至对品质也有一定程度影响，而且能够减缓环境污染，在持续农业中微生物制剂的应用无疑将占有愈益重要的地位在持续农业中微生物制剂的应用无疑将占有愈益重要的地位。

在微生物被发现之前，古代农民就有采用“客土法”的经验，搬运一些多年栽种豆科作物的土壤到从未种植过该种作物的田地里，其实质就是用根瘤菌接种。不过，直到根瘤菌纯培养成功后，才有商品接种剂的出现和发展。

接种剂

一类是提高土壤供肥能力并提供植物养料 ，也称为微生物肥料。

另一类是防治植物病虫害和消除杂草，也称为微生物农药。

一、微生物肥料

（一）微生物肥料的性质

微生物肥料同一般有机和无几肥料有重大区别。

它在单位面积上的用量微小，以最常用的草碳吸附接种剂为例，一般每公顷施用 7·5—15Kg 即够。也就是说，菌剂不是直接作为的养料或药物因为其量微不足道，而是靠它们在土壤中或植物表面大量繁殖，进行旺盛的代谢作用，才有可能起到供肥的作用。

所以接种剂这一术语较好地反映了它们的一般性质和作用，它同其它肥料的区别是十分明显的。

菌剂既然是起接种的作用，十分明显，作为接种剂的微生物必定是经过研究确定了它的性状。其性状的要求有：

一如是根瘤菌菌珠必须是结瘤能力强、固氮效率高，而且对土著根瘤菌有竞争结瘤优势；

二是作为商品菌剂要经过一系列的严格检验，证明对植物有益而无害，更不能是人畜的条件致病菌；

三是菌剂的应用效果要有田间试验报告；

四是我国农业部设立了菌剂质量检查的专门机构，有效菌数等重要指标要经过检测，符合标准的产品才能出售；

五是要标明菌剂的适用作物和土壤情况等。

菌剂的性质决定了对它应有非常严格的要求，以保证使用后即有利于增产，又不污染环境。

固体和液体培养可以直接施用，但一般都将培养体放入吸附剂中保存，使用方便。吸附剂是影响菌剂质量的因素之一。

常用的吸附剂有下列几类物质：

①草炭和土壤及添加物；

②植物材料，包括谷壳粉、蔗糖渣、玉米穗轴粉、腐熟堆肥等；

③惰性无机和有机材料，如蛭石、珍珠石、粉末磷灰石、硫酸钙、聚丙酰胺胶粒等。

易于取材和使用广泛的是草炭吸附剂，以草炭作吸附剂制成的接种剂有粉末状和颗粒状两种剂型，可根据使用方式选用。

（二）、微生物肥料的应用

接种剂是用少量微生物接种于种子表面或土壤中，所以施用后不但要存活，而且要大量繁殖，才能发挥应有效果。

1、根瘤菌剂

在 1896年欧洲出现根瘤菌剂的专利产品后，它的应用一直在发展。根据豆科植物互接种族特点选用相应的优质根瘤菌接种，多数情况下有不同程度的增产效果，特别是过去从未载培过该种豆科植物的土壤条件下。

（ 1 ）、生产方法 根瘤菌剂的生产就是根瘤菌的繁殖过程，其生产流程为： 砂土管 固体扩大培养 （ 25—30℃， 5—7天） 斜面菌种培养 （ 25—30℃， 液体扩大培养 菌 种 3—5天） （ 25—30℃， 2—3天）

菌液含菌量 （ 20—100 亿个 / 毫升）

吸附剂 干燥、粉碎 吸 拌 成品（菌肥） 灭 菌 附 （ 含菌量原 料 剂 菌 2—3亿个 /克）

为了保证根瘤菌剂的质量，必须抓住以下几个环节：①、侵染力强

要有很强的竟争力，选出的菌种要和土壤中原有的根瘤菌竟争。

②、结瘤率高 要具有旺盛的结瘤作用。

③、固氮力强 要有很强的固氮效率

④、对豆科作物品种适应性强 要对不同品种都具备适应性，也就是说，对这种品种适应，对另一种也适应。

（ 2 ）、应用方法 根瘤菌的田间应用传统上有两种基本方法，即种子拌菌和土壤混菌，它们各有利弊，需要改进和完善。

①、种子拌菌

种子拌菌是最常用的方法，它简便易行，用少量菌剂能使每粒种子上都黏附一定数量的根瘤菌。如果在拌种过程中加入黏附剂（常用阿拉伯胶）和其它材料做成丸衣化种子，则效果更好。若同时需要某种化学农药拌种，则必须预先测定该农药是否对施用的根瘤菌有不利影响。某种豆科植物种皮含有抑制根瘤菌的物质，这时拌种就不合适了。

种子拌菌法在未栽种过该种豆科植物的土壤上，一般都能获得良好的效果；

而在有相同根瘤菌的大量土著菌株的土壤中，往往达不到预期目的。

②、土壤混菌

•采用能使根瘤菌混合到根圈重要部位的方法比种子拌菌法的占瘤率高。

•土壤混菌法早已有之，它源于古代“客土法”。随着根瘤菌生态学研究的深入，土壤混菌法也受到了重视，它可以提高接种菌的占瘤率和固氮效率（表 11—1），在土著根瘤菌多的情况下尤为明显。

•土壤混菌法的缺点是菌剂用量多，大面积混菌也不方便。经济而有效的方法仍有待于创造。

表 11—1 大豆根瘤菌不同施用方法对共生效应的影响

施用方法 固氮量 固氮率 产量

种子拌菌 40 30 4.6

土壤混菌 66 47 5.0

接种剂施用播种层 55 36 5.5

接种剂施于播种层 5cm 以下 63 46 5.3

不接种 — — 4.7

（ 3）、应用时间

为了简便，根瘤菌剂多在播种时施用，但也可在播种前后施用，需要时施用几次，以提高接种效果。①、播种前

种子可以在播种前几个月或一年以上进行拌种，由厂家或种子公司做成丸衣化种子出售。

②、播种时

•在播种的同时施用根瘤菌是最常采用的方法，可以进行种子拌菌，也可以土壤混菌。

•小规模播种时，种子拌菌一般在容器种中进行；•大规模播种时，可以在播种机上安上辅助装置，拌菌后立即播入土壤中，固体和液体菌剂均可使用。③、播种后

播种后再接种根瘤菌过去只是作为一种补救办法，当结瘤不好时追施一、二次菌剂可以提高结瘤率，国内外均有此经验。

2、固氮细菌制剂 土壤中能够进行固氮作用的细菌属种很多，用于生产菌剂的主要是固氮菌属的某些种和菌株，以及固氮螺菌属等。

（ 1 ）、固氮菌剂前苏联于 20 世纪 30至 50年代曾经广泛地应用固氮菌剂，我国在 50年代后期和 70年代中期也进行过许多试验和推广，有些发展中国家，如印度也有过研究和应用。大量资料说明它的效果不稳定。

60年代以来，固氮菌生理学和固氮酶学的研究进展很快，认识到固氮菌只有在生长繁殖过程中固定分子态氮，而且仅满足自身需要，要待它们死亡后，细胞自溶或被分解时才能释放出化合态氮供植物和其它微生物利用。

贫瘠土壤中如果不加入有机物质，固氮菌不会生长繁殖和固氮；而在化合态氮较丰富的肥沃土壤中，固氮菌则利用有效氮而不固定分子态氮。

固氮菌在某些条件下，对植物生长的有利作用同它们产生植物生长激素和抗菌物质有关。

（ 2 ）、联合固氮菌剂联合固氮细菌的应用已进行了许多接种试验。研究结果表明固氮螺菌对植物生长有促进作用，盆栽试验和小区田间试验表明增产效果，但变化幅度很大。

3、促生细菌（ PGPR）剂

•PGPR能改善植物的营养状况并抑制某些致病菌（见第八章），盆栽试验和小区试验表明它们有很好地应用前景。

•PGPR的研究和应用是当前一个较为活跃的领域，有些种类可能诱导植物产生获得性整体抗性。

4、菌根菌人们对菌根菌的应用已做了大量研究工作，特别是外生菌根。典型的例子是彩色豆马勃，它在林木育苗中已显示了很好的作用。这种菌的寄主范围广、抗逆性强、容易分离和培养，在美国已作为商品制剂广泛应用于林业生产，我国也进行了小规模应用。

至今丛枝菌根的应用人仍处于研究阶段，主要原因是丛枝菌不能在人工培养基上生长繁殖，只能用寄生植物进行组织培养，限制了生产量。

二、微生物农药

•近数十年来，有机农药在植物病虫害防治中的广泛使用，为确保农作物的高产丰收发挥了巨大的作用。

•但其毒性、残留毒性、对商品和环境的污染、对天敌的杀害、对生态体系的影响、抗药性的发展带来了一系列的问题，所以积极发展高效、安全、经济的新农药是十分必要和迫切的。•其中微生物农药是值得重视的一种类型。

但微生物农药所存在的残效短、效率慢、杀虫抗病范围不广等缺点还有待进一步研究解决。

（一）、微生物农药的性质和种类利用自然界中某些生物控制虫害、病害及其它有害生物的方法称为生物防治，对有害生物起控制作用的生物统称为天敌。

微生物是天敌的一种类型。在微生物的各类群中，包括细菌、真菌、病毒和原生动物，都有一些能起控制病虫害作用的种类。

用它们防治害虫，称为以菌治虫；用它们来抑制作物的致病微生物或防治病害，称为以菌治菌或以菌治病。

微生物农药

①杀菌剂：利用微生物杀菌剂来杀死有害微生物；

②杀虫剂：利用微生物制品来杀死有害昆虫；

③除草剂：利用微生物制品来除草（鲁保一号）。

（二）、微生物杀虫剂

微生物杀虫剂

①细菌杀虫剂；

②真菌杀虫剂；

③病毒杀虫剂；

原生动物杀虫剂；

象苏云金杆菌是世界上最广泛应用的杀虫细菌。

1、细菌杀虫剂

已发现的昆虫致病菌有： 苏云金芽孢杆菌、 金龟子芽孢杆菌、 缓死芽孢杆菌等。

在芽孢杆菌中研究得最深刻，应用最广泛的是苏云金芽孢杆菌。

苏云金芽孢杆菌对昆虫之所以有致病能力，主要是由于它产生的毒素。认为苏云金芽孢杆菌在生长过程中所产生的毒素可分为两大类：

另一类是外毒素

毒素

一类是 δ—内毒素，即伴孢晶体

α 一外毒素

β— 外毒素

r— 外毒素

不稳定外毒素

是细菌在生命活动过程中排出体外的代谢产物。

在所有这些毒素中，研究得较多的，同时也是杀虫中起重要作用的是 δ—内毒素，其次为 β—外毒素。

•这种短肽作用于上皮细胞，使中肠麻痹。随着病情的发展，肠道壁细胞得胶粘物质破坏，上皮细胞削离，散落在肠腔内，这时中肠的透性失去控制，肠壁随后穿孔，肠道内含物、芽孢和细菌大量侵入血腔。中肠的 PH由 10·4下降至 9·0 ；血液的PH则由正常的 6·8上升至 8·0，引起虫体全身麻痹，细菌大量繁殖，发生败血症而死亡。

δ—内毒素杀虫原理 :

•δ—内毒素 (蛋白质晶体 )在其碱性肠道中被水解成毒性短肽，产生毒性。

苏云金杆菌对营养的要求不严，能在常用的细菌培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）中迅速地旺盛生长，并形成芽孢和伴胞晶体。

黄豆饼粉、玉米浆、麸皮等农副产品都是培养苏云金杆菌的良好材料。

苏云金杆菌制剂的大量生产可采用深层发酵法，也可采用固体发酵法。

2、真菌杀虫剂

在昆虫病原微生物中，霉菌占 60%以上，而其中白僵菌引起的占 21%，应用白僵菌治虫，国内已推广。

白僵菌属于半知菌类的一种真菌，其中包括 球孢白僵菌、 卵孢白僵菌、 小球孢白僵菌 3个种。白僵菌最适生长温度为 22—26℃， 30℃和相对湿度20%—50%有利于孢子的成熟。孢子萌发要求相对湿度90%以上。

白僵杀虫原理

白僵菌一旦侵入虫体，就大量繁殖，形成许多长筒形孢子，也叫节孢子，如此反复增殖，充满于昆虫血液中，影响血液循环。

菌丝还分泌一定量的草酸钙结晶，在血液中大量积累，致使血液酸碱度下降，失去固有的透明性，引起血液理化性质改变。

病原菌大量地吸取昆虫的体液、养份、并分泌毒素（白僵菌素）破坏其组织，损害其机能，严重地干扰了它的新陈代谢活动，约二、三天后就死亡。

刚死亡的虫子，身体柔软，但因菌丝猛烈的夺取水份，尸体就很快干硬。

直至侵入脂肪组织的菌丝破环全部脂肪吸尽其养份后，体内的菌丝便沿着尸体的气门间隙和环节间膜伸出体外，顶端产生分生孢子。

这时，可看见虫体上披着白色茸毛，叫白僵虫。

条件适应时，从白僵菌孢子接触虫体，到萌发、生长、繁殖，使虫发病僵死，直至再长出菌丝体与分生孢子，仅需 7—10 天时间。

因此，使用白僵菌剂后，害虫很快就会因疾病蔓延而死亡，而且可较长时间有较；用起来也很方便，即可以把菌剂喷撒在虫子为害的作物上，也可以撒施在害虫群集的场所，这些优点都是化学农药无可比拟的。

白僵菌用于防治松毛虫、玉米螟效果更好，尤其是用于防治松毛虫，白僵菌可作为环境因子，持续多年控制松毛虫的危害。

白僵菌对营养要求不严，在以黄豆粉或玉米粉等为原料的半固体培养基中 生长良好，并形成分生孢子。培养物干燥后制成白僵菌制剂。

在液体培养基中，白僵菌形成抗逆力差的芽生孢子。

除在菌剂生产中孢子萌发可引起操作人员的过敏外，尚未发现其它对人体有害的作用。

3、昆虫病毒杀虫剂

昆虫病毒种类多，分布广，专性强。常见的昆 虫病毒有： 核型多角体病毒、 质型多角体病毒、 颗粒体病毒、 无包含体病毒。

核型多角体病毒是已发现的种类最多的昆虫病毒。

昆虫幼虫感染多角体病毒后，一般需 4—20天才死亡。昆虫病毒由于：①需通过寄主昆虫才能繁殖，培养困难；②专性强，杀虫谱太窄；③使昆虫致死的时间太长等原因未能在生产中应用。

4、原生动物杀虫剂

很多原生动物是节肢动物的病原菌，但它们感染动物的速度慢，时间长，因而大部分均不能用作杀虫剂。

（三）、微生物杀菌剂

在自然界的微生物之间，存在着各种不同的相互关系（见第八章），其中有一种称为拮抗关系，其含义是指生活在同一生境的两种生物，其中一种产生毒素或其它因素抑制另一种生物的现象。

这也就是“以菌治菌”的生防措施得以发展的依据。

•早在 1929年英国圣玛利学院的细菌学讲师弗来明最先发现了这种现象。

抗生素的发现

•当他正研究毒性很大的葡萄球菌时，忽然发现原来生长很好的葡萄球菌全部消失了。

•是什么原因呢？经过仔细观察后发现，原来有些青霉菌掉到那里去了。

•显然消灭这些葡萄球菌的，不是别的，正是青霉菌。

•这一偶然事件，导致药物青霉素以及一系列其他抗菌素的发现。

1 、抗生菌和抗菌素

产生抗生素的菌种称为抗生菌。

目前已知的抗生菌种类很多，几乎微生物中的细菌、放线菌、真菌都能产生抗生素。

但放线菌类产生的抗生素最多，尤其是放线菌中的链霉菌属，真菌类抗生菌产生的抗生素仅次于放线菌，细菌类抗生菌比较少，主要是芽孢杆菌和极毛杆菌属。

抗生素是有抗生菌产生的次生代谢产物生理性活性物质。

它既不参与细胞结构，也不是细胞贮存性养料，对产生菌本身无害。

但对敏感微生物有专性拮抗作用，而且作用很强，一万倍以上的稀释液有显著的抑菌和杀菌效果。

抗生素的作用具有选择性。

抗菌谱：各种抗生素的抗菌范围称为抗菌谱。

窄谱抗菌素：象有的抗菌素对它敏感的微生物种类 很少，称为窄谱抗菌素。

广谱抗菌素：而有的抗菌素对它敏感的微生物种 类较多，故称为广谱抗菌素。

如四环素族（金霉素、土霉素等）对革兰氏阳性和阴性、立克次氏体以及一部分病毒和原虫等都有抑制作用，属于广谱抗菌素。

青霉素只对革兰氏阳性菌有抑制作用，属于窄谱抗菌素。

抗生素的种类很多，它们来源于不同微生物类群，它们的化学结构，作用对象和作用机制都有不同。表 11—2列出了最常见类别的代表。

抗生素对微生物的抗菌机制

①阻碍菌体细胞壁的合成；

②影响菌体细胞膜的通透性；

③抑制核酸的合成；

④抑制菌体蛋白质的合成。

2、应用抗生素防治植物病害

•各种抗生素一般都在低浓度下对病原菌产生作用，这是抗生素区别于其它化学杀菌剂的又一重要特点。

•各种抗生素对不同微生物产生抑制作用的有效浓度各不相同。

•通常以抑制微生物生长的最低浓度作为抗生素的抗菌强度，简称有效浓度。

•有效浓度越低，表明抗菌作用越强。有效浓度在 100mg/L以上的属于作用强度较低的抗生素，有效浓度在 1mg/L以下的是作用强度高的抗生素。

表 11—3列举了我国已应用的和有应用前景的农用抗菌素种类，主要应用方法，使用浓度和药理特性。

抗生素的应用方法有下列几种：

①对种子、秧苗传染的病害，可用抗生素浸种和苗床喷洒；

②对大田作物地上部分病害，选择适当时期进行植株喷洒；③在果木上使用，若治疗树干病部，一般是将抗生素制成油膏进行涂敷或涂刷，

如用内疗素涂敷橡胶割面，防治橡胶条疡病；用放线菌酮涂刷树干防治白松孢锈病。防治叶部病害仍然是采取喷酒的方法。

第二节 微生物与农村有机废物处理

•在农作物收获中，籽实和花果只是有机体的少部分，留下大量茎叶。

•这些有机废物除少部分直接作燃料外，都要处理，转化为肥料或再生能源，

•这是自然界物质循环的一个特殊方面，微生物起主要作用。

一、堆肥制作的微生物学过程

堆肥一是指以植物性物质为主，一般略加粪尿，经混合堆积腐熟而成的有机肥料。

也就是把不能直接使用到土壤中植物秸杆等原料，加入人畜粪尿进行堆制。

（一）、堆肥的制作

包括了原料的处理、水分、通气与保温、泥封和翻堆一系列操作过程，其详细内容不讲，请大家自己看。

（二）、堆肥的微生物学过程

堆肥制作过程中，复杂有机物质在一系列微生物作用下，逐渐降低 С/Ν率，为植物提供可给态养料。

此过程包括了 发热阶段、 高温阶段、 降温阶段、 腐熟保肥阶段。

现分别加以讨论。

1 、发热阶段 堆肥堆制初期，微生物旺盛繁殖，分解有机质，释放出热，不断提高堆肥温度，叫发热阶段。

在这阶段中，堆肥物质的变化主要是在好气性条件下易分解的有机质（简单糖类、淀粉、蛋白质等）迅速分解，产生大量的热，产生的热不易散失，积累起来提高堆制的温度。

在发热阶段，堆肥中的微生物以好气性的种类为主。最常见的是无芽孢细菌、芽孢细菌和霉菌。随着温度的提高，好热性微生物种类逐渐代替了中温性的种类而起主导作用，温度持续上升一般在几天之内即达到 50℃以上，进入高温阶段。

2 、高温阶段 •温度可上升到 50—60℃，堆肥材料中复杂的有机物质如纤维素、半纤维素、果胶物质等也开始被微生物强烈分解。

•在这一阶段参与的微生物重要是好热性芽孢细菌，好热性放线菌和好热性真菌。

•由于微生物继续旺盛活动，热量积累，堆肥温度上升到 70℃以上。这时，大多数好热性微生物也大量死亡或进入休眠状态。由于初死亡的微生物所含的各种酶的作用，有机物质的腐解作用仍能进行一段时间。

但是，酶的作用很快衰退，产生的热量减少，当产生的热量小于堆肥散发的热量时，处于休眠状态的好热性微生物又恢复了它们的生命活动，产热量又增加了。

这样堆肥温度处于一个自然调节的延续较久的高温期，这对堆肥的快速腐熟起着重要的作用。

制造得法的快速堆肥，有相当长得高温期（持续在 50℃以上大约二个月左右），堆肥材料能够在几个星期或 2—3个月内达到适于施用的腐熟状态。

堆制不当得堆肥，或者只有很短得高温期，或者根本达不到高温，因而腐熟很慢，在半年或者很长时间达不到半腐熟的状态。

3 、降温阶段 当高温阶段持续在一定时间后，纤维素、半纤维素和果胶类物质大部分已经分解，剩下很难分解的物质（如木质素等）在这一阶段分解，由于微生物生命活动的减弱，温度就逐步下降，当温度下降到40℃℃以下时，中温性微生物又代替了好热性微生物成为占优势种类。

如果降温阶段来得早，表明堆制条件不够理想，植物性物质一般还没有充分分解，在这样情况下，将堆肥拌均，再次封堆，这样通过可以产生第二次发热，升温，有利用植物性物质的充分分解。

4 、保肥阶段

•堆肥中的植物性物质绝大部分已经腐解，堆温下降至稍高于气温，进入腐熟保肥阶段，

•这时侯的问题不是怎样使它加速腐熟，而是要保存已形成的腐殖质和植物养料（尤其是氮素养料），

•这时最好将堆肥压紧，造成厌气状态，在厌气状态下，有机物质矿化作用减弱，有利于保肥，成熟的堆肥应具备表 11—4所列的特性。

表 11—4 成熟堆肥的特性 项目 指标 N （ % ） >2

C/N <20

水分 10—20<40

灰分 10—20

P （ % ） 0.15-1.5

持水量（ % ） 150-200

阳离子交换量（ cmol/kg) 75-100

还原糖（ % ） <35

颜色 棕色

气味 泥土气

（三）、制作堆肥新方法简介

•近年来，西方发达国家对堆肥制作进行了多方面的研究，以图找到最有效的处理得城市垃圾的方法。

•研究的重点首先是放在改进堆肥的通气状况上。

一是 Rutgers方法，这种方法是将多孔的管子铺放在堆肥中，由自动控制的鼓风机循环管通入空气。这一措施一方面是增氧，另一方面是依靠通气调节堆肥的温度，将堆肥温度控制在 60℃以下，因为温度超过 60℃会抑制生物降解作用。这种通气堆肥三星期即可达到使有机质腐解的目的，但其成本却很大。

二是用生物反应器可使制作堆肥的效率更进一步提高， 2—4天即可完成制作。这样制作的堆肥均匀，稳定，但需要高的投资。

三是 1992年比利时开发了一种处理固体有机废物的厌氧方法，称为 DRANCO，它将有机废料的处理和沼气的利用结合在一起。把有机废料装入一直立圆筒形、密封的生物反应器中，保温 50—55℃，经 18-21d，反应器中的有机质即可腐熟。反应器中所生沼气 30%用于运转这一过程， 70%用于发电。所获发酵产品的质量好，无病菌，类似草炭（每吨湿废料可产生 300—350Kg）。

二、沼气发酵的微生物学原理

沼气是有机质在厌气条件下，经微生物分解作用而产生出来的一种生物气（ biogas ）。

•主要成分是甲烷和二氧化碳。

•在农村，利用秸秆、人畜粪尿、垃圾等废弃有机物，在人工控制厌氧条件下，进行沼气发酵是既有经济效益又有良好生态效益和社会效益的重要措施，值得广泛开展。

参与沼气发酵的微生物，属于产甲烷细菌。

现有的产甲烷细菌按形态分有： 甲烷杆菌属、 甲烷球菌属、 甲烷八叠球菌属、 甲烷螺菌属等。

按其生理作用则分为： 发酵性细菌群、 产氢产乙酸细菌群、 产甲烷细菌群等。

它们在推动有机物转化为甲烷的过程中，分别发挥着不同的作用。

•自然界中纤维素等复杂有机物质在厌氧条件下，转化为甲烷和二氧化碳是不同类群微生物连续作用的结果。

•在沼气发酵池中，由于有机物料的不断添加和腐熟肥料与沼气的排出，各类微生物均同时起作用。

•但就有机物的分解而言，是有阶段性的。

1、水解发酵阶段：

•这一阶段由发酵性细菌群完成的。

•这类细菌是一个十分复杂的混合细菌群。

•它们产生水解性的胞外酶类，把有机质水解成分子量较小的可溶性物质。

•如将多糖水解为单糖，蛋白质降解为肽和氨基酸，脂肪变为甘油和脂肪酸等。

2、产氢产乙酸阶段：

在水解发酵阶段所产生的丙酸、丁酸、乳酸、乙酸等，都不能为产甲烷菌所利用。

必须被产氢、产乙酸菌进一步分解为乙酸和氢、二氧化碳等。

这个阶段的微生物是由多种细菌组成的，如丁酸菌类、乳酸杆菌和革兰氏阳性小球菌类等。每种细菌有着不同的代谢产物。

3、产甲烷阶段 :

由产甲烷细菌将以上两个阶段产生的乙酸、 H2 、 CO2 和甲酸等转化成甲烷的过程。

•在人工发酵池中进行沼气发酵有类似于微生物的连续培养，有机物料的不断投入，沼气和肥料不断产出，维持多种微生物平衡生长。

•要点是掌握投入和产出的关系，在适宜温度下使沼气池长期运转。

•大型沼气池发电不但能供照明，还能用作机械的动力。•沼气池也是有机肥料的制造车间。因此沼气发酵是一举多得的微生物利用途径。

第三节 微生物与城市污水的处理

在当代，随着人类工业生产活动的高速发展和人口的急剧增长，使人类赖以生存的环境受到越来越严重的污染。

这种情况在水体环境的污染中尤为明显，它常表现为无法进行水体的自净作用。

因此，加强对污水的净化处理，减少排污量已是刻不容缓的上时候了。

一、自然水体的自净作用

在自然界，有些水体中的污染物的浓度，可通过河水向下游流动而自然降低，此种现象称为水体自净现象。在天然水体自净中，除了稀释、沉淀等作用外，主要是微生物的作用。

水体内的微生物，在其生命活动中，吸收和转化某些污染物质，并将大量有机物质分解成无几盐类、二氧化碳和水。

从而使水体得到自净。当进入水体的外来污染物质数量，超过了水体的自净能力，并达到破坏水体原有用途的程度，即为水体污染。

•污水有生活污水和工业污水两大类，其年排放总量为 300 亿吨。

•处理污水的方法很多，可归纳为 : 物理方法、 化学方法、 生物方法三大类。

生物方法是目前最重要的废水处理方法。在污水的生物处理过程中，微生物起着特别重要的作用。

在微生物处理污水的过程中， BOD5 和 COD这两个名词是十分常见的，现解释如下：

（ 1） BOD5 即五日生化需氧量。

一般指在 20℃下， 1L 污水中所含的有机物（主要是有机碳源），在进行微生物氧化时，5日内消耗的分子氧的毫克数（或 ppm数）。

它是一种表示水中有机物含量的间接指标，

BOD5测定的大体操作是：取一定量被测水样，用加有磷素营养（如 NaH2PO4 或 K2HPO4等）和经氧饱和的稀释用水，将被测水样稀释到一定浓度，然后放在密封瓶内，在 20 ℃恒温箱内培养 5 天，最后测定水中残留的溶解的量，并计算 BOD5值。

在水处理技术中，污水处理后水中 BOD5值之差，即可理解为这一处理过程对有机物处理效率的高低。

（ 2） COD或化学需氧量。

使用强氧化剂使 1L 污水中的有机物质迅速进行化学氧化时所消耗氧的毫克数，称 COD或化学需氧量。

COD能在短时间中测得。有利于指导现场操作。使用的氧化剂一般有 KMnO4 和 K2CrO7 。 KMnO4 的氧化力较弱，往往测得的数值常较低。 KCr2O7 的氧化能力极强，氧化率高达 80—100%，只有少数直链脂肪族有机物，芳香烃和吡啶等环式化合物才不易被氧化，因此，实际使用时常采用 K2Cr2O7 作为氧化剂，并把测得的数值称为 CODcr。

二、污水处理及微生物的作用

•根据水体自净的原理，人们设计了各种污水生物学处理的方法。

•概括起来说，这些方法的基本原理就是通过微生物的旺盛代谢活动，分解有机污染物，使污水净化。

•根据污水处理过程中起作用的微生物对氧气要求不同，可将污水生物处理分为需氧处理与厌氧处理两大类。

常用的方法有： 活性污泥法、 生物膜法、 氧化塘法、 厌氧消化法、 土地处理法五大类。

下面以应用最广的活性污泥法为例，介绍污水处理的微生物学原理。

所谓活性污泥，是指一种由细菌、原生动物和其它微生物群体与污水中的悬浮有机物、胶状物质和吸附物质在一起构成的凝絮团，在污水处理中具有很强的吸附、分解和利用有机物或毒物的能力。

•活性污泥中的微生物群非常多，但其中的主要成员是细菌，特别是异养细菌占优势，伴以腐生的原生动物，它们构成基本的营养层次。

•然后是以细菌为食料的捕食性原生动物占优势。正常情况下没有藻类，真菌也很少。

第四节 血清学技术的原理

动物的躯体内存在许多种微生物 , 有些种类是正常类群 , 不但无害 , 甚至还有益处 ;

有的种类则具有致病性 , 引起人类和动物的病害 .

但是动物也具备抵御和消灭外源异物 ( 包括微生物 ) 的功能 , 免疫性就是表现之一。

一、外源微生物引起的动物免疫反应

免疫是机体对异物（包括自身化学成分中起了变化的物质）的一种抵抗和保护反应。

人和脊椎动物都具有免疫系统，包括免疫淋巴器官（如骨髓、胸腺、脾脏和淋巴结等）、免疫反应细胞（淋巴细胞和白细胞等）以及体液成分（抗体、补体和干扰素等）。

机体的免疫性及有关问题的研究已成为一个独立的学科（免疫学），这里仅从应用的角度简要介绍特异性免疫中的抗原和抗体反应。

诱发免疫反应的外界物质称为抗原。由于抗原的刺激，免疫系统产生一些特异蛋白，称为抗体或免疫球蛋白（ Ig），以及称为活化 T 细胞的特异细胞，它们能够识别外源物质并将其破坏。

免疫反应具备 3 个主要特点： ①抗原—抗体（或抗原— T 细胞）作用的特异性；

②记忆性 ;

特定的抗体或活化 T—细胞一旦产生，能够更快更多形成相同的抗体或 T 细胞；

③忍耐性。

因为动物躯体细胞表面的大分子也具有潜在的抗原性，如果在免疫反应过程中产生对应于它们的抗体或 T 细胞，则本身将遭受损害 . 形成抗体的免疫性称为体液免疫 , 形成活化 T 细胞的免疫性称为细胞免疫 .

二、抗原和抗体

抗原和抗体是体液免疫的一对物质，是后面将要介绍的学清学反应的基础。

（一）、抗原（ antigens ， Ag)1 、基本概念

是一类能诱导机体发生免疫应答并能与相应抗体或 T 淋巴细胞受体发生特异性免疫反应的大分子物质。

抗原两个特性

免疫原性，又称抗原性

免疫反应性，或称反应原性

指抗原进入机体后，能诱导免疫系统形成特异抗体或致敏淋巴细胞的能力

指抗原能与其所诱导产生的抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的能力

2 、抗原的特性

⑴. 异物性 ( 外源物质 )

⑵. 分子大小

⑶. 化学组成与结构

⑷. 特异性

3 ．抗原免疫原性的物质基础

⑴. 异物性 ( 外源物质 )

进入机体的抗原物质必须与该机体的组织和体液成分有差别，才能诱导机体产生免疫应答。

在正常情况下，机体的自身物质不能刺激自身的免疫系统发生免疫应答。

抗原的异物性主要包括：异种间的物质、同种异体间的不同成分、自体内隔绝成分和自体变异成分等。

抗原的理化性质与其所刺激的机体的自身物质理化性质的差异程度。

⑵. 分子大小

通常情况下，抗原的免疫原性与其分子量成正比

而分子大小对免疫原性却很重要。相对分子质量小于 5000-10000的物质一般是弱的免疫原，相对分子质量大于 10000的物质是良好的免疫原。

一般相对分子质量越小，免疫原性越小。相对分子质量越大，免疫原性也就越强。低相对分子质量化合物如氨基酸、脂肪酸、嘌呤嘧啶以及单糖通常均没有免疫原性，但可充当半抗原，一旦与大分子载体结合成复合物时，即可获得免疫原性。

⑶. 化学组成与结构

抗原性与物质的化学组成有关。有些相对分子质量大的分子不一定具有抗原性，如明胶的相对分子质量虽高达 1 ． 0×105 ，但因其中缺乏含苯环的氨基酸，又易降解，故免疫原性很弱；

又如胰岛素相对分子质量虽仅为 5734，但因其氨基酸成分和肽链结构复杂，也具有免疫原性。

在大分子中，蛋白质的免疫原性最强，其次是复杂多糖，再次是核酸、类脂物质。 通常情况下，大分子的结构越复杂，免疫原性越强。

⑷. 特异性

抗原的特异性是由分散于抗原分子上而具有免疫活性的化学基团决定的。

此化学基团曾称为抗原决定簇或称抗原决定基，现称为表位，它对诱发机体产生特异性抗体起决定性作用。

一个抗原上含有能与抗体分子相结合的表位的总数，称抗原结合价，一般抗原是多价的。

4 ．抗原的种类

抗原的种类

完全抗原：具有免疫原性和反应原性的抗原

不完全抗原或半抗原：只有反应原性而没有免疫原性的抗原

医学上的病原微生物都是完全抗原，并且是抗原性很强的抗原

很多小分子物质如类脂质、寡糖、核酸以及许多药物和化学物质不能单独诱导人或动物产生抗体或致敏淋巴细胞，即无免疫原性。若与蛋白质结合 ( 与载体结合 ) 形成高分子复合物时，就成为完全抗原

5 ．细菌的抗原

细菌、病毒、螺旋体和立克次氏体等病原微生物的化学成分相当复杂，有各种不同的蛋白质及脂蛋白、脂多糖。

因而它们的抗原组成相当复杂，每一个细胞都含有多种抗原，最常利用的抗原是细菌。

以细菌为例介绍如下。

⑴．菌体抗原 (somatic antigen) 存在于细胞壁、细胞膜和细胞质中的抗原

一个细菌细胞含有许多种菌体抗原，有的抗原是某种细菌所特有，称为特异性抗原，有的抗原是几种细菌所共有，称为共同抗原或类属抗原。

抗原结构是微生物分类鉴定的重要根据之一。

革兰氏阴性菌的菌体抗原称 O 抗原，主要成分为多糖、脂类和蛋白质组成的复合物。

⑵. 鞭毛抗原 (flagella antigen)

此抗原存在于细菌的鞭毛上。也将鞭毛抗原命名为 H 抗原。

H 抗原的化学成分为蛋白质，即鞭毛蛋白，具有很强的抗原性。

鞭毛抗原也是分类的重要依据之一。

⑶. 表面抗原 (surface antigen)指包围在细菌细胞壁外层的抗原，主要是荚膜或

微荚膜抗原。

根据菌种或结构的不同，表面抗原还有几种习惯名称，例如肺炎链球菌的表面抗原称荚膜抗原，

大肠杆菌，痢疾志贺氏菌的表面抗原称荚膜抗原或 K 抗原；

而伤寒沙门氏菌的表面抗原则称为 Vi抗原。

(4).菌毛抗原 (pili antigen)

由细菌细胞表面的菌毛蛋白所形成的抗原。如大肠杆菌的表面有菌毛结构，也具有抗原性。

( ５ )、毒素抗原

分为外毒素和类毒素两大类，前者抗原性很强，后者较弱。

（二）抗体 定义：是高等动物体在抗原物质的刺激下，由浆细胞产生的一类能与相应抗原在体内外发生特异结合的免疫球蛋白（ Ig） ，称为抗体。

它们主要存在于血液的血清部分，也存在于其他体液如乳液及某些外分泌液中。当血液除去血细胞和造成血凝固的物质后，剩下

的液体部分就是血清，含有抗体的血清叫做抗血清或免疫血清。

1 ．抗体的种类与结构

根据理化特性和免疫性质，抗体分为 5 种：

IgG

IgA

IgM

IgD

IgE其中 IgG最为普遍。

它们具有相似的基本结构，由 4 条多肽链组成的。

免疫球蛋白的分子结构：典型的免疫球蛋白分子呈 Y形

2 条相同的长链称为重链 (H链 ) ，通过二硫键连接起来，呈 Y 字型。

2 条相同的短链称轻链(L链 ) ，通过二硫键连接在 Y 字的两侧，所以整个免疫球蛋白分子结构是对称的。

2 、特点鱼类以上的脊椎动物的浆细胞分泌

在抗原的刺激下产生

可与相应的抗原发生特异性、非共价和可逆的结合

化学本质为球蛋白

可成为抗原

（三）补体

概念：是人和动物血清中的一组球蛋白 (20种以上 ) 成分，因在抗原抗体反应中，有补充抗体的能力，称为补体。

一般情况下，补体在体液中以无活性的酶原状态存在，当抗原与特异性抗体结合为抗原抗体复合物时，抗体构象发生变化，暴露出补体结合位点，从而激活补体。

激活后的补体攻击侵入细胞导致细胞 ( 细菌 ) 溶解。

补体的作用无特异性，对任何抗原抗体复合物都能发生反应，有杀菌、溶细胞和灭活病毒等作用，并能非特异性地促进吞噬细胞的吞噬作用。

补体成分在血清中的含量不因免疫接种而增加。

补体极不稳定，对热敏感。 56℃ 经 30min或61℃ 经 2min即被灭活。冰冻干燥可长期保存。许多理化因素如紫外线照射、机械振荡、酸、碱、乙醇等均可破坏补体。

三、常用的血清学技术

在体外进行的体液免疫反应一般采用血清进行试验，称为血清学反应。

血清学反应既可用已知抗原检测未知抗体，也可用已知抗体检测未知抗原。

故常用来进行体外体液免疫功能的测定、传染病的诊断、微生物的分类鉴定以及广泛应用于生物化学、遗传学、胚胎发育学、病毒学、细菌学等各学科的研究之中。这里只介绍一些常用反应方法的原理。

( 一 ) 、抗原、抗体反应的一般规律

1、特异性

2、可逆性

3、定比性

4、阶段性

5、条件依赖性

( 二 ) 、抗原、抗体间的主要反应

颗粒性抗原（完整的细菌细胞或血细胞等）与其特异性抗体在有电解质的情况下，结合成可见的凝集块，称为凝集反应。

反应中的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素 .

在实际操作时，一般要稀释抗体。

具体的方法有直接法、间接法。

1 、凝集反应

（ 1 ）．直接凝集反应

有玻片法和试管法。玻片法简便、快速，是一种定性试验，可用于菌种鉴定、测定血型等。试管法可定量判断血清中抗体的相对含量，可用于协助临床诊断或供流行病学调查。

（ 2 ）．间接凝集反应 将可溶性抗原吸附于一种载体颗粒表面，然后与抗体结合，在有电解质存在的适宜条件下，可发生凝集反应，称为间接凝集反应。

2 、沉淀反应

可溶性抗原，如细菌的外毒素、内毒素、血清、病毒的可溶性抗原和组织浸出液等与相应抗体结合，在适量电解质存在下，聚合成肉眼可见的白色沉淀，称为沉淀反应。

反应中的抗原称为沉淀原，可以是类脂、多糖或蛋白质等；抗体称为沉淀素。

在操作时，一般要稀释抗原。

经典方法

现代方法

环状沉淀反应

絮状沉淀反应

单向琼脂扩散法（单向免疫扩散法 ）

双向琼脂扩散法（双向免疫扩散法）

对流免疫电泳法

免疫电泳 火箭电泳法

双向免疫电泳法

沉淀反应的主要方法

(1)经典方法

环状沉淀反应 :

又称环状试验，是一种试管法。

先在小试管内加入已知抗血清，然后小心加入待检抗原于血清上表面，使之成为分界清晰的两层。一定时间后，凡两层液面交界处出现白色环状沉淀者即为阳性反应。此法简单、敏感，所需被检材料少，可用作抗原的定性试验如炭疽病的诊断、血迹鉴定、沉淀素的效价滴定等。

絮状沉淀反应 :

又称絮状反应。把抗原与抗血清在试管内混合，在有电解质存在时，抗原抗体复合物可形成混浊沉淀或絮状凝聚物。

此反应可用于诊断螺旋体引起的梅毒病(Kahn氏试验 ) 以及用以滴定毒素、类毒素和抗毒素的效价。

(2).现代方法

现代方法的共同的原理是抗原与抗体在半固体凝胶介质中作相对方向的自由扩散或在电场种进行电泳，由于反应物的分子大小、形状和电荷的不同，导致两者的扩散或泳动速度的差异，于是会在合适的比例处形成特异的沉淀带。

这种方法具有灵敏度高、分辨力强等优点。

单向琼脂扩散法 :

又称单向免疫扩散法。将抗原溶液滴加在混有抗体的琼脂介质小孔中，抗原经扩散后，可在小孔周围适当位置形成一沉淀环，根据环的面积可进行抗原的定量测定。

双向琼脂扩散法 :

双向免疫扩散法。将抗原、抗体分别滴加在琼脂介质的不同小孔中，作相对方向扩散，在两孔间合适的部位会形成沉淀线。此法灵敏度较差，工作时间较长。但对进行抗原分析有益。

免疫电泳 :

将琼脂双扩散与琼脂电泳技术相结合的方法。

待检样品 ( 含复合抗原 ) 先在琼脂凝胶板上电泳，将抗原的各个组分在板上初步分开，然后再在点样孔一侧或两侧打槽，加入抗血清，进行双向双扩散。

电泳迁移率相近而不能分开的抗原物质，又可按扩散系数不同形成不同的沉淀带，从而进一步加强了对复合抗原组分的分辨能力。

免疫电泳敏感性高，特异性强，近年来在生物学、生物化学、微生物学、免疫学及临床医学等领域中广泛应用。

可用来进行抗原与抗体成分的研究、生物制品纯度分析、甲胎蛋白和肝炎协同抗原(HAA)的诊断等，并在此基础上又发展成为对流免疫电泳和火箭免疫电泳等。

3 、 免疫标记技术

（１）．免疫荧光技术

抗体与某些特定的荧光物质结合而成为荧光标记抗体，仍能特异性地结合抗原成为荧光标记的抗体抗原复合物，在荧光显微镜下可被观察到。

荧光素与抗体结合能侦察出抗原所在部位，故可用来进行抗原的定位或定性测定。

（２）酶联免疫测定（ ELISA ） 将某种酶先结合到抗原或抗体伤作标记，通

过酶对底物的显色作用来指示抗原和抗体的特异反应。常用的酶有碱性磷酸酶、过氧化物酶和 β—半乳糖苷酶。酶对底物的作用与否及其强弱，可以根据有

无颜色变化及颜色的深浅来判断。

这种方法的特异性强、灵敏度高、基本、简便快速，还在不断地改进和创新。

（ 3 ）、放射免疫测定法

是将放射性同位素的灵敏性和免疫学抗原抗体反应的特异性结合起来的一种技术。

此法是一种定量分析方法，能检测生物体液中的微量免疫活性物质，具有灵敏、特异、精密、准确和快速等特点。

（ 4 ） . 单克隆抗体技术

单抗一问世，便被誉为“免疫学中的技术革命”，显示出巨大的生命力和广阔的发展前景。

在生物学各领域，尤其是在疾病诊断中的广泛应用，己取得令人瞩目的进展，而在治疗和预防中的应用也己成为可能。

单抗在预防移植排斥反应及治疗肿瘤上又显示出可喜的苗头，在治疗自身免疫性疾病、免疫缺陷病及某些烈性传染病，控制药物过敏反应中也受到重视。

思 考 题

1 、作为接种剂应具备哪些性质？ 2 、有哪几种常用接种剂？ 3 、微生物接种剂与农业生产的关系如何？ 4 、微生物农药有哪些种类 5 、应用于农业害虫防治的微生物有哪些？试述苏 云金杆菌的杀虫原理。 6 、什么叫抗菌素？抗菌素的抗菌机理怎样？ 7 、抗菌素是在什么时间有哪位科学家发明的？ 8 、什么叫堆肥？试述堆肥的微生物学过程？ 9 、试述沼气发酵的微生物学原理。 10 、试述污水处理的微生物学原理及常用 方法。