1

תהליכי הפרדה למוצרים ביולוגיים

ניתוח ואופטימיזציה של תהליכים כרומטוגרפיים

פלמינגר' גדעון פרופ

ולביוטכנולוגיה מולקולרית למיקרוביולוגיה המחלקה

" א ת אוניברסיטת

2

The Chromatograph

ic Process

3

פרמטרים המשמשים באנליזה ובאופטימיזציה של תהליכים כרומטוגרפיים

o

x

R

o

sm

m

sm

m

nn

u

u

t

t

tt

tR

Mobilitylativeknn

nR

FactorCapacitykm

s

Re'1

1)2(

')1(

ns - No. of moles of Protein x in the Stationary Phase

nm - No. of moles of Protein x in the Mobile Phase

to - Retention time for unretained compounds

tR - Retention time for Protein x

u - Linear velocity of the Solventux - Linear velocity of Protein x

4

סטטיסטיים שיקולים נתונה:עבור חלבון בעל •

בכל רגע נתון היחס בין מספר המולים בפאזה הניידת –לבין סה"כ המולים של החלבון שווה ל-

הסיכוי של מולקולה מסוימת להיות בפאזה הניידת –ברגע נתון שווה ל-

tm

ts

t0

tm= t0

tm+ts)= tR

= t0/tR

5

פרמטרים המשמשים באנליזה ובאופטימיזציה של תהליכים כרומטוגרפיים

o

oR

o

oR

V

VV

t

tt'k)5(

+

6

The Correlation of the Capacity Factor (k’) and Affinity Constant (Ka)

7

Effect of Sample Load on k’

8

The Correlation of the Capacity Factor (k’) and Distribution Constant (KD)

9

Evaluation of Chromatographic Behavior

Theoretical Plate

tR and VR vary from one compound to the other.

L is common to all compounds separated on a column

10

The Theoretical Plate

11

Diffusion

12

Effect of Linear Velocity on Peak Broadening

Van Deemter Equation

13

Peak Broadening

14

Peak Broadening

(Cont.)

15

Peak width

16

Peak Broadening

(Cont.)

17

Velocity vs. Pressure

18

Spherical and irregular HPLC Packings

19

Peak Tailing

20

Evaluation of Peak Tailing

21

Causes for Peak Tailing

• Overloading

• Poor Column packing (Channeling)

• Mixed Retention Mechanism

• Poor Equilibration and/or Slow Mass Transfer

• Extra-Column Effects

• Micelle Formation

22

Resolution

+

1

*k1/k1

23

Two-Peak Separatio

n

24

Separation Optimization

25

The Correlation between k’ and tw

K=tR/to-1 tw=4to/N

26

Effect of Solvent Strength

27

Effect of Selectivity ()

28

Effect of Efficiency (N)

29

Effect of temperature on RP

If G<0 andT

Then Ka and k’

Peaks usually become sharper at higher temperatures

30

HPLC ו- FPLC

31

The HPLC Chromatographic System

Back-Pressure

Regulator

Damp

Automatic Control

32

Problems Derived from High Pressure Chromatography

• Need for Pressure Control/Monitoring.

• Stainless Steel Columns.

• High Pressure/Low Stroke Volume Pumps.

• High Pressure Mixing.

• High Pressure Injectors.

• Need for Gas Bubbles Elimination – Degassing and/or Back Pressure Regulator.

33

The FPLC

Buffer A Buffer B

Pump A

Pump B

Mixer

Injector

Column

Conductivity Meter

UV Monitor

Fraction Collector

Computer Control

34

FPLC vs. HPLCHPLC• High Pressure Operation• Uses Mostly Reversed and Normal Phase Chromatographies

Often with Organic Solvents – Applicable to small proteins, peptides and low MW molecules.

• Highest advantage – High Resolution.

FPLC• Medium Pressure Operation.• Uses Mostly Ion Exchange, Hydrophobic, Affinity and Gel

Chromatographies in aquous buffers – Highly applicable to proteins.

• Highest Advantage – Ease of Operation and Versatility.