1
תהליכי הפרדה למוצרים ביולוגיים
ניתוח ואופטימיזציה של תהליכים כרומטוגרפיים
פלמינגר' גדעון פרופ
ולביוטכנולוגיה מולקולרית למיקרוביולוגיה המחלקה
" א ת אוניברסיטת
2
The Chromatograph
ic Process
3
פרמטרים המשמשים באנליזה ובאופטימיזציה של תהליכים כרומטוגרפיים
o
x
R
o
sm
m
sm
m
nn
u
u
t
t
tt
tR
Mobilitylativeknn
nR
FactorCapacitykm
s
Re'1
1)2(
')1(
ns - No. of moles of Protein x in the Stationary Phase
nm - No. of moles of Protein x in the Mobile Phase
to - Retention time for unretained compounds
tR - Retention time for Protein x
u - Linear velocity of the Solventux - Linear velocity of Protein x
4
סטטיסטיים שיקולים נתונה:עבור חלבון בעל •
בכל רגע נתון היחס בין מספר המולים בפאזה הניידת –לבין סה"כ המולים של החלבון שווה ל-
הסיכוי של מולקולה מסוימת להיות בפאזה הניידת –ברגע נתון שווה ל-
tm
ts
t0
tm= t0
tm+ts)= tR
= t0/tR
5
פרמטרים המשמשים באנליזה ובאופטימיזציה של תהליכים כרומטוגרפיים
o
oR
o
oR
V
VV
t
tt'k)5(
+
6
The Correlation of the Capacity Factor (k’) and Affinity Constant (Ka)
7
Effect of Sample Load on k’
8
The Correlation of the Capacity Factor (k’) and Distribution Constant (KD)
9
Evaluation of Chromatographic Behavior
Theoretical Plate
tR and VR vary from one compound to the other.
L is common to all compounds separated on a column
10
The Theoretical Plate
11
Diffusion
12
Effect of Linear Velocity on Peak Broadening
Van Deemter Equation
13
Peak Broadening
14
Peak Broadening
(Cont.)
15
Peak width
16
Peak Broadening
(Cont.)
17
Velocity vs. Pressure
18
Spherical and irregular HPLC Packings
19
Peak Tailing
20
Evaluation of Peak Tailing
21
Causes for Peak Tailing
• Overloading
• Poor Column packing (Channeling)
• Mixed Retention Mechanism
• Poor Equilibration and/or Slow Mass Transfer
• Extra-Column Effects
• Micelle Formation
22
Resolution
+
1
*k1/k1
23
Two-Peak Separatio
n
24
Separation Optimization
25
The Correlation between k’ and tw
K=tR/to-1 tw=4to/N
26
Effect of Solvent Strength
27
Effect of Selectivity ()
28
Effect of Efficiency (N)
29
Effect of temperature on RP
If G<0 andT
Then Ka and k’
Peaks usually become sharper at higher temperatures
30
HPLC ו- FPLC
31
The HPLC Chromatographic System
Back-Pressure
Regulator
Damp
Automatic Control
32
Problems Derived from High Pressure Chromatography
• Need for Pressure Control/Monitoring.
• Stainless Steel Columns.
• High Pressure/Low Stroke Volume Pumps.
• High Pressure Mixing.
• High Pressure Injectors.
• Need for Gas Bubbles Elimination – Degassing and/or Back Pressure Regulator.
33
The FPLC
Buffer A Buffer B
Pump A
Pump B
Mixer
Injector
Column
Conductivity Meter
UV Monitor
Fraction Collector
Computer Control
34
FPLC vs. HPLCHPLC• High Pressure Operation• Uses Mostly Reversed and Normal Phase Chromatographies
Often with Organic Solvents – Applicable to small proteins, peptides and low MW molecules.
• Highest advantage – High Resolution.
FPLC• Medium Pressure Operation.• Uses Mostly Ion Exchange, Hydrophobic, Affinity and Gel
Chromatographies in aquous buffers – Highly applicable to proteins.
• Highest Advantage – Ease of Operation and Versatility.
Recommended
