第三章 生防微生物第三章 生防微生物吴云锋吴云锋

第一节 根际微生物第一节 根际微生物

11 ．微生物．微生物 微生物作为农业生态系中必不可少的成员，

广泛分布于土壤、根际、根表、根内，及地上部分各种器官的表面和内部。

根际（ rhizosphere ）： 也称为根围、根圈、根域，是指土壤中紧密

环绕根的区域。 根际微生物（ rhizosphere microorganisms ）：

由于植物根系经常向周围的土壤分泌各种外

渗物质，因此，在根际活动着大量的微生物，由于根围微生物多而活跃，构成了根围特有的微生物区系，根际微生物以无芽孢杆菌居多。

2. 2. 分布分布 土壤具有微生物生长繁殖所需要的一切营养

物质及各种条件，因此土壤是微生物良好的生活场所，有“微生物的天然培养基”之称。

地球上 " 最早的居民 " 是微生物。 无论是繁华的现代城市、富饶的广阔田野、

还是人迹罕见的高山之巅、辽阔的海洋深处，从1 万米深、水压高达 1140 个大气压的太平洋底到8.5 万米高的大气层；从炎热的赤道海域到寒冷的南极冰川；从高盐度的死海到强酸和强碱性环境，到处都有微生物。

地球表面存在大量的微生物

土壤微生物（土壤微生物（ Soil Soil microbemicrobe ））

温泉水微生物温泉水微生物

AnimalsPlants

水体微生物 水体微生物

雪域高原雪域高原 微生物 微生物

( 苏联 ) 东方号站

南极冰川南极冰川 微生物 微生物

Bacteria in Antartic ice cores Mine Drainage矿山水

假如把地球演化到今天的历史浓缩到一天，地球诞生是 24 小时中的零点，

地球诞生 零点， 地球的首批居民 -- 厌氧

性异养细菌 早晨 7 点钟 好氧性异养细菌 午后 1

3 点左右， 鱼和陆生植物 晚上 22

点； 人类 一天的最后一分钟

才出现。 1 1 首批居民—首批居民—厌氧性异养细菌厌氧性异养细菌

22 好氧性好氧性异养细菌异养细菌4 4 人类人类

3 3 鱼和鱼和陆生植物陆生植物

尽管人类对微生物的利用已有几千年的历尽管人类对微生物的利用已有几千年的历史，现代微生物学也经历了一个多世纪的史，现代微生物学也经历了一个多世纪的发展，但至今，为人们所认识的微生物种发展，但至今，为人们所认识的微生物种类仍仅占自然界中微生物总数的类仍仅占自然界中微生物总数的 1%1% ～～ 5%5% ，，人类生产和生活中开发利用的则更少。因人类生产和生活中开发利用的则更少。因此，微生物可能是地球上最大的、尚未有此，微生物可能是地球上最大的、尚未有效开发利用的自然资源。效开发利用的自然资源。

目前已知的细菌不足目前已知的细菌不足 60006000 种（估计在种（估计在 3003000000 种以上），真菌不足种以上），真菌不足 8000080000 种（估计在种（估计在15000001500000 种），目前为人类所了解的数目种），目前为人类所了解的数目约占总数的约占总数的 55 ％；仅有约％；仅有约 1%1% 保存于世界保存于世界各地菌种中心，并被开发利用。各地菌种中心，并被开发利用。

一个国家对生物资源掌握得越多、研究得越深入、利用得一个国家对生物资源掌握得越多、研究得越深入、利用得越充分，就越能掌握自己国家的未来发展。科学家们普遍越充分，就越能掌握自己国家的未来发展。科学家们普遍相信，至少相信，至少 20%20% 以上的昆虫肠道系统或体内均可分离出以上的昆虫肠道系统或体内均可分离出多种单一宿主的绝对寄生微生物。因此，在昆虫种类数目多种单一宿主的绝对寄生微生物。因此，在昆虫种类数目未清楚前，所有微生物种类的数量都可能被低估。随着人未清楚前，所有微生物种类的数量都可能被低估。随着人类对生命过程认识的加深，生物技术已成为实现社会可持类对生命过程认识的加深，生物技术已成为实现社会可持续发展的最有潜力的技术手段。当前的生物技术以微生物续发展的最有潜力的技术手段。当前的生物技术以微生物技术为核心，在环境整治、可再生能源生产和人类健康保技术为核心，在环境整治、可再生能源生产和人类健康保障等方面正发挥着不可替代的作用。微生物的生存环境和障等方面正发挥着不可替代的作用。微生物的生存环境和生命策略的多样性，使之成为人类寻求解决环境、能源和生命策略的多样性，使之成为人类寻求解决环境、能源和健康等问题的最佳材料。 健康等问题的最佳材料。

据估计，发达国家微生物产品的年产值约占国民生产总值据估计，发达国家微生物产品的年产值约占国民生产总值的的 6%~10%6%~10% ，每年仅向全球药业市场提供的原材料就有，每年仅向全球药业市场提供的原材料就有500500 亿美元而；在中国，其产值目前约占亿美元而；在中国，其产值目前约占 3%3% 。。

植物根系PLANT ROOTS

植物残体PLANT RESIDUES

植物PLANTS

Bacteria Fungi微生物Microbial

原核生物Protozoa

线虫nematodes

植物生长与微生物活动的关系

微生物根系活动微生物根系活动 MICROBIAL ACTIVITY MICROBIAL ACTIVITY Parent material, time, topography, climate, vegetation, faunaParent material, time, topography, climate, vegetation, fauna

植物根系PLANT ROOTS

植物残体PLANT RESIDUES

植物PLANTS

Bacteria Fungi微生物Microbial

原核生物Protozoa

线虫nematodes

33．类群．类群（ 1 ）土壤中生活的生物：

土壤微生物 微小的植物 动物等。

（ 2 ）土壤微生物的种类（ major groups of soil microorganisms ）：

主要有 6 种。 细菌 Bacteria 真菌 Fungi放线菌 Actinomycetes 病毒 Viruses线虫Nematodes酵母 Yeast 。

其它生物还有： 藻类 Algae原生动物 Protozoa螨类 Mite Populations contributes to development of the

total community These groups + higher animals interact

in soil to catalyze the biogeochemical processes occurring therein

土壤微生物种类繁多，数量极大，其中以土壤表层或耕作层中及植物根附近微生物数量较多。

土壤越肥沃，微生物种类和数量越多。 根际微生物的种类受植物的种类和植物的发育阶段所影响。

土壤微生物数量 (Amount of soil microorganisms):

Bacteria ： exists in soil at densities of 108 to 109 colony-forming units per g dry soil

 Actinomycete: 107 to 109 propagules per g dry soil

Fungal and Protozoan: 106 propagules each per g dry soil

（ 1 ） 细菌 土壤中数量最多的微生物。 占土壤微生物总量的 70% ～ 90％， 田间土壤中一般为 106 ～ 108 个 /cm3 ， 其中上层 15厘米的土壤中，细菌鲜重为

1500—3700公斤 /公顷。

土壤细菌 soil bacteria

革兰氏阳性菌 Gram +

节杆菌属Arthrobacter

芽胞杆菌 Bacillus

梭菌属 Clostridium

革兰氏阴性菌 Gram-

假单胞菌 Pseudomonas

根瘤菌 Rhizobium,

（大豆根瘤菌Bradyrhizobium japonicum）

固氮菌 Azotobacter

亚消化单胞菌Nitrosomonas

硝化甘油菌 Nitrobacter

农杆菌 Agrobacterium

2 .大肠杆菌 Escherichia coli

1 .芽孢杆菌 Bacillus subtilis

3. 棒状杆菌 Corynebacterium

细菌种类

杆状菌 Bacillus 梭菌属 Clostridium

内生芽胞杆菌 Endospore-bearing bacteria

4 .假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa

5 .阴沟肠杆菌 Enterobacter cloacae

Bordetella pertussis乳酸菌 Lactobacillus

链球菌 Streptococcus sobrinus葡萄球菌 Staphylococcus

葡萄球菌 Staphylococcus 螺原体 Spirillum Borrelia burgdorferi

蓝藻细菌 Cyanobacteria

（ 2 ） 放线菌 是土壤中另一类主要的微生物类群，数量仅次于细菌，占微生物区系总量的 13 ～ 14% 。

放线菌多存在于偏碱性的土壤中，大部分土壤放线菌属于链霉菌科的三个属：

链霉菌属（ Streptomyces） 小单孢菌（Micromonospora） 诺卡氏菌属（Nocardia） 土壤或根围中的链霉菌大多数种都归于链霉

菌属。放线菌虽然数量比细菌少，但由于其菌丝体的体积比单个细菌大几十倍甚至几百倍，所以在土壤中的生物量也相近于细菌。

放线菌Actinomyc

etes

（ 3 ） 土壤真菌 数量排第三位。土壤中的真菌各种类型

都有，以半知菌类为最多，主要分布于土壤表层中。

真菌和细菌（ Fungi and bacteria ）Culturable and unculturable

Fungi bacteria

有机营养型或异养型微生物：只利用现成有机物质的微生物。

无机营养型或自养微生物：一些靠二氧化碳和碳酸盐自食其力的微生物。

微生物具有极强的抗热、抗寒、抗盐、抗干燥、抗酸、抗碱、抗缺氧、抗压、抗辐射及抗毒物等能力。

微生物的呼吸： 有的喜欢吸氧气，是好氧性的； 有的则讨厌氧气，属于厌氧性的； 还有的在有氧和无氧环境下都能生存，叫兼

性微生物。（ 4 ）藻类 由于藻类主要是自养型，所以它同腐生物的竞争力较弱，在根围的数量较低。土壤中的藻类数量远远少于上述各类。

主要有：绿藻、硅藻等。 土壤中的原生动物都是单细胞异养型的，主

要是纤毛虫、鞭毛虫、根足虫等，次要是纤毛虫、鞭毛虫、根足虫等。

相互作用Complexity Interactions

L1L2

Cnb

L1

L1

The lichen PeltulaUnidentified lichen

Microcoleus vaginatus地木耳 Nostoc

N2

N2

与地衣共生藻类

44．作用．作用 根据对植物的作用，根际微生物 (rhizosphere) 分为：

3 类 （ 1）有害微生物：占 8% ～ 15% （ 2）中性微生物：占 80% ～ 90% （ 3）有益微生物：占 2% ～ 5% 有益微生物的种类包括： 共生物：根瘤菌、某些放线菌和菌根真菌。 腐生物：它们有些促进对矿质营养的吸收和利用，或者产

生激素促进植物生长，或者可抑制寄生和非寄生病原菌的微生物。由于这类能直接或间接地促进植物生长的细菌又被称为根际促生菌〔 Plant growth-promoting rhizobacteria ， PGPR〕。

有些生防菌能减轻病害，故称为根围促健菌〔 Plant health-promoting rhizobacteria ， PHPR〕。

PGPR 细菌包括： 假单胞杆菌属 (Pseudomonas)：荧光假单胞菌 土壤杆菌属 (Agrobacterium) 欧文氏杆菌属 (Erwinia) 伯克氏杆菌属 (Burkholderia) 芽孢杆菌属 (Bacillus) 。 沙雷氏菌 (Serratis spp.) Arthrobactor Alculigenes Rhizobactium20 多个属的根围细菌。 放线菌 木霉菌

PGPR 的作用： （ 1 ）定殖于植物根系 , 优先占领根际； （ 2 ）抗生素、嗜铁素等直接作用于病原菌，抑

制根际有害微生物（ DRMO ）。 PGPR 能抑制 DRMO 产生氰化物，从而促进马铃薯

的生长发育 , 多年连作效果更为明显。 PGPR 海洋放线菌 MB 97 和海洋细菌 BAC 9912 , 则能抑制大豆紫青霉菌产生毒素 Rubratoxins ， MB97 还能产生刺激大豆生长的次级代谢产物 , 克服大豆连作障碍 , 从而促进重茬大豆的生长发育 , 提高大豆的产量和品质。

（ 3 ）产生 IAA 等植物生长调节剂，促进植物生长发育；

（ 4 ）诱导植物抗病性（ ISR ）。

根毛 Root hair

H2O

O2

CO2

H2O

毛细管Capillarity

土壤颗粒Soil particles,有机质organic matter

Mucigel 根分泌物Root exudates

根际 / 根表rhizosphere/rhizoplane

在植物根际微生态系统中，植物有益微生物和有害微生物是相互制约的。

土壤微生物可以降解土壤中的有机成分，先将有机质降解成腐殖质，然后变成各种化合成分，最终变成基本的土壤成分。

有机物是土壤微生物生存的必要条件，各种各样的有机物在土壤中生存、繁衍和死亡。

大多数根际、根表细菌很活跃Most bacteria in the rhizosphere/rhizoplane are active

根尖 Root tip

根毛 Root hair

根内微生物

55．影响因素．影响因素 由于土壤具备里各种微生物生长发育所需要的营养、水分、空气、酸

碱度、渗透压和温度等条件，所以土壤是微生物生活的良好环境。 （ 1 ）土壤质地 土壤质地：包括土壤的物理结构及其理化性状。 耕作土壤：矿物质占 95％以上，有机质占 5％。 我国南方的红壤土、黄壤土以及高山地区灰化土、森林

土均为碱性土，其余广大地区为中性土。沙漠地区多为碱性土。

微生物的原生质的 pH接近中性，大部分微生物在中性条件下生长良好。

土壤细菌、放线菌在中性偏碱土壤中生长良好， pH5以下停止生长。

真菌喜欢在弱酸性土壤中生长， pH约为 3.0 ，真菌占优势。真菌在偏碱土壤中停止生长或死亡。

土壤组成

微生物活动 Microbial activity

Soil depth

+

-

Plant cover, +

Water 50-70% Field capacity25-35oC, mesophiles 喜温的Aerobiosis 好氧的Following tillageReduced or no tillageCarbon input

+

Distance from plant rootSubstrate removalBad conditions:Cold, pollution, flooding, drought

-

Sand

Fungal hyphae

Bacteria

ActinomycetesOrganicmatter

ClaySilt

25 m

Fgl

MycorrhizaeRoot

Wt

Mite

NMt

Clt

100 m

m

The manner in which soil particules are assembled in aggregate forms

Aggregates are the products of the ， interactions of the soil mineral components,the microbial and plant communities, and of the soil ecosystem history

StructureStructure

（ 2 ）植物种类 植物种类的影响植物分泌物或挥发物质的差

异，现在已形成了一门“化学生物群落学”来专门研究植物、分泌物或挥发物与生物群落之间的关系。

（ 3 ）土壤微生物互作 ① 抑制病害的发生 ②刺激病害的发生

第二节 放线菌 Actinomycetes

一、生物学

11 ．定义．定义 放线菌（ actinomyces）是一类介于

细菌与真 菌之间的单细胞原核微生物，所以在 Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Vol.4 上归在分枝菌纲 (Actinomycetes) 。菌丝纤细、分枝，从一个中心向周围呈放射生长，故称为放线菌。

放线菌（ Actinomycetes）形态

22 ．菌丝形态．菌丝形态 放线菌菌丝：直径与细菌相似，小于 1 微

米，菌丝细胞的结构与细菌基本相同，形态比细菌复杂。

细胞核：无核膜，多数能形成分生孢子。

放线菌（ Actinomycetes）形态

根据菌丝形态和功能的不同，放线菌菌丝可分为三种 :

基内菌丝 (Substrate mycelium） 气生菌丝 (Aerial mycelium) 孢子丝 (Reproductive mycelium) 基质菌丝：专管吸收营养 ; 气生菌丝：作为放线菌成长发育标志的。 孢子丝：放线菌长到一定阶段便开始产生孢子，先在气生菌丝的顶端长出孢子丝，等到成熟之后，就分裂出成串的孢子。

孢子：形状有球形，卵圆形，可以随风飘散，遇到适宜的环境，开始吸水，萌生成新的放线菌。

链霉菌的一般形态。

链霉菌菌丝链霉菌菌丝

链霉菌属（ Streptomyces）蓝色亚群（ Gyaneus） .

链霉菌属（ Streptomyces）黄色亚群（ Flavus）

链霉菌属（ Streptomyces），粉红孢类群（ Roseoporus）弗氏亚群亚群（ Fradiae）

33．菌落形态．菌落形态 放线菌生长较慢，菌丝从平板底层开始生长，呈放射状，菌丝相互交错缠绕形成质地致密的小菌落。

菌落表面粗糙干燥粉状，不透明、难以挑取。 菌落颜色鲜艳，有白色、粉色、灰色、紫色等。放线菌在固体培养基上形成与细菌不同的菌落特征，当大量孢子覆盖于菌落表面时，就形成表面为粉末状或颗粒状的典型放线菌菌落。

由于基内菌丝和孢子常有颜色，使得菌落的正反面呈现出不同的色泽。

放线菌 Actinomycetes

放线菌的菌丝形态光镜照片

质地 : 致密、干燥、多皱、小而不蔓延、不挑起，表面有放射状沟纹。

形状：随菌种不同有两类： (1) 产生大量分枝状菌丝的菌种： 如链霉菌（ Str

ptomyces）形成与培养基结合较紧的菌落，不易挑起或整个挑起。

(2) 不产生大量菌丝的菌种： 如诺卡氏菌属（Nocardia）形成的菌落呈粉质，挑之易碎

放线菌的菌落特征 A：诺尔斯氏链霉菌 B：皮疽诺卡氏菌 C：酒红指孢囊菌 D：游动放线菌 E：小单胞菌 F：皱双孢马杜拉放线菌

44．生活习性．生活习性 分布：广泛分布于自然界，多见于土壤

中。较干燥、微碱性和有机质丰富的土壤是放线菌的主要习居场所。估计每克土壤中约含放线菌孢子 107 个。多数情况下，泥土中散发出的“泥腥味”就是由放线菌中链霉菌产生的土腥素造成的。

除少数厌氧或兼性厌氧的寄生菌外，大多数是好气性的腐生菌，属于化能异养。其种类繁多，代谢功能各异，是具有巨大实用价值的一类微生物。

55．繁殖．繁殖 放线菌没有有性繁殖，主要通过形成无性分子

孢子方式和菌丝断裂成片段进行无性繁殖。 一种方式先在气生菌丝的尖端生长出孢子丝，

成熟后分裂出成串的分生孢子或孢囊孢子散落在适宜环境里发芽形成新的菌丝体；放线菌能像真菌那样形成分枝菌丝，并在菌丝末端产生外生的分生孢子，有些种类甚至形成孢子囊。

另一种方式是菌丝体的无限伸长和分枝，在液体振荡培养（或工业发酵）中，放线菌每一个脱落的菌丝片段，在适宜条件下都能长成新的菌丝体，也是一种无性繁殖方式。

º á̧ ô· ÖÁ Ñ

Ë õç Ë· ÖÁ Ñ

· ÖÉ úæ ß× Ó æ ß× ÓÄ Òæ ß× Ó

无 性 孢 子 （ 主 要 ） 菌 丝 片 段

放 线 菌 的 繁 殖

放线菌的繁殖方式图放线菌的繁殖方式图

应用： 产生大量的、种类繁多的抗菌素； 产生酶类、维生素； 一些放线菌有固氮能力； 放线菌在自然界物质循环中也起着重要作用，由于它们具有较强的分解复杂有机物的能力，对于土壤肥力的提高也有重要作用。危害： 只有极少数放线菌对人类构成危害，某些放线菌（ Actinomyces ）菌种引起动物放线菌病（皮肤、脑、肺和足部感染），某些诺卡氏菌属（Nocardia ）引起人和动物的诺卡氏菌病； 少数放线菌能引起植物病害。如马铃薯疮痂病。

1898 年德国的 Globing 从土壤中分离出第一株放线菌以来，至今有百年历史。瓦克斯曼研究土壤微生物时发现放线菌中含有链霉素，为世界上的肺结核及脑膜炎患者带来了福音。 1952年他和另外一位科学家荣获诺贝尔医学生理奖诺贝尔医学生理奖。

目前 4000 多种抗菌素中三分之二是由不同的放线菌产生。

二、放线菌的分离

1. 1. 分离培养基分离培养基 高氏一号培养基 秸秆腐解琼脂培养基 玉米粉琼脂培养基 黄豆粉琼脂培养基。

玉米粉琼脂培养基上分离的放线菌数量及种类均最多，细菌数量最少。

黄豆粉琼脂培养基上有抑菌圈，易挑菌。 采用玉米粉琼脂培养基和黄豆粉琼脂培养基两种培养

基，就可以从土壤中分离到绝大部分放线菌（种类和数量），能充分地反映土壤中的放线菌数量。

2.2. 土壤样品预处理方法土壤样品预处理方法（ 1） 6% 酵母膏能够强烈抑制真菌的生长，但

是不能减少细菌的污染；（ 2） 0.05%SDS（ 5mmol/L磷酸缓冲液配制）能够强烈抑制细菌的生长，放线菌出菌率较前者高但是依然有真菌的污染存在；（ 3）重铬酸钾强烈抑制真菌生长，对细菌也有一定有效的抑制作用，使用后放线菌出菌率低。

（ 4） 6% 酵母膏和 0.05%SDS混合处理，再加土样风干 10d 能够完全抑制真菌的污染问题，大量降低细菌的出菌率，不影响放线菌的筛选。

采样后 4℃ 条件下贮藏 1 个月后的土样进行同样预处理的分菌效果，是细菌菌落数显著增加，尤其是未经风干土样，细菌、真菌菌落连成一片，已无法挑菌。

11 ．土壤中放线菌的种类．土壤中放线菌的种类 1943 年链霉素的发现及其医药上的巨大作用，促进了放线菌分类的发展。目前有放线菌 80 多个属，仅链霉属就有 1000 多个种和变种。

a. 链霉菌（（ Streptomyces canescensStreptomyces canescens ），），也称“灰色链丝菌”。放线菌类的一个大属。约有 800 种左右。

其基质菌丝不断裂，气生菌丝分化成直的、弯曲的或螺旋状的孢子丝，顶端生很多分生孢子。菌落较小而致密，不易挑取，表面呈粉状，有多种颜色。

许多种类：可产生抗菌素，如链霉素、四环素、红霉素、卡那霉素、春雷霉素、阿维菌素等；

有些：可生产蛋白酶、葡萄糖异构酶。还可以用于制造菌肥，如“ 5406”抗生菌肥料等。

三、种类与分类依据

b. 金霉菌（ Streptomyces aureofaciens），亦称“金色链霉菌”。

以在固体培养基上产生金黄色色素而得名。 抗菌素工业上用以生产金霉素。 c. 土霉菌（ Streptomyces rimosus），亦称

“龟裂状链霉菌”。 菌落呈皱状裂纹。 抗菌素工业上用以生产土霉素 ( 地霉素 ) 。 d. 小单孢菌（Micromonospora），放线菌的

一个属。 只在基质菌丝末端产生单个分生孢子，不形

成气生菌丝。菌落很小。 如产生庆大霉素的棘状小单孢菌和紫色小单

孢菌等。

e. 诺卡氏菌属（ Nocardia ） 利福霉素、诺卡杀菌素（Nocardicins）。

22 ．分类依据．分类依据 经典分类（ 1 ） 形态特征

基内菌丝体的发育程度 有无气生菌丝体和孢子、孢囊、菌核以及其它结构， 孢子链、孢子、孢囊、孢囊孢子的形状、大小、数目等；

各类繁殖体是否有能游动的鞭毛以及鞭毛的位置。

（ 2 ）培养特征 基质菌丝和气生菌丝的颜色一向是分类重要特征， 7

0 年代微生物所编的《链霉菌鉴定手册》中，主要就是根据这二者区分的。

60 年代后期到 70 年代初发表的《国际链霉菌计划（ ISP）》，以和气生菌丝颜色为主，基质菌丝和可溶色素的颜色为副。新增加的色素对酸碱度是否敏感的方法，极具鉴别价值。

为了观察形态和培养特征，国际链霉菌计划只采用 4种培养基：

甘油天门冬素琼脂无机盐淀粉琼脂酵母精麦芽糖琼脂燕麦粉琼脂。

还必须辅以蔗糖硝酸盐（查氏）琼脂，葡萄糖天门冬素琼脂，苹果酸钙琼脂，营养琼脂等，最好还需接种到高氏合成 1 号琼脂，伊莫松琼脂，马铃薯块上，才能充分观察到某些菌的特征。

（ 3 ）生化特征 最初所测定的几个酶的活性上，如明胶液化、牛奶凝固和胨化、淀粉水解、纤维素分解、硝酸盐还原、蔗糖转化等。

在链霉素属各个种的鉴定中，对于其是否能够在有机培养基内产生黑色素越来越受重视。 国际链霉菌计划规定用胰胨酵母精培养液测定产生黑色素的能力；

用酪氨酸琼脂测定是否产生酪氨酸酶； 用蛋白胨酵母精铁琼脂测定是否产生硫化氢，但这三者

的反应时常并非总是一致的。

对于氮源的利用，逐渐成为比可少的测定项目。

测定碳源种类较多，有时竟达 20 多种。 国际链霉菌计划规定 9 种碳源：以 D-葡萄糖

为阳性对照，再加上 L-阿拉伯糖、 L-鼠李糖、D-果糖、蔗糖、棉子糖、 DL-肌醇和甘露醇。实践证明，由这几种碳源所反应的碳源谱时常相同，有必要再加一些碳源，如半乳糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖、蜜二糖、松三糖、淀粉、菊糖、甘油、卫矛醇等才能显示不同菌种碳源利用的差异。

（ 4 ） 生态条件 主要是好气与嫌气、腐生与寄 生、中温与嗜温（少数嗜低温）以及对酸碱度（ PH）的要求。

绝大部分放线菌都是好气的，只有放线菌属的几个种和小单孢菌属的个别种是嫌气的；绝大部分放线菌是腐生的，只有几个放线菌属的几个种，分枝杆菌属的许多种、诺卡氏菌属少数种以及嗜皮菌等是寄生的，其中几种链霉菌能够寄生再植物上。

（ 5 ） 放线菌的化学分类 在传统分类学中形态学是很好的分类特征。

从 20 世纪 60 年代初期开始， Lechvaliev等放线菌分类学家进行了化学分类学的研究，建立了一套放线菌细胞组分的化学分析方法，从而逐步打破了传统的分类概念，奠定了化学分类的基础，使放线菌分类学的内容从表观水平，深入到了细胞水平。

A. 细胞壁化学组分 放线菌的细胞壁是由肽聚糖胞壁酸、多糖等高分子组成。

肽聚糖四肽三位往往含特异氨基酸，不同种放线菌的肽聚糖中，这个位置的氨基酸不同， Lechevalier 等用纸层析法分析了大量放线菌株细胞壁化学组分，按所含氨基酸种类分型，按全细胞糖型分为 4 个型，这以成为确定放线菌种属必不可少的手段。

磷酸脂是位于细菌、放线菌细胞膜上的极性物质，不同属的菌磷酸质组成不同，它是鉴别属的重要依据之一。

分类上重要的磷酸脂有：磷酸酰乙醇氨（ PE）、磷酸酰甲醇乙醇氨（ PME ）、磷脂酰胆碱及含有葡萄糖氨未知结构的磷酸脂。

B. 醌 醌是细胞原生质上的组分，在电子传递和氧化磷酸化中起重要作用。放线菌的醌有泛醌（辅酶 Q）和甲萘醌等。甲萘醌的侧链由不同长度的异戊烯基单位所构成，异戊烯基单位的长度及氢饱和度在不同的属中是不同的，因此，可以作为分类的特征之一。

C. 枝菌酸 枝菌酸及其他脂类是细胞膜的重要组成部分。

根据枝菌酸的有无将不含枝菌酸的诺卡氏菌里划分出来，并结合其他指标建立了无枝菌酸属和拟无枝菌酸属。对于既含枝菌酸细胞壁又是 IV型的诺卡氏菌、分枝杆菌以及非常接近细菌的棒杆菌，用枝菌酸分析方法可以明确的分开。因此，枝菌酸的测定是研究诺卡氏放线菌分类中必不可少的化学指标。

D. 脂肪酸 脂肪酸以脂的形式存在于磷脂蛋白、脂多糖、磷壁酸脂中，其中一些细胞膜的组成部分。放线菌的脂肪酸分为 6 类，它们的脂链长度在不同的菌中不同，根据侧链脂肪酸有无 ANT/ISO 系统与是否为 7碳烷，把磷酸中的脂肪酸分为 4 个类型，放线菌肪酸的类型不同。

E. 化学分类系统存在问题及发展趋势 从每种化学分类的鉴定内容看，都是

由一组数据来决定种属的。在数据间由于缺乏定量的相关系，不同属得数据难以截然分开，从而造成分类上的混乱，给化学分类的实际应用造成困难。近年来，仪器分析方法越来越多的应用于化学分类研究，使定量化有发展。同时，不同学科的相互渗透也会促进分类标准向合理化发展，从而形成公认得分类标准。

（ 6 ）放线菌的分子分类 自 80 年代分子生物学及遗传学的发展，许多

学者又在分子生物学方面探索放线菌得分类。 a. DNA碱基分析 DNA 内 G+C含量摩尔百分比在细菌分类中很重要，在放线菌中由于百分数范围窄，各属重叠多，所以通常起辅助作用，但有时也有重要参考价值，常常以 GCmol% 的显著差异来纠正错误的种属划分。

b. DNA-DNA(rRNA) 分子杂交技术 研究表明 : DNA-DNA(rRNA) 分子杂交技术在种属水平上研究细菌、放线菌分类地位是一个强有力的手段，可以用来解决传统分类方法难以解决的问题。

c. 16SrRNA寡核苷酸编目分析 16SrRNA寡核苷酸编目分析法，是

Worse等于本世纪 70 年代早期设计的用来研究原核生物进化关系的一种方法。该种方法应用于细菌、放线菌分类研究之后已取得了丰硕成果，除了发现生命的第三种形式——古细菌（ Archaebacteria） 之后，还对真细菌（ Eubacteria）的亲源关系进行了系统的阐述。

通过对放线菌不同菌种的寡核苷酸序列分析，它们的亲缘关系也日清楚 GCmol%含量在 55%以上的革兰氏阳性菌还包括双歧杆菌属和丙酸杆菌属两类厌氧菌，它们在放线菌分枝线上形成最早的分枝（ SAB值分别为 0.40 和 0.48）。

放线菌分为 5个分枝：第一个分枝：包括节杆菌属、纤维单孢菌属、微

球菌属、微杆菌属、短杆菌属和放线菌属；第二分枝：以简单接杆菌属为代表；第三分枝：是棒状杆菌及其相近菌株；第四分枝：包括分之杆菌、诺卡氏菌、以及下列

菌属的代表种，这些属是红球菌属、缠绕棒杆菌、石灰壤诺卡氏菌属、地嗜皮菌属、指孢囊菌属、小单孢菌属、小瓶菌属。

我国中科院提出的分类系统 放线菌目包括 66 个科个科：： 1. 1. 嗜皮菌科嗜皮菌科：：菌丝体多方向分裂为成叠的立方形细胞堆。 2. 2. 弗兰克氏菌科弗兰克氏菌科：：与植物共生，有菌丝体阶段。 3. 3. 放线菌科放线菌科：：基内菌丝体分裂成杆菌或球菌状小体，大

多厌气。 4. 4. 键霉菌科键霉菌科：：基丝不断裂，只有气丝形成的孢子链，好

气。 链霉菌科包括三个属： 链霉菌属 (Streptomyces)：孢子丝直，钩状，螺旋形或轮生。有灰白链霉菌 (S.canescens) 、柠檬荧光链霉菌(S.citrecofluorescens) 和极美链霉菌 (S.pulcher)等。金霉菌（ Streptomyces aureofaciens），亦称“金色链霉菌”。以在固体培养基上产生金黄色色素而得名。抗菌素工业上用以生产金霉素。 土霉菌（ Streptomyces rimosus），亦称“龟裂状链霉菌”。菌落呈皱状裂纹。

钦氏霉属 (Chainia )：形成菌核。 孢器放线菌属 (Actinopycnidium)：形成分生孢子器。 5. 寡孢菌科：孢子单个或成短链。 6. 游动放线菌科：形成孢束。

链霉菌属分类原则链霉菌属分类原则 以形态特征为主，生理生化特征为副的分类原则。 形态、培养特征：

孢子丝形状 菌落形态 孢子堆颜色 气丝和基丝颜色以及可溶性色素有无等。

近年由于微生物分子生物学的渗透，放线菌分类出现由描述科学向实验科学发展的趋势，而现代技术尤其是电镜技术，生理生化技术，分子生物学的应用，促进了这一趋势并打破了传统的描述分类，建立了化学分类，分子分类，数值分类等新的标准，促进了分类学的发展。

四、防治原理11 ．抗生素．抗生素 井冈霉素有内吸性和治疗作用。井冈霉素具有强

内吸作用 , 能很快被菌丝体吸收并在体内传导，从而保持它的优异防治效果。大多数农药均为保护剂，而井冈霉素在水稻发病率 15% 时用药最为经济有效。 15% 以下发病一般不影响水稻的产量 ,发现病害后施药具有更好的经济性。

灭瘟素又叫“稻瘟散”、“布拉叶斯”，是一种从放线菌培养液中提取出来的抗生素，用于防治稻瘟病、稻胡麻斑病、水稻菌核病等。

Cataly

zers

Cataly

zers

Enzymes

Enzymes

Inhibitors

InhibitorsA

ctive compounds

Active com

pounds

22 ．其它作用．其它作用 放线菌的代谢产物几丁质酶（ chitinase）是造

成菌丝畸变、细胞质凝集和外溢的直接原因。 放线菌具有分解几丁质的能力，含有几丁质的土

壤，灭菌后溶解病原真菌的能力消失，由于真菌细胞壁的主要成份是几丁质，因此土壤中添加几丁质或有机质可促进放线菌大量繁殖，从而达到抑制土传病害的目的。

放线菌在植物根系分泌类似赤霉素的物质并能为植物根系直接吸收，促进了植物的生长。

第三节 芽孢杆菌第三节 芽孢杆菌一、概述1. 1. 概念概念 芽孢杆菌是一群好氧或兼性厌氧、产芽孢的 G+ 杆菌

的总称，其生理特征丰富多样。分布及其广泛，是土壤和植物体表根际的重要微生物种群。

2. 2. 特点特点 由于芽抱杆菌能产生耐热性抗逆芽孢，这有利于生防

菌剂的生产、剂型加工及在环境中存活、定殖与繁殖。芽孢杆菌生防菌剂在稳定性、与化学农药的相容性和在不同植物不同年份防效的一致性等方面，明显优于非芽孢杆菌和真菌生防菌剂。

3. 3. 应用应用 应用芽孢杆菌防治植物病害的研究具有悠久

的历史，枯草芽孢杆菌已经应用于生产实践。 美国有 4株枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtili

s）生防菌株获得环保局（ EPA）商品化或有限商品化生产许可证，它们是 GBO3 、 MBI600 、QST713 和 B. subtilis var.amyloliquefaciens FZB24 。

我国利用芽孢杆菌防治植物病害的应用研究也达到了世界先进水平，开发出了一批优良的枯草芽孢杆菌如 B916 、 B908 、 B3 、 B903 、 BL03 、 XM16 ，蜡样芽孢杆菌（ B.cereus）菌株R2 ，短小芽孢杆菌（ B.pumillus） A3 和增产菌系列产品等。

1998 年辛玉成从苹果树体上分离得到的枯草芽抱杆菌〔 Bacillus subtilis〕 BL03 菌株，经室内测定对苹果霉心病菌、炭疽病菌、红霉病菌和镰刀菌等 10 种病原菌的抑制效果均为 100% 。B-912 对油桃和桃的褐腐病的进行防治试验，发现 B-912 对油桃和桃的褐腐病有显著的抑制作用。

1999 年陈以仁从土壤分离获得枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis) 菌株 B-916 对水稻纹枯病菌有较好拮抗作用的菌株。

二、作用原理 芽孢杆菌的作用原理以抗生、竞争和诱导植物抗性为主。

11 ．抗生．抗生 芽孢杆菌产生的拮抗物质主要是抗生素、抗菌蛋白（又称为芽孢杆菌素 Bacilysin ）及挥发性抗菌物质。

抗生素有以下三类。 （ a ）脂肽抗生素： IturinIturin家族脂肽抗生素家族脂肽抗生素，，一般对真菌具有强烈拮抗作用，有 B.subtlis合成的 Iturin A 、 C ， Bacillomycin L 、 D 、 F 和 Mycosubtilin等；

SurfactinSurfactin家族脂肽抗生素家族脂肽抗生素具有抗菌、抗病毒和生物表面活性剂作用，包括枯草芽孢杆菌产生的Surfactin 、 Esperins 和 B.licheniformis 产生的 Surfactant 86 、 Lichenysin A~D ；

FengycinFengycin 是另一类抗真菌脂肽抗生素，包括 B.subtilis 产生的 Fengycin A 、 B 和 B.cereus 产生的 Plipastatin 。

（ b ）多肽抗生素： 芽孢杆菌多肽抗生素有线状、环状和分支状多肽抗生素 3 类， 线状抗真菌短肽抗生素： B.brevis 产生的 Gramicidin

和 Edeine 。 环状多肽抗生素： B.brevis 产生的 Gramicidin S 和 Ty

rocidine 是。 分支环肽抗生素包括 Polymyxin 、 Octapeptins 和 Bac

tracin ，它们主要作用于细菌。 芽孢杆菌素（ Bacilysin）是枯草芽孢杆菌 Ma

rburg168 产生的 2肽抗生素，是一个最简单的多肽抗生素； AzoxybacillinAzoxybacillin 是是 B.cereusB.cereus 产生的，具有广谱抗真菌活性，其作用机制是通过转录水平抑制真菌硫吸收（ sulfate assimilate ， SA）途径有关酶的合成，这是第一真菌转录特异的抑制抗生素，在医药上有重要的应用前景。

（ c ）其它抗生素： 线状聚酰胺物 Zwittermicin A：在 B.cereuB.cereu

ss 和和 B.thuringiensisB.thuringiensis 的很多菌株中都存在。对原核生物和真菌具有广谱抑菌活性，对 PhytophthPhytophthoraora 和和 PythiumPythium属病原真菌活性极强，并对 Bt杀虫晶体蛋白具有协同增效作用。

抗菌蛋白有以下几种： 芽孢杆菌产生的蛋白类抗菌物质主要有细菌素、细胞壁降解酶如几丁质酶和葡聚糖酶。

（（ aa））细菌素细菌素：：细菌素是细菌合成的对于其它微生物具有抗生作用的小分子量蛋白质，芽孢杆菌能产生多种细菌素。

枯草芽孢抗菌产生的 Subtilin 和 Subtilosin及巨大芽孢杆菌产生的 Megacins 对 G+ 细菌具有很强的活性，枯草芽孢杆菌产生的 Botrcidin AJ1316 、 Alirin B-1 和 6.9kDa 小肽及 Bacillus licheniformis M-4 产生的 M-4 Amoebicidal同时具有抗细菌和真菌作用。

（（ bb））几丁质酶和葡聚糖酶几丁质酶和葡聚糖酶：： 许多病原真菌细胞壁含有几丁质和 β-1 ， 3-葡聚糖。几丁质酶（ chitinase）和 β-1 ， 3-葡聚糖酶（ glucanase）是植物病程相关蛋白，它们通过破坏病原真菌的细胞壁而具有抗菌防病的作用。

最早报道几丁质酶活性的微生物是芽孢杆菌 B.B.chitinovrouschitinovrous ，目前涉及，目前涉及 B.subtilisB.subtilis 、、 B.coaguB.coagulanslans 、、 B.megateriumB.megaterium 、、 B.licheniformisB.licheniformis 、 、 B.thuringiersisB.thuringiersis 、、 B.cereusB.cereus 、、 B.circulansB.circulans 、、B.stearothermophilusB.stearothermophilus 、、 B.pabuliB.pabuli等等很多芽孢杆菌种群。

（（ cc））其它抗菌蛋白其它抗菌蛋白：： TasA(transition-phase spore-associate

d antibacterial protein ， TasA)抗菌蛋白是从枯草芽孢杆菌 PY79 菌株分离的孢子成分，对 G+ 和 G- 细菌具有广谱抗菌活性。基因 tasA 是通过氨基酸序列测定和枯草芽孢杆菌基因组序列文库比较获得的。我国有很多分离纯化枯草芽孢杆菌未知抗菌蛋白的报道，如 B034 菌株 50.3kDa 和 A014菌株 22.5kDa抗水稻白叶枯病蛋白和 BS-98 菌株 59kDa 、 TG26 菌株 14kDa 、 B3菌株 13kDa 及 BS-908抗真菌蛋白质等。

抗菌肽的作用机理 多种抗菌肽通过静电作用被吸附到细菌膜表

面，然后疏水尾巴插入到细胞疏水区域，通过改变膜的构象，多种抗菌肽聚合在膜上形成离子通道，造成细胞质泄露和细胞死亡。

挥发性抗菌物质 许多微生物产生挥发性抗菌物质（ antifung

al colatiles ， AFVs）。蜡样芽孢杆菌能够产生对 Trichoderma viride 具有活性的 AFVs ，枯草芽孢杆菌 NCIMB12376 能够产生具有广谱抗真菌活性的 AFVs 。

22 ．竞争．竞争 竞争作用竞争作用是生防微生物通过对营养物质的争夺、物理和生物学位点的抢夺等方式控制植物病原微生物的发展。

生防芽孢杆菌的施用剂量、时间、定殖能力和种群建立状况对生防效果的显著影响反应了竞争作用的重要性。 B.subtilis B916 在纹枯病病斑定殖能力很强，而在健康植株上定殖能力弱，在病原物接种前和接种 10d 后施用时都没有防效，而在接种病原物 1d 后施用则可达到最佳防治效果。

植物内在或附生芽孢杆菌有很好的定殖和繁殖能力，一般对维管束和种传病害有很好的效果。如甘蓝叶面附生菌 B.subtilis R14 ，接种病原物前 3d施用、与病原 物同时使用和接种病原物后 3d施用对 X.campestris pv.campestrisX.campestris pv.campestris防效没有差别（ 100%），而内生菌 B.megateriumB.megaterium 和和B.cereusB.cereus 则是接种病原物前 3d施用最好，原因可能是后者需要较长时间才能定殖和建立有效种群。

33．诱导植物抗病性．诱导植物抗病性 诱导植物抗性是生防细菌发挥生防作用的一

个重要方面。 病原物诱导的植物抗性（ pathogen-induce

d systemic acquired resistance ， SAR）与非病原物诱导植物抗性（ nonpathogen-induced systemic acquired resistance ， ISR）具有相同的表型特征，包括通过组织木质化增强细胞机械屏障和产生植保素，这些过程涉及苯丙氨酸解氨酶（ PAL）、过氧化酶（ PO）、多酚氧化酶（ PPO）与超氧化物歧化酶（ SOD）的活性。

生防微生物诱导植物抗性在 G- 细菌如假单孢菌和真菌已有很多研究。虽然芽孢杆菌诱导植物抗性作用的报道较少，但已经证明诱导植物抗性也是其生防作用的重要机制之一。对水稻纹枯病生防枯草芽孢杆菌 B916 的研究表明，不同时期接种 B916 后都能诱导水稻鞘细胞 PAL 、 PO 、PPO 和 SOD 活性增强，且分别在 24 、 48 、 72和 24h 达到最高。接种 B916 、病原菌（（ R.solanR.solanii））和同时接种 B916+R.solani 对这些酶活性的影响趋势基本一致，但单独接种 B916诱导 PO 和 PPO 活性增加量低于病原菌和 B916+R.solani2 种处理，且后者产生枯斑。 Tang研究也发现 B.subB.subtilistilis B3 能诱导小麦 PO 活性的增加并产生新的 PO 。