Волуме 63, број 1-2

editor in chiefMiloš Branković

deputy editordr Marko Janković

secretaryMilenko Bogdanović

advisory boardAkademik Prof. dr Nebojša LalićProf. dr Živan MaksimovićProf. dr Petar BulatProf. dr Vesna BjegovićProf. dr Slobodan SavićProf. dr Gordana Teofilovski ParapidProf. dr Aleksandra IsakovićProf. dr Marina Svetel

readerProf. Mirjana Gluščević

promoter& ownerMedicinski fakultet, Univerzitet u BeograduDr Subbotića 811000 Beograd, Srbija

coverDr Marko JankovićGNU Free documentation licence, Wikipedia:“5q-syndrome bone marrow histology withtypical abnormal megakarycoytes”

circulation500 primeraka

editorial boarddr Tina TomaševićMihailo BelaćevićMilica ŽivkovićNebojša MarkovićČarna Jovanović

Doc. dr Nađa MarićDoc. dr Darija KisićDoc. dr Silvio de LukaMiloš BrankovićMarko JankovićJelena Leković, predsednik CSNIRS-aDarko Radaković, potpredsednik CSNIRS-a

readerProf. Nataša Micić

E-mail: [email protected].: +381 11 36 36 382Fax.: +381 11 36 36 382ISSN-YU 0369-1527UDK 61 (05)

prepress and press„BeoSing“, Beograd

acknowledgementProf. dr Tatjana SimićProf. dr Andreas Engertdr Miloš Maksimovićdr Milan Marinković

Reč Dekana Medicinskog fakulteta Univerziteta u Beogradu

Poštovani čitaoci,

Medicinski podmladak, čiji je novi broj sada pred vama, predsta-vlja izuzetnu tekovinu Medicinskog fakulteta Univerziteta u Beo-gradu, koja istovremeno obeležava istoriju Fakulteta, ispunjava njegovu sadašnjost i predstavlja nezaobilazni deo njegove uspešne budućnosti.

Kada se radi o istoriji, to nisu samo 63 godine postojanja čime se mali broj fakulteta može pohvaliti. Posebnu vrednost predstavlja činjenica da su brojni kasnije ugledni nastavnici, saradnici i istra-živači, kao i poštovani lekari, važan deo svog studentskog doba ugradili u Medicinski podmladak, da se tog vremena sa zadovoljstvom sećaju i da to danas sa ponosom ističu.

Kada se radi o sadašnjosti, mislim da postoji saglasnost u opredeljenju ka neprekidnom podizanju kriterijuma kvaliteta i kritičkom preuzimanje brojnih savremenih kretanja u naučnoj publicistici. Ova dva postulata su osnova očuvanja ugleda iz prošlosti ali i uspešnog opstanka u sve oštrijim zahtevima koji se postavljaju u sadašnjosti.

Kada se radi o budućnosti, uslovi u kojima ćemo raditi se obično ne boje optimističkim bojama. Međutim, polazeći od ostvarenog, časopis ima značajne potencijale daljeg razvoja. U okviru ovih razvojnih mogućnosti vrlo je značajno intenzivnije uključivanje u međunarodne projekte, upravo koristeći prednosti jednog savremenog časopisa sa dugom tradicijom.

U celini, sadašnja Uprava Fakulteta smatra da je Medicinski podmladak izuzetno važan deo edu-kacije za naučni rad, kao tradicionalna škola uspešnih istraživača. Zbog toga ćemo podržati vaše inicijative za dalji razvoj časopisa i sarađivati u suočavanju sa izazovima kojih će biti na tom putu.

U tom smislu, želim vam svima puno uspeha i zadovoljstva u novoj 2013. godini.

Profesor dr Nebojša M. Lalić

UVODNA REČforeword

Vivere tota vita discendum est – Čovek uči dok je živ

Poštovani čitaoci,

Čast nam je i zadovoljstvo da vam predstavimo novi 63. dvobroj stručno-naučnog časopisa „Me-dicinski podmladak“. S ponosom, podsećamo da je reč o stručno-naučnoj publikaciji studenata Medicinskog fakulteta Univerziteta u Beogradu, sa najstarijom tradicijom na balkanskim pro-storima. Odgovorno smo pristupili važnom zadatku koji smo nasledili od naših cenjenih pred-hodnika, da nastavimo sa idejom podsticanja i promovisanja studentskog naučno-istraživačkog rada.

Nastojali smo, da održimo tradiciju objavljivanja najboljih i najinovativnijih studentskih radova koji će predstavljati ne samo kvalitetan akademski materijal za učenje i usavršavanje, već i in-spiraciju za nova istraživanja i dostignuća u oblasti medicine. U pripremi ovog dvobroja, težili smo ka ciljevima širim od edukacije i naučnog istraživanja, koji se ogledaju u doprinosu na polju ličnog razvoja svakog mladog lekara u pravcu visoke moralne snage i etičkih načela.

Želimo da naš časopis inspiriše nove mlade ljude da krenu putem nauke i istraživanja i da za-jedno sa svojim mentorima, daju svoj doprinos razvoju srpske medicine i pomeraju granice do-stignuća u lečenju čoveka. Da studenti nisu sami na tom putu naučno-istaživačkog stvaralaštva, govore i editorijali naših nastavnika, prof. dr Nebojše J. Jovića, prof. dr Zorana Todorovića, doc. dr Tatjane Terzić i doc. dr Dragane Bogićević, uvaženih stručnjaka Medicinskog fakulteta, Univerziteta u Beogradu. Takođe, želimo da se zahvalimo cenjenom profesoru Andreas Engertu sa Univerzitetske Klinike u Kelnu, na ostvarenoj saradnji i editorijalu, koji sa velikom zadovolj-stvom objavljujemo u nasem časopisu.

Nadamo se, da smo uspeli odgovoriti izazovu, da sadržaj časopisa bude u istoj meri tematski raznovrstan i zanimljiv kao što je edukativan i naučno referentan. Znanje i usavršavanje tokom čitavog života, jeste put koji je predodređen svima koji su prihvatili ovaj plemeniti poziv i streme ka uspehu.

Na kraju, želimo da se zahvalimo svima koji su svojim radom i angažovanjem doprineli izradi ovog dvobroja časopisa „Medicinski podmladak“.

S poštovanjem,Glavni i odgovorni urednik

Miloš Branković

Vivere tota vita discendum est – Čovek uči dok je živ

UVODNA REČforeword

SADRŽAJcontents

foreword

Akademik Prof. dr Nebojša Lalić, dekan Medicinskog fakulteta, Univerziteta u Beogradu

Miloš Branković, glavni i odgovorni urednik časopisa Medicinski podmladak

editorials

Hodgkin lymphoma 6Prof. dr Andreas Engert

Ukršteni sindromi moždanog stabla 15Prof. dr Nebojša J. Jović

Trovanje antidepresivima 26Prof. dr Zoran Todorović

Mijeloproliferativne neoplazme 31Doc. dr Tatjana Terzić

Febrilni napadi 36Doc. dr Dragana Bogićević

students papers

Ispitivanje in vitro citotoksičnih efekata diazepama na modelu B16 ćelijske linije melanoma 41Ivana Radulović

Uticaj risperidona na koncentraciju lipidnih peroksida i aktivnost i ekspresiju superoksid dizmutaze u mozgu pacova perinatalno tretiranih fenciklidinom 48Nebojša Marković

Divertikularna bolest creva na autopsijama 54Sanjin Kovačević, Davor Kovačević

Hematološki parametri, celularnost slezine I tibije starih pacova posle dugotrajnog izlaganja stalnom magnetnom polju 58Darko Radaković, Rajko Rušnov, Dejan Radaković

Uticaj novosintetisanog jedinjenja estarske prirode na diferencijaciju humane promijelocitne leukemijske ćelijske linije 62Željko Antić

SADRŽAJcontents

students papers

Efekti toksina vipera ammodytes ammodytes na odabrane bakterijske vrste 68Dušan Kekić

Metabolički odgovor na test fizičkog opterećenja kod fizički aktivnih i neaktivnih ispitanika 74Rada Jeremić, Ankica Bjelić, Nebojša Skorupan

Povezanost odnosa Tg/HDL, insulinske rezistencije i pojave i intenziteta koronarne bolesti u pacijenata sa tipom 2 dijabetesa i nedijabetičara 78Iva Kadić, Lucija Kosi

Fizička aktivnost i bavljenje sportom dece i adolescenata sa epilepsijom 83Mihailo Belaćević, Miloš Babić

Oksidativni stres nakon reperfuzionog oštećenja izazvanog trombolitičkom terapijom kod bolesnika sa moždanim udarom 86Bojana Tasić

Procena perioperativnog morbiditeta i mortaliteta kardiohirurških bolesnika na hroničnom programu hemodijalize 92Milan Milojević

Povezanost metaboličkog sindroma i oporavka srčane frekvence nakon testa fizičkog opterećenja 98Nikola Bošković, Dragoljub Blagojević

Akutni vertiginozni sindrom kao indikacija za prijem na neurološko odeljenje 103Marko Benčić, Milenko Bogdanović, Vuk Aleksić

featured article

Priča o insulinu – 90 godina od otkrića koje je promenilo svet 107Doc. dr Danijela Vučević, Prof. dr Tatjana Radosavljević

instructions for the autors

6

Medicinski podmladakEditorijali

│Decembar 2012│Broj 1–2│Izdanje 63

Summary:Hodgkin Lymphoma is the best curable cancer in

adults. With current risk-adapted approaches, 80-90% of patients can be cured long term. The standard of care includes a combination of 2-4 cycles of ABVD in early favorable or early unfavorable stages and additional IFRT. In advanced stages, 6 cycles of BEACOPPescalated or 6-8 cycles of ABVD are being used. High-dose che-motherapy is indicated for relapsing or refractory pa-tients. Currently, there are a number of interesting new approaches for this malignancy including the antibody drug conjugate Brentuximab Vedotin. PET-guided treat-ment approaches might help to further individualize treatment for these patients and, importantly, help to re-duce acute and long-term side effects of treatment.

Introduct ionHodgkin lymphoma (HL) has become one of the best

curable malignancies in oncology. Today, more than 80% of patients can be cured with risk-adapted treatment that in-cludes chemo- and radiotherapy. This progress is mainly due to the development of multi-agent chemotherapy and im-proved radiation techniques. However, there are also severe life-threatening treatment-related side effects including organ toxicity and secondary malignancies. Thus, the treatment ap-proaches must be carefully balanced between optimal disease control and the risk of long-term sequelae. This article gives an overview on the pathogenesis, diagnostic procedures and current treatment approaches for patients with HL.

Pathogenesi sHodgkin lymphoma is divided into the classical vari-

ant (cHL) and nodular lymphocyte predominant HL (NPHL). Classical Hodgkin lymphoma is characterized by the pres-ence of mononucleated Hodgkin and multinucleated Reed/Sternberg (H-RS) cells (figure 1a).

Figure 1a. Classical Hodgkin Lymphoma, Histology. Courtesy of Professor Harald Stein.In contrast, lymphocytic and histiocytic (L&H) cells are pathognomonic for the LPHL subtype (figure 1b).

HODGKIN LYMPHOMAProf. dr Andreas Engert

Chairman, German Hodgkin Study Group (GHSG),University Hospital Cologne, Cologne, Germany

7

EditorijaliMedicinski podmladak

Izdanje 63│Broj 1–2│Decembar 2012│

Figure 1b. LPHL and NLPHL, Histology. Courtesy of Francisco Vega-Vazquez, MD, PhD.H-RS cells typically stain strongly positive for CD30 (figure 1c) while L&H cells are CD20-positive and negative for CD30.

Figure 1c. Immunhistology of HL cells, CD30-staining. Courtesy of Professor Harald Stein.

In the majority of cases, H-RS cells are derived from pre-apoptotic germinal-centre B-cells, but have lost most of the B-cell-typical genes. In contrast, L&H cells originate from antigen-selected germinal centre B-cells and are charac-terized by the expression of multiple B-cell markers. H-RS cells are derived from pre-apoptotic germinal center B-cells in most cases, but can also be of T-cell origin. The expression of EBV-latent genes in EBV-positive cases (50%) may play a role in cellular transformation by up-regulating the transcrip-tion factor NF-kB. Many questions on the pathogenesis of Hodgkin lymphoma are still unanswered. Multiple signaling pathways and transcription factors show deregulated activity in H-RS cells that are physiologically not activated in B-cells. These include the NFkB-, Jak-Stat- and PI3k-pathway and signaling molecules such as Notch-1. In addition, the interac-tion of H-RS cells with the surrounding inflammatory cells, the microenvironment, plays an important role in the growth and survival of the malignant cell population.

Epidemiolog yWith an annual incidence of 2-3 per 100000 in Europe

and the USA, HL accounts for approximately 30% of all ma-

lignant lymphoma. Slightly more men than women are af-fected. The onset of disease shows a bimodal distribution among industrialized countries with a first peak in the third decade and a second, smaller peak around 60-70 years of age.

Cl in ica l presentat ionIn Hodgkin lymphoma, swollen lymph nodes of the

cervical or supraclavicular region are initial symptoms in 60-70% patients with; axillary lymph nodes are involved in about 30% of newly diagnosed patients. Almost two-thirds of pa-tients have radiographic evidence of intra-thoracic involve-ment. Bone marrow involvement occurs in less than 10% of newly diagnosed patients. Details on organ involvement at diagnosis are given in table 1.

Table 1. Clinical Involvement of HL

Anatomic site Involvement [%]Waldeyer’s ring 1-2Cervical nodes 60-70Axillary nodes 30-35Mediastinum 50-60Hilar nodes 15-35Para-aortic nodes 30-40Iliac nodes 15-20Mesenteric nodes 1-4Inguinal nodes 8-15Spleen 30-35Liver 2-6Bone marrow 1-4Total extranodal 10-15

About 40% of patients suffer from B-symptoms, espe-cially those with initial abdominal involvement or advanced stage disease. Other symptoms include pain at the site of nod-al involvement shortly after alcohol consumption, pruritus or fatigue1.

Compared with cHL, nLPHL usually begins as a local-ized, slowly-growing and rather benign disease with involve-ment of only one peripheral nodal region.

8



Table 2. Staging Classification for Hodgkin Lymphoma

STAGE Description

I Involvement of a single lymph node region or lymphoid structure (e.g., spleen, thymus, Waldeyer’s ring) or involve-ment of a single extralymphatic site (IE).

II

Involvement of two or more lymph node regions on the same side of the diaphragm (hilar nodes, when involved on both sides, constitute stage II disease); localized contiguous involvement of only one extranodal organ or site and lymph node region(s) on the same side of the diaphragm (IIE). The number of anatomic regions involved should be indicated by a subscript (e.g., II3).

IIIInvolvement of lymph node regions on both sides of the diaphragm (III), which may also be accompanied by in-volvement of the spleen (IIIS) or by localized contiguous involvement of only one extranodal organ site (IIIE) or both (III SE).

III1 With or without involvement of splenic, hilar, celiac, or portal nodes.III2 With involvement of para-aortic, iliac, and mesenteric nodes.

IV Diffuse or disseminated involvement of one or more extranodal organs or tissues, with or without associated lymph node involvement.

DESIGNATIONS APPLICABLE TO ANY DISEASE STAGEA No symptoms.

B Fever (temperature, >38oC), drenching night sweats, unexplained loss of >10% body weight within the preceding 6 months.

X Bulky disease (a widening of the mediastinum by more than one-third or the presence of a nodal mass with a maximal dimension >10 cm).

E Involvement of a single extranodal site that is contiguous or proximal to the known nodal site.CS Clinical stage.PS Pathologic stage (as determined by laparotomy).

Diagnost ics , s tag ing and r i sk st rat i f icat ionAn excisional biopsy of a suspicious lymph node is in-

dispensable for the diagnosis of Hodgkin lymphoma. HL pa-tients are treated according to stage and risk factors. The his-tological subtype – except NLPHL – does not influence the treatment decision. Stage of disease is classified according to the Cotswolds definition, a modified version of the Ann-Arbor classification (table 2).

The clinical staging is based on CT-scans of the neck, thorax, abdomen and pelvis, and often includes chest X-ray, abdominal sonography, bone marrow biopsy and bone mar-row or skeletal radionuclide imaging. In some cases, addition-al tests such as MRI, PET or liver biopsy might be needed.

The prognostic factors used by the German Hodgkin Lymphoma Study Group (GHSG) for risk stratification of HL

patients is based on stage, B-symptoms, bulky disease of me-diastinal lymphoma manifestation defined as >⅓ mediastinal diameter, extranodal manifestation, at least three involved nodal areas and an elevated erythrocyte sedimentation rate. In North America, most centers treat patients according to their traditional classification of early stages (CS I-IIA or B) and advanced stages (CS III-IVA or B, CS I-II A or B with bulky disease defined as >10cm maximum dimension of nodal mass). European study groups such as the EORTC (European Organisation for Research and Treatment of Cancer), GELA (Groupe d’Etudes des Lymphomes de l’Adulte), and GHSG classify patients into early favorable, early unfavorable and ad-vanced stages depending on the clinical factors listed in table 3.

Table 3. Definition of Treatment Groups by different Study Groups

Treatment Group EORTC/GELA GHSG NCIC/ECOGEarly-stage favorable CS I-II without risk factors

(supradiaphragmatic)CS I-II without risk factors Standard risk group: favorable CS I-II

(without risk factors)Early-stage unfavor-able (intermediate)

CS I-II with ≥1 risk factors (supradiaphragmatic)

CS I, CSIIA ≥1 risk factors; CS IIB with C/D but without A/B

Standard risk group: unfavorableCS I-II (at least one risk factor)

Advanced stage CS III-IV CS IIB with A/B; High-risk group:CS III-IV CS I or II with bulky disease; intra-

abdominal disease; CS III, IVRisk factors A large mediastinal mass

B age ≥50 yearsC elevated ESRD ≥4 involved regions

A large mediastinal massB extranodal diseaseC elevated ESRD ≥3 involved areas

A ≥40 yearsB not NLPHL or NS histologyC ESR ≥50 mm/hD ≥4 involved nodal regions

EORTC, European Organization for Research and treatment of Cancer; GELA, Groupe d’Etude des Lymphomes de l’Adulte; GHSG, German Hodgkin Lymphoma Study Group; ECOG, Eastern Cooperative Oncology Group; NCIC, National Cancer Institute of Canada; CS, clinical stage; NLPHL, nodular lymphocyte predominance Hodgkin lymphoma, NS, nodular sclero-sis; ESR, erythrocyte sedimentation rate (≥50 mm/h without or ≥30 mm/h with B symptoms).

9



In order to more precisely define the risk of patients with advanced disease, the “International Prognostic Score” (IPS) was developed2. The IPS consists of seven risk factors that are associated with a more unfavorable prognosis includ-ing serum albumin <4 g/dl, haemoglobin <10.5 g/dl, male sex, age >45 years, stage IV disease, leukocytosis >15.000/mm³, lymphocytopenia <600/mm³ and/or <8% of white-cells. These factors can be used to better judge the prognosis of ad-vanced-stage HL patients at diagnosis (figure 2).

Figure 2. Prognostic score in patients with Hodgkin lympho-ma. Factors included serum albumin, hemoglobin, male gen-der, stage IV disease, age > 45 years, white blood cell count > 15.000/mm3 and lymphopenia < 600/mm3 or 8% of white blood cell count. (Hasenclever D et al, N Engl J Med, Nov 19 (1998))

Response assessmentIn addition to conventional CT scans, metabolic imag-

ing using 2-[18F]Fluoro-2-deoxyglucose Positron Emission Tomography (18FFDG-PET or simply PET) has gained an in-creasing relevance in the response assessment in HL patients. A significant prognostic value of negative PET scans after completion of chemotherapy was described in a number of phase II trials. A number of ongoing trials currently evaluate the role of PET in prospectively randomized trials (see below).

Response-adapted chemotherapy treatment of HL is also currently being developed on the basis of interim PET scan results. Several phase II trials reported a negative pre-dicting value of more than 90% for interim PET. In addition, there was also a strong correlation between result of the early interim PET scan and progression free survival. However, the negative predictive value might vary dependent on the chemo-therapy regimen. A number of ongoing trials currently evalu-ate response–adapted treatment in HL patients based on the interim PET scan results.

Treatment of early favorable HLFor many years, large-field radiotherapy (RT) had been

the treatment of choice for early favorable HL. With this ap-proach, more than 70% of patients achieved complete remis-sion (CR); however, relapses were frequent and overall sur-vival (OS) was not satisfying. Studies by the EORTC demon-strated that three cycles of MOPP-ABV followed by involved-field RT (IFRT) led to a significantly better outcome than RT alone 3. Very similar, the GHSG HD7 clinical trial compared

extended-field RT (EFRT) only with a combination of two cycles of ABVD followed by the same RT. Tumor control was better in patients treated with the combined modality ap-proach (FFTF 88% versus 67% p<0,001) 4. Based mainly on these two trials, RT alone in the treatment of early stage HL was largely abandoned. Subsequent trials showed that radia-tion fields could be reduced from EF to IF without compro-mising treatment efficacy so that the combination of four cy-cles of ABVD and IFRT became standard therapy for early favorable HL.

The more recent GHSG HD10 study then compared two or four cycles of ABVD followed by either 20Gy or 30Gy IFRT. With a follow-up of eight years, there was no difference between study arms in terms of tumor control (freedom from treatment failure, FFTF) and OS (figure 3).

Figure 3. Tumour control in early favorable HL (FFTF; HD10) (Engert A et al, NEJM 363;7:640-52, 2010)

However, reduced toxicity was observed in the less in-tensive treatment arms. The overall FFTF rate was 92.0% and the OS 96.8% at five years5. Thus, two cycles of ABVD fol-lowed by 20Gy IFRT has been adopted as standard of care for early favorable HL.

The question whether RT can be omitted in selected patients with early favorable HL is a matter of debate. Meyer and colleagues recently reported long-term data of their HD.6 trial conducted by the National Cancer Institute of Canada (NCIC) and the Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG). In this study, early stage HL patients without bulky tumors were included. Patients with favorable risk profile were randomly assigned to receive either subtotal nodal irra-diation (STNI) alone or four to six cycles of ABVD. At a me-dian follow-up of 11.3 years, OS, FFTF and event-free sur-vival (EFS) were comparable in both treatment groups6. The authors concluded that ABVD alone is an appropriate treat-ment for patients with early favorable HL. However, it has to be kept in mind that the RT technique used in the HD.6 is outdated. Currently used state of the art RT techniques bear a considerably lower risk for long-term side effects. In addition, it is questionable whether patients treated with six cycles of ABVD will have a lower risk of treatment-related late effects than patients treated with two cycles of ABVD followed by 20Gy IFRT. This is mainly due to the significantly higher cu-mulative anthracycline dose with six cycles.

Interim FDG-PET is becoming recognized as predic-tor for response in HL 7,8. A number of ongoing trials in ear-ly-stage disease currently evaluate PET-guided and response-

10



adapted treatment in this malignancy. Ongoing studies use PET after two courses of ABVD and treat with additional IFRT only in PET-positive patients. Studies including GHSG HD16, EORTC H10 as well as the UK PAPID trial will dem-onstrate whether consolidative RT is necessary in patients with metabolic CR after two cycles of ABVD. However, the question whether treatment can be stratified according to in-terim PET has not been answered yet. Treatment decisions based on interim PET should thus not be used outside clinical trials jet.

HL-related death of patients with early favorable dis-ease is unusual and overall survival is not a useful parameter for early evaluation in early-stage HL. Current trials should be judged by freedom from first recurrence rates and acute morbidity. On the basis of the available data, it can be con-cluded that patients with early favorable HL benefit from a short course of ABVD chemotherapy in combination with involved-field radiotherapy. Although there is some evidence that radiotherapy might not be necessary for patients in com-plete remission (CR) after two courses of ABVD chemothera-py, it is advisable to treat patients with early favorable HL with combined-modality since long-term results of patients treated with chemotherapy only are pending.

Early unfavorable HLIn the standard treatment defining EORTC/GELA

H8U study, 996 patients received either four or six cycles of MOPP/ABV followed by IFRT or four cycles of MOPP/ABV followed by either small field (IFRT) or large field (STNI) ra-diotherapy. There were similar rates for 5-year event-free sur-vival (EFS) and OS9. Thus the least toxic approach, i.e. four cycles of chemotherapy followed by IFRT, became standard of care for early unfavorable HL. Based mainly on trial results in advanced HL, ABVD was subsequently chosen as standard regimen for this group of patients.

In follow-up clinical trials such as the GHSG HD11 study10 and EORTC H9U11, the more intensive BEACOPP regimen (bleomycin, etoposide, doxorubicin, cyclophospha-mide, vincristine, procarbazine, prednisone) in baseline dose was compared with ABVD. In this trial, chemotherapy was followed by either 30Gy or 20Gy IFRT. The final analysis re-vealed no significant outcome differences between the differ-ent regimens (figure 4).

Figure 4. Tumour control in early unfavorable HL (FFTF; HD11) (Eich HT et al, J Clin Oncol 28(27);20:4199-4206)

In contrast to early stage HL, however, IFRT with 30Gy was superior as compared to 20Gy radiation dose. Interim results of the EORTC H9U trial were similar. In this study, patients were randomized into three treatment arms consisting of four cycles of ABVD, six cycles of ABVD or four cycles of BEACOPPbaseline each followed by 30 Gy IFRT. An interim analysis at a median follow-up of four years showed no significant differences regarding EFS and OS be-tween treatment arms while increased toxicity was observed with BEACOPPbaseline. Consequently, ABVD followed by 30Gy IFRT remained standard of care in this group of pa-tients.

Significant outcome improvements in patients with early unfavorable HL were seen after the introduction of BEACOPPescalated in this setting: patients in the GHSG HD14 trial12 were randomized to either four cycles of ABVD fol-lowed by 30Gy IFRT or two cycles of BEACOPPescalated fol-lowed by two cycles of ABVD (“2+2”) and the same radio-therapy. The final analysis of this trial including 1623 patients showed that FFTF among patients who received the intensi-fied 2+2 chemotherapy was better compared with four cycles of ABVD (94.7% vs 89.3%). The GHSG has adapted 2+2 as new standard in their ongoing HD17 study for this patient population. Since there was no difference in survival between arms in HD14 so far, four cycles of ABVD chemotherapy fol-lowed by IFRT with 30Gy can still be regarded as a standard treatment for patients with early unfavorable HL.

It is unclear whether chemotherapy alone represents an option in this group of patients. Based on the results from the randomized Canadian/US HD.6 trial, patients achieving CR after 4-6 cycles of ABVD chemotherapy might not need ad-ditional RT. Final analyses of ongoing trials using interim PET-guided strategies will indicate whether this approach is feasible. Until then, interim PET-based treatment of early un-favorable disease must be restricted to clinical trials.

Advanced StagesBefore the introduction of multi-agent chemotherapy,

more than 95% of patients with advanced HL succumbed to their disease within few years13. The introduction of combina-tion chemotherapy such as MOPP or similar regimens in the 1960s led to long-term remission of up to 50%. An alternative regimen, ABVD, was developed a few years later by Bonadonna and colleagues in Europe resulting in significant-ly improved tumor control and OS14. The MOPP/ABVD hy-brid regimen and other alternating regimens were equally ef-fective as compared to ABVD, but more toxic. This included acute toxicity and the induction of secondary acute leukae-mias or MDS. Therefore ABVD became accepted as standard chemotherapy and was mainly used in combined modality strategies.

In order to further improve the outcome for this group of patients, new regimens were developed by integrating other drugs and increasing dose intensity. These new approaches included regimens such as Stanford-V, MEC, and BEACOPP (table 4).

11



Table 4. Chemotherapy regimen in HL

Drug Dose (mg/m2) Route Schedule (days) Cycle Length (days)MOPP 21Mechlorethamine 6 IV 1, 8Oncovin (vincristine) 1.4 IV 1, 8Procarbazine 100 PO 1–14Prednisone 40 PO 1–14COPP 28Cyclophosphamide 650 IV 1, 8Oncovin (vincristine) 1.4 IV 1, 8Procarbazine 100 PO 1–14Prednisone 40 PO 1–14ABVD 28Adriamycin (doxorubicin) 25 IV 1, 15Bleomycin 10 IV 1, 15Vinblastine 6 IV 1, 15Dacarbazine 375 IV 1, 15BEACOPP (baseline) 21Bleomycin 10 IV 8Etoposide 100 IV 1–3Adriamycin (doxorubicin) 25 IV 1Cyclophosphamide 650 IV 1Oncovin (vincristine) 1.4a IV 8Procarbazine 100 PO 1–7Prednisone 40 PO 1–14BEACOPPescalated 22Cyclophosphamide 1250 IV 1Adriamycin 35 IV 1Etoposide 200 IV 1–3Procarbazine 100 PO 1–7Prednisone 40 PO 1–14Oncovin (vincristine) 1.4a IV 8Bleomycin 10 IV 8G-CSF — SC From d 8STANFORD V 12 wkMechlorethamine 6 IV Wk 1, 5, 9Adriamycin (doxorubicin) 25 IV Wk 1, 3, 5, 7, 9, 11Vinblastine 6 IV Wk 1, 3, 5, 7, 9, 11Vincristine 1.4a IV Wk 2, 4, 6, 8, 10, 12Bleomycin 5 IV Wk 2, 4, 6, 8, 10, 12Etoposide 60 IV Wk 3, 7, 11Prednisone 40 IV Wk 1–10 q.o.d.G-CSF — PO Dose reduction or delay

A randomized comparison with MEC and ABVD showed inferiority of Stanford-V, but no significant difference between ABVD and MEC15. In a randomized phase III trial of the Eastern Cooperative Oncology Group, Stanford V was compared with ABVD: at a median follow-up of 5 years, PFS and OS of Stanford-V and ABVD were very similar while Stanford-V was more toxic16.

In 1992, the GHSG designed the BEACOPP regimen, both, in a baseline and an escalated version and compared these variants with COPP/ABVD in the HD9 trial. IFRT was used for bulky disease at diagnosis and for residual disease after eight cycles of chemotherapy17. At ten years follow-up, FFTF and overall survival were 82% and 86% with BEACOPP-escalated, 70% and 80% with BEACOPP-baseline and 64% and 75% in the COPP/ABVD (figure 5).

12



Figure 5. Tumour control in advanced stage HL (FFTF; HD9) (Engert A et al, J Clin Oncol 27(27);20:4548-4554, 2009)

Importantly, the survival benefit became more evident with longer follow-up and was 11% at ten years when com-pared with COPP/ABVD 18. The higher efficacy of BEACOPPescalated was particularly evident in intermediate risk patients (IPS 2-3). However, toxicity of 8xBEACOPPescalated were a concern since this treatment was associated with more acute and long-term toxicity. The subsequent GHSG trials for advanced stage HL, HD12 and HD15, thus aimed at reducing treatment-associated toxicity by modifying the eight courses BEACOPP-escalated regimen and by revisiting the role of consolidative radiotherapy.

In HD1519, a total of 2.182 patients were randomized into the three study arms comparing eight cycles of BEACOPPescalated, six cycles of BEACOPPescalated and eight cy-cles of BEACOPP-14. FFTF at 5 years was 84.4% with eight cycles of BEACOPPescalated, 89.3% with six cycles of BEACOPPescalated, and 85.4% with eight cycles of BEACOPP-14. OS with six cycles of BEACOPPescalated was 95.3%, and also significantly better than the former standard treatment of eight cycles. Importantly, six cycles of BEACOPPescalated were also associated with a lower treatment-related mortality (0.8% vs 2.1%) and fewer cases of secondary acute myeloid leuke-mia (0.3 vs 2.7%) than eight cycles of BEACOPPescalated. Thus, the HD15 study showed that in patients with advanced stage HL, six cycles of BEACOPPescalated are better than eight cycles in terms of disease control and OS while being less toxic. Due to the better outcome and tolerability, 6 cycles of BEACOPPescalated followed by PET-guided RT to residual dis-ease became the new standard-of-care for advanced-stage HL within the GHSG and other groups. These date present the best lymphoma control and OS reported so far reported for advanced stage HL patients.

Another important question in HD15 was to possibly reduce the number of patients with additional radiotherapy. Patients with PET negative residual disease ≥2.5cm after the end of chemotherapy did not receive any additional RT and their outcome was not different from patients reaching a CR after chemotherapy. The negative predictive value (NPV) for PET was 94.1% at 12 months 19. With this PET-guided ap-proach, only 11% of all patients in this trial needed additional RT as compared to 70% in HD9.

Current concepts in advanced stage patients also in-vestigate early PET-adapted treatment. Strategies include in-creasing intensity of treatment for PET-2 positive patients af-ter ABVD or decreasing intensity in PET-2 negative patients after BEACOPPescalated. Until final results of these studies will be available, early PET-guided treatment-adaption is not ad-vised outside clinical trials.

Relapsed and refractor y H LHigh dose chemotherapy (HDCT) followed by autolo-

gous stem cell transplantation (ASCT) is the treatment of choice for HL patients who relapse after initial chemotherapy or are primary refractory to first-line treatment due to im-proved disease control compared to conventional chemother-apy20, 21. The benefit of HDCT and ASCT is significantly influ-enced by several prognostic factors such as time to relapse, anemia and stage at relapse. Various salvage chemotherapy regimens have been evaluated in single-arm trials. So far, there was only one randomized trial comparing different sec-ond-line induction regimens. This cooperative European trial, HDR2, demonstrated that two courses of DHAP followed by HDCT and ASCT are equally effective when compared to a more aggressive sequential high-dose-based induction treat-ment22. Thus, two courses of DHAP or similar regimens fol-lowed by HDCT and ASCT are considered standard of care for patients with relapsed HL.

Patients with primary refractory HL also benefit from HDCT and ASCT, but their outcome is poorer than for patients with relapsed HL. Thus, a tandem ASCT as suggested by a prospective multicenter phase II study of the GELA might be an appropriate approach for patients with primary refractory HL23.

New DrugsA number of promising new drugs are currently being

developed and evaluated in patients with relapsed or refrac-tory HL. The most advanced is Brentuximab Vedotin, an an-tibody-drug conjugate consisting of an anti-CD30 antibody conjugated to the potent anti-microtubule agent Monomethyl Auristatin-E (MMAE). In a phase I study that enrolled 45 pa-tients with CD30-positive lymphomas, the maximally toler-ated dose of SGN-35 was 1.8 mg/kg delivered as intravenous infusion every three weeks24. The subsequent phase II includ-ed relapsed HL patients after HDCT and ASCT. In this trial, 96 of 102 patients (94%) achieved tumor reduction; the overall response rate (ORR) was 75%, CR was achieved in 34% of patients25. The median PFS for all patients was 5.6 months and the median duration of response for those in CR 20.5 months. After a median observation time of over 1.5 years, 31 patients were alive and free of documented progressive disease (PD). The most common treatment-related adverse events were pe-ripheral sensory neuropathy, nausea, fatigue, neutropenia, and diarrhea. Based on these results, SGN-35 was approved for the treatment of relapsed HL patients after at least two prior lines of treatment. Further novel agents currently under-going clinical evaluation include monoclonal antibodies and small molecules.

13



Reduced intensit y cond it ion ing a l logeneic stem cel l t ransplantat ion

Allogeneic stem cell transplantation (aSCT) represents a potentially curative treatment option for patients relapsing after ASCT but has to be considered experimental in HL since it is associated with relevant non-relapse mortality (NRM) and high relapse rates resulting in a long-term survival of only 30% to 40%. Sureda and colleagues recently reported results from a prospective phase II study including patients who underwent aSCT after induction chemotherapy with DHAP or other salvage protocols and reduced intensity condi-tioning with fludarabine and melphalan26. At one year, NRM rate was 15%. Cumulative relapse rates at one and four years were 37% and 59%, respectively. The estimated OS rate at four years was 43%. Patients not responding to the induction chemotherapy had a significantly worse clinical outcome. On the basis of these data, aSCT after reduced intensity condi-tioning cannot be recommended as standard approach in pa-tients failing HDCT and ASCT but might be used in selected patients. In particular, young chemosensitive patients may profit. Since optimization of aSCT in HL is necessary, treat-ment should be conducted within clinical trials only.

Nodular lymphocy te -predominant Hodgk in lymphoma

NLPHL accounts for about 5% of HL cases and differs from cHL in terms of histology, immunophenotype and clini-cal course. The detection of lymphocyte predominant (LP) cells is required for the diagnosis of NLPHL. A consistent expression of CD20 on the malignant cells is the hallmark of this disease; CD45 and the epithelial membrane antigen (EMA) are also frequently expressed. Particularly in patients with early-stage disease, the clinical course is often more in-dolent when compared with cHL27. Treatment with IFRT alone leads to excellent results in these patients and is widely considered standard of care for stage IA NLPH. In early unfa-vorable and advanced stages, the standard of care is very sim-ilar to cHL consisting of chemotherapy alone or combined modality approaches28. In relapsed NLPHL, standard treat-ment is undefined. However, impressive response rates of 90% to 100% and durable remissions in a relevant proportion of patients were observed after anti-CD20 antibody treat-ment29,30. Hence, it appears possible to spare HDCT and ASCT at least in patients with localized relapse.

Treatment of e lderly pat ients w ith Hodgk in lymphoma

According to cancer registries, HL patients aged 60 years or older account for about 20% of all cases in Western countries. Compared with younger patients, older HL patients have a significantly poorer clinical outcome. This is mostly due to the poorer tolerability of multi-agent chemotherapy 31. Since elderly patients are also often excluded from random-ized clinical trials, no standard of care for this age group has been defined yet. Most elderly patients in early favorable stag-es can be treated with the standard approach for younger pa-tients consisting of two cycles of ABVD followed by 20Gy IFRT. In early unfavorable stages, treatment with four cycles of ABVD followed by 30Gy IFRT is feasible in elderly pa-

tients although associated with an increased rate of toxic events 32. In advanced stages, most often six to eight cycles of ABVD are followed by localized RT of residual lymphoma. The BEACOPP protocol should not be applied in elderly pa-tients since increased toxicity and treatment-related mortality were observed in this age group. Treatment options in elderly patients with relapsed HL are very limited since the vast ma-jority is not eligible for HDCT and ASCT. Here, the anti-CD30 ADC Brentuximab Vedotin might offer new possibili-ties for this age group.

References1. DeVita VT Jr, Hubbard SM. Hodgkin’s disease. N Engl J

Med 1993;328(8): 560-5.2. Hasenclever D, Diehl V et al. A prognostic score for ad-

vanced Hodgkin’s disease. N Engl J Med 1998;339: 1506-1514.

3. Engert, A et al. Two cycles of doxorubicin, bleomycin, vinblastine, and dacarbazine plus extended-field radio-therapy is superior to radiotherapy alone in early favorable Hodgkin’s lymphoma: final results of the GHSG HD7 tri-al. J Clin Oncol Aug 10 2007;25(23): 3495-502.

4. Raemaekers, J et al. The achievements of the EORTC Lymphoma Group. European Organisation for Research and Treatment of Cancer. Eur J Cancer 2002;38 Suppl 4, S107-113.

5. Engert, A et al. Reduced treatment intensity in patients with early-stage Hodgkin’s lymphoma. N Engl J Med 2010;363: 640-652.

6. Meyer, RM et al. ABVD alone versus radiation-based therapy in limited-stage Hodgkin’s lymphoma. N Engl J Med 2012;366: 399-408.

7. Hutchings, M et al. FDG-PET after two cycles of chemo-therapy predicts treatment failure and progression-free survival in Hodgkin lymphoma. Blood 2006;107: 52-59.

8. Gallamini, A et al. Early interim 2-[18F]fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emission tomography is prognostically superior to international prognostic score in advanced-stage Hodgkin’s lymphoma: a report from a joint Italian-Danish study. J Clin Oncol 2007;25: 3746-3752.

9. Ferme, C et al. Chemotherapy plus involved-field radiation in early-stage Hodgkin’s disease. N Engl J Med 2007;357: 1916-1927.

10. Eich, HT et al. Intensified chemotherapy and dose-reduced involved-field radiotherapy in patients with early unfavor-able Hodgkin’s lymphoma: final analysis of the German Hodgkin Study Group HD11 trial. J Clin Oncol 2010;28: 4199-4206.

11. Thomas, J, Ferme, C & Noordijk, E. Results of the EORTC-GELA H9 randomized trials: The H9-F trial (comparing 3 radiation dose levels) and H9-U trial com-paring 3 chemotherapy schemes) in patients with favor-able or unfavorable early stage Hodgkin’s lymphoma. Haematologica 2007;92: 27.

12. von Tresckow, B, Plütschow, A, Fuchs, M et al. Dose-intensification in early favorable Hodgkin lymphoma: Final Analysis of the GHSG HD14 trial. J Clin Oncol Mar 20 2012;30(9):907-13.

14



13. DeVita, VT Jr et al. Curability of advanced Hodgkin’s dis-ease with chemotherapy. Long-term follow-up of MOPP-treated patients at the National Cancer Institute. Ann Intern Med May 1980;92(5):587-595.

14. Bonadonna, G, Valagussa, P & Santoro, A. Alternating non-cross-resistant combination chemotherapy or MOPP in stage IV Hodgkin’s disease. A report of 8-year results. Ann Intern Med 1986;104: 739-746.

15. Chisesi, T, et al. Long-term follow-up analysis of HD9601 trial comparing ABVD versus Stanford V versus MOPP/EBV/CAD in patients with newly diagnosed advanced-stage Hodgkin’s lymphoma: a study from the Intergruppo Italiano Linfomi. J Clin Oncol Nov 10 2011;29(32):4227-33.

16. Gordon, LI, Hong, F, Fisher RI et al. A randomized phase III trial of ABVD vs Stanford V +/- radiation therapy in locally extensive and advanced stage Hodgkin’s lympho-ma: An intergroup study coordinated by the Eastern Cooperative Oncology Group. 52nd ASH Annual Meeting & Exposition, abstract 415 (2010)

17. Diehl, V et al. Standard and increased-dose BEACOPP chemotherapy compared with COPP-ABVD for advanced Hodgkin’s disease. N Engl J Med 2003;348: 2386-2395.

18. Engert, A et al. Escalated-dose BEACOPP in the treat-ment of patients with advanced-stage Hodgkin’s lympho-ma: 10 years of follow-up of the GHSG HD9 study. J Clin Oncol 2009;27: 4548-4554.

19. Engert, A et al. Reduced-intensity chemotherapy and PET-guided radiotherapy in patients with advanced stage Hodgkin’s lymphoma (HD15 trial): a randomized, open-label, phase 3 non-inferiority trial. Lancet 2012;379: 1791-1799.

20. Linch, DC et al. Dose intensification with autologous bone-marrow transplantation in relapsed and resistant Hodgkin’s disease: results of a BNLI randomised trial. Lancet 1993;341: 1051-1054.

21. Schmitz, N et al. Aggressive conventional chemotherapy compared with high-dose chemotherapy with autologous haemopoietic stem-cell transplantation for relapsed che-mosensitive Hodgkin’s disease: a randomised trial. Lancet 2002;359: 2065-2071.

22. Josting, A et al. Dose intensity of chemotherapy in pa-tients with relapsed Hodgkin’s lymphoma. J Clin Oncol 2010;28: 5074-5080.

23. Morschhauser, F et al. Risk-adapted salvage treatment with single or tandem autologous stem-cell transplanta-tion for first relapse/refractory Hodgkin’s lymphoma: re-sults of the prospective multicenter H96 trial by the GELA/SFGM study group. J Clin Oncol 2008;26: 5980-5987.

24. Younes, A et al. Brentuximab vedotin (SGN-35) for re-lapsed CD30-positive lymphomas. N Engl J Med 2010;363: 1812-1821.

25. Younes, A, Gopal, AK, Smith, SE et al. Results of a piv-otal phase II study of Brentuximab Vedotin (SGN-35) for patients with relapsed or rfractory Hodgkin lymphoma. J Clin Oncol 2012.

26. Sureda, A et al. Allogeneic stem cell transplantation after reduced intensity conditioning in patients with relapsed or refractory Hodgkin’s lymphoma. Results of the HDR-ALLO study–a prospective clinical trial by the Grupo Espanol de Linfomas/Trasplante de Medula Osea (GEL/TAMO) and the Lymphoma Working Party of the European Group for Blood and Marrow Transplantation. Haematologica 2012;97: 310-317.

27. Nogova, L, Rudiger, T & Engert, A. Biology, clinical course and management of nodular lymphocyte-predomi-nant hodgkin lymphoma. Hematology Am Soc Hematol Educ Program, 266-272 (2006)

28. Nogova, L et al. Lymphocyte-predominant and classical Hodgkin’s lymphoma: a comprehensive analysis from the German Hodgkin Study Group. J Clin Oncol 2008;26: 434-439.

29. Schulz, H et al. Rituximab in relapsed lymphocyte-pre-dominant Hodgkin lymphoma: long-term results of a phase 2 trial by the German Hodgkin Lymphoma Study Group (GHSG). Blood 2008;111: 109-111.

30. Ekstrand, BC et al. Rituximab in lymphocyte-predomi-nant Hodgkin disease: results of a phase 2 trial. Blood 2003;101: 4285-4289.

31. Engert, A et al. Hodgkin’s lymphoma in elderly patients: a comprehensive retrospective analysis from the German Hodgkin’s Study Group. J Clin Oncol 2005;23: 5052-5060.

32. Boll, B et al. Feasibility and Efficacy of ABVD In Elderly Hodgkin Lymphoma Patients: Analysis of Two Randomized Prospective Multicenter Trials of the German Hodgkin Study Group (HD10 and HD11). ASH Annual Meeting Abstracts 116, 418- (2010)

15



MOŽDA NO STA BLOMoždano stablo je smešteno u zadnjoj lobanjskoj jami

i čine ga produžena moždina, pons i srednji mozak. Longitudinalne strukture su krov ili tektum, bazilarni region i tegmentom u sredini. Jedra svih lobanjskih živaca, osim op-tičkog i olfaktivnih, nalaze se u moždanom stablu. Stablo je pokriveno malim mozgom sa kojim je povezano cerebelarnim kracima. Četvrta moždana komora nalazi se između tegmen-tuma i krova. Senzitivna vlakna lobanjskih živaca završavaju se u jedrima, a motorna vlakna polaze iz motornih jedara u moždanom stablu. Piramidni i senzitivni putevi prolaze kroz moždano stablo. Povrede i oštećenja moždanog stabla manife-stuju se kao motorni, somatosenzitivni, cerebelarni i simpto-mi disfunkcije kranijumskih živaca. Nivo lezije moždanog stabla najčešće može se otkriti na osnovu oštećenog lobanj-skog živca (Slika 1). Mala i pojedinačna lezija može izazvati teške i višestruke ispade (1)

Slika 1. Jedra lobanjskih živaca. Dorzalni izgled moždanog stable i lokalizacija jedara kranijumskih nerava.

Značajan broj ukrštenih sindroma moždanog stabla opisan je u neurološkoj literaturi, posebno tokom XIX i počet-kom XX veka. Većina ovih sindroma sastoje se iz ipsilateral-nog oštećenja lobanjskog živca i kontralateralne zahvaćenosti

dugog puta, koja najčešće dovodi do hemipareze ili hemisen-zitivnih ispada. Više od 25 alternih sindroma imenovani su prema autorima koji su ih prvi opisali (2). Izuzev Wallenbergovog sindroma, drugi klasični sindromi retko se sreću u kliničkoj praksi. Većina je opisana na osnovu analize i prikaza pojedinačnih slučajeva bolesnika, ponekada i na osnovu autopsijskih nalaza. U vreme tih prikaza nisu bile do-stupne metode neuroslikanja, niti funkcionalni testovi za pro-cenu i proveru pretpostavljene akutne lezije moždanog stabla (2).

Jedra kranijumskih živaca često su oštećena različitim patološkim procesima koji zahvataju moždano stablo. Oštećenje jedra motornog nerva dovodi do paralize mišića ko-je on inerviše. Ova oduzetost je skoro uvek na strani ošteće-nja. Trohlearni živac (n.IV) predstavlja izuzetak, jer se njego-va vlakna potpuno ukrštaju na zadnjoj strani. Neka vlakna okulomotornog živca takođe se ukrštaju i izlaze sa vlaknima nerva suprotne strane. Oštećenje motornog jedra kranijum-skog živca dovodi do periferne paralize sa atrofijom zahvaće-nog mišića.

Kod lezija koje su lokalizovane lateralno, javiće se znaci oštećenja Edingerovog puta (kontralateralna analgezija i termanestezija). Ako se proces širi iz dorzolateralnog dela moždanog stabla, oštećenje silaznog simpatičkog puta i po-vreda donjeg cerebelarnog pedunkula dovodi do pojave Hornerovog sindroma i istostranih cerebelarnih znakova. Dorzalna lezija moždanog stabla najpre daje sliku povrede je-dara lobanjskih živaca, zatim medijalnog lemniskusa (ošteće-nje dubokog senzibiliteta na suprotnoj strani) a kasnije i pira-midne ispade (hemiplegija ekstremiteta suprotne strane) (3). Ushodni somatosenzitivni putevi ukrštaju se u srednjem delu produžene moždine.

Piramidni putevi nalaze se u prednjim delovima me-zencefalona i produžene moždine. U najnižim delovima pro-dužene moždine piramidni putevi se nalaze blizu jedan dru-gome pa i malo oštećenje može oštetiti oba puta i dovesti do kvadripareze ili kvadriplegije. U bazilarnom delu ponsa, u kome su vlakna piramidnih puteva razdvojena u brojne snopo-ve, mala lezija može biti klinički neprimetna. U moždanom stablu izuzetna je izolovana lezija piramidnih puteva jer se blizu njih nalaze kortikobulbusna vlakna koja odlaze u motor-na kranijumska jedra. Oštećenje će u tom slučaju izazvati pa-ralizu i motornog kranijumskog živca i ekstremiteta na su-protnoj strani. Lezije koje oštećuju kortikospinalni i kortiko-bulbusni put često zahvataju jedan ili više kranijumskih nera-va (3).

Ishemija moždanog stabla najčešći je uzrok akutnog oštečenja. Najčešće pogađa moždani most. Nevaskularni uz-roci uključuju demijelinacijsku bolest, degenerativne poreme-ćaje, povrede, neoplazme i dr. i najčešće daju multifokusna oštećenja, pa imaju manju topografsku vrednost. Opisi ukr-

UKRŠTENI SINDROMI MOŽDANOG STABLAProf. dr Nebojša J. Jović

Klinika za neurologiju i psihijatriju za decu i omladinu, Beograd, SrbijaMedicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu, Srbija

16



štenih sindroma moždanog stabla bili su značajni u definisa-nju važnih principa lokalizacije oštećenja u moždanom stablu (2).

A. SI N DROMI SR EDNJ EG MOZGA A.1. V ENTR A LNA OŠTEĆENJA SR EDNJ EG MOZGA

Jednostrano oštećenje ventralnog dela srednjeg mozga može uključiti moždane pedunkule (kortikospinalni i korti-kobulbarni putevi). Oštećenje anteromedijalnih struktura uzrokuje dizartriju ili disfagiju i slabost lica i ruke suprotne strane, bez senzitivnih ispada. Zahvaćenost n.III i Westphal-Edingerovog jedra manifestuje se devijacijom oka na stranu lezije naniže i upolje, uz dilataciju zenice i ptozu. Lateralnije oštećenje uzrokuje hemiparezu suprotne strane uz veću za-hvaćenost noge, gubitak vibracijskog i položajnog senzibilite-ta (medijalni lemniskus) na suprotnoj strani od oštećenja i gubitak senzibiliteta za bol i temperaturu na trupu i ekstremi-tetima (ushodni spino-talamički put). Horeoatetoza (crveno jedro), ataksija suprotne strane (gornji cerebelarni kraci) i in-ternukleusna oftalmoplegija (medijalni longitudinalni snop), Hornerov sindrom i slušna disfunkcija se ,takođe, mogu javiti (1).

A. 1.1. Weberov sindrom (H. Veber, 1863) Alterna okulomotorna hemiplegija

Herman David Weber (1823-1918) lekar Nemačke bol-nice u Londonu 1863.g. prikazao je slučaj 52-godišnjeg čove-ka sa desnostranom hemiparezom i paralizom levog okulo-motornog živca koje su uzrokovane krvavljenjem i oštećenjem

levog moždanog kraka. Bolesnik je imao slabost desne strane lica, devijaciju jezika u desno, ptozu levog gornjeg očnog kap-ka i midrijazu leve zenice. Levo oko je bilo okrenuto u stranu, uz očuvanu abdukciju i intorziju. Senzitivna diskriminacija dve odvojene tačke lica i tela sa desne strane bila je snižena (5, 6). Njegov bolesnik umro je dva meseca kasnije zbog bron-hopneumonije i pleuritisa. Autopsija je pokazala ateromato-zne promene unutrašnje karotidne arterije, bazilarne artrerije i leve srednje i zadnje arterije mozga. Raymond i Cestan su ovaj sindrom označili kao pedunkularni (4).

Weberov sindrom nastaje kao posledica oštećenja je-dra i vlakana n.III (najčešće na izlazu iz tegmentuma) i mo-ždanog kraka i karakterišu ga:

1. kontralateralna hemiplegija/hemipareza (uključu-čujući i donji deo lica), zbog zahvaćenosti kortiko-spinalnog i kortikobulbarnog puta.

2. ipsilateralna spoljna okulomotorna pareza, uklju-čujući i parasimpatički deo nerva (dilatacija zeni-ce). Potpuna zahvaćenost n.III dovodi do ipsilate-ralne ptoze, dilatacije zenice, gubitka pupilarnih refleksa i reakcije na akomodaciju i lateralne devi-jacije oka (7).

Kliničke manifestacije infarkta srednjeg mozga najče-šće jasno i direktno odgovaraju lokalizaciji lezije, ali se one ne poklapaju uvek sa klasičnim, izvornim, opisom (6, 8). Ovo je češće kod bolesnika sa istorijom dugotrajne arterijske hiper-tenzije i šećerne bolesti. Veberov sindrom najčešće je posledi-ca okluzije (uglavnom emobolijskog tipa), paramedijalnih perforantnih, pedunkularnih i interpedunkularnih grana zad-nje moždane arterije (Slika 2).

Slika 2 Weberov sindrom. (A) T1-weighted MR –postkontrastno pojačana lezija, lokalizovana levo u srednjem mozgu i možda-nom pedunkulu (B) T2-weighted–oštećenje koje zahvata srednji mozak, možćdani krak i optički put s leve strane

17



Prikazan je slučaj bolesnice sa Weberovim sindromom i normalnom zenicom. Ishemijska lezija donjeg srednjeg mo-zga, viđena na MR pregledu mozga, uključila je motorno je-dro n.III. ali ne i Westphal-Edingerovo jedro, čime se obja-šnjava takav nalaz (7). Weberov sindrom vaskularne etiologi-je može imati povoljan ishod uz reverzibilni tok ukrštene pa-ralize (6). Netipični slučajevi ukrštene hemiplegije sa parali-zom n.III i n.VII koje su izazvane infarktom posteriorne cir-kulacije, uključujući ventro-medijalni kruralni region sred-njeg mozga, veoma su retki (8, 9). Opisani su brojni slučajevi nevaskularne etiologije Veberovog sindroma, uključujući aneurizmu, tumor, demijelinaciju, primarni limfom CNS i ne-urocisticerkozu jedne strane ventralnog srednjeg mozga (10).

A.1.2. Benediktov sindrom (M. Benedikt, 1889)Originalni slučaj koji je opisao Benedikt imao je tuber-

kulozu mozga. Lezija ventralnog tegmentuma srednjeg mo-zga sa zahvaćenošću crvenog jedra, moždanih pedunkula i okulomotornih snopova izaziva Benediktov sindrom koji či-ne:

1. istostrana okulomotorne paraliza, najčešće uz dila-teranu zenicu

2. kontralateralni nevoljni pokreti- hiperkinezije (in-tencioni tremor, hemihorea, hemiatetoza), koji na-staju zbog lezije crvenog jedra.

Benediktov sindrom najčešće je uzrokovan stenozom proksimalne zadnje moždane arterije (12). Prikazan je i slučaj sa naglim razvojem diplopija, desnostrane ptoze, retrakcije levog kapka, lake levostrane hemipareze i nevoljnih pokreta. Zaključena je istovremena pojava dva mezencefalička sindro-ma (Benediktov i „plus–minus lid sindrom”-jednostrana re-trakcija kapka sa kontralateralnom ptozom) izazvani odvoje-nim infarktima srednjeg mozga posle okluzije više malih gra-na distalne bazilarne aretrije i proksimalnih, paramedijalnih i pedunkularnih perforantnih arterija. Angiografija je pokazala tešku stenozu proksimalnog segmenta desne zadnje moždane aretrije (13).

A.1.3. Claudeov sindrom (H. Klod, 1912)Claude je 1912. opisao molera kod koga se razvila de-

snostrana paraliza okulomotornog živca i kontralateralana ataksija hoda. Patološki pregled njegovog bolesnika otkrio je infarkt u desnom paramedijalnom delu srednjeg mozga, koji je uključio gornje cerebelarne pedunkule i medijalnu polovi-nu crvenog jedra (14). Klodov sindrom je ukršteni sindrom srednjeg mozga koji nastaje zbog simultane zahvaćenosti ce-rebelarnih dentato-talamičkih vlakana i snopova n.III i karak-teriše se ipsilateralnom oduzetošću okulomotornog živca i kontralateralnom hemiataksijom (15).

Cerebrovaskulni poremećaji i tumori su najčešća etio-logija. Okluzija perforantnih arterija koje potiču iz zadnje mo-ždane arterije pretpostavljena je najčešća vaskularna osnova ovog sindroma (9). Neurocisticerkusna infekcija retko izaziva Klodov sindrom (16). Iako neki raniji prikazi podržavaju ori-ginalnu zahvaćenost crvenog jedra (14), većina prikaza suge-riše ključnu leziju gornjeg cerebelarnog kraka, ispod i unutra od crvenog jedra (16, 17). (Slika 3). Samo retki slučajevi po-kazuju dodatnu zahvaćenost crvenog jedra.

A.2 . DOR ZA LNA OŠTEĆENJA SR EDNJ EG MOZGA

Ova oštećenja uglavnom izazivaju neuro-oftalmološke poremećaje i viđaju kod hidrocefalusa i tumora pinealnog re-giona.

Slika 3 a. Claudeov sindrom. MR mozga (FLAIR). Hiperin-tenzna lezija u levom ventro-medijalnom srednjem mozgu (3a).

Slika 3 b. Claudeov sindrom. MR mozga (FLAIR). Oštećenje lokalizovano u gornjem cerebelarnom kraku, ispod i medijal-no od crvenog jedra (3b)

18



A.2 .1. Par inaud- ov s indrom ( Par ino, 1883, 1886)

A.2.2 Koerber Salus Elschnigov syndrome (1903, 1910)Ova dva sindroma se ne mogu smatrati klasičnim ukr-

štenim sindromima moždanog stabla, s obzirom na odsustvo oštećenja dugih puteva u moždanom stablu. S obzirom na to da su praćeni oftalmološkim i neurološkim znacima koji uka-zuju na tipične lezije moždanog stabla, oni su često uključeni u listu alternih sindroma ove strukture.

Parinaudov sindrom (18) se odlikuje paralizom konju-govanog vertikalnog pogleda i pokreta očiju i slabošću kon-vergencije uz druge neuro-oftalmološke znake (široke i ne-pravilne zenice, retrakcija kapka, nistagmus pri konvergenci-ji, slabost akomodacije). Koerber Salus Elschnigov sindrom se negde izdvaja kao poseban entitet i pored značajnog prekla-panja sa Parinaudovim sindromom koji se karakteriše retrak-tornim nistagmusom, paralizom vertikalnog pogleda, pore-mećajima pupile i znacima bolesti srednjeg mozga (15). U ni-zu prikaza bolesnika sa Parinaudovim sindromom, zapažena je pošteđenost okulomotornih jedara i pretpostavljeno je ošte-ćenje rostralnih intersticijskih jedara medijalnog longitudi-nalnog snopa ili eferentnih puteva koji posreduju u pogledu naviše (1,19,20).

B. MOŽDA NI MOST

PONTINI ALTERNI SINDROMI

B.1. Millard-Gublerov sindrom (A. Milar, A. Gubler, 1856)

Auguste Millard (1830-1915) prvi je saopštio Anatomskom udruženju u Parizu zapažanje po kome je peri-ferna paraliza lica na strani oštećenja udržena sa kontralate-ralnom hemiplegijom znak pontine hemoragije. Opisao je bo-lesnika sa takvim nalazom i naveo je još jedan slučaj prodavca voća i povrća čija autopsija je otkrila 5 mm veliku zonu raz-mekšanja sa središnjim krvavljenjem u srednjem ponsu. Adolphe Gubler (1821-1897) opisao je dodatnih 6 slučajeva. Njegov prvi pacijent bila je žena sa plućnom tuberkulozom, desnostranom hemiparezom i slabošću leve polovine lica. Gubler je zaključio da su opisane ukrštene paralize vezane za oštećenje ponsa. Nepromenjenu inteligenciju smatrao je po-kazateljem očuvanih funkcija moždanih hemisfera. Originalni bolesnici Millarda i Gublera nisu imali paralizu VI živca a ventro-kaudalna lezija ponsa verovatno je zahvatila kortiko-spinalni put i snop VII (21, 22).

Ovaj sindrom zahvata lice na strani lezije i ekstremite-te na suprotnoj strani Njačešće unilateralno oštećenje bazal-nog dela ventro-kaudalnog ponsa uključuje kortikospinalni put i vlakna abducensa i facijalnog lobanjskog živca. Kao po-sledica ove lezije nastaju:

1. periferna paraliza/pareza lica (VII) na strani ošteće-nja

2. kontralateralna hemiplegija (uz poštedu lica) zbog zahvaćenosti piramidnog puta pre njegovog ukrštanja,

3. istostrana pareza pravog spoljašnjeg mišića oka, (VI) sa dvoslikama koje se naglašavaju pri pogledu u stranu lezije

Strukturna oštećenja tegmentuma donjeg dela možda-nog mosta izazvana tumorima i krvavljenjem a retko i infark-tom koji nastaje zbog okluzije bazilarne arterije mogu dati sliku ovog sindroma. Krvavljenja iz kavernoznog hemangio-na jedne strane ponsa opisano je kao moguća etiologija (23) (Slika 4).

Bolesnici mogu imati i druge neurološke ispade koji su posledica oštećenja struktura blizu jedra facijalnog živca, kao što su hemiparestezija i cerebelarna ataksija na suprotnoj stra-ni od lezije (24). Prikazan je slučaj 3-godišnje devojčica sa desnostranom oduzetošću n.VI i n.VII i levostranom hemipa-rezom koje su uzrokovane tuberkuloznim granulomom mo-ždanog stabla (desna polovina mosta, uz širenje lezije prema desnom srednjem cerebelarnom kraku i srednjem mozgu). Uz antituberkuloznu terapiju došlo je do značajnog poboljšanja neuroloških ispada (25).

B.2. Foville-ov sindrom (A.L. Fovil, 1858)Achille Louis Foville (1799-1878) opisao je 43-godi-

šnjeg bolesnika sa desnostranom slabošću ekstremiteta, pot-punom levostranom paralizom lica i nemogućnošću da gleda u levu stranu (paraliza konjugovanih pokreta). Pretpostavio je da je za ove ispade odgovorna jednostrana lezija moždanog mosta i da je paraliza pogleda posledica oštećenja jedra abdu-censa na strani oštećenja (26).

Slika 4. Millard –Gublerov sindrom. MR mozga pokazuje hemoragiju koja potiče iz kavernoznog hemangioma u ponsu sa leve strane

Ovaj sindrom je posledica lezije dorzalnog pontinog tegmentuma u donjoj trećini ponsa. Sastoji se od:

1. kontralateralne hemiplegije (uz poštedu lica) zbog zahvaćenosti piramidnog puta,

2. ipsilateralne periferne facijalne paralize zbog za-hvaćenosti jedra i snopova n. VII,

19



3. nesposobnosti konjugovanog pomeranja očiju na is-tu stranu (devijacija pogleda ka zdravoj strani) zbog zahvaćenosti paramedijalne retikularne pon-tine formacije i/ili jedra abducensa (15).

Opisano je nekoliko varijanti ovog sindroma:Pontini Fovilov sindrom pored kontralateralne hemi-

plegije odlikuje se paralizom abducensa.Gornji Fovilov sindrom sastoji se od ukrštene hemi-

plegije, istostrane paralize okulomotornog živca i kontralate-ralne paralize lica.

Donji Fovilov sindrom karakteriše se hemiplegijom suprotne strane i istostranom paralizom okulomotornog i fa-cijalnog živca (3).

Nagla, prolazna pojava dvoslika i hemipareze može ukazati na početni razvoj medijalnog donjeg pontinog sindro-ma (27). Fluktiuirajući Fovilov sindrom prikazan je kod bole-snika sa kavernoznim angiomom dorzalnog ponsa i hronič-nim bubrežnim popuštanjem zbog policističnih bubrega. Lokalizovani mali hematom u pontinom angiomu, nastao to-kom hemodijalize, uzrokovao je paralizu konjugovanog po-kreta očiju u stranu lezije i kontralateralnu hemiparezu (28).

Milar-Gublerov sindrom treba razlikovati od Fovilovog syndrome, kod koga postoji i slabost pogleda u stranu. To je zato što kod Fovilovog sindroma zahvaćeno jedro n.VI, koje sadrži interneurone koji povezuju unutrašnji longitudinalni snop sa podjedrom za unutrašnji pravi mišić okulomotornog kompleksa suprotne strane. To dovodi do potpune oduzetosti pokreta oka u stranu zbog slabost ipsilateralnog pravog spolj-nog i kontralateralnog unutrašnjeg pravog mišića (27).

B. 3.1. Reymondov s indrom ( F-Remon 1895)

B.3.2 Reymond-Céstanov sindrom (F. Remon, R. Sestan, 1901-1903)

Fulgence Raymond (1844-1910), naslednik Charcota na mestu profesora u Klinici za nervne bolesti Salpêtrière u

Parizu, opisao je oštećenje levog abducensa i kontralateralnu hemiparezu kod jedne žene sa sifilisom. Pretpostavio je da lezija donjeg ponsa može istovremeno da ošteti i piramidni put i n.abducens, ali pošteđuje facijalni živac koji je lateralni-je položen. S druge strane, njegova pacijentkinja je jasno ima-la brojne druge lezije i desnostranu facijalnu paralizu, afaziju, prozopagnoziju i diplopije. Raymond je opisao i strukturu moždanih pedunkula, uključujući kortikobulbarna vlakna od motorne kore kroz koleno unutrašnje kapsule do ukrštanja u ponsu i njihove inervacije jedra facijalnog živca (29).

U periodu od 1901-1903. Raymond i Cestan (1872-1934) (30) opisali su tri slučaja. Svi bolesnici imali su internu-kleusnu oftalmoplegiju, bez devijacije očiju u primarnom po-ložaju. Konvergencija bulbusa i zenice bili su normalni. Postojali su senzorimotorni poremećaji, kontralateralno od slabosti adukcije bulbusa. Slabost ekstremiteta bila je laka, ali voljni motorni pokreti bili su veoma poremećeni, uz krupan statički tremor, atetozne pokrete prstiju, ataksiju, dismetriju i asinergiju. Hipoestezija i astereognozija su ,takođe, zapažene.

U svim slučajevima ukrštena paraliza bila je uzroko-vana pojedinačnim tuberkulumom u rostralnom tegmentumu. Autori su označili ovaj sindrom kao gornji pontini (syndrome protuberatiel superieur). Naglasili su da se paraliza konjugo-vanih pokreta očiju kod njihovih bolesnika odvija bez zahva-ćenosti jedra n.VI i da je tuberkulom mogao indirektno da ga ošteti. Pretpostavili su da je slabost horizontalnih pokreta oči-ju (internukleusna oftalmoloplegija) uzrokovana destrukci-jom longitudinalnog medijalnog snopa.

Raymondov sindrom pripada grupi anteromedijal-nih/anterolateralnih sindroma i sastoji se iz ipsilateralnog oštećenja abducensa (oduzetost spoljnog pravog mišića na strani lezije) i hemipareze suprotne strane. Kortikospinalni i kortikobulbarni put prolaze kroz ventromedijalnu zonu kau-dalnog ponsa. Većina bolesnika ima ishemijsko oštećenje pa-ramedijalnog i lateralnog dela baze kaudalnog ponsa i MR mozga pokazuje infarkt ove strukture (Slika 5).

Slika 5. Raymondov sindrom. MR mozga (T2 sekvencija) pokazuje zonu nenormalno visokog intenziteta u paramedijalnom i spoljašnjem delu baze kaudalnog ponsa, sa leve strane (strelice)

20



Udruženost Raymondovog sindroma i supranukleusne paralize facijalnog živca zbog infarkta u nivou baze možda-nog mosta retko se opisuje (31). Mali hematom medijalnog ponto-medularnog spoja može dati sliku ovog ukrštenog sin-droma (32).

Predložen je koncept po kome postoje dva klinička tipa Raymondovog sindroma: 1) klasični tip, koji je izazvan ošte-ćenjem srednjeg ponsa , koje uključuje ipsilateralni snop ab-ducensa i neukrštena kortikofacijalna i kortikospinalna vlak-na (ipsilateralno oštećenje n.VI, kontralateralna centralna fa-cijalna pareza i kontralateralna hemipareza), 2) običan, jedno-stavan tip, koji može biti uzrokovan zahvatanjem ipsilateral-nog snopa n.VI i neukrštenih kortikospinalnih vlakana, uz poštedu kortikofacijalnih vlakana (bez facijalne slabosti) i češće je opisivan u kasnijim kliničkim zapažanjima (31).

Reymond-Céstanov sindrom viđa se kod rostralnih lezija dorzalnog ponsa (povreda medijalnog lemniskusa i lon-gitudinalnog medijalnog snopa). Uključuje:

1. Ataksiju (sa grubim, rubralnim tremorom)(15),2. kontralateralni poremećaj senzibiliteta lica, ekstre-

miteta (hemianestezija ili hemihipestezija), zbog zahvaćenosti medijalnog lemniskusa spinotalamič-kog trakta.

3. kontralateralna hemipareza (1) i moguća paraliza konjugovanog pokreta očiju ka strani lezije zbog zahvaćenosti paramedijalne retikularne pontine formacije (15).

B. 4 . Mar ie -Foi x s indromOpisuje se kod dorzo-lateralnih oštećenja ponsa (po-

sebno brachium pontis). Sastoji se iz:1. ipsilateralne cerebelarne ataksije, 2. kontralateralne

hemipareze, 3. promenljive kontralateralne hemihipestezije za bol (hemihipalgezija) i temperaturu (zahvaćenost Edingerovog puta) (15).

B. 5 . Gasper in ijev s indrom ( U. Gasper in i , 1912)Italijanski internista Ubaldo Gasperini je 1912.g. opi-

sao bolesnicu sa lezijom lobanjskih nerava V-VIII s jedne strane, perifernom facijalnom paralizom, perifernom oduze-tošću abducensa i paralizom pogleda u obolelu stranu, udru-ženim sa hipakuzijom suprotne strane i hemisenzitivnim is-padima -kontralateralnom hemihipestezijom za bol (hemihi-palgezija) i temparaturu tela niže od vrata (33, 34). U početku se može javiti i laka motorna slabost (33). Nagli nastanak kli-ničkih simptoma ukazuje je vaskularno poreklo ispada. Gasperini je pretpostavio uzročno krvavljenje u moždanom stablu, lokalizovano u lateralnom, kaudalnom tegmentumu moždanog mosta. Njegov prikaz je sugerisao mogućnost da se u sliku uključe i periferna oduzetost trigeminusa i gluvoća na strani lezije. Nije rađena autopsija koja bi podržala Gasperinijevo kliničko zapažanje.

Gasperinijev sindrom nastaje kao posledica male ishe-mičke, infarktne ili hemoragične lezije mediolateralnog pon-tinog tegmentuma (34).Anatomska osnova za ovaj sindrom uključuje jednostrano oštećenje jedra facijalnog živca (peri-ferna facijalna paraliza), n. abducensa (paraliza pogleda pre-ma strani lezije) ili intrapontinih segmenata ovih živaca), aku-stičkih vlakana (hipakuzija), spinalnog trigeminusnog puta

(hipestezija lica) i spinotalamusnog puta (kontralateralna he-mihipestezija za bol i temperaturu). Paraliza pogleda u stranu lezije javlja se retko i smatra se posledicom zahvaćenosti pa-rapontine retikularne formacije. Ukoliko bi bila izražena dija-gnoza Fovilovog sindroma bi bila razmatrana (27,34).

Slika 6. Gasperinijev sindrom. MR mozga (FLAIR) pokazuje zonu povišenog intenzioteta signala u levostranom lateral-nom, kaudalnom tegmentumu moždanog mosta

Najveći broj slučajeva opisan je u japanskoj literaturi. Neuroslikanje pokazuje da je Gasperinijev sindrom ishemič-ke etiologije uglavnom vezan za oštećenje duge cirkuferentne grane prednje donje cerebelarne arterije (34). Prikazan je i slučaj bolesnika sa klasičnim sindromom koji je uzrokovan pontinom demijelinacijom u sklopu multiple skleroze (35). Neki autori sumnjaju u autentičnost inicijalnog opisa ovog sindroma i vezanost za Gasperinijevo ime (2). (Slika 6)

Iako prikazi slučajeva sa Gasperinijevim sindromom nisu česti, vidljiva je značajna heterogenost kliničke slike. Gasperinijev originalni prikaz opisao je kontralateralni gubi-tak senzibiliteta zbog oštećenja spinotalamičkog puta. U ne-kim slučajevima uključen je trigeminotalamusni put dovodeći do poremećaja senzibiliteta polovine lica suprotne strane. Gubitak sluha je čest, ali je vertigo izuzetano redak. Prikazana je udruženost jednostrane trigemino-autonomne glavobolje (kratkotrajni napadi fronto-periorbitalnog bola umerene jači-ne, praćenog suzenjem i lakom kongestijom vežnjača tokom jačih nastupa na strani lezije) kod bolesnika sa Gasperinijevim sindromom koji je uzrokovan okluzijom desne prednje donje cerebelarne arterije. MR mozga je pokazala infarkt desnog cerebelarnog kraka, koji se prostire do pontinog tegmentuma i uključuje spinalno trigeminusno jedro i snop iste strane (36).

21



PRODUŽENA MOŽDI NA

C. 1. Wallenbergov (lateralni medularni) sindrom /A. Valenberg, 1895)

Najraniji poznati prikaz lateralnog medularnog infark-ta dao je 1810. godine Gaspard Vieusseux iz Geneve, u Medicinskom i Hirurškom Društvu u Londonu. “Vertigo, jed-nostrana facijalna pareza, gubitak osećaja za bol i temperatu-ru u kontralateralnim ekstremitetima, disfazija i promuklost, zahvaćenost jezika, štucanje (dobro je reagovalo na uzimanje jutranje cigarete) i unilateralna ptoza.”

Adolf Wallenberg, nemački lekar, posle studija u Hajdelbergu i Lajpcigu, najveći deo stručne prakse obavljao je u Danzigu. Pored rukopisa koji se odnose na patoantomske i patofiziološke aspekte CNS, njegov najveći doprinos odnosi se na lateralni medularni sindrom (LMS). Wallenbergov pri-kaz slučaja 1895.g. upotpunio je kliničku sliku tačnom lokali-zacijom oštećenja, odgovornog za zapažene ispade, koje je kasnije potvrđeno u obdukcionom nalazu. On je objavio 4 ra-da koji opisuju slučajeve sa LMS. U njima je sugerisao ošteće-nje lateralne moždine zbog poremećaja snabdevanja krvlju iz zadnje donje cerebelarne arterije posle stenoze ili potpune okluzije (37, 38) (Slika 7).

Ovaj sindrom je najčešće posledica okluzije vertebral-ne ili zadnje donje cerebelarne arterije, disekcije vertebralne arterije, ali se javlja i kod kokainomana, metastaza u produže-noj moždini, radionekroze i hematoma posle rupture vasku-larne malformacije (15). Angiografija načinjena kod 123 bole-snika sa laterlanim medularnim infarktom pokazala je bolest vertebralne arterije kod 67% i zadnje donje cerebelarne arte-rije kod 10%. Najčešća vaskularna patologija uključila je in-farkt (češće većih nego manjih krvnih sudova), disekciju arte-rija i srčani embolizam. Izolovana patologija zadnje donje cerebelarne arterije češće je bila vezana za srčani embolizam nego za arterijsku disekciju (39). Prikazan je slučaj LMS na-stalog posle traumatogene disekcije vertebralne arterije i ra-zvoja infarkta zadnje donje cerebelarne arterije, posle lakog saobraćajnog udesa u kome je povređeni učestvovao kao mo-torciklista. Autori sugerišu mogućnost infarkta zadnje cirku-lacije i kod mladih odraslih osoba, čak i posle trivijalne po-vrede glave i vrata (40).

Slika 7. Produžena moždina u nivou donjeg olivarnog jedra

Pretpostavlja se da ekstraduralno poreklo zadnje donje cerebelarne arterije može predisponovati za ne-traumatski lateralni medularni sindrom posle naglih ili ponavljanih pokreta glave i vrata. Uz normalan angiografski nalaz , sma-tra se da neurološka slika nastaje zbog prekida hemodinamsk-og protoka i prolaznog arterijskog spazma uzrokovanog mehaničkom silom (pritisak ili rastezanje) na krvni sud tokom pokreta glave i vrata.Veoma retko, multipla skleroza može izazvati LMS. Izolovana zahvaćenost donjeg moždanog stab-la retka je inicijalna prezentacija multiple skleroze. Prva eg-zacerbacija bolesti, pod određenim uslovima može izazvati dijagnostičku konfuziju i ličiti na šlog (41) (Slika 8).

Slika 8. a/b. Wallenbergov sindrom izazvan multiplom sklerozom. MR (aksijalni i sagitalni) pregled moždanog stabla i vratne kičmene moždine pokazuje lateralni medularni demijelinacijski plak

22



Klinička slika odražava oštećenje lateralne medule i donjeg cerebeluma :

Na strani lezije (ipsilateralno):poremećaji gutanja sa bitonalnim glasom zbog paralize IX, X i XI-M živca i oštećenja jedra ambiguusa (ipsilateralna para-liza nepca, ždrela i jedne glasnice), Claude-Bernard-Hornerov sindrom, vestibularni poremećaji sa rotatornim nistagmusom, vrtoglavicom, mučninom i povraćanjem (za-hvatanje vestibularnih jedara); hipalgezija i termoanestezija polovine lica, najčešće oftalmične zone trigeminusne inerva-

cije (spinalno trigeminusno jedro i put); cerebelarni znaci i simptomi na istostranoj nozi (zahvaćenost donjeg cerebelar-nog pedunkula).

B. na suprotnoj strani od uzročnog oštećenja:kontralateralna hipalgezija i termanestezija trupa i ekstremi-teta (spinotalamički put), najčešće pošteđujući lice (42)

Piramidni sistem, pokretljivost jezika i vibracijski i po-ložajni senzibilitet tipično su pošteđeni zato što je njihova anatomska osnova vezana za medijalni deo produžene moždi-ne.

Slika 9. a/b. Wallenbergov sindrom. MR mozga (FLAIR) –hiperintenzitet u desnoj lateralnoj produženoj moždini i desnom cerebelumu. 6b-Diffusion-weighted MR pokazuje istu leziju koja odgovara skorom infarktu

Poremećaji pokreta očiju koji su opisani uz lateralni medularni sindrom su: lateropulzija prema strani lezija, skew devijacija, nistagmusni trzaji očnih kapaka, konjugovana de-vijacija oka na stranu lezije pri zatvorenim kapcima. Postoje nepotpuni oblici sindroma, ali i oni koji ga prevazilaze i uključuju ipsilateralne okulomotorne oduzetosti (42). Kliničko-radiološka analiza 130 bolesnika sa akutnim lateral-nim medularnim infarkom pokazala je da rostralna lezija čes-šće dovodi do disfagije, facijalne pareze i dizartrije a ređe do teške ataksije hoda i glavobolje u poređenju sa kaudalnim oštećenjem (39) (Slika 9).

Kompletni oblik LMS uključuje vertigo, mučninu, po-vraćanje, disfagiju, štucanje, nistagmus, ataksiju, ipsilateralni gubitak senzibiliteta lica i Hornerov sindrom i kontralateralnu spinotalamičku hemianesteziju tela. Nepotpuni oblici javljaju se često i predstavljaju različite kombinacije ovih kliničkih simptoma i znakova. Slučajevi LMS u kojima ukrštenost neu-roloških ispada nedostaje ili je delom izražena, prikazani su. Hipalgezija koja uključuje lice, trup i ekstremitete na suprot-noj strani u odnosu na leziju, bez zahvaćenosti istre strane li-ca, povremeno se opisuje (43). Prikazani su i bolesnici sa ipsi-lateralnom aksijalnom lateropulzijom kao početnim simpto-mom okluzije vertebralne arterije. Oštećenje vestibularnih

jedara, gornjeg i donjeg cerebelarnog kraka i donjeg dela ma-log mozga i spino-cerebelarnog puta smatra se mogućom ana-tomskom osnovom za pojavu aksijalne lateropulzije (44).

Klinički razvoj Wallenbergovog sindroma najčešće ima povoljnu prognozu. Najveći problem predstavljaju bolovi polovine tela sa hipoestezijom, spino-talamičkog porekla. Centralni hronični bol nastaje kod 15-25% bolesnika sa LMS posle lateralnog medularnog infarkta, u periodu tokom 6 me-seci posle insulta. Stalan je, jak, žareći i sa čestom alodinijom, pojačava se sa hladnoćom i mehaničkim nadražajima. Najčešće zahvata ipsilateralni peri-orbitalni region lica (retko sa neurotrofičnom ulceracijom) i kontralateralne ekstremitete (45) u sklopu selektivne lezije spino- i trigemino-talamičkog sistema. Ipsilateralni facijalni bol može biti stalan ili intermi-tentan a povremeno ima svojstva kratkih napada karakteri-stičnih za trigeminusnu neuralgiju. Prikazani su i bolesnici sa bolnim, paroksizmalnim nastupima u inervacijskim zonama trigeminusa, koji su nastali nekoliko nedelja posle medular-nog infarkta (46) .

Primena MR mozga i neinvazivnih neuroslikanja krv-nih sudova delom su modifikovali prethodni koncept klinič-kog spektra i uzroka različitih tipova infarkta moždanog sta-bla (Slika 10). Wallenbergov sindrom često pokazuje obrasce

23



senzitivnih ispada, različitog od klasičnog ukrštenog tipa. Infarkti bočnog dela produžene moždine udruženi su sa rizi-kom od respiratornih i kardiovaskularnih komplikacija u akutnoj fazi, što zahteva brižno nadgledanje bolesnika (47). Razlike u topografskom obrascu infarkta u donjem delu mo-ždanog stable najverovatnije odražavaju razlike u etiopatoge-netskim mehanizmima. Skorašnji prikazi opisuju neočekiva-ni nagli kardiorespiratorni zastoj kod bolesnika sa lateralnim medularnim infarktom tokom perioda oporavka posle šloga sa minimalnom motornom onesposobljenošću. Pretpostavljeni su: srčana aritmija, ishemična zona koja zahvata srčane i re-spiratorne centre u produženoj moždini. Ove medularne lezije izazivaju autonomnu nestabilnost koja dovodi do smrti. (48)

Slika 10. Wallenbergov sindrom. MR mozga (aksijalni FLA-IR) pokazuje lateralni medularni infarkt

C.2 . MEDIJA LNI MEDU LA R NI SI N DROM

C.2.1 Dejerineov (Dežerin, 1926) SindromU sklopu medijalnog medularnog sindroma (MMS),

najčešći je klasični Dejerineov (Dežerin) sindrom. Ateroskleroza i distalna okluzija vertebralne arterije, atero-matozna bolest penetrantnih arterija ili okluzija gornjeg dela prednje spinalne arterije najčešći su uzroci infarkta medijalne moždine (1, 9). Disekcija vertebralne arterije, iako češća kod Wallenbergovog sindroma, utvrđena je kao važan etiološki činilac i za medijalni sindrom (49). Šećerna bolest je česta kod bolesnika sa MMS.

Neurološki nalaz sastoji se iz kontralateralne hemipa-reze, lemniskusnog gubitka senzibiliteta i paralize jezika na strani lezije.Oštećenje piramidnog puta u medijalnoj moždini dovodi do pareze ruke i noge na suprostnoj strain od lezije i u polovini slučajeva i do pareze suprotne strane lica. Hipoglosni živac je često oštećen, što do void do istostrane slabosti jezi-ka. Vibracijski i senzibilitet za položaj i sterognozija na kon-tralateralnim ekstremitetima mogu biti poremećeni uz pošte-du osetljivosti za bol i temperature. Poremećaj svesti, opisan

kod nekih od njih bio je blag i prolazan i uglavnom je bio po tipu pospanosti i zbunjebnosti.

C. 3. Hemimedularn i Babinsk i -Nageot teov s in-drom (Ž. Babinsk i , Ž. Nažot , 1902)

Otkada su Babinski i Nageotte opisali autopsijski na-laz ishemijske lezije unilateralne produžene moždine, opisi hemimedularnog infarkta retki su ili su osporavani. Oni su opisali hemiasinergiju, hemiataksiju sa lateropulzijom i mio-zu na strani lezije, a hemianesteziju i hemiplegiju na suprotnoj strani (50). U ranim kliničkim prikazima hemimedularnog sindroma uglavnom se isticao fatalni ishod, naročito ako je tok komplikovan respiracijskim poremećajima (51). Babinski-Nageotteov sindrom se može posmatrati kao retka kombinaci-ja medijalnog i lateralnog medularnog sindroma. Nuhalni bol i Wallenbergov sindrom javljaju se na strani lezije a sa suprot-ne strane razvijaju se hemipareza i poremećaj senzibiliteta. Jednostrani bol u nuhalnom predelu često prethodi razvoju neuroloških ispada kod hemimedularne ishemije.

U etiologiji hemimedularnog sindroma najčešći su in-farkti, tumori ili zapaljenski procesi. S obzirom na snabdeva-nje krvlju dorzolateralnih i medijalnih delova medule iz razli-čitih krvnih sudova, ovaj sindrom se karakteriše simultanim javljanjem ishemičkih lezija u oba područja. Hemimedularna infarkcija se najčešće smatra za posledicu aterosklerotične okluzije vertebralne arterije, a prikazani su i veoma retki slu-čajevi uzročne disekcije ove arterije (51-53).

Za razliku od prethodno opisanih klasičnih ukrštenih sindroma moždanog stable, interpretacija Schmidtovog sin-droma (ipsilateralno oštećenje lobanjskih živaca IX, X, XI, XII udruženo sa kontralateralnom hemiparezom) i Vernetovog sindroma (ipsilateralna lezija nn. IX, X, XI sa kontralateral-nom hemiparezom) je problematična. Analiza istorijskih opi-sa i savremena istraživanja ukazuju da se radi o ekstracere-bralnom oštećenju više kranijumskih živaca, bez oštećenja moždanog stabla, tj. da ovi entiteti zapravo ne postoje kao al-terni sindromi (2, 54).

Smatra se da je klinički značaj većine ukrštenih sin-droma moždanog stabla, izuzev Wallenbergovog sindroma, danas ograničen uglavnom na neurološke centre (2). Ishemija moždanog stabla najčešći je uzrok akutnih oštećenja ove strukture. Većina navedenih sindroma je originalno opisana kao posledica infarkta moždanog stabla.

Pravilo 4Gates (55) je predložio jednostavan način za postavlja-

nje dijagnoze i određivanja lokalizacije oštećenja moždanog stabla.

1. Postoje 4 strukture u srednjoj liniji koje počinju sa slovom „M“Motorni put: kontralateralna slabostMedijalni lemniskus (kontralateralni gubitak vibracij-skog i proprioceptivnog senzibiliteta ruke i noge)Medijalni longitudinalni snop (internukleusna oftal-moloplegija sa iste strane)Motorno jedro lobanjskog živca (ipsilateralni gubitak funkcije zahvaćenog nerva)

24



2. Postoje 4 strukture sa lateralnim položajem koje počinju slovom „S“Spinocerebelarni putSpinotalamički put (kontralateralna izmena senzibili-teta za bol i temperaturu ruke i noge)Senzitivno jedro n V (ipsilateralna izmena senzibilite-ta za bol i temperaturu lica)Simpatički put (ipsilateralni Hornerov sindrom)

3. U produženoj možini su 4 živca, u ponsu su 4 i iznad mosta su 4 (2 su u srednjem mozgu)

4. U srednjoj liniji su 4 motorna jedra n.III, n.IV, n.VI i n.XII. U lateralnom moždanom stablu su jedra n.V, n.VII, n.IX i n.XI.

Literatura1. Querol-Pascual MR. Clinical Approach to Brainstem

Lesions. Semin Ultrasound CT MRI 2010; 31:220-9.2. Marx JJ, Thomke F. Classical crossed brain stem syndro-

mes: myth or reality? J Neurol 2009;256: 898-903.3. Radojčić B. Ukršteni sindromi moždanog stabla. U:

Klinička neurologija. XVI izdanje. Elit Medica, Beograd 2006:426-30.

4. Silverman IE, Liu GT, Volpe NJ, Galetta SL. The Crossed Paralyses. The original brain-stem syndromes of Millard-Gubler, Foville, Weber, and Raymond-Cestan. Arch Neurol 1995; 52: 635-8.

5. Weber H. A contribution to the pathology of the crura ce-rebri. Medico Chirurg Trans 1863;46: 121-39.

6. Umasankar U, Huwez FU. A patient with reversible pupi-l-sparing Weber’s syndrome. Neurology India, 2003; 51 (3): 388-9.

7. Breen LA, Hopf HC, Farris BK, et al. Pupil-sparing oculo-motor nerve palsy due to midbrain infarction. Arch Neurol 1991;48: 105-6.

8. Algin DI, Taser F, Aydin S, Aksakalli E. Midbrain infarc-tion presenting with Weber’s syndrome and central facial palsy: a case report. Arch Neuropsychiatry 2009; The Free Library -a0216041552

9. Kumral E, Bayulkem G, Akyol A, et al. Mesencephalic and associated posterior circulation infarcts. Stroke. 2002; 33:2224-31

10. Singh NN, Verma R, Pankaj BK, Misra S. Neurocysticercosis presenting as Weber’s syndrome: As short report. Neurol India 2003;51:551-2.

11. Sitthinamsuwan B, Nunta-aree S, Sitthinamsuwan P, Suwanawiboon B, Chiewvit P. Two patients with rare cau-ses of Weber’s syndrome. J Clin Neurosci 2011;18: 578-9.

12. Duncan GW, Weindling SM. Posterior cerebral artery ste-nosis with midbrain infarction. Stroke 1995;26: 900-2.

13. Akdala G, Kutluka K, Menb S, Yaka E. Benedikt and “plus–minus lid” syndromes arising from posterior cere-bral artery branch occlusion. J Neurol Sci 2005;228: 105-7.

14. Claude H. Syndrome pédonculaire de la région du noyau rouge. Revue Neurologique 1912; 1: 311–313.

15. Brazis PW. The Brainstem. In: Brazis PW, Masdeu JC, Biller J. (eds): Localization in Clinical Neurology (ed 5). Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkins, 2007: 827-870.

16. Song TJ, Suh SH, Cho H, Lee KY. Claude’s Syndrome Associated with Neurocysticercosis. Yonsei Med J 2010; 51(6):978-9.

17. Serrano-Pozo A, Montes-Latorre E, Gonzalez-Marcos JR, Gil-Peralta A. Cardiac embolism in a Claude’s syndrome without involvement of the red nucleus. European Journal of Neurology 2007, 14, e1–e2.

18. Parinaud H. Paralysis of the movements of convergence of the eyes (trans Henry Juler). Brain 1886; 9:330–41.

19. Pieŕrot-Deseilligny Ch, Chain F, Gray F, Serdaru M, Escourolle R, Lhermitte F. Parinaud’s syndrome. Brain (1982) 105 (4): 667-96.

20. Bhola R, Keech RV, Olson RJ: Dorsal Midbrain Syndrome (Parinaud’s Syndrome) with Bilateral Superior Oblique Palsy: 43 year-old male referred for evaluation of binocu-lar diplopia. 2005, http://webeye.ophth.uiowa.edu/eyefo-rum/case21.htm.

21. Millard A. Extrait du rapport de M. Millard sur les obser-vations précédentes. Bull Soc Anat Paris 1856;31:217-21.

22. Gubler A.De l’hémiplégie alterne envisagée comme signe de lésion de la protubérance annulaire et comme preuve de la décussation des nerfs faciaux. Gaz Hebdomadaire Med Chirurg. 1856;3: 749-54, 789-92, 811-6.

23. Kesikburun S, Safaz I, Alaca R. Pontine Cavernoma Hemorrhage Leading to Millard-Gubler Syndrome. Am J Phys Med Rehabil 2011:263 10.1097/PHM.0b013e3181e29e8e

24. Onbas O, Kantarci M, Alper F, et al: Millard-Gubler syn-drome: MR findings. Neuroradiology 2005; 47: 35Y7

25. Sharif M, More V, Purandare S. Brainstem Tuberculoma – Presenting as Millard Gubler

26. Syndrome. Indian J Pediatrics, 2010; 77: 707.27. Foville A. Note sur une paralysie peu connue de certains

muscles de l’oeil, et sa liaison avec quelques points de l’a-natomie et la physiologie de la protubérance annulaire. Bull Soc Anat Paris 1858;33:393-414.

28. Hubloue I, Laureys S, Michotte A. A rare case of diplopia: medial inferior pontine syndrome or Foville’s syndrome. Eur J Emerg Med 1996; 3(3):194-8.

29. Nakaso K, Sasaki K. Fluctuating Foville’s Syndrome Caused by a Pontine Angioma in a Patient with a Polycystic Kidney. Inter Med 2009; 48: 1335-6.

30. Raymond F. Concerning a special type of alternating he-miplegia; in Leçons sur les maladies nerveuses. 1894-1895, Ire ser. Paris, Ricklin & Soques, 1896; 365-83.

31. Raymond F, Cestan R. Le syndrome protubérantiel supéri-eur. Gaz Hop Paris 1903;76: 829-34.

32. Ogawa K, Suzuki Y, Kamei S. Two patients with abducens nerve palsy and crossed hemiplegia (Raymond syndrome). Acta Neurol. Belg 2010;110: 270-1.

33. Satake M, Kira J, Yamada T, Kobayashi T. Raymond syn-drome (alternating hemiplegia) caused by a small haema-toma at the medial pontomedullary junction. J Neurol Neurosurg Psychiatry 1995;57: 261.

34. Gasperini U. Di un caso di emorragia protuberenziale. Contributo clinico allo studio delle sindromi pontine infe-riori. Rif Med 1912;28: 880-3, 898-905.

25



35. Hayashi-Hayata M, Nakayasu H, Doi M, Fukada Y, Murakami T, Nakashima K. Gasperini syndrome, a report of two cases. Intern Med 2007;46: 129-33.

36. Krasnianski M, Muller T, Zierz S, Winterholler M. Gasperini syndrome as clinical manifestation of pontine demyelination. Eur J Med Res 2009;14: 413-4.

37. Vesza Z, Varallyay G, Szoke K, Bozsik G, Manhalter N, Bereczki D, Ertsey C. Trigemino-autonomic headache re-lated to Gasperini syndrome. J Headache Pain 2010; 11: 535-8.

38. Wallenberg A. Acute Bulbäraffektion (Embolie der Arteria cerebelli posterior inferior sinistra?) Archives fur Psychiatry 1895; 27:504-40.

39. Pearce JMS. Wallenberg’s syndrome. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2000;68 (5):570 doi:10.1136/jnnp.68.5.570

40. Kim JS. Pure lateral medullary infarction: clinical and ra-diological correlation of 130 acute, consecutive patients. Brain 2003;126: 1864-72.

41. Yeh HF, Seak CJ, Chiu TF, Chang YC. Traumatic verte-bral artery dissection and Wallenberg syndrome after a motorcycle collision. Am J Emerg Med 2009;27: 131.e1-131.e3

42. Qiu W, Wua JS, Carroll WM, Mastaglia FL, Kermode AG. Wallenberg syndrome caused by multiple sclerosis mimic-king stroke. J Clin Neurosci 2009;16:1700-2.

43. Gil R. Pathologie vasculaire cérébrale. In: Neurologie po-ur le praticien. SIMEP, Paris, 1989: 271-292.

44. Zhang SQ, Liu MY, Wan B, Zheng HM. Contralateral Body Half Hypalgesia in a Patient with Lateral Medullary Infarction: Atypical Wallenberg Syndrome. Eur Neurol 2008;59: 211–5.

45. Nowak DA, Topka HR. The clinical variability of Wallenberg’s syndrome. The anatomical correlate of ipsi-lateral axial lateropulsion. J Neurol 2006;253: 507-11.

46. MacGowan DJL, Janal MN, Clark WC, et al. Central post-stroke pain and Wallenberg’s lateral medullary infarction:

Frequency, character and determinants in 63 patients. Neurology 1997;49:120-5.

47. Ordas CM, Cuadrado ML, Simal P, et al. Wallenberg’s syndrome and symptomatic trigeminal neuralgia. J Headache Pain 2011;12: 377-80.

48. Norrving B, Hydén D. New aspects of Wallenberg syndro-me and other brain stem infarctions. Lakartidningen 2004;101(36):2728-30, 2732, 2734.

49. Duberkar D, Khurana D, Gupta V, Prabhakar S. Sudden death in a case of lateral medullary syndrome. Neurol India 2009;57: 225-6.

50. Kameda W, Kawanami T, Kurita K, Daimon M, Kayama T, Hosoya T, Kato T. Lateral and Medial Medullary Infarction : A Comparative Analysis of 214 Patients. Stroke 2004;35: 694-9.

51. Babinski J, Nageotte J. Hemiasynergie, lateropulsion et myosis bulbaires avec hemianesthesie et hemiplegie croi-sees. Rev Neurol (Paris) 1902;10: 358-65.

52. Irie F, Toyoda K, Hagiwara N, Fujimoto S, Okada Y. Babinski-Nageotte Syndrome due to Vertebral Artery Dissection. Int Med 2003;42: 871-4.

53. Nakane H, Okada Y, Sadoshima S, Fujishima M. Babinski-Nageotte syndrome on magnetic resonance imaging. Stroke. 1991;22: 272-5.

54. Tada M, Tada M, Ishiguro H, Hirota K. Babinski-Nageotte Syndrome With Ipsilateral Hemiparesis. Arch Neurol 2005;62: 676-7.

55. Krasnianski M, Neudecker S, Zierz S. The Schmidt and Vernet classical syndrome. Alternating brain stem syndro-mes that do not exist? Nervenarzt 2003;74(12):1150-4.

56. Gates P: The rule of 4 the brainstem; a simplified method for understanding brainstem anatomy and brainstem va-scular syndromes for the non-neurologist. Intern Med J 2005; 35:263-6.

26



Antidepresivi su heterogena grupa lekova u svakom pogledu–prema hemijskoj strukturi, farmakokinetici i farma-kodinamiji, kao i kliničkoj efikasnosti i bezbednosti. Veoma se široko koriste, što je i razumljivo, s obzirom na to da 10–15% populacije oboli od nekog oblika depresije ili anksioznos-ti, dakle, poremećaja za čije lečenje se antidepresivi i koriste. Lečenje antidepresivima sve više uključuje i druge specijal-nosti osim psihijatara. Tokom devedesetih, publikovano je više radova u kojima su trovanja antidepresivima činila 8–12% svih trovanja i skoro jednu trećinu trovanja sa smrtnim ishodom (1, 2).

Antidepresivi se dele na više grupa (3): ○ Inhibitori preuzimanja monoamina

• selektivni inhibitori preuzimanja serotonina (5-HT): fluoksetin, fluvoksamin, paroksetin, sertralin, vilazodon, citalopram i escitalopram;

• klasični triciklični antidepresivi: imipramin, dezipra-min, amitriptilin, nortriptilin, klomipramin;

• noviji selektivni inhibitori preuzimanja noradrenalina i serotonina: venlafaksin, dezvenlafaksin, duloksetin i milnacipran;

• inhibitori preuzimanja noradrenalina: bupropion, re-boksetin, atomoksetin;

• biljni preparati kantariona čiji je aktivni sastojak hiper-forin;

○ Antagonisti receptora za monoamine (adrenergički alfa2 i/ili serotoninski 5HT2)• mirtazapin, trazodon, mianserin;

○ Inhibitori monoaminooksidaze• ireverzibilni, nekompetitivni (fenelzin, tranilcipromin);• reverzibilni, selektivni MAO-A (npr. moklobemid).

Svi antidepresivi deluju na efekte noradrenalina (nor-epinefrina) i serotonina (5-HT) u mozgu. Njihove najvažnije karakteristike date su u Tabeli 11.

TR ICIK LIČNI A NTI DEPR ESI V ITrovanja triciklični antidepresivima (TCA) bila su do

pre dvadeset godina jedan od vodećih uzroka trovanja sa smrtnim ishodom, kada je samoubilačko2 trovanje u pitanju (7–10). Zahvaljujući efikasnosti, ovi lekovi se koriste i dalje,

1 Problemi vezani za upotrebu lekova obuhvataju i neželjene reakcije (javljaju se u terapijskim dozama) i trovanja (nasta-ju pri predoziranju, odnosno preko praga toksičnosti).

2 Trovanja mogu biti zadesna, samoubilačka ili ubilačka.

pa se i trovanja TCA sreću u toksikološkoj praksi3. Inače, ovi lekovi se koriste u lečenju velike depresije, anksioznosti, po-remećaja hiperaktivnosti i deficita pažnje, učestalog noćnog mokrenja kod dece, kao i hroničnog bola. U SAD 2010.g. tro-vanja TCA činila su 3% svih trovanja sa smrtnim ishodom.

Podaci iz SAD (2004. godina) govore sledeće (na ukupno oko 293 miliona stanovnika): bilo je ukupno 12234 trovanja antidepresivima, a od toga 7430 trovanja amitriptili-nom, 185 – dezipraminom, 1288 – doksepinom, 815 – imipra-minom, 1152 – nortriptilinom, 26 – protriptilinom, kao i 1152 – drugim i/ili nepoznatim antidepresivima i 182 trovanja kombinacijama cikličnih antidepresiva sa benzodiazepinima i fenotiazinima. Trovanja dece do 6 godina bila su zastupljena sa 9%, a zadesna trovanja sa 32%. Tri četvrtine svih zabeleže-nih trovanja antidepresivima te godine bila su lečena u zdrav-stvenim ustanovama.

Visoka stopa prijavljivanja ovih trovanja govori o nji-hovom toksičnom potencijalu. Prvi slučajevi trovanja antide-

3 Lečenje akutnih trovanja obuhvata niz postupaka koje treba da izvodimo određenim redosledom:

• Prvo, sprečavamo dalju resorpciju otrova (iznosimo otrova-nog iz zatrovane prostorije, skidamo mu odeću natopljenu otrovom i sl.). Odmah započinjemo i sa simptomatskom te-rapijom, odnosno spasavamo život otrovanog tako što mu održavamo vitalne funkcije (suportivna terapija).◦ Pre svega, obezbeđujemo disanje (čistimo disajne puteve,

okrećemo otrovanog u bočni položaj, a ako je potrebno, sprovodimo i veštačko disanje ili povezujemo pacijenta na respirator).

◦ Zatim, održavamo arterijski pritisak i borimo se protiv šoka (infuzije tečnosti i vazoaktivni lekovi, nr. adrenalin ili dopamin).

◦ Takođe, štitimo mozak infuzijama rastvora glukoze, kori-gujemo acidozu rastvorima bikarbonata, održavamo tele-snu temperaturu i diurezu dr.

• Drugo, dalje sprečavamo resorpciju otrova (ispiramo želu-dac i sl.), ubrzavamo njegovu eliminaciju (mokraćom ili sto-licom) i primenjujemo antidote (lekove koji specifično spre-čavaju dejstvo određenih otrova. Nažalost, specifičnih anti-dota je malo, a otrova mnogo.

• Treće, sprovodimo dalje simptomatsku terapiju i pomažemo oporavak otrovanog. Ovde možemo primeniti antibiotike ako postoji opasnost od upale pluća, davanje analgetika i antiemetika i dr.

U Srbiji, svi otrovani se što pre transportuju u Centar za kontrolu trovanja na Vojnomedicinskoj akademiji. Važno je spasiti im život dok ne stignu do tog centra. Dakle, prva grupa mera (sprečavanje dalje resorpcije otrova i održava-nje vitalnih funkcija) je zadatak svih koji pronađu otrovane, a specifične mere će sprovesti stručnjaci za trovanja.

TROVANJE ANTIDEPRESIVIMAProf. dr Zoran Todorović

Institut za farmakologiju, kliničku farmakologiju i toksikologijuMedicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu

27



Tabe

la 1

. Naj

važn

ije k

arak

teris

tike

odab

rani

h an

tidep

resiv

a (N

06A

gru

pa le

kova

pre

ma

ATC

kla

sifik

aciji

) (4–

6)

АТC

ko

d,

inte

rnac

iona

lni

neza

štić

eni

nazi

v (I

NN

) i

uobi

čaje

na d

nevn

a do

zaa

Am

ini

na

koje

lek

de-

luje

Než

elje

ni e

fekt

i

Agi

tiran

ost

Kon

vulz

ijeSe

daci

jaH

ipot

enzi

jaA

ntim

uska

r. de

jstv

oG

I teg

obe

Pov

ećan

je

TM

Sek

sual

na

funk

cija

Cen

tra

lni

efek

tiN

06A

A N

esel

ektiv

ni in

hibi

tori

pre

uzim

anja

sero

toni

naN

06A

A04

klo

mip

ram

in10

0–20

0 m

g/da

nN

E, 5

-HT

03+

2+2+

3++

2+3+

3+

N06

AA

09 a

mitr

iptil

in10

0–20

0 m

g/da

nN

E, 5

-HT

02+

3+3+

3+0/

+2+

2+3+

N06

AA

21 m

apro

tilin

100–

150

mg/

dan

NE

0/+

3+2+

2+2+

0/+

+2+

2+

N06

AB

Sel

ektiv

ni in

hibi

tori

pre

uzim

anja

sero

toni

na

N06

AB

03 fl

uoks

etin

20–4

0 m

g/da

n5-

HT

+0/

+0/

+0

03+

0/+

3+0/

+

N06

AB

04 c

italo

pram

20–4

0 m

g/da

n5-

HT

0/+

00/

+0

03+

03+

0

N06

AB

05 p

arok

setin

20–4

0 m

g/da

n5-

HT

+0

0/+

00/

+3+

03+

0

N06

AB

06 se

rtra

lin10

0–15

0 m

g/da

n5-

HT

+0

0/+

00

3+0

3+0

N06

AB

08 fl

uvok

sam

in10

0–20

0 m

g/da

n5+

HT

00

0/+

00

3+0

3+0

N06

AB1

0 es

cita

lopr

am10

–20

mg/

dan

5-H

T0/

+0

0/+

00

3+0

3+0

N06

AX

Ost

ali a

ntid

epre

sivi

N06

AX

05 tr

azod

on15

0–20

0 m

g/da

n5-

HT

00

3+0

02+

++

0/+

N06

AX

11 m

irta

zapi

n15

–45

mg/

dan

5-H

T, N

E0

04+

0/+

00/

+0/

+0

0

N06

AX

12 b

upro

pion

200–

300

mg/

dan

DA

, ?N

E3+

4+0

00

2+0

00

N06

AX

14 ti

enep

tin37

,5 m

g/da

nN

06A

X16

ven

lafa

ksin

75–2

25 m

g/da

n5-

HT,

NE

0/+

00

00

3+0

3+0/

+

N06

AX

21 d

ulok

setin

80–1

00 m

g/da

nN

E, 5

-HT

+0

0/+

0/+

00/

+0/

+0/

+0/

+

28



presivima zabeleženi su ubrzo po njihovom uvođenju u klinič-ku praksu. Kada su triciklični antidepresivi u pitanju, rezulta-ti nisu jednoznačni, ali neke studije govore o većoj toksičnosti amitriptilina, imipramina i dezipramina u odnosu na protrip-tilin (mereno stopama smrtnosti kod trovanja ovim lekovima).

Ovi lekovi inhibiraju preuzimanje noradrenalina i se-rotonina. Dele se na sekundarne amine (više deluju na preuzi-manje noradrenalina) i tercijerne amine (u većoj meri blokira-ju preuzimanje serotonina). Osim blokade preuzimanja neuro-transmitera, oni ispoljavaju i brojna druga farmakološka dej-stva: blokiraju muskarinske, alfa-adrenergičke i histaminske receptore. Posebno, mogu delovati toksično na kardiovasku-larni sistem. Kardiotoksičnost, koja je dominantna kada je trovanje ovim lekovima u pitanju, nastaje zbog blokade natri-jumskih kanala („stabilizacija membrane“ ekscitabilnih tki-va), kao i dejstva na alfa-adrenergičke i muskarinske recepto-re. Manifestuje se teškom hipotenzijom, poremećajima spro-vodljivosti i srčanim aritmijama. Blokada natrijumskih kana-la i nulte faze akcionog potencijala u većoj meri pogađa desnu granu sa pomeranjem srčane osovine u desno, pošto je refrak-torni period desne grane duži nego kada je leva grana u pita-nju. Stoga, nastaje produženje PQ intervala zbog smetnji u sprovođenju impulsa, kao i proširenje QRS kompleksa. Takođe, TCA blokiraju i treću fazu akcionog potencijala, po-što blokiraju izlaznu struju kalijuma (deluju na podvrstu vol-tažnih kalijumskih kanala) i tako dovode do produženja QTc intervala u EKG-u. Teorijski, produženje QTc intervala može izazvati komorske aritmije po tipu torsades des pointes (tor-sade), ali se ovo u praksi retko sreće; TCA dovode do tahikar-dije, a torsade nastaju u uslovima bradikardije.

Hipotenzija je najčešći uzrok smrti kod trovanja TCA. Nastaje zbog blokade alfa-adrenergičkih receptora u krvnim sudovima, a pogoršavaju je hipoksija, acidoza i hipovolemija. U početku, hipertenzija i tahikardija kao posledica inhibicije preuzimanja noradrenalina mogu da preovladaju, ali kasnije nastaje refraktarna hipotenzija.

Sinusna tahikardija kod trovanja TCA posledica je in-hibicije preuzimanja noradrenalina, kao i blokade muskarin-skih receptora. Ova tahikardija praćena je proširenjem QRS kompleksa zbog usporenog anterogradnog sprovođenja im-pulsa. Neravnomerno sprovođenje impulsa vodi nastanku re-entry fenomena.

Neurološke tegobe u vidu agitiranosti i delirijuma po-sledica su blokade muskarinskih receptora. Međutim, u na-stanku konvulzija, do kojih obično dolazi 1–2 sata po unoše-nju veće doze TCA, učestvuju brojni mehanizmi: inhibicija preuzimanja noradrenalina, interakcija sa NMDA i GABA receptorima, blokada dopaminskih i muskarinskih receptora, kao i blokada natrijumskih kanala. Takve konvulzije mogu izazvati tešku metaboličku acidozu (potencira kardiotoksič-nost), rabdomiolizu, hipertermiju i akutnu bubrežnu insufici-jenciju.

Trovanje TCA prate i plućne tegobe, sve do akutne re-spiratorme insufijencije, aspiracionog pneumonitisa i akutnog respiratornog distres sindroma (ARDS). Takođe, prilikom trovanja TCA može nastati i hipertermija, kao i druge posle-dice blokade muskarinskih receptora (npr. suvoća usta). Osim toga, antimuskarinska dejstva ispoljavaju se i u sistemu za va-renje. Usporava se crevna peristaltika i vreme pražnjenja že-

luca, što ima za posledicu varijacije u vremenu potrebnom za resorpciju oralno unetog leka i pojavu odložene toksičnosti na TCA. Spora resorpcija, veliki volumen distribucije (10–50 l/kg) i enterohepatička recirkulacija matičnog leka i njegovih metabolita značajno utiču na produženu toksičnost ovih leko-va. Kod predoziranja, poluvreme eliminacije amitriptilina iz-nosi prosečno 37 h, a obično je i duže od 60 h. S druge strane, kada je dezipramin u pitanju, pedijatrijska studija na deci ra-zličitog uzrasta pokazala je da jedna doza ovog leka od 3,75 mg/kg dovodi do serumskih koncentracija leka od 45 mikro-g/l, a klirens dezipramina od 0,74 l/kg/h ne zavisi znatno od starosti ili pola.

Prag toksičnosti TCA kod akutnog trovanja obično iz-nosi oko 1000 mg, ali doza može da značajno varira. Tako, imipramin može dovesti do zastoja srca u dozi od 200 mg, kao i 300 mg amitriptilina (zabeležen infarkt miokarda u toj dozi, kod pacijentkinje koja je istovremeno unela i 80 mg diazepa-ma). Takođe, 1000 mg imipramina je doza koja je imala letal-ni ishod, a 600 mg klomipramina – koja je dovela samo do blagih toksičnih efekata. Osim toga, 500–750 mg amitriptili-na izazivalo je srednje teške ili teške toksične efekte kod otro-vanih.

Kod hroničnog trovanja 3 mg/kg/dan klomipramina ili dezipramina dovodilo je do promena u EKG-u (produženje PQ, QRS i QTc intervala. U principu, hronična primena 0,75–5 mg/kg imipramina, amitriptilina ili dezipramina dovela je do promena na EKG-u manjeg stepena, kao i do blažih pore-mećaja srčanog ritma i arterijskog pritiska. Ipak, čak i hronič-na primena terapijskih doza TCA dovodila je do iznenadne smrti i drugih kardiovaskularnih komplikacija kod dece razli-čitog uzrasta.

Dijagnoza ovog trovanja postavlja se na osnovu anam-neze i fizikalnog nalaza. Laboratorijske vrednosti (merenje koncentracija TCA u krvi) uglavnom nije dostupno, a određi-vanje koncentracija leka u krvi nema uvek prediktivnu vred-nost za ishod trovanja. Kod pacijenata sa hipoksijom i hipo-ventilacijom obavezno je proceniti acido-bazni status i odre-diti gasove u krvi. Pri prijemu u centar za lečenje trovanja, obavezno je odmah zabeležiti EKG, u cilju procene rizika od trovanja. Kod trovanja TCA, QRS može biti duži od 100 ms, a osa je pomerena u desno (negativan R u I, a pozitivan u aVF odvodu).

Lečenje t rovanja TCAPre svega, mora se obezbediti prohodnost disajnih pu-

teva, a intubacija je neophodna svima čiji je skor po Glazgov koma skali manji ili jednak 8 i nekim pacijentima sa ovim skorom većim od 8.

U prehospitalnom zbrinjavanju otrovanih od TCA ve-rovatno pomaže medicinski ugalj koji sprečava dalju resorpci-ju otrova ukoliko se primeni pravovremeno (jedna doza; deca mlađa od 1 god. 10–25 g; deca stara 1–12 god. 25–50 g; deca starija od 12 god. i odrasli 25–100 g). Međutim, teško je done-ti konačni zaključak bez odgovarajućih poređenja. Jedan gram medicinskog uglja vezuje 318 g nortriptilina, a 5 g me-dicinskog uglja, datog per os pola sata posle primene 75 mg nortriptilina smanjivalo je njegove maksimalne koncentracije u krvi za 60% u studiji na zdravim dobrovoljcima. U sličnoj studiji, 10 g medicinskog uglja dovelo je do smanjenja maksi-

29



malnih koncentracija istog leka za 77% kada je primenjen po-la sata posle nortriptilina, za 37% kada je dat posle 2 h, a za 19% ukoliko je medicinski ugalj primenjen posle 4 h. Istovremeno, biološka raspoloživost nortriptilina smanjivana je za 74%, 38% i 13% (medicinski ugalj – dat posle 30 min, 2 h, odnosno 4 h). Slični su podaci i za druge TCA: postoji do-zno- i vremenski-zavisno dejstvo medicinskog uglja na far-makokinetičke parametre TCA. U zaključku, medicinski uga-lj se primenjuje najviše jedan sat posle trovanja, i to kod paci-jenata kod kojih su disajni putevi intaktni ili je prohodnost obezbeđena. Takođe, ne treba ponavljati primenu medicin-skog uglja kod istog pacijenta. Slično se može reći i za ispira-nje želuca, mada je dokaza za efikasnost tog postupka manje nego za medicinski ugalj: do 1 h posle trovanja i uz obezbeđe-nu prohodnost/zaštićene disajne puteve.

Postoje dokazi iz pretkliničkih i kliničkih studija o ko-risnom delovanju natrijum bikarbonata kod trovanja TCA, pa se preporučuje intravenska primena njegovog hipertonog ras-tvora (deca i odrasli: 1–2 mEq/kg, ponavljati po potrebi) u ci-lju alkalizacije krvi otrovanih (do pH krvi od 7,45–7,55). Time se povoljno deluje na srčane aritmije i konvulzije. Ove prepo-ruke u najvećoj meri važe za pacijente koji su otrovani TCA i imaju hipotenziju opasnu po život ili srčane aritmije koje su potvrđene na EKG-u.

Preporučuje se i primena diazepama (odrasli: 5–10 mg, sporo i.v., maksimalna brzina do 5 mg/min, po potrebi pona-vljati na 5–10 min; deca: 0,1–0,3 mg/kg, ukupna doza do 10 mg, sporo i.v., 5 mg/min, po potrebi ponavljati na 5–10 min) u cilju lečenja konvulzija4, ukoliko ne pomogne infuzija natri-jum bikarbonata, kao i lečenje aritmija lidokainom.

Hipotenzija se leči nadoknadom tečnosti, a nekada je potrebna i primena vazoaktivnih lekova kao što je dopamin.

Smatra se takođe da kod asimtomatskih pacijenata čije je trovanje bilo zadesno i nastalo pre više od 6 h može da se preporuči da budu pod nadzorom u kućnim uslovima. S druge strane, posebna opreznost i nadzor pri prijemu u centar za kontrolu trovanja preporučuje se ukoliko se kod otrovanih ja-ve vrtoglavica, sinkopa, konvulzije, bolovi u grudima, opšta slabost i otežano disanje, kao mogući znaci ozbiljnog trovanja TCA. Takođe, opreznost je potrebna kod pacijenata sa komor-biditetima (npr. neurološke bolesti, kao što je epilepsija ili kar-diološke bolesti kao što je terminalna srčana insuficijencija) ili komedikacijom (npr. drugi psihofarmaci ili kardiološki le-kovi koji stupaju u potencijalne interakcije sa TCA i pogorša-vaju kardiološke ili neurološke znake trovanja TCA).

Primena lekova sa emetičkim delovanjem (npr. sirup ipekakuane) ili korišćenje flumazenila (antidot kod trovanja benzodiazepinima), smatra se kontraindikovanom kod otro-vanih TCA. Takođe, ne preporučuje se korišćenje antiaritmi-ka iz Ia i Ic grupe, kao i iz II i IV grupe. Fenitoin se više ne koristi kod trovanja TCA. Takođe, ne primenjuje se ni fizo-stigmin.

SELEKTI V NI I NHIBITOR I PR EUZIM A NJA SEROTONI NA

U SAD je 2004. bilo 48204 slučajeva trovanja selektiv-nim inhibitorima preuzimanja serotonina (SSRI – selective serotonin reuptake inhibitors) na oko 293 miliona stanovnika

4 Koriste se i lorazepam, fenobarbiton i midazolam.

(10, 11). Od toga, hospitalno je bilo zbrinuto oko 65% slučaje-va i bilo je 17% dece mlađe od 6 godina.

Ovi lekovi se koriste u terapiji depresije, bulimije i op-sesivno-kompulzivne bolesti.

Trovanje prate: mučnina, povraćanje,depresija CNS-a, pospanost, vrtoglavica, sinusna tahikardija, tremor i zamuće-nje vida. Retki slučajevi po život opasnih trovanja ovim leko-vima zabeleženi su u dozama koje su bile 50 puta veće od preporučenih i bili su praćeni konvulzijama, produženjem QTc intervala, poremećejm svesti i pojavom serotoninskog sindroma5.

Trovanje SSRI mogu da prate sledeći poremećaji, po sistemima:

○ Kardiovaskularni sistem – blok grane, srčani blok, hipo- ili hipertenzija, sinusna bradikardija ili tahikardija, palpitaci-je, proširenje QRS kompleksa (posebno kod trovanja cital-opramom i escitalopramom), produženje QTc intervala, supraventrikularne tahikardije, ventrikularne tahikardije po tipu torsada i dr.

○ Centralni nervni sistem – agitiranost, antiholinergički efekti (retko), anksioznost, depresija CNS-a (češće), koma, konfuzija, poremećaj koordinacije, delirijum, vrtoglavica, pospanost, glavobolja, hiperaktivnost, hipertermija, hipo-manija, nesanica, neuroleptički maligni sistem, sedacija, konvulzije, somnolencija i dr.

○ Endokrine i metaboličke tegobe – serotoninski sindrom, kao i hipoglikemija i hiponatremija (ređe).

○ Gastrointestinalni sistem – bol u trbuhu, dijareja, dispep-sija, mučnina, povraćanje (oba – češće) i suvoća usta.

○ Krv i krvotvorni organi – diseminovana intravaskularna koagulacija (retko).

○ Nervi, mišići i kosti – klonus, diskinezija, hiperrefleksija, povišen tonus, mioklonus, rabdomioliza (ređe), rigiditet, tremor (češće).

○ Oči – zamućen vid, midrijaza. ○ Ostalo – pojačano znojenje.

Do trovanja SSRI dolazi zbog inhibicije preuzimaja serotonina, dok ovi lekovi minimalno deluju na preuzimanje noradrenalina i dopamina. Kod akutnog trovanja SSRI obično nema blokade alfa-adrenergičkih, dopaminskih i histamin-skih receptora, mada se nekada mogu javiti blagi antiholiner-gički efekti. Serotoninski sindrom verovatno nastaje zbog prekomerne stimulacije 5-HT2A receptora, a rizik je veći kod pacijenata koji uzimaju istovremeno lekove koji potenciraju efekte SSRI, kao i onih koji se hronično leče ovim lekovima. Citalopram se metaboliše do dezmetilcitaloprama (DCT) i di-dezmetilcitaloprama (DDCT). Na produženje QTc intervala i proširenje QRS kompleksa, kao i pojavu torsada najviše utiče upravo DDCT koji je dozno-zavisno kardiotoksičan.

5 Stanje opasno po život, sa kognitivnim (glavobolja, agitira-nost, hipomanija, konfuzija, halucinacije, koma), autonom-nim (drhtavica, preznojavanje, hipertermija, hipertenzija, tahikardija, mučnina, povraćanje) i somatskim tegobama (mioklonus, hiperrefleksija, tremor). Takođe, javljaju se i midrijaza, tahikardija, hipertermija i hipertenzija. Nastaje brzo, nekoliko minuta posle unošenja lekova koji ga izazi-vaju, a posebno je opasna kombinacija inhibitora monoami-nooksidaze i selektivnih inhibitora preuzimanja serotonina.

30



Dijagnoza se postavlja na osnovu anamneze i fizikal-nog nalaza, dok specifičnog laboratorijskog testa nema. Na trovanje SSRI ukazuje pojava klonusa (inducibilnog, sponta-nog, okularnog), agitiranosti, prekomernog znojenja, tremora i hiperrefleksije.

Lečenje t rovanja SSR IPre svega, potrebno je zbrinuti vitalne funkcije (disa-

nje, cirkulacija), kao i kod svakog trovanja. Trovanje SSRI u najtežim slučajevima može da prati depresija CNS-a, srčane aritmije, serotoninski sindrom i konvulzije.

Ispiranje želuca i medicinski ugalj (jedna doza; deca mlađa od 1 god. 10–25 g; deca stara 1–12 god. 25–50 g; deca starija od 12 god. i odrasli 25–100 g) pomažu ukoliko se pri-mene do 1 h posle unošenja leka. Međutim, ne preporučuje se rutinska primena ovih mera kod svih pacijenata otrovanih SSRI zbog nedostatka ubedljivih dokaza o efikasnosti. Upotreba emetika je kontraindikovana kod ovih bolesnika.

Lečenje serotoninskog sindroma treba da počne što pre i da bude individualno, prema pacijentu. za agitiranost se ko-riste benzodiazepini. Kod vegetativnih tegoba pomažu isti lekovi. Posebno, kod hipertenzije i tahikardije koriste se leko-vi sa kratkim delovanjem (npr. nitroprusid i esmolol), a ne oni sa dužim delovanjem mogu dovesti do hipotenzije i šoka. U cilju nadoknade tečnosti daju se kristaloidni rastvori i.v. U te-rapiji hipertermije ne pomažu antipiretici, već se koriste ben-zodiazepini, akod refraktarnih hipertermija (preko 41,1oC) daju se nedepolarizirajući miorelaksansi i primenjuje intuba-cija; slično pomaže i kod rigiditeta muskulature. Osim toga, za hipertermiju se primenjuje i spoljašnje hlađenje. Za pojača-nu serotonisku stimulaciju pomažu antagonisti – npr. cipro-heptadin, hlorpromazin (može dovesti do ortostatske hipoten-zije, pogoršati hipertermiju ili sniziti prag za nastajanje kon-vulzija), kao i olanzapin. Za lečenje konvulzija koristi se dia-zepam (iste doze kao i kod trovanja TCA, v. prethodni tekst), lorazepam, fenobarbiton ili midazolam. Infuzije natrijum bi-karbonata mogu pomoći kod poremećaja u sprovođenju im-pulsa u srcu, a doze i režim doziranja se ne razlikuju od nave-denog za trovanje TCA6.

Asimptomatski slučajevi ili pacijenti sa blagim tegoba-ma koji su uneli do 5 puta veće doze SSRI od preporučenih za odrasle (npr. citalopram 100 mg, escitalopram 50 mg, fluokse-tin 100 mg, fluvoksamin 250 mg, paroksetin 100 mg, sertralin 250 mg) mogu da ostanu pod nadzorom u kućnim uslovima.

6 Napomena: prvo je potrebno korigovati elektrolitni disba-lans, a posebno hipokalemiju i hipomagnezemiju, a zatim davati natrijum bikarbonat.

Reference1. Thomas SH, Bevan L, Bhattacharyya S, Bramble MG,

Chew K, Connolly J et al. Presentation of poisoned pa-tients to accident and emergency departments in the north of England. Hum Exp Toxicol 1996; 15(6):466–70.

2. Buckley NA, Whyte IM, Dawson AH, McManus PR, Ferguson NW. Self-poisoning in Newcastle, 1987–1992. Med J Aust 1995; 162(4):190–3.

3. Rang HP, Dale MM, Ritter JM, Flower R, Henderson G. Rang and Dale’s Pharmacology (7th ed). Churchill -Livingstone, 2011.

4. Brunton LL, Chabner BA, Knollmann BC (eds). Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics (12 ed). New York: The McGraw-Hill Companies, Inc., 2011.

5. Nacionalni registar lekova NRL 2012. Beograd: Agencija za lekove i medicinska sredstva Srbije, 2012.

6. Katzung BG, Masters SB, Trevor AJ (eds). Basic and Clinical Pharmacology (12th ed). New York: The McGraw-Hill Companies, Inc., 2012.

7. Todorović V, Jović-Stošić J, Babić G, Vučinić S. Akutna trovanja lekovima. U: Terzić B, Anđelković D, Meyboom R, Stanulović M (ur). Farmakovigilanca i bezbedna pri-mena lekova. Beograd: Farmaceutski fakultet u Beogradu, 2004: 93–101.

8. Woolf AD, Erdman AR, Nelson LS, Caravati EM, Cobaugh DJ, Booze LL et al. Tricyclic antidepressant poi-soning: an evidence-based consensus guideline for out-of-hospital management. Clin Toxicol (Phila) 2007; 45(3): 203–33.

9. Jacob J, Benzer TI. Antidepressant toxicity. Dostupno na: http://emedicine.medscape.com/article/812727-overview, 30.11.2012.

10. Poisoning and Toxicology. Hudson (OH): Lexi-Comp, Inc.; 2012. Dostupno na: http://www.lexi.com/, 30.11.2012.

11. Nelson LS, Erdman AR, Booze LL, Cobaugh DJ, Chyka PA, Woolf AD et al. Selective serotonin reuptake inhibitor poisoning: An evidence-based consensus guideline for out-of-hospital management. Clin Toxicol (Phila) 2007; 45(4): 315–32.

31



Mijeloproliferativne neoplazme (MPN) su klonska oboljenja pluripotentne matične ćelije hematopoeznog tkiva koja se karakterišu autonomnom proliferacijom jedne ili više mijeloidnih loza (tj. granulocitne, eritroidne, megakariocitne loze i mastocita), intaktne maturacije i diferencijacije, a najče-šće se manifestuju povećanim brojem krvnih ćelija (cytosis) u perifernoj krvi (leukocytosis i/ili polycythaemia i/ili throm-bocytosis).

Revidirana Klasifikacija hematopoetskih i limfoidnih neoplazmi Svetske zdravstvene organizacije (eng. World Health Organization-WHO) iz 2008.godine uvodi naziv “mi-jeloproliferativne neoplazme” umesto “hronične mijeloproli-ferativne bolesti” kako bi istakla njihovu neoplastičnu prirodu (1). Pored toga, ova klasifikacija u odnosu na prethodnu izdva-ja i nove podgrupe ovih neoplazmi, kao i neke nove dijagno-stičke kriterijume unutar pojedinih podgrupa. Dodatni dija-gnostički kriterijumi omogućavaju ne samo preciznije razli-kovanje podtipova MPN, već i diferencijaciju od reaktivne granulocitne, eritroidne i megakariocitne hiperplazije.

MPN obuhvataju sledeće podgrupe: hronična mijelo-idna leukemija, BCR/ABL1 pozitivna (eng. chronic myeloge-nous leukaemia –CML), hronična neutrofilna leukemija(eng. chronic neutrophilic leukaemia –CNL), policitemija vera (eng. polycythaemia vera–PV), primarna mijelofibroza (eng. primary myelofibrosis–PMF), esencijalna trombocitemija (eng. essential thrombocythaemia–ET), hronična eozinofilna leukemija, bez daljeg određenja (eng. chronic eosinophilic le-ukaemia, not otherwise specified–CEL, NOS), mastocitoza i neklasifikovana mijeloproliferativna neoplazma (eng. myelo-proliferative neoplasm, unclassifable–MPN, U).

Klasifikacija MPN prikazana je u Tabeli 1.MPN se najčešće javljaju kod odraslih (uglavnom iz-

među 40. i 60. godine), ali se neke podgrupe, posebno CML i ET, opisuju i u dečjem uzrastu. Incidenca MPN je 6–10/100000 stanovnika godišnje (2).

Etiologija je nepoznata, ali se nastanak MPN dovodi u vezu sa jonizujućim zračenjem i ekpozicijom hemikalijama (3).

Klinički, bolest počinje podmuklo, asimptomatski ili sa nespecifičnim simptomima (glavobolja, slabost, svrab po

koži, poremećaj vida, parestezije, gubitak u težini, noćno zno-jenje), pa se bolest obično otkriva pri pregledu periferne krvi.

Inicijalno, MPN se karakterišu hipercelularnom kost-nom srži, sa očuvanom maturacijom hematopoetskih ćelija i povećanim brojem granulocita, eritrocita i/ili trombocita u perifernoj krvi. Često su udružene sa hepatosplenomegali-jom, koja je posledica ili povećane sekvestracije prekomernog broja krvnih ćelija ili ekstramedularne hematopoeze (EMH).

Dijagnoza MPN zasniva se, pre svega, na nalazu u pe-rifernoj krvi, kao i na citološkom i patohistološkom nalazu u kostnoj srži, uz citogenetsku analizu. CML se izdvaja kao po-seban entitet od ostalih MPN zbog ekspresije fuzionog onko-proteina, BCR-ABL1, koji je rezultat stečene somatske muta-cije–jukstapozicije hromozoma 9 i 22 (Philadelphia, Ph hro-mozom–translokacija t(9;22)). Najnovija istraživanja utvrdila su značaj stečene klonske mutacijeJanus kinaze 2 (JAK2) (supstitucija fenilalanina valinom na poziciji 617 (V617F) u JAK 2 pseudodomenu) u patogenezi BCR-ABL1 negativnih MPN. JAK2 V617F mutacija se detektuje kod skoro svih paci-jenata sa PV I kod oko polovine bolesnika sa ET ili PMF (4).Zbog toga se razmatra primena Jak inhibitora kao target tera-pije za lečenje pre svega PMF, koji mogu dovesti do patohisto-loške i citogenetske remisije, uz povlačenje simptoma, reduk-ciju splenomegalije i reverziju fibroze kostne srži (5).Međutim, molekularna patogeneza kod skoro polovine bolesnika sa ET i PMF ostaje još uvek nepoznata.

Svaka MPN je potencijalno progresivna, sapostepe-nom evolucijom u mijelofibrozu i insuficijenciju kostne sržiili, eventualno, blastnu transformaciju. Postojanje genetske evo-lucije obično najavljuje kliničku progresiju bolesti sa poveća-njem organomegalije, povećanjem ili smanjenjem broja krv-nih ćelija u perifernoj krvi, mijelofibrozom, kao i mijelodi-splazijom. Prisustvo 10–19% blasta u perifernoj krvi ili kost-noj srži ukazuje na akceleraciju bolesti, a 20% blasta ili više, dovoljan je kriterijum za dijagnozu blastne faze, tj. transfor-macije u akutnu leukemiju.

Patohistološka analiza biopsije kostne srži neophodna je ne samo za postavljanje dijagnoze i klasifikaciju, već i za praćenje progresije bolesti tokom vremena, procene terapij-

MIJELOPROLIFERATIVNE NEOPLAZMEDoc. dr Tatjana Terzić

Institut za patologiju, Medicinski fakultet,Univerzitet u Beogradu, Srbija

Tabela 1. Klasifikacija mijeloproliferativnih neoplazmi (WHO, 2008)

Hronična mijeloidna leukemija, BCR-ABL1 pozitivna (CML) Hronična neutrofilna leukemija (CNL)Policitemija vera (PV)Primarna mijelofibroza (PMF)Esencijalna trombocitemija (ET)Hronična eozinofilna leukemija, NOS (CEL, NOS)MastocitozaMijeloproliferativna neoplazma, neklasifikovana (MPN, U)

32



skog odgovora, kao i stratifikaciju prognostičkih grupa bole-snika.

Sledi kratki prikaz kliničko-patoloških karakteristika četiri najčešće MPN: CML, PV, PMF i ET.

Hronična mijeloidna leukemija (CML), BCR-ABL1 pozitivna

Hronična mijeloidna leukemija (CML), BCR-ABL1 pozitivna–najčešća je MPN (incidenca 1–2/100000 stanovni-ka godišnje), koja se izdvaja od ostalih MPN po citogenet-skom nalazu Ph hromozoma/ BCR-ABL1 fuzionog gena. Bolest može nastati u svim uzrastima, ali najčešće između 30. i 60.godine života. Klinički se prezentuje leukocitozom sa ne-utrofilijom (20–1000x109/l), često udruženom sa normocit-nom normohromnom anemijom, a kod 50% bolesnika i sa trombocitozom, uz konzistentan nalaz niske ili odsutne aktiv-nosti leukocitne (neutrofilne) alkalne fosfataze (LAF). Bolest prolazi kroz 3 faze:a. Hronična faza – obično traje 2–3 godine, a simptomi su

blagi i nespecifični. U perifernoj krvi postoji leukocitoza sa predominacijom segmentiranih neutrofilnih granulocita, ali se uočavaju i prelazni elementi sazrevanja G-loze sa “nesimetričnom” distribucijom (mijelociti > metamijeloci-ti). Broj blasta ne prelazi 5%.Obično postoji i bazofilija i eozinofilija, kako u perifernoj krvi, tako i u kostnoj srži. U biopsiji kostne srži hipercelularnost je izražena, sa nagla-šenom proliferacijom granulocitne loze (bez displazije), očuvane maturacije (sa lakim pomakom ulevo u sazreva-nju), uz oskudnu eritroidnu lozu (E/G= 1:10 do 1: 50)i ume-reno povećan broj megakariocita, koji su obično sitni, hipo-lobuliranog jedra (Slika 1A). Biopsija kostne srži ima ne samo dijagnostički značaj, već pruža i informacije koje koreliraju sa kliničko-laboratorijskim parametrima i pro-gnozom. Npr. broj eritroidnih prekursora i stepen fibroze kostne srži koreliraju sa vrednošću hemoglobina, veliči-nom slezine, procentom blasta u perifernoj krvi i vredno-stima LDH (6). Veća zastupljenost eritroidnih prekursora korelira sa boljom prognozom (6).Umerena do izražena fi-broza kostne srži se uočava kod 20–30% bolesnika sa CML i indikator je loše prognoze. Slezina je uvećana zbog infil-tracije crvene pulpe elementima granulocitne loze u svim stadijumima sazrevanja, a slični infiltrati se uočavaju i u sinusoidima jetre. Česti su infarkti slezine.

b. Faza akceleracije - nastupa unutar 3 godine od postavlja-nja dijagnoze u oko 50% obolelih od CML. Ostalih 50% bolesnika razvijaju akutnu “blastnu krizu” bez faze akcele-racije. Kriterijumi za dijagnozu ove faze su jasno definisa-ni WHO klasifikacijom iz 2008. godine (održavanje leuko-citoze i splenomegalije uprkos terapiji, održavanje trombo-citopenije, citogenetska evolucija, 20% ili više bazofila u perifernoj krvi i 10–19% blasta u perifernoj krvi ili kostnoj srži). Imunohistohemijskom analizom biopsije kostne srži primenom CD34, CD117 i TdT utvrđuje se procenat blasta.

c. Blastna faza – predstavlja terminalnu fazu CML. Anemija i trombocitopenija pokazuju znake brze progresije, uz po-većan broj blasta (20% i više) u perifernoj krvi ili kostnoj srži. U 70% bolesnika blasti su tipa mijeloblasta, a u 20–30% su tipa limfoblasta. Ekstramedularna blastna infiltra-cija je česta pojava u blastnoj fazi (koža, limfni čvor, slezi-

na, kost, sluznice, meka tkiva, pleuralna šupljina, dojka i dr.) i može biti mijeloblastnog ili limfoblastnog tipa. Medijana preživljavanja bolesnika u blastnoj fazi CML je 6 meseci.

Mijeloidni sarkom (sinonimi: ekstramedularni mije-loidni tumor, granulocitni sarkom, hlorom) je tumorska masa izvan kostne srži, koja se sastoji od mijeloblasta, sa ili bez znakova sazrevanja (Slika 1B). Može nastati u bilo kom orga-nu ili tkivu i ekvivalent je akutne mijeloidne leukemije. Najčešće se javlja u okviru akutne blastne transformacije mi-jelodisplastičnog sindroma i mijeloproliferativnih neoplazmi, ali može prethoditi ili istovremeno nastati sa akutnom mijelo-idnom leukemijom (7). Takođe, mijeloidni sarkom može biti inicijalna manifestacija relapsa kod pacijenata sa ranije dija-gnostikovanom akutnom mijeloidnom leukemijom, u odsu-stvu relapsa u perifernoj krvi i kostnoj srži.

Slika 1. A Hronična mijeloidna leukemija (hronična faza), kostna srž. Proliferacija granulocitne loze sa pomakom ulevo u sazrevanju i brojni hipolobulirani megakariociti. B Mijelo-idni sarkom, gingiva. Subepitelno se uočava difuzna infiltra-cija blastima.

Policitemija vera (PV)Policitemija vera (PV) ili prava policitemija je retka

MPN (incidenca 0,7/100000 stanovnika godišnje), koja se ka-

33



rakteriše povećanom produkcijom eritrocita koja je nezavisna od normalnih regulatora eritropoeze. Skoro svi bolesnici sa PV nosioci su somatske mutacije JAK2, što ima za posledicu ne samo proliferaciju eritroidne loze, već i granulocitne i me-gakariocitne („panmyelosis“). Bolest ima tri faze: 1. prodro-malnu, pre-policitemičnu fazu, koja se karakteriše lakom eri-trocitozom; 2. policitemičnu fazu, koja se prezentuje značaj-nim povećanjem mase eritrocita; i 3. „spent“ ili post- policite-mičnu mijelofibrotičnu fazu, u kojoj nastaje pancitopenija, neefektivna hematopoeza, mijelofibroza, ekstramedularna hematopoeza (EMH) i hipersplenizam. Dijagnostički kriteri-jumi za PV odnose se na jasno definisane kliničke, laborato-rijske i patohistološke parametre (1). Klinički se prezentuje hipertenzijom i vaskularnim poremećajima nastalim kao po-sledica povećane mase eritrocita. Kod 20% bolesnika javljaju se epizode arterijske ili venske tromboze (infarkt miokarda, mezenterična, portna ili splenična venska tromboza, Budd-Chiari sindrom, cerebrovaskularni insult) kao prva manife-stacija bolesti. Rani simptomi mogu biti nespecifični–glavo-bolja, slabost, svrab po koži, eritromelalgija, poremećaj vida, parestezije, epigastrični bol, giht. U fizikalnom nalazu uočava se pletora kože lica, kao i splenomegalija, koja je prisutna kod 70% bolesnika, i laka do umerena hepatomegalija, kod oko 40% bolesnika sa PV. Hepatosplenomegalija je posledica EMH.U laboratorijskim nalazima vrednosti hemoglobina su preko 18,5g/dl za muškarce, odnosno preko 16,5g/dl za žene, uz nizak nivo eritropoetina u serumu.Trombocitoza postoji kod 15% bolesnika sa PV, a kod 2/3 bolesnika i leukocitoza sa neutrofilijom (15–25x109/l). U biopsiji kostne srži hipercelu-larnost je izražena, sa naglašenom proliferacijom sve tri loze hematopoeze (panmijeloza), uz nepromenjen E:G odnos i umeren pleomorfizam megakariocita, koji su disperzno ra-spoređeni (Slika 2).Medijana preživljavanja bolesnika sa PV je preko 10 godina. Najčešći uzrok smrti su tromboze i hemo-ragije(zbog hipoksičnog oštećenja endotela krvnih sudova kao rezultat povećanja viskoznosti krvi i usporenog toka krv-ne struje). Transformacija PV u akutnu mijeloidnu leukemiju nastaje kod 2–3% bolesnika koji nisu lečeni citotoksičnim agensima, ali kod više od 10% bolesnika koji su lečeni hemi-oterapijom.

Slika 2. Prava policitemija (policitemična faza). Hipercelu-larna kostna srž, sa panmijelozom i disperznom distribucijom megakariocita, koji su umereno pleomorfni.

Primarna mijelofibroza (PMF)Primarna mijelofibroza (PMF) (sinonimi: hronična

idiopatska mijelofibroza, agnogena mijeloidna metaplazi-ja) označava proliferaciju pre svega megakariocitne i granulo-citne loze, uz reaktivnu fibrozu u kostnoj srži i ekstramedular-nu hematopoezu. Fibroza kostne srži nastaje stimulacijom fi-broblasta faktorima rasta koje stvaraju megakariociti.Preko 30% bolesnika je bez simptoma u vreme dijagnostikovanja.Bolest se otkriva nalazom normocitne normohromne anemije, leukocitoze i/ili trombocitoze u perifernoj krvi, uz prisustvo splenomegalije.U razmazu periferne krvi uočavaju se eritro-citi oblika suze (dakriociti), kao i nukleisani elementi eritroid-ne loze i prelazni oblici sazrevanja G-loze (leukoerythrobla-stosis). Bolest ima tri faze: 1. prefibrotični, rani stadijum (ce-lularna faza), koja se karakteriše izraženom hipercelularno-šću kostne srži i panmijelozom, uz grupisanje pleomorfnih megakariocita u vidu klastera duž sinusa i trabekula; retiku-linska fibroza je minimalna (Slika 3A); 2. fibrotični stadijum označava normo- do hipocelularnu kostnu srž, sa klasterima atipičnih megakariocita, umnoženim i dilatiranim sinusoidi-ma, sa intrasinusoidalnom hematopoezom, i izraženom reti-kulinsko-kolagenom mijelofibrozom, uz osteosklerozu (Slika 3B); 3. završni stadijum, u kome su koštane trabekule široke, a medularni prostori suženi, ispunjeni vezivom i ostrvcima hematopoetskih prekursora (osteomijeloskleroza i ćelijska de-plecija). U ovom stadijumu izražena je ekstramedularna he-matopoeza i to najčešće u slezini i jetri (Slika 3C). Slezina je uvećana i do 30 puta (nekad doseže i do male karlice), a jetra 4 puta.Ascites i limfadenomegalija nalaze se retko.EMH se može naći u bubrezima, nadbubrežnim žlezdama, koži, mo-zgu, retroperitonelanom prostoru, gastrointestinalnom traktu, plućima, duri, serozama.Prognoza PMF je lošija nego kod ostalih MPN, sa medijanom preživljavanja od svega 5 godina. Bolesnici umiru zbog srčane insuficijencije, pulmonalnog embolizma i insuficijencije kostne srži (infekcije, krvavlje-nja). Blastna (leukemijska) transformacija PMF (mijeloblast-na ili limfoblastna) viđa se kod oko 5–30% bolesnika (Slika 3D) (1, 8). Iznenadno pogoršanje anemije i trombocitopenije uz naglo uvećanje slezine klinički je suspektno na blastnu transformaciju.

Esencijalna trombocitemija (ET)Esencijalna trombocitemija (ET), kao i ostale MPN,

nastaje klonskom proliferacijom pluripotentne stem ćelije, ali sa dominantnom proliferacijom megakariocita i perzistent-nom trombocitozom u perifernoj krvi (≥ 450x109/l), pri čemu je broj trombocita obično između 1000–4000x109/l.S obzirom na to da nije poznat genetski ili biološki marker specifičan za ET, druge MPN sa trombocitozom moraju biti isključene, kao i reaktivna (neneoplastična) trombocitoza koja se najčešće ja-vlja kao posledica anemije, splenektomije, hirurške interven-cije,hroničnog zapaljenja, autoimunih bolesti, metastaza, lim-foma. Bar 20% bolesnika sa ET je bez simptoma u trenutku dijagnostikovanja (incidentalni nalaz), a dve trećine bolesnika sa simptomima se klinički prezentuju venskom ili arterijskom trombozom ili simptomima koji su posledica opstrukcije ma-lih krvnih sudova (glavobolja, poremećaj vida, parestezije, vrtoglavica). Trećina simptomatskih bolesnika se prezentuje abnormalnim krvavljenjem, npr. u gastrointestinalnom traktu

34



i potkožnom tkivu. Krvavljenja kod bolesnika sa ET nastaju zbog kvalitativnih promena trombocita.Umerena splenome-galija postoji kod 40% pacijenata, a hepatomegalija kod oko 20%. Često su ponavljani infarkti slezine, koji mogu dovesti do atrofije slezine. Kostna srž je na početku bolesti hipo- ili normocelularna, a kasnije hipercelularna sa upadljivom proli-feracijom megakariocita, koji su krupni, hiperlobulirani, sa jedrom u vidu jelenskih rogova, a u citoplazmi često je prisut-na emperipoleza.Megakariociti obično su disperzne distribu-

cije, ili eventualno grupisani u lako naznačene klastere (Slika 4). Fibroza kostne srži po pravilu je odsutna (nalaz fibroze is-ključuje dijagnozu ET!).U perifernoj krvi, pored trombocito-ze, moguć je nalaz hipohromne mikrocitne anemije (zbog kr-vavljenja), dok je broj leukocita normalan. Za razliku od dru-gih MPN, bolesnici sa ET mogu imati skoro normalan životni vek. Progresija bolesti sa razvojem mijelofibroze i blastne transformacije je retka (samo 1–2% ET se transformiše u akutnu mijeloidnu leukemiju).

Slika 3. A-C Primarna mijelofibroza. A Prefibrotični, rani stadijum PMF. Hipercelularna kostna srž, sa proliferacijom mega-kariocitne i granulocitne loze i potiskivanjem masnog tkiva uz trabekule. B Fibrotični stadijum PMF. Izražena retikulinska i kolagena fibroza kostne srži. C Fibrotični stadijum PMF–ekstramedularna hematopoeza, jetra. U dilatiranim sinusoidima jetre uočavaju se elementi sve tri loze hematopoeze. D Blastna transformacija PMF, kostna srž. Medularni prostor difuzno infiltro-van blastima.

35



Slika 4. Esencijalna trombocitemija, kostna srž. Povećan broj megakariocita, koji su krupni, hiperlobulirani, bez značajnog umnožavanja granulocitne i eritroidne loze.

Literatura1. Swerdlow SH, Campo E, Harris NL, Jaffe ES, Pileri SA,

Stein H, Thiele J, Vardiman JW. World health organisation classification of tumours of haemopoietic and lymphoid tissues. Lyon: International Agency for Research on Cancer (IARC) Press, 2008.

2. Jemal A, Tiwari RC, Murray T, Ghafoor A, Samuels A, Ward E, Feuer EJ, Thun MJ. Cancer Statistics, 2004. CA Cancer J Clin 2004; 54:8–29.

3. Dingli D, Mesa RA, Tefferi A. Myelofibrosis with myeloid metaplasia: new developments in pathogenesis and treat-ment. Intern Med 2004; 43:540–547.

4. Kralovics R, Passamonti F, Buser AS, i sar. A gain of function mutation of JAK2 in myeloproliferative disor-ders. N Engl J Med 2005; 352:1779–90.

5. Tefferi A. JAK inhibitors for myeloproliferative neo-plasms: clarifying facts from myths. Blood 2012; 119:2721–2730.

6. Thiele J, Kvasnicka HM, Schmitt-Graeff A, Zirbes TK, Birnbaum F, Kressmann C, i sar. Bone marrow features and clinical findings in chronic myeloid leukemia – a com-parative, multicenter, immunohistological and morpho-metric study on 614 patients. Leuk Lymphoma 2000; 36:295–308.

7. Čolović N, Jurišić V, Terzić T, Jevtović D, Čolović M. Alveolar granulocytic sarcoma of the mandible in a pa-tient with HIV. Onkologie 2011; 34(1–2):55–8.

8. Jurišić V, Čolović N, Terzić T, Djordjević V, Čolović M. Transformation of primary myelofibrosis with 20q- in Philadelphia-positive acute lymphoblastic leukemia: case report and review of literature. Pathol Res Pract 2012; 208(7):420–423.

36



DefinicijaPrema definiciji Internacionalne lige za borbu protiv

epilepsije, febrilni napad (fras, febrilne konvulzije) je „epilep-tični napad koji se javlja posle prvog meseca života, u toku povišene temperature koja nije uzrokovana infekcijom CNS-a, kod dece koja prethodno nisu imala neonatalne ili afebrilne napade“. Međutim, prema reviziji Klasifikacije epilepsija i epileptičnih sindroma, FN su kategorisani kao stanja s epilep-tičnim napadima koja ne predstavljaju pravu epilepsiju, odno-sno kao benigni epileptoidni fenomeni koji sami po sebi ne znače dijagnozu epilepsije. Prema ovoj klasifikaciji, savetuje se da se termini „konvulzije“ i „konvulzivni“ više ne koriste jer se smatraju laičkim terminima i da se umesto njih koristi termin febrilni napadi (FN) (1).

EpidemiologijaFebrilni napadi najčešći su neurološki poremećaj u de-

tinjstvu. Javljaju se u uzrastu od 6. meseca do pete godine, sa najvećom učestalošću između 12. i 20. meseca života. Učestalost javljanja prvih FN je između 2–5%, rizik za pojavu recidiva 30–50%, dok se epilepsija razvije kod 1–3%, u zavi-snosti od prisutnih faktora rizika (1–3).

KlasifikacijaKlasifikacija FN zasnovana je, pre svega, na razlikama

u kliničkoj prezentaciji samog napada i njegovom trajanju, ali i podacima o porodičnoj anamnezi, neurološkom nalazu pre i posle napada i drugim faktorima. Prema kliničkim karakteri-stikama, FN se dele na proste (tipične) i kompleksne (atipične) (2–9). Tipični napadi traju kraće od 15 minuta, generalizovani su i ne ponavljaju se u toku 24 sata. Kompleksne FN mogu biti hemigeneralizovane i/ili fokalne, i mogu sa ponoviti to-kom 24 sata. Najčešće, napad traje nekoliko minuta, dok na-pad trajanja 30 minuta ili više označavamo kao febrilni epi-leptični status (FES) (4–9).

Etiologiija i faktori rizikaFebrilna bolest. Iako sam naziv ‘febrilni napadi’ uka-

zuje na korelaciju između konvulzija i povišene telesne tem-perature (TT) nije sasvim jasno da li je primarna etiologija napada sama temperatura, infektivni agens, sistemska reakci-ja na temperaturu ili sistemska reakcija na infekciju (5,7) (Slika 1.).

Naime, moguće je da visok nivo zapaljenskih medija-tora (pre svega IL-1, IL-2, IL-6 i TNF-a), cirkulišućih toksina i/ ili metabolička alkaloza koja nastaje u febrilnim stanjima, doprinose povećanju ekscitabilnosti nervnog tkiva (Slika 2.). Takođe, ne mogu se zanemariti ni nedovoljno razvijen celu-larni imunitet, nedovršena mijelinizacija i drugi faktori (5–10).

Slika 1. Uticaj zapaljenskih medijatora na nastanak FN

Slika 2. Uticaj metaboličke alkaloze na nastanak FN

Uzroci povišene temperature, u sklopu koje se javljaju FN, mogu biti različiti. Brojna ispitivanja pokazala su da su u preko 70% slučajeva izazivači virusi, a ređe bakterije (5, 7, 9). Najčešći uzročnici febrilne bolesti, koji su povezani sa poja-vom FN su:

• virus influence–deca kod koje se razviju FN u toku ove infekcije imaju veoma visoku TT, kraće traja-

FEBRILNI NAPADIDoc. dr Dragana Bogićević

Univerzitetska dečja klinika, Beograd, SrbijaMedicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu, Srbija

37



nje TT pre pojave FN i češće imaju kompleksne napade

• enterovirusi–kao najčešći uzročnik iz ove grupe izdvaja se Coxsaki virus A

• herpesvirus–neurotropni. HSV1, HHV6, HHV7, CMV povezani sa nastankom febrilnih konvulzija

• bakterije–Shigella dysenteriae (enteritis), Salmonella enteritidis (enteritis), Streptococcus pneumoniae (respiratorne infekcije) i Escherichia coli (urinarne infekcije).

Genetika.Iako postoje jasni dokazi koji ukazuju na po-rodičnu pojavu febrilnih napada, način nasleđivanja i dalje nije u potpunosti razjašnjen (10). Novija istraživanja pružila su dokaze o povezanosti FN i mutacija na određenim genima koji su odgovorni za sintezu hloridnih i natrijumskih jonskih kanala (dug krak hromozoma 8q13–21, hromozom 19p, hro-mozom 5q14–15).Pretpostavlja se da se ove mutacije nasleđu-ju autozomno dominantno (10–12).Ipak, ne javljaju se febrilni napadi kod sve dece koja imaju povišenu temperaturu ili neku infekciju. Smatra se da postoje tzv. faktori rizika koji decu koja ih imaju čine sklonijim za nastanak FN.

Predisponirajući faktori za pojavu prvih FN: visoka telesna temperatura, uzrast do 12 meseci i pozitivna porodič-na anamneza za febrilne napade (1, 9, 12–15). Verovatnoća pojave febrilnih napada kod dece čiji je srodnik prvog stepena imao napade je 10%, dok se ta verovatnoća povećava do 50% ukoliko su i roditelji imali slične neurološke probleme. Neki autori u faktore rizika ubrajaju i: ženski pol, česta febrilna stanja deteta, dugo trajanje febrilnih epizoda, perinatalne komplikacije, konzumaciju duvana u toku trudnoće i razne sociodemografske faktore (9, 13, 15). Recidive FN ima trećina do polovina dece, a u zavisnosti od broja faktora rizika.

Faktori rizika za pojavu recidiva FN: prvi febrilni na-pad pre navršenih 12 meseci života, temperatura pri prvim FN između 38 i 38.5°C, trajanje temperature pre prvih FN kraće od 12 sati, FN kod rođaka prvog stepena, epilepsija kod rođaka prvog stepena i kompleksne prve FN (6,9,11,15). Kako pojedinačni riziko faktori deluju na aditivan način, njihova udruženost kod istog deteta značajno povećava rizik od reci-diva FN (20). Rizik od pojave prvog recidiva je 23–42%, a od narednog 30–50% (2,6,7). Recidive FN ima preko 70 % dece sa više od tri faktora rizika, a manje od 20 % onih bez riziko faktora (16,19).

Klinička slikaFebrilni napadi se, prema kliničkoj slici, klasifikuju u

dve osnovne grupe : proste i složene, tj. tipične i atipične (1–10).

Tipični napadi javljaju se, uglavnom, u uzrastu od 6 meseci do 5.godine, pri temperaturi većoj od 38°C. Klinički se manifestuju pojavom generalizovanih toničko kloničkih konvulzija koje karakteriše fiksiranje očnih jabučica u jednu stranu, trzaji ruku i/ili nogu, krkljanje, povraćanje, cijanoza i moguć gubitak svesti. Kod ovakvih napada neurološki status pre i posle napada je uredan, oni traju nekoliko minuta i ne ponavljaju se u toku 24 sata. Kod ovih bolesnika najčešće ne-ma sličnih poremećaja u porodici.

Ređe, FN se mogu prezentovati kao kompleksni (ati-pični) napadi, koji se često javljaju i pre nego što se registruje

povećanje TT, odnosno pri temperaturi nižoj od 38°C. Njih karakterišu fokalni neurološki ispadi, grčenje i/ili trzaji jedne ruke ili noge, ukočen pogled, mlitavost, ne reagovanje na dra-ži, dizfazija, popuštanje sfinktera i sl. Ovi napadi traju dugo, a često se i ponavljaju u toku 24h. Može se desiti da se javi postiktalna pareza/paraliza koja kratko traje (Toddova parali-za), razdražljivost ili izražen umor. Pri uzimanju anamneze uglavnom se dobijaju podaci o sličnim događajima kod bli-skih članova porodice.

Većina dece imaće prvi napad u toku prvog dana fe-brilne bolesti (>70%). U nekim slučajevima FN mogu biti i prvi znak bolesti. Iako se smatra da je pri naglom porastu TT veća mogućnost javljanja FN, to se ne može sa sigurnošću tvrditi. Visina temperature pri kojoj nastaju napadi je varija-bilna. Kod tri četvrtine bolesnika, u trenutku prvog napada, izmeri se TT veća od 38°C.

Sa druge strane, recidivi se ne moraju javiti pri istim vrednostima TT koje je dete imalo pri prvim FN, niti se oni javljaju svaki put kada dete ima povišenu TT. Kao što je pret-hodno rečeno, njihovo javljanje zavisi od većeg broja faktora. U Tabeli 1. prikazane su osnovne karakteristike prostih i slo-ženih napada (10–14,17).

Tabela 1. Karakteristike febrilnih napada

Tipični febrilni napadi Kompleksni febrilni napadi

6 meseci do 5. Godine pre 6 meseci i posle 5. Godine

javljaju se uz visoku temper-aturu >38 C uz temperaturu <38

jave se jedan do dva puta u životu javljaju se češće

klinička slika generalizova-nog napada

često parcijalni (fokalni) na-padi

napad traje par minuta, najduže do 15 min. napad traje preko 20 minuta

neurološki status pre i posle napada uredan

postiktalne prolazne pareze(Toddova pareza)

porodična anamneza obično nije pozitivna

u porodici postoje članovi sa EPI ili FN

EEG: postiktalno nalaz ure-dan

u neurološkom statusu post-oje abnormalnosti i pre i po-sle napada

DijagnozaIspitivanja posle FN prvenstveno imaju za cilj da otkri-

ju uzrok povišene temperature (1,2,14) i da isključe druge uz-roke konvulzija kod febrilne dece (naročito infekcije CNS-a i teške metaboličke poremećaje) (3,16,17).

Dijagnoza FN postavlja se na osnovu detaljne anamne-ze (heteroanamneze), kliničke slike i neuropedijatrijskog pre-gleda, a veoma je važno utvrditi koje osnovno oboljenje je izazvalo febrilnost. Važna je diferencijalna dijagnoza FN od konvulzivnih napada u toku meningitisa, iako je učestalost meningitisa kod dece sa FN veoma mala (8).

Koje dijagnostičke procedure će se primeniti zavisi od stanja bolesnika, težine kliničke slike i obima infekcije. U

38



Tabeli 2. prikazane su indikacije za različite dijagnostičke procedure u sklopu lečenja FN.

Dijagnostičke procedure koje dolaze u obzir kod fe-brilnih napada su:

Analize krvi i urina – KKS, biohemija, određivanje elektrolita i glukoze u serumu i pregled urina ne spadaju u rutinske dijagnostičke procedure kod febrilnih konvulzija jer ne daju pouzdane podatke o samom napadu. Ove analize mo-gu se koristiti u cilju dokazivanja infekcije i eventualne iden-tifikacije uzročnika, što će dalje doprineti efikasnijem lečenju (16).

EEG – ne radi se rutinski u dijagnostičkoj obradi jer ne postoje dokazi o tome da epileptiformna pražnjenja na EEG –u imaju bilo kakav dijagnostički ili prognostički značaj, čak i kod dece sa kompleksnim napadima (15). Takođe, abnormal-nosti na EEG- u nisu prediktori za kasniji razvoj epilepsije (14,15). EEG snimanje može se uzeti u obzir kod pacijenata kod kojih postoji sumnja na neurološki ili kognitivnideficit ili organski uzrok napada, kao i kod dece sa FES.

Lumbalna punkcija–Najteže je postaviti indikaciju za lumbalnu punkciju. Deca mlađa od 18 meseci (otvorena veli-ka fontanela) posebno su problematična, jer prateći znakovi meningitisa mogu biti samo blago izraženi. Svaki febrilni na-pad kod odojčeta mlađeg od 6 meseci smatra se posledicom meningitisa dok se ne dokaže suprotno. Postojanje meningiti-sa nije verovatno ako se detetovo kliničko stanje ubrzo nakon konvulzija poboljša. Po pravilu se dete ne punktira unutar 24 sata od početka febrilne bolesti, jer postoji velika mogućnost lažno negativnog nalaza, osim u slučaju postojanja jasnih zna-kova iritacije moždanih ovojnica. Ako se nakon 24 sata traja-nja febrilne bolesti, uprkos započetom simptomatskom i etio-loškom lečenju, stanje deteta ne poboljšava, odnosno, još se dodatno pogoršava, indikovana je lumbalna punkcija (8,17–19,24).

CT glave – rutinski se ne upotrebljava kod dece sa fe-brilnim napadima (15). Ne koristi se ukoliko nema znakova postojanja kraniokompresivne mase, krvarenja, hidrocefalu-sa, apscesa ili edema moždanog tkiva, koji zahtevaju hitnu hiruršku ili medikamentoznu intervenciju (15,17).

MR glave – ova procedura može se razmatrati kod de-ce koja imaju rekurentne kompleksne napade koji su praćeni nekim drugim neurološkim poremećajima kao što su abnor-malan oblik glave, značajan zastoj u razvoju i perzistentne neurološke deficite (15,17).

Terapija i prognozaNeophodne terapijske mere su prekid napada antiepi-

lepticima (ukoliko napadi traju duže od 15 minuta ili ako se ponavljaju), snižavanje telesne temperature antipireticima i lečenje osnovne bolesti, pre svega isključivanje ili lečenje me-ningitisa (3,8).

Većina napada prolazi za nekoliko minuta. Dete u na-padu treba položiti na levi bok kako bi se sprečilo zapadanje jezika, bez nasilnog otvaranja usta deteta. Ukoliko se bole-snik u trenutku napada nalazi u zdravstvenoj ustanovi, u cilju prekida konvulzija može se dati diazepam intravenski ili rek-talno ili midazolam per os ili intravenski (17–23).

Hospitalizacija je neophodna u slučaju da dete ima kompleksne napade (pre svega deca do 12 meseci) i da se sta-

nje svesti ne popravlja u periodu od 60 minuta. Cilj hospitali-zacije je sprovođenje dodatne dijagnostike i terapije, kao i smirivanje veoma uplašenih roditelja.

Profilaksa FN preporučuje se relativno malom broju bolesnika (17,18,21–23). Na odluku o uvođenju profilakse i na optimalni način prevencije utiču i individualne karakteristike bolesnika i njegove porodice, kao i socijalni faktori (21). U ove svrhe koriste se antiepileptici koji se primenjuju kontinu-irano ili intermitentno. Za kontinuiranu profilaksu preporuču-je se oralna primena Na-valproata, uz kontrolne neuropedija-trijske preglede, dok se za intermitentnu najčešće koriste rek-tiole diazepama, intranazalni sprej midazolama (ili u vidu gela za oralnu primenu) ili oralna primena diazepama, koji se deci daju pri prvim znacima febrilne bolesti. Važno je nagla-siti da ovi lekovi nisu zamena za antipiretike, ne utiču na fe-brilnost i da pored njihove primene, treba preduzeti sve mere za snižavanje telesne temperature (21–23).

Prognoza kod dece sa FN je uglavnom dobra. Ipak, kod malog broja pacijenata može se razviti epilepsija ili epi-leptični sindromi. Kod dece koja su imala proste FN rizik za nastanak epilepsije do 7 godine isti je kao u opštoj populaciji (1%), dok je taj rizik veći kod dece koja su imala kompleksne prve FN, napade pre 12. meseca i kod kojih je porodična anamneza pozitivna (13,14) kao i kod bolesnika koji nisu ima-li adekvatan odgovor na terapiju. Uprkos ovim saznanjima, ni jedna studija nije pokazala da uspešno lečenje FN može spre-čiti razvoj epilepsije, pa se sve više veruje da ona nastaje kao posledica genetske predispozicije (4,13).

Kod većine generalizovaih epilepsija dobijaju se poda-ci o prethodnom postojanju FN, koji se klinički mogu prezen-tovati različito, od tipičnih FN pa sve do malignih oblika bo-lesti, kao što su: FIRES (febrile induced refractory epilepsy syndrome), Jeavons-ov Sy., Dravet Sy., MERRF (Myoclonic Epilepsy with Ragged-Red Fibers), zatim MTS (mesiotempo-ral lobe epilepsy) i dr. U osnovi ovih sindroma uglavnom leže genetski determinisana, strukturna oštećenja CNS-a, koja se klinički, pored FN, manifestuju i drugim simptomima i zna-cima (Tabela 3.) (25–29). Febrilni napadi koji su javljaju u sklopu ovih poremećaja najčešće su atipični (po uzrastu, tra-janju, izmenjenom neurološkom nalazu, postojanju fokalnih i/ili hemigeneralizovanih neuroloških ispada (lateralizacije), mentalne subnormalnosti i/ili retardacije i sl ) te prepoznava-nje tzv. rizičnih pacijenata sa FN i atipičnih formi FN može pomoći u bržoj dijagnostici i prepoznavanju ovih pacijenata i terapiji koja bi imala za cilj sprečavanje propadanja struktura CNS-a. S obzorim na to da se radi o epilepsijama koje imaju genetsku osnovu, primenom novih tehnika molekularno-ge-netske dijagnostike, mnogi od ovih sindroma mogu se otkriti i porodicama dati odgovarajući genetski savet za dalje plani-ranje potomstva.

Jedan od najvažnijih koraka u lečenju FN svakako je razgovor sa roditeljima, a sve sa ciljem da prevladaju strah i napetost koju su napadi njihovog deteta izazvali. Neophodno je objasniti roditeljima klinički tok febrilnih napada uključu-jući i rizik ponovnog javljanja. Edukovati ih o načinu sprovo-đenja antipiretičkih mera i upoznati ih sa potencijalnim efek-tima kontinuirane ili intermitentne antikonvulzivne profilak-se kao i njenih neželjenih dejstava (pospanost, malaksalost, nesiguran hod). Neophodno je upoznati roditelje sa načinom

39



davanja rektiola diazepama u slučaju recidiva febrilne kon-vulzivne krize kao i postavljanja deteta u odgovarajući polo-žaj koji mu osigurava prohodnost disajnih puteva, a onemogu-ćava udisanje sadržaja iz usta. Ova uputstva doprineće sma-njenju straha i učiniti efektnijim postupke roditelja sa detetom koje je imalo konvulzije (14,18,24).

Zakl jučakFebrilni napadi su značajni ne samo zbog velike uče-

stalosti i dramatične kliničke slike, već i zbog čestih recidiva i moguće kasnije epilepsije (4–6). Uglavnom su benigne pri-rode i većinom imaju dobru dugoročnu prognozu (8–11).

Iako patogenetski mehanizam nije poznat, postoje do-kazi značajnog uticaja nasleđa, pa veću pažnju treba posvetiti deci sa porodičnim opterećenjem.Kod svakog drugog bole-snika mogu recidivirati, ali tek kod svakog desetog tri ili više puta. Retko su praćene dugotrajnim posledicama (12–13). Ipak, kod malog broja bolesnika može se razviti epilepsija ili različiti epileptični sindromi, pa je stoga prepoznavanje rizič-nih pacijenata značajno za rano otkrivanje ovih poremećaja i blagovremeno započinjanje terapije.

Pri kliničkoj obradi pacijenta, najznačajnije je uzeti detaljnu anamnezu, uraditi neuropedijatrijski pregled i isprav-no pristupiti roditeljima, nastojati im pomoći u prevladavanju doživljenog šoka i straha od smrti deteta, naknadno ih detalj-no upoznati sa febrilnim napadima i „naoružati“ znanjem u slučaju pojave recidiva.

Literatura:1. Berg A, et al. Revised terminology and concepts for orga-

nization of seizures and epilepsies: Report of the ILAE Commission on Classification and Terminology, 2005–2009. Epilepsia 2010, 51(4):676–685.

2. Siqureira LFM. Febrile seizures: update on diagnosis and management. Rev Assoc Med Bras 2010; 56(4): 489–92.

3. Gohnston MV. Febrile seizures. In: Kliegman RM, Behrman RE, Jenson HB, Stanton BF, editors. Nelson Textbook of Pediatrics. Philadelphia, Pa, USA: Sunders; 2007. Pp.2458–9.

4. Abolfazl M, Parviz A, et al.Risk factors of the first febrile seizures in Iranian children. Int J Pediatr. 2010; Vol. 2010, 1–3.

5. Sadleir L, Scheffer I. Febrile seizures. BMJ 2007; 334: 307–11.

6. Leung AK, Robson WL. Febrile seizures. J Pediatr Health Care 2007; 21:250–5.

7. Schuchmann S, Schmitz D, Rivera C, et al. Experimental febrile seizures are precipitated by a hyperthermia-in-duced respiratory alkalosis. Nat Med. 2006; 12:817–23.

8. Fetveit A. Assesment of febrile seizures in children. Eur J Pediatr 2008; 167:17–27.

9. Aydin A, Ergor A, Ozkan H. Effects of sociodemographic factors on febrile convulsion prevalence. Pediatr Int 2008; 50: 216–20.

10. Audenaert D, Van Broeckhoven C, De Jonghe P. Genes and loci involved in febrile seizures and related epilepsy syndromes. Hum Mutat. May 2006; 27(5):391–401.

11. Céline M. Dubé, Amy L. Brewster, Tallie Z. Baram Febrile seizures: Mechanisms and relationship to epilepsy. Brain and Development, May 2009: (31) 366–71.

12. Pavlidou E, Tzitiridou M. Effectiveness of intermittent di-azepam prophylaxis in febrile seizures: long-term pro-spective controlled study. J Child Neurol. 2006 Dec; 21(12):1036–40.

13. Tosun A, Koturoglu G, Serdaroglu G. et al. Ratios of nine risk factors in children with recurrent febrile seizures. Pediatric Neurology 2010; Volume 43: 177–82.

14. Pedespan L. Febrile seizures. Arch Pediatr 2007; 14:394–8.

15. Steering Committee on Quality Improvement and Management. Febrile Seizures: Clinical Practice Guideline for the Long-term Management of the Child with Simple Febrile Seizures. 2008. 121(6):1281–6.

16. Fallah R, Golestan M. Role of laboratory diagnostic tests in first febrile seizure. J Pediatr Neurol 2008; 6(2): 129–32.

17. Jones T, Jacobsen SJ. Childhood febrile seizures: over-view and implication. Int J Med Sci 2007; 4:110–4.

18. Teng D, Dayan P, et al. Risk of intracranial pathologic con-ditions requiring emergency intervention after a first com-

Tabela 3. Karakteristike epileptičnih sindroma u kojima se javljaju FN

Početak Oblici FN Simptomi i znaci Terapija

FIRES Nagli početak Ponavljani ES » EPI Kognitivna, bihejvioralna oštećenja

Rezistentna na antiepi-leptike

JEAVONS syn-drome 2–14 god. Mioklonizmi obrva i kapaka Devijacija glave i bulbusa Doživotno antiepileptici

DRAVET syn-drome U 1. godini Tipični FN, mioklonizmi »

ESPoremećaj govora, motornih veština... Antiepileptici keto dijeta

MERRF Kasno detin-jstvo GTK napadi + mioklonizmi Gluvoća, miopatija, ataksija,

retinopatija, WPW Antiepileptici

MTS Kasno detin-jstvo

Kompleksne, recidivantne FN Kognitivna oštećenja Antiepileptici

FIRES–febrile induced refractory epilepsy syndrome,MERRF–myoclonic epilepsy with ragged-red fibers MTS–mesiotemporal lobe epilepsy, ES–epileptični status, EPI – epilepsija, GTK–generalizovani toničko-klonički napadi

40



plex febrile seizure episode among children. Pediatrics 2006; 117:304–8.

19. Imia AA, Capraro AJ, Hummel D, et al. Utility of lumbar puncture for first simple febrile seizure among children 6 to 18 months of age. Pediatrics. Jan 2009; 123(1):6–12.

20. Karande S. Febrile seizures: a review for physicians. Indian J Med Sci 2007; 61(3): 161–72.

21. Cigdem IA. Febrile seizures: the role of intermittent pro-phylaxis. Journal of Pediatric Neurology 2005; 3: 1–3.

22. Bhattacharyya M, Kalra V, Gulati S. Intranasal midazol-am vs rectal diazepam in acute childhood seizures. Pediatr Neurol 2006; 34:355–9.

23. McIntyre J, Robertson S, et al. Safety and efficacy of buc-cal midazolam versus rectal diazepam for emergency treatment of seizures in children: a randomised controlled trial. Lancet 2005; 366(9481):205–10.

24. W Carroll, D Brookfield. Lumbar puncture following fe-brile convulsion. Arch Dis Child 2002;87:238–40.

25. Scheffer IE, et al. Dravet syndrom or genetic (generalized) epilepsy with febrile seizure plus? Brain development, May 2009; 31(5):394–400.

26. Sighn NA, et al. A role of SCN9A in human epilepsies, as cause of febrile seizures and as a potential modifier of Dravet syndrome. Plos genet, 2009. 5(9):e1000649.

27. M Häusler, et al. FIRES (febrile infection-related epilepsy syndrome) partially responsive to magnesium and dextro-methorphan treatment. Neuropediatrics 2012; 43(3):173–8.

28. Roberto Horacio Caraballo, Natalio Fejerman. Dravet syndrome: A study of 53 patients. Epilepsy Research, August 2006; Vol 70: 231–8.

29. Kramer U, et al. Febrile infection-related epilepsy syn-drome (FIRES): pathogenesis, treatment, and outcome: a multicenter study on 77 children. Epilepsia. November 2011; 52(11):1956–65.

41

Studentski radoviMedicinski podmladak


Sažetak:Uvod: Visoka incidenca i letalitet malignog mela-

noma, maligni potencijal i brzina metastaziranja, česti relapsi uz neefikasnost adjuvantne terapije predstavljaju razloge zbog kojih se ulažu veliki napori u pronalaženje kao i u ispitivanje molekularnih mehanizama dejstva po-tencijalnih citotoksičnih jedinjenja.

Cilj: Ispitivanje potencijalnog citotoksičnog efek-ta diazepama na B16 ćelije mišjeg melanoma i mehani-zama odgovornih za njegovo antitumorsko delovanje.

Materijal i metode: Vijabilitet B16 ćelija u kulturi određen je merenjem aktivnosti kisele fosfataze. Analiza potencijalnog mehanizma delovanja ispitivanog leka na ćelije mišjeg melanoma izvedena je primenom odgova-rajućih fluorohroma i analizom na protočnom citofluori-metru. Bojenje propidijum jodidom, dihidrorodaminom, dihidroetidijumom i akridin-oranžom sprovedeno je u cilju analize ćelijskog ciklusa, produkcije slobodnih ki-seoničnih radikala i superoksidnih anjona kao i autofa-gije. Promena morfologije ćelija i prisustvo autofagoli-zozoma praćeno je primenom svetlosne,odnosno, fluore-scentne mikroskopije.

Rezultati: Diazepam je ispoljio citotoksično dej-stvo na B16 ćelije tokom 24 h tretmana (IC50=389,4 µM). Analizom ćelijskog ciklusa zapažen je povećan procenat ćelija u G2/M fazi pri koncentraciji diazepama koja je bliska IC50 (400 μM) nakon 24 h inkubacije (50,2% u od-nosu na kontrolu – 21,3%). Primećen je porast produkci-je slobodnih kiseoničnih radikala, kao i superoksidnog anjona nakon 24 h tretmana diazepamom (2,8 puta i 1,5 puta, u odnosu na kontrolu). Utvrđeno je prisustvo auto-fagičnih vakuola i povećanje intenziteta narandžaste flu-orescence (1,4 puta u odnosu na kontrolu).

Zaključak: Ispitivani lek iz grupe benzodiazepina tokom 24h tretmana primenjen na B16 ćelije u kulturi u dozi od 400 µM, pokazuje antiproliferativno i citotoksič-no dejstvo u čijoj se osnovi verovatno nalazi povećana produkcija slobodnih kiseoničnih radikala koja indukuje ćelijsku smrt po tipu autofagije.

Ključne reči: citotoksičnost, B16 mišji melanom, diaze-pam, autofagija.

Abstract:Introduction: High prevalence and lethality of

malignant melanoma, malignant potential and high rate of metastasis, frequent relapses, and the inefficiency of adjuvant therapy are reasons why great efforts are made in investigations of molecular mechanisms of potential cytotoxic compounds.

The Aim: The potential cytotoxic effects of diaze-pam against B16 mouse melanoma cells and mechanisms responsible for its antitumor effect.

Material and methods: Viability rate of B16 treat-ed cells was assessed by acid phosphatase assay. Potential mechanism of the action of diazepam was in-vestigated using flow cytometry analysis. Propidium-iodide, dihydrorhodamine, dihydroethidium and acri-dine-orange staining were used to determine cell cycle distribution, levels of reactive oxigen species, superox-ide anion production and autophagy, respectively. Fluorescence and light microscopy evaluation were made to determine morphological changes of treated cells.

Results: Diazepam demonstrated a cytotoxic ac-tivity against B16 cells after 24–hour exposure (IC50=389.4µM). When used in the same concentration (400 µM) diazepam increased percentage of cells in G2/M phase, compared to control (50.2% vs 21.3%). Free radicals and superoxide anion production after 24–hour treatment were increased (2.8 and 1.5 fold increase, vs control, respectively). Fluorescent microscopy revealed the presence of autophagic vacuoles while flow cytome-try analysis further evidenced increase of orange fluo-rescence (1.4 fold compared to control).

Conclusion: Investigated benzodiazepine drug has significant antiproliferative and cytotoxic activity against B16 mouse melanoma cells. The possible antitu-mor mechanism of its action could be the induction of oxidative stress, which probably initiates autophagy.

Key words: cytotoxicity, B16 mouse melanoma, diaze-pam, autophagy.

UvodProšlo je 200 godina od kada je francuski lekar Rene

Laennac opisao prvi slučaj malignog melanoma (1). To je je-

ISPITIVANJE IN VITRO CITOTOKSIČNOG EFEKTA DIAZEPAMA NA MODELU B16 ĆELIJSKE LINIJE MELANOMA

Autori: Ivana Radulović1

Mentor: Prof. dr Aleksandra Isaković2, dr Anđelka Isaković2

1Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu2Institut za medicinsku i kliničku biohemiju, Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu

42

Medicinski podmladakStudentski radovi


dan od najsmrtonosnijih tumora kože,s obzirom na to da smrtnost od malignog melanoma iznosi čak 71–80% u odnosu na ostale tumore kože (2), a njegova incidenca je konstantno u usponu u proteklih nekoliko decenija (3). U Sjedinjenim Američkim Državama u proteklih četrdeset godina incidenca melanoma porasla je 15 puta, tj. smatra se da jedna osoba umre na svakih šezdeset minuta (4).

Maligni melanom nastaje malignom transformacijom melanocita, ćelija koje pripadaju bazalnom sloju epidermisa i produkuju pigment–melanin (1). Ključ za razumevanje proce-sa kojim se melanociti tranformišu u maligni melanom leži u interakciji genetskih faktora i ultravioletnog (UV) spektra sunčevog zračenja. UVA, a posebno UVB zraci imaju znača-jan uticaj na kancerogenezu. Ultravioletni zraci uzrokuju eri-tem i opekotine, koje su poznati rizik za razvijanje karcinoma kože (1), pri čemu posebno mesto zauzima hronično izlaganje suncu u periodu detinjstva i adolescencije (5). Kod bolesnika sa intermitentnim izlaganjem UV zracima otkriven je porast BRAF mutacija, izmene jednog mesta na egzonu serin-treo-nin kinaze koja je deo RAS signalnog puta (6). Istraživanja su ,takođe, pokazala da displastični nevusi, koji predstavljaju prekusornu leziju maligne melanotične promene, sintetišu vi-še feomelanin, a ova promena u sintezi melanina je posledica genetske modifikacije receptora za melanokortin-1 (7).

S obzirom na činjenicu da poseduje visok maligni po-tencijal i mogućnost metastaziranja, jedinom uspešnom tera-pijom malignog melanoma smatra se rana hirurška ekscizija. U slučaju da se melanom proširi van lokalizovanog regiona, za sada ne postoji ni jedan dovoljno efikasan tretman koji bi mogao produžiti životni vek pacijenta (4).Sprovode se brojna istraživanja u cilju pronalaženja hemioterapeutika koji bi bio efikasan u terapiji ove neoplazije, posebno u svrhu prevenira-nja recidiva i metastatskog oblika melanoma. Trenutni izazov istraživačima predstavljaju imunomodulatorne supstance (8), ali za sada ni ova adjuvantna terapija nije postigla značajan uspeh.

Neuroblastomske ćelije i melanociti vode zajedničko embrionalno poreklo od ćelija neuralne kreste (9) i moguće je da su zadržali neke od karakteristika iste. Poznato je da neu-roblastomske ćelije poseduju receptore za lekove iz grupe benzodiazepina (10, 11). Diazepam, lek iz grupe agenasa koji svoje delovanje ostvaruju putem benzodiazepinskih recepto-ra, deluje preko α-subjedinice GABAA receptora na ćelijskoj membrani (centralni benzodiazepinski receptor) kao pozitiv-ni alosterni modulator i vrši facilitaciju inhibitornog efekta GABA-e (12). Noviji podaci pokazuju da ovaj lek ,takođe, in-tereaguje i preko perifernog receptora, danas poznatog kao protein translokator (translocator protein–TSPO) koji se pr-venstveno nalazi na spoljašnjoj membrani mitohondrija (13). TSPO se nalazi u sprezi sa voltažno zavisnim anjonskim ka-nalom i transporterom adenin nukleotida, koji su komponente tranzicione pore mitohondrije (14). Uključen je u regulaciju transporta i sinteze neurosteroida (15), proliferaciju ćelije (16), imunski odgovor (17), a takođe, pokazano je da je medi-jator u procesu inhibicije mitohondrijalnog disanja (18). Primećeno je i da je primena diazepama u tretmanu Friendove eritroleukemije, dovela do diferencijacije maligno izmenjenih eritroblasta (19), što ih čini podložnijim citotoksičnom dej-stvu hemioterapeutika, tj. lekova koji se koriste u standardnoj

terapiji leukemije. Eksperimentalno je pokazano da benzodi-azepini, koji su agonisti receptora perifernog tipa, imaju zna-čajan uticaj i na proliferaciju melanocita (20). Međutim, do sada nije poznato da li diazepam ima direktno citotoksično dejstvo na ćelije malignog melanoma, in vitro.

U proteklih trideset godina postignut je jako mali na-predak u terapiji metastatskih oblika melanoma (21), a kako melanociti poseduju receptore preko kojih diazepam interagu-je sa unutarćelijskim signalnim sistemom (20, 22) želeli smo da ispitamo mehanizme kojima on ostvaruje potencijalno ci-totoksično dejstvo na B16 ćelije mišjeg melanoma.

Mater ija l i metodeĆelijske kulture i reagensi

Ćelijska linija mišjeg melanoma (B16) dobijena je od European Collection of Animal Cell Cultures (Salisbury, UK). Ova ćelijska linija gajena je u inkubatoru na temperatu-ri od 37°C i vlažnoj atmosferi sa 5% CO2, u medijumu RPMI 1640 (PAA, Austria) koji je obogaćen HEPES-om (20 mM) sa dodatkom 5% fetalnog goveđeg seruma (FBS), kao i 2 mM L-glutamina i miksturom antibiotik/antimikotik (1%). Adherentna ćelijska kultura je pripremana za eksperimente uobičajenom procedurom tripsinizacije sa tripsin/EDTA (PAA, Austria). Za potrebe različitih eksperimenata ćelije su, po tripsinizaciji, zasejavane u ploče sa 96 bunara (8x103 ćelija/bunaru) za procenu ćelijskog vijabiliteta, odnosno, u ploče sa 6 bunara (2,5x105 ćelija/bunaru) za analizu protočnom citoflu-orimetrijom ili analizu morfologije na svetlosnom mikrosko-pu sa faznim kontrastom, nakon 24 h inkubacije sa odgovara-jućim koncentracijama diazepama. Ćelije su tretirane diaze-pamom (Galenika, Zemun, Srbija) koji je rastvaran u DMSO-u (Sigma) (početna koncentracija štok rastvora 100 mM), a za potrebe eksperimenata dalji radni rastvori pripremani su raz-blaživanjem štok rastvora u medijumu (finalna koncentracija DMSO<1%). Svaki eksperiment uključivao je kontrolu (netre-tirane ćelije) kao i kontrolu DMSO (ćelije tretirane maksimal-nom koncentracijom upotrebljenog rastvora DMSO-a).

Ćelijski vijabilitetPraćenje ćelijskog rasta i određivanje vijabiliteta vrše-

no je testom aktivnosti kisele fosfataze, lizozomalnog enzi-ma, čija je aktivnost kvantifikovana posle 24h delovanja dia-zepama. Ćelije su inkubirane sa različitim koncentracijama ispitivanog leka (dvostruko opadajuće koncentracije 400 μM-6,25 μM, kao i maksimalne korišćene koncentracije DMSO-a). IC50 vrednosti izračunate su pomoću računarskog programa GraphPad Prism 4 za Windows. Vrednost IC50 predstavlja onu koncentraciju ispitivanog jedinjenja koja dovodi do smanjenja vijabiliteta ćelija za 50% u odnosu na kontrolu (netretirane ćelije).

Test kisele fosfataze zasniva se na hidrolizi p-nitrofe-nil-fosfata (PNPP) intracelularnom kiselom fosfatazom, pri čemu nastaje žuti p-nitrofenil-hromofor. Jači intenzitet boje ukazuje na veću aktivnost lizozoma, tj. veći vijabilitet ćelija. Nakon 24 h tretmana ćelija, odstranjen je medijum koji je sa-držao diazepam a zatim dodat pufer sa supstratom (10 mM PNPP u 0,1 M Na-acetata, pH=5,5; sa dodatkom 0,1% Triton-X). Reakcija je zaustavljena nakon 2 h inkubacije (na 37°C) sa 1 M Na-hidroksidom. Apsorbance su merene na ta-

43



lasnoj dužini od 405 nm na automatskom čitaču za mikrotitar-ske ploče (Sunrise, TECAN, UK) i rezultati su predstavljeni u procentima vijabiliteta u odnosu na netretirane ćelije u kon-troli (vijabilitet arbitrarno postavljen na 100%). Po završenom 24 h tretmanu sa odabranom koncentracijom diazepama, morfologija B16 ćelija praćena je pomoću svetlosnog mikro-skopa sa faznim kontrastom.

Analiza uzoraka na protočnom citofluorimetruIspitivanje mehanizma citotoksičnog dejstva diazepa-

ma izvedeno je nakon 24 h inkubacije B16 ćelija sa koncentra-cijom rastvora diazepama koja je bliska IC50 vrednosti anali-zom uzoraka na FACSCalibur protočnom citofluorimetru (BD, Heidelberg, Germany) primenom originalnog računar-skog programa Cell Quest Pro (BD).

Ćelijski ciklusAnaliza ćelijskog ciklusa vršena je određivanjem sadr-

žaja DNK u ćelijama bojenjem sa propidijum jodidom (PI) koji prolazi kroz oštećenu ćelijsku i jedarnu membranu, i in-terkalira se za DNK. Ekscitacijom uzorka svetlom plavog spektra (argonski laser, 488nm) PI emituje fluorescencu crve-ne boje koja se detektuje u FL2 kanalu protočnog citofluori-metra. Emitovana fluorescenca odgovara sadržaju DNK u će-liji, što odgovara različitim fazama ćelijskog ciklusa (subG0, G1, S i G2/M).

Po isteku inkubacije sa diazepamom, ćelije su tripsini-zirane i fiksirane u hladnom 70% etanolu (-20°C). Nakon 24 h na +4°C i inkubiranja sa ribonukleazom (100 μg/mL, 30 mi-nuta na 37°C), ćelije su obojene rastvorom PI (25 μg/mL, 15 minuta na 37°C), i zatim analizirane na protočnom citofluori-metru. Kvantifikacijom DNK određivan je procenat ćelija u svakoj fazi ćelijskog ciklusa (subG0, G1, S i G2/M).

Merenje produkcije slobodnih kiseoničnih radikala – bojenje dihidrorodaminom

Intracelularna produkcija kiseoničnih slobodnih radi-kala (ROS) određena je merenjem intenziteta zelene fluore-scence emitovane od strane redoks–senzitivne boje dihidro-rodamina 123 (DHR; Sigma). Boja je dodata ćelijskim kultu-rama (finalna koncentracija 5 μM) 1 h pre završetka tretmana. Rezultati su prezentovani kao srednje vrednosti (Mean) inten-ziteta zelene fluorescence koja je registrovana u FL1 kanalu protočnog citofluorimetra.

Merenje produkcije superoksidnog radikala – bojenje dihidroetidijumom

Produkcija superoksidnih anjona ispitivana je boje-njem fluorohromom dihidroksietidijumom (DHE). DHE pri-sutan u citosolu emituje plavu fluorescencu. Pod uticajem su-peroksidnog anjona, DHE se oksiduje do etidijuma, koji po-tom interkalira sa DNK uz emisiju crvene fluorescence u je-dru, koja se registruje u FL2 kanalu protočnog citofluorime-tra. Po završetku tretmana, uzorcima je dodat DHE (finalna koncentracija 20 μM) i nakon inkubacije u trajanju od 35 mi-nuta (na 37°C), izvršena je analiza na protočnom citofluori-metru.

Ispitivanje autofagijeZa potrebe ispitivanja prisustva autofagije, ćelije su po

završetku 24 h inkubacije sa diazepamom inkubirane 30 min na 37°C sa pH senzitivnom supravitalnom bojom akridin-o-ranž (AO, Sigma) (finalna koncentracija 1 μM). AO boji kisele citoplazmatske autofagolizozome narandžasto/crveno dok su citoplazma i nukleusi obojeni zeleno. Pošto su ćelije tretirane i obojene AO, primenom fluorescentnog mikroskopa vizuali-zovana je pojava autofagolizozoma–narandžaste vezikule u zeleno obojenoj citoplazmi, dok je njihova kvantifikacija izvr-šena analizom ovih uzoraka na protočnom citofluorimetru–autofagija se na protočnom citofluorimetru detektuje kao po-većanje intenziteta narandžaste (FL3) u odnosu na zelenu (FL1) fluorescencu (povećanje odnosa FL3/FL1).

Statistička analizaVrednosti vijabiliteta izražene su kao srednja vrednost

± standardna devijacija (SD). Vijabilitet tretiranih ćelija upo-ređivan je sa vijabilitetom kontrole (netretirane ćelije). Statistička značajnost razlike analizirana je ANOVA testom. Statistički podaci analizirani su računarskim programom GraphPad Prism 4 for Windows.

Rezultat iIspitivanje vijabiliteta

Ispitivanjem vijabiliteta pomoću testa kisele fosfataze pokazano je da diazepam dovodi do statistički značajnog smanjenja vijabiliteta B16 ćelija tek u koncentracijama većim od 200 µM (vijabilitet ćelija 77,2%). Izračunato je da koncen-tracija leka koja dovodi do smanjenja vijabiliteta ćelija za 50%, u odnosu na kontrolu nakon 24h tretmana, iznosi 389,4 μM (Grafikon 1).

Grafikon 1. Vijabilitet B16 ćelijske linije malignog melanoma nakon 24 h tretmana različitim koncentracijama diazepama, utvrđen testom aktivnosti kisele fosfataze. Vijabilitet ćelija predstavljen je kao procenat živih ćelija u odnosu na kontrolu. Sve vrednosti su prikazane kao X±SD dobijene iz tri nezavi-sna merenja.

44



Analizom morfologije B16 ćelija nakon tretmana sa di-azepamom, uočava se smanjenje broja živih ćelija (adherent-ne, poligonalne), uz povećanje broja mrtvih ćelija (okrugle, svetle, odlepljene od podloge). Promena oblika uočava se me-đu živim ćelijama, a podrazumeva stvaranje struktura sličnih dendritima i izduživanje same ćelije (Slika 1).

Slika 1. Svetlosna mikroskopija netretiranih B16 ćelija (kon-trola, A) i ćelija tretiranih diazepamom (400μM, B), nakon 24 h (uveličanje 100x).

Analiza ćelijskog ciklusaSadržaj DNK analiziran je bojenjem sa PI i dobijeni

rezultati su prikazani na slici 2. Zapaža se povećan procenat ćelija u G2/M fazi ćelijskog ciklusa i značajno smanjen broj ćelija u S ali i u G1 fazi, u odnosu na netretirane ćelije. Ovi rezultati ukazuju na to da ćelije prolaze uobičajenom kineti-kom kroz S fazu, ali ne prolaze kroz G2, u kojoj se zaustavlja-ju. Usled toga, u koncentraciji koja je blizu IC50 (400 μM) na-kon 24 h tretmana dolazi do „nagomilavanja“ ćelija u G2 fazi ćelijskog ciklusa (50,2% vs. 21,3% u kontroli) i posledičnog smanjenja broja ćelija u fazi umnožavanja sadržaja DNK (8,9% vs. 18,7% u kontroli). Ovakav rezultat ukazuje na to da ispitivana supstanca ima značajan antiproliferativan efekat na B16 ćelije mišjeg melanoma, in vitro.

Ispitivanje prisustva slobodnih kiseoničnih radikala i superoksidnog anjona

Produkcija kiseoničnih slobodnih radikala analizirana je merenjem intenziteta zelene fluorescence emitovane od strane fluorohroma DHR, kojim su bojene B16 ćelije nakon tretmana ispitivanim lekom. Zapaža se pomeranje histogram-

skog zapisa detektovane zelene fluorescence u prisustvu 400 μM diazepama udesno u odnosu na kontrolu (slika 3A). Pokazano je da nakon 24 h inkubacije rastvorom diazepama (400 μM) dolazi do porasta srednje vrednosti intenziteta zele-ne fluorescence 2,8 puta (kontrola 26,3; tretitane ćelije 74,5) (slika 3B).

0 2 0 0 4 0 0 6 0 0 8 0 0 1 0 0 0F L 2 - A

kontrola

diazepam (400μM)

0 2 0 0 4 0 0 6 0 0 8 0 0 1 0 0 0F L 2 - A

kontrola

diazepam (400μM)

Slika 2. Originalni histogramski prikaz kontrolnog uzorka (netretirane ćelije) i B16 ćelija tretiranih sa 400µM diazepa-ma, nakon bojenja propidijum jodidom, dobijen analizom na protočnom citofluorimetru.

A

100 101 102 103 104FL1-H

diazepam (400μM)kontrola

A

100 101 102 103 104FL1-H


100 101 102 103 104FL1-H

100 101 102 103 104FL1-H


B uzorak Mean

kontrola 26,29

diazepam 400μM 75,50

B uzorak Meankontrola 26,29


Slika 3. Efekat diazepama na produkciju slobodnih kiseonič-nih radikala. A – Originalni histogramski prikaz produkcije slobodnih kiseoničnih radikala u kontrolnom uzorku i pod tretmanom diazepamom, analiziran protočnom citoflurime-trijom (DHR bojenje) po 24 h tretmanu B16 ćelijske linije; B – Tabelarni prikaz vrednosti intenziteta zelene fluorescen-ce (Mean) ćelija u kontroli i nakon tretmana diazepamom (400μM).

45



Produkcija superoksidnog kiseoničnog radikala anali-zirana je merenjem intenziteta crvene fluorescence emitovane od strane fluorohroma DHE kojim su bojene B16 ćelije nakon tretmana ispitivanim lekom. 24 h inkubacija sa diazepamom dovela je do povećanja srednje vrednosti intenziteta crvene fluorescence tretiranih ćelija u odnosu na kontrolu, što je vi-zualizovano pomeranjem histogramskog zapisa tretmana udesno u odnosu na kontrolu (slika 3A). Intenzitet crvene flu-orescence u tretmanu (400 μM) se u odnosu na kontrolu pove-ćao 1,5 puta (kontrola 24,8, tretman 36,9) (slika 3B).

Ispitivanje prisustva autofagijeAnaliza B16 ćelija obojenih pH senzitivnom bojom

akridin-oranž, nakon 24 h tretmana ispitivanim lekom, izvr-šena je kvalitativno posmatranjem ćelija pod fluorescentnim mikroskopom i kvantitativno merenjem intenziteta narandža-ste i zelene fluorescence emitovane od strane AO, na protoč-nom citofluorimetru. Fluorescentnom mikroskopijom se u ćelijama tretiranim sa 400 μM diazepama uočava prisustvo narandžastih vakuola, što bi odgovaralo autofagolizozomima, dok u kontrolnim ćelijama ove vakuole nisu uočljive (slika 5).

Rezultati analize protočnim citofluorimetrom pokazu-ju da je došlo do značajne promene odnosa crvene i zelene fluorescence nakon tretmana diazepamom u koncentraciji od 400 μM (FL3/FL1=1,43) u odnosu na kontrolu (arbitrarno FL3/FL1=1) (slika 6).

Slika 6. Efekat diazepama na indukciju autofagije. Histo-gramski prikaz analize odnosa narandžaste (FL3) i zelene (FL1) fluorescence protočnom citofluorimetrijom u B16 ćeli-jama (kontrolne netretirane ćelije i tretman sa diazepamom 400 µM). Odnos narandžaste i zelene fluorescence (FL3/FL1) netretiranih (kontrola), i ćelija tretiranih tokom 24h diazepa-mom u koncentraciji od 400 μM (tretman) je prikazan u okvi-ru odgovarajućeg histograma.

100 101 102 103 104FL1-H

FL3/FL1=1,00kontrola

100 101 102 103 104FL1-H

100 101 102 103 104FL1-H

100 101 102 103 104FL1-H

FL3/FL1=1,00kontrola

100 101 102 103 104FL1-H

FL3/FL1=1,43tretman

100 101 102 103 104FL1-H

100 101 102 103 104FL1-H

100 101 102 103 104FL1-H

FL3/FL1=1,43tretman

A

B

Slika 5. Fluorescentna mikroskopija netretiranih ćelija (kon-trola, A) i ćelija tretiranih diazepamom (400µM, B), nakon 24 h inkubacije (bojenje AO, uveličanje 100x).

A

100 101 102 103 104FL2-H


A

100 101 102



B

uzorak Meankontrola 24,83


Buzorak Meankontrola 24,83


Slika 4. Efekat diazepama na produkciju superoksidnog an-jona. A–Originalni histogramski prikaz produkcije superok-sidnog kiseoničnog radikala u kontrolnom uzorku i pod tret-manom diazepamom, analiziran protočnom citoflurimetrijom (DHE bojenje) po 24 h tretmanu B16 ćelijske linije; B – Tabe-larni prikaz vrednosti intenziteta crvene fluorescence (Mean) ćelija u kontroli i nakon 24 h tretmana diazepamom (400μM).

46



DiskusijaImajući u vidu incidencu koja rapidno raste proteklih

godina, kao i visok letalitet koji izaziva (3, 23, 24), maligni melanom predstavlja značajan problem savremene onkologi-je. Pacijenti sa malignim oboljenjima skloni su anksioznosti i čestoj upotrebi anksiolitičkih lekova. Stoga su uticaji benzodi-azepinskih liganada u kombinaciji sa standardnim hemiotera-peuticima bili predmet raznih analiza. Pokazano je da pored očekivanog terapijskog efekta benzodiazepini prouzrokuju i pojačavanje dejstva hemioterapeutika. Diazepam može da po-tencira citotoksično dejstvo 5-fluorouracila na ćelije kolorek-talnog adenokarcinoma (25). On ,takođe, povećava citotoksi-čan uticaj etopozida na ćelije glioma, dok u monoterapiji sma-njuje njihov vijabilitet (26). Sinergističko delovanje pokazuje i u kombinovanoj terapiji sa interferonom (27). Rezultati istra-živanja na ćelijama humanog melanoma su pokazala da se ovaj antiproliferativni efekat benzodiazepina verovatno ostvaruje inhibicijom Ca2+/PKC signalnog puta (20). Imajući u vidu ove činjenice koje pokazuju da diazepam može poten-cirati dejstvo različitih hemioterapeutika, ali i da primenjen kao monoterapija ima antiproliferativni efekat, kao i podatak da detaljni mehanizmi ovakvih njegovih efekata do sada nisu opisani, našu istraživačku pažnju usmerili smo ka ispitivanju citotoksičnih efekata diazepama na ćelijama mišjeg melano-ma in vitro, kao i rasvetljavanju unutarćelijskih procesa koji bi eventualno objasnili ovakve efekte.

Ispitivana supstanca iz grupe benzodiazepinskih leko-va dovela je do značajnog smanjenja vijabiliteta B16 ćelija na-kon 24h tretmana, pri čemu su korišćene koncentracije koje su u skladu sa koncentracijama poznatim iz prethodnih publika-cija (20).

Kako bismo analizirali unutarćelijske mehanizme cito-toksičnog delovanja diazepama, analiziran je ćelijski ciklus tretiranih i kontrolnih tumorskih ćelija. Pokazano je da diaze-pam ne dovodi do povećanja procenta ćelija sa fragmentisa-nom DNK (SubG0), ali da bi razlog smanjenog vijabiliteta mogao biti objašnjen povećanjem procenta ćelija u G2/M fazi ćelijskog ciklusa, tj. zaustavljanjem ćelija u ovoj fazi. Naša analiza ćelijskog ciklusa u saglasnosti je sa podacima iz lite-rature po kojima diazepam ima aneugeno dejstvo, što znači da indukuje stvaranje monopolarnog deobnog vretena i sprečava separaciju centriola tokom prometafaze (28). Analiziranjem tretiranih ćelija pod svetlosnim mikroskopom utvrdili smo promenu njihovih morfoloških osobina, tj. fenotipa, pri čemu je bilo primetno formiranje nastavaka koji liče na produžetke neuronskih ćelija, što bi se moglo dovesti u vezu sa procesom diferencijacije ovih ćelija. Iako u ovom istraživanju nisu de-taljnije razmatrani razlozi diferencijacije, potencijalno obja-šnjenje nalazimo u podacima iz literature po kojima diazepam smanjuje intracelularne nivoe nukleotida (22), s obzirom na to da poznati agensi koji dovode do diferencijacije ćelija (tiazo-furin, mikofenolična kiselina) dovode i do deplecije unutarće-lijskog sadržaja nukleotida (29, 30).

Poznato je da vezivanje liganda za TSPO dovodi do inhibicije mitohondrijalne respiracije (18), što je uslovilo da sledeći korak istraživanja bude ispitivanje produkcije slobod-nih kiseoničnih radikala u ćelijama B16 melanoma pod utica-jem diazepama. Rezultati su pokazali značajno povećanje produkcije ROS, kao i superoksidnog anjona, nakon 24h tret-

mana diazepamom, što je u skladu sa literaturnim podacima da diazepam povećava lipidnu peroksidaciju (31).

Dalji tok našeg istraživanja obuhvatio je analizu prisu-stva autofagije u tretiranim ćelijama. Autofagija je proces koji uključuje sekvestraciju ćelijskih struktura u organele sa dvo-strukom membranom–autofagozome (32). Nakon fuzije auto-fagozoma sa lizozomima i formiranja autolizozoma, dolazi do razgradnje sadržaja kiselim lizozomalnim hidrolazama. Fiziološka uloga autofagije je da odstrani proteine i oštećene organele, ali kada je obimna, neadekvatno aktivirana ili u će-lijama koje ne mogu da uđu u proces apoptoze, ona deluje kao alternativni put ćelijske smrti, poznata kao programirana će-lijska smrt tip II (33,34). Autofagija može delovati i kao meha-nizam opstanka ćelije koji obezbeđuje energiju tokom meta-boličkog stresa i štiti ćelije od apoptotičke ili nekrotičke smrti indukovane različitim anititumorskim agensima (35). Analiza tretiranih ćelija protočnim citofluorimetrom pokazala je da diazepam dovodi do povećanja sadržaja kiselih vezikula koje odgovaraju autofagolizozomima, što odgovara indukciji auto-fagije u B16 ćelijama. Ovaj nalaz je bio očekivan s obzirom na prethodno pokazanu indukciju oksidativnog stresa i značajnu citotoksičnost koja se ne može objasniti fragmentacijom DNK.

U ovom radu nisu ispitivani unutarćelijski signalni pu-tevi koji bi mogli dovesti do indukcije autofagije. Dobijeni rezultati našeg istraživanja nameću potrebu za daljim ispitiva-njem, prvenstveno detektovanje aktiviranih unutarćelijskih enzima metodom imunoblota. Jedan od potencijalnih signal-nih puteva koji bi trebalo analizirati je i AMPK/mTOR. Literaturni podaci ukazuju da proces autofagije može biti po-krenut i aktivacijom AMPK, enzima koji se aktivira u broj-nim stanjima koja izazivaju ćelijski stres (36), pri čemu svoje dejstvo ostvaruje inhibicijom mTOR kompleksa koji reguliše i određene korake u G2/M fazi ćelijskog ciklusa (37–40).

Zaključci do kojih smo došli ovim istraživanjem su sledeći:

• Diazepam pokazuje značajno antiproliferativno i citotoksično dejstvo na B16 ćelije mišjeg melanoma

• Ispitivani član benzodiazepina dovodi do inhibicije progresije ćelijskog ciklusa, tj. do zaustavljanja ćelija u G2M fazi

• Mogući tip ćelijske smrti koju diazepam indukuje primenjen na B16 ćelije mišjeg melanoma je au-tofagija indukovana oksidativnim stresom

Literatura1. Jhappan C, Noonan FP, Merlino G. Ultraviolet radiation

and cutaneous malignant melanoma. Oncogene 2003; 22:3099–112.

2. Malatestinić D, Nadarević-Stefanec V, Suljić P, Glazar B, Janković S. Increasing burden of melanoma in Croatia. Coll Antropol. 2011; 35 Suppl 2:267–70.

3. Cho YR, Chiang MP. Epidemiology, staging (new sys-tem), and prognosis of cutaneous melanoma. Clin Plast Surg. 2010; 37(1):47–53.

4. Chudnovsky Y, Khavari PA, Adams AE. Melanoma ge-netics and the development of rational therapeutics. J Clin Invest. 2005; 115(4):813–24.

5. Garbe C. The sun and malignant melanoma. Hautarzt. 1992; 43(5):251–7.

47



6. Maldonado JL, Fridlyand J et al. Determinants of BRAF mutations in primary melanomas. J Natl Cancer Inst. 2003; 95(24):1878–90.

7. Pavel S, Smit NP. Risk factors for skin melanoma: genetic factors probably more important than exposure to sun-light. Ned Tijdschr Geneeskd. 2004; 148(46):2267–72.

8. Davar D, Tarhini A, Kirkwood JM. Adjuvant therapy: melanoma. J Skin Cancer. 2011;2011:274382.

9. Rawles ME. Origin of pigment cells from the neural crest in the mouse embryo. Physiol Zool. 1947; 20(3):248–66.

10. Syapin PJ, Skolnick P. Characterization of benzodiazepine binding sites in cultured cells of neural origin. J Neurochem. 1979; 32(3):1047–51.

11. Baraldi M, Guidotti A, Schwartz JP, Costa E. GABA re-ceptors in clonal cell lines: a model for study of benzodi-azepine action at molecular level. Science. 1979; 205(4408):821–3.

12. DeLorey TM, Olsen RW. Gamma-aminobutyric acidA re-ceptor structure and function. J Biol Chem. 1992; 267(24):16747–50.

13. Veenman L, Levin E et al. Peripheral-type benzodiaze-pine receptor density and in vitro tumorigenicity of glio-ma cell lines. Biochem Pharmacol. 2004; 68(4):689–98.

14. Sarnowska A, Beresewicz M, Zabłocka B, Domańska-Janik K. Diazepam neuroprotection in excitotoxic and oxidative stress involves a mitochondrial mechanism ad-ditional to the GABAAR and hypothermic effects. Neurochem Int. 2009; 55(1–3):164–73.

15. Papadopoulos V, Amri H et al. Peripheral benzodiazepine receptor in cholesterol transport and steroidogenesis. Steroids. 1997; 62(1):21–8.

16. Schlumpf M, Lichtensteiger W, van Loveren H. Impaired host resistance to Trichinella spiralis as a consequence of prenatal treatment of rats with diazepam. Toxicology. 1994; 94(1–3):223–30.

17. Lazzarini R, Malucelli BE, Palermo-Neto J. Reduction of acute inflammation in rats by diazepam: role of peripheral benzodiazepine receptors and corticosterone. Immunopharmacol Immunotoxicol. 2001; 23(2):253–65.

18. Hirsch JD, Beyer CF, Malkowitz L, Beer B, Blume AJ. Mitochondrial benzodiazepine receptors mediate inhibi-tion of mitochondrial respiratory control. Mol Pharmacol. 1989; 35(1):157–63.

19. Clarke GD, Ryan PJ. Tranquillizers can block mitogenesis in 3T3 cells and induce differentiation in Friend cells. Nature. 1980; 287(5778):160–1.

20. Crocker CE, Niles LP. Benzodiazepine-induced inhibition of human malignant melanoma (M-6) cell growth. Anticancer Res. 1996; 16(3A):1259–63.

21. Haanen J. Issues around melanoma. Ned Tijdschr Geneeskd. 2011; 155(45):A3836.

22. Landau M, Weizman A et al. Antiproliferative and differ-entiating effects of benzodiazepine receptor ligands on B16 melanoma cells. Biochem Pharmacol. 1998; 56(8):1029–34.

23. Nestle, M., and Carol, H. 2003. Melanoma. In: Bolognia J, Jorizzo j, and Rapini R, editors. Dermatology. New York: Mosby Inc.; 2003. p.1789–1815.

24. Rigel DS. The effect of sunscreen on melanoma risk. Dermatol Clin 2002; 20: 601–6.

25. Lee SW, Lee JT et al. In vitro antiproliferative character-istics of flavonoids and diazepam on SNU-C4 colorectal adenocarcinoma cells. J Nat Med. 2009; 63(2):124–9.

26. Lavicka J, Sarisský M, Mirossay A, Sulla I, Mojzis J, Mirossay L. Diazepam enhances etoposide-induced cyto-toxicity in U-87 MG human glioma cell line. Fundam Clin Pharmacol. 2001; 15(3):201–7.

27. Solowey WE, Pestka S, Spector S, Fryer RI, Fisher PB. Peripheral-acting benzodiazepines inhibit the growth of human melanoma cells and potentiate the antiproliferative activity of recombinant human interferons. J Interferon Res. 1990; 10(3):269–80.

28. Spurck TP, Pickett-Heaps JD. The effects of diazepam on mitosis and the microtubule cytoskeleton. I. Observations on the diatoms Hantzschia amphioxys and Surirella ro-busta. J Cell Sci. 1994; 107 ( Pt 9):2643–51.

29. Zoref-Shani E, Lavie R et al. Effects of differentiation-in-ducing agents on purine nucleotide metabolism in an ovar-ian cancer cell line. J Cancer Res Clin Oncol. 1994; 120(12):717–22.

30. Sidi Y, Beery E, Panet C, Wasserman L, Novogrodsky A, Nordenberg J. Growth inhibition and induction of pheno-typic alterations by tiazofurin: differential effects on MCF-7 breast cancer and HBL-100 breast cell lines. Eur J Cancer Clin Oncol. 1989; 25(5):883–9.

31. Gagné F, André C, Gélinas M. Neurochemical effects of benzodiazepine and morphine on freshwater mussels. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 2010; 152(2):207–14.

32. Yorimitsu T, Klionsky DJ. Autophagy: molecular machin-ery for self-eating. Cell Death Differ. 2005; 12 Suppl 2:1542–52.

33. Mizushima N, Levine B, Cuervo AM, Klionsky DJ. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 2008; 451(7182):1069–75.

34. Maiuri MC, Zalckvar E, Kimchi A, Kroemer G. Self-eating and self-killing: crosstalk between autophagy and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007; 8(9):741–52.

35. White E. Autophagic cell death unraveled: Pharmacological inhibition of apoptosis and autophagy enables necrosis. Autophagy. 2008; 4(4):399–401.

36. Kahn BB, Alquier T, Carling D, Hardie DG. AMP-activated protein kinase: ancient energy gauge provides clues to modern understanding of metabolism. Cell Metab. 2005; 1(1):15–25.

37. Shaw RJ. LKB1 and AMP-activated protein kinase con-trol of mTOR signalling and growth. Acta Physiol (Oxf). 2009; 196(1):65–80.

38. He C, Klionsky DJ. Regulation mechanisms and signaling pathways of autophagy. Annu Rev Genet. 2009; 43:67–93.

39. Meijer AJ, Codogno P. Regulation and role of autophagy in mammalian cells. Int J Biochem Cell Biol. 2004; 36(12):2445–62.

40. Guertin DA, Sabatini DM. Defining the role of mTOR in cancer. Cancer Cell. 2007; 12(1):9–22.

48



Sažetak:Uvod: Fenciklidin (PCP) je antagonist NMDA re-

ceptora. Primena fenciklidina kod ljudi izaziva pozitivne i negativne simptome shizofrenije. Prenatalna primena fenciklidina kod pacova je prihvaćena kao eksperimen-talni model shizofrenije. Risperidon, atipični antipsiho-tik, je antagonist D2 i 5-HT receptora. Priroda neurohe-mijskih poremećaja kod shizofrenije je još uvjek nepo-znata, a jedan od bitnih faktora je oksidativni stre.

Cilj: Ispitati uticaj risperidona na aktivnost i ek-spresiju superoksid dismutaze, kao i na koncentraciju lipidnih peroksida u korteksu i hipokampusu pacova pe-rinatalno tretiranih fenciklidinom.

Materijal i metode: Četiri grupe Wistar pacova tretirane su 2-og, 6-og, 9-og i 12-og postnatalnog (PN) dana fenciklidinom (10 mg/kg tm) ili fiziološkim rastvo-rom natrijum hlorida (s.c.). Od 35. PN dana dve grupe: kontrolna (NaCl-RSP grupa) i eksperimentalna (PCP-RSP grupa) dobijale su risperidon u vodi. Životinje su žrtvovane PN dana 100. Risperidon je primenjivan oral-no u dozi 0,84 mg/kg TT/ dan. Aktivnost SOD i koncen-tracija lipidnih peroksida (MDA) određivani su spektro-fotometrijski, a ekspresija SOD Western blot tehnikom.

Rezultati: Aktivnost SOD u korteksu i hipokampu-su pacova iz PCP grupe bila je značajno niža nego u kontroli. Primena risperidona je ,takođe, dovela do zna-čajnog smanjenja aktivnosti SOD, što nije praćeno zna-čajnim promenama u ekspresiji SOD1 i SOD2. Koncentracija MDA u korteksu pacova bila je značajno povišena u odnosu na kontrolu samo u PCP-RSP grupi, dok je u hipokampusu bila značajno viša u PCP grupi u poredjenju sa kontrolnom grupom, a primena risperido-na dovela je do normalizacije.

Zaključak: Perinatalna primena PCP-a dovodi do povećanja pokazatelja oksidativnog stresa u mozgu teti-ranih životinja, a risperidon deluje protektivno samo u hipokampusu.

Ključne reči: Shizofrenija, fenciklidin, risperidon, oksi-dativni stres.

Abstract:Introduction: Phencyclidine (PCP) acts as a non-

competitive NMDA antagonist. Phencyclidine is a psy-chostimulans capable of producing both positive and negative symptoms of schizophrenia. Perinatal phency-clidine administration has been widely accepted as an experimental model of schizophrenia. Risperidone, atypical antipsychotic, acts as antagonist of D2 and 5-HT receptors. Nature of neurochemical misbalance still remains unknown. One of the factors included in ethiopathology of the disease is oxidative stress.

Aim: To determine the effects of risperidone on expression and activity of superoxide dismutase, and concentration of lipid peroxides in cortex and hippo-campus of rats perinatally treated with phencyclidine.

Material and methods: Four groups of Wistar rats were treated on postnatal (PN) day 2, 6, 9 and 12 with either PCP (10 mg/kg) or saline s.c. From PN 35, two groups: one control (NaCl-RSP) and one experimental (PCP-RSP) were reciving risperidone in drinking water at dosage 0.84 mg/kg/day. Rats were sacrificed on PN100. Activity of SOD and concentration of lipid per-oxides (MDA) was determined spectrophotometriclly. Expression of SOD was determined by Western blot technique.

Results: Activity of SOD in cortex and hippocam-pus of rats from PCP group was significantlly lower than control.Treatment with risperidone also led to a si-ginificant decrease in activity of SOD, which was not assosiated with changes in expression of SOD-1 and SOD-2. Concetration of MDA in cortex was significantly elevated in comparison to PCP-RSP group. Concentration of MDA in hippocampus was significant-ly higher in PCP-group than in control group,while ris-peridone treatmen led to normalisatio.

Conclusion: Perinatal treatment of PCP leads to elevation of parameters of oxidative stress, and risperi-done has protective effects only in hippocampus.

Key words: Schizophrenia, phencyclidine, risperidone, oxidative stress.

UTICAJ RISPERIDONA NA KONCENTRACIJU LIPIDNIH PEROKSIDA I AKTIVNOST I EKSPRESIJU SUPEROKSID

DIZMUTAZE U MOZGU PACOVA PERINATALNO TRETIRANIH FENCIKLIDINOM

Autor: Nebojša Marković1

Mentor: Doc. dr Nevena Radonjić2, Prof. dr Nataša Petronijević2

1 Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu2 Institut za medicinsku i kliničku biohemiju, Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu

49



UvodShizofrenija predstavlja teško neuropsihijatrijsko obo-

ljenje koje pogađa oko 1% stanovništva (1). Najčešće se javlja kod maldih osoba, ima hroničan tok i značajno onesposoblja-va obolele. Shizofrenija i grupa shizofrenih poremećaja sasto-je se od dve grupe sindroma koji se međusobno prepliću: pro-duktivni (pozitivni) i neproduktivni (negativni) simptomi. Pozitivni simptomi mogu biti: halucinacije, deluzije, poreme-ćaj mišljenja, govora i ponašanja. Negativni simptomi su alo-gija, gubitak volje, afektivno zaravnjivanje. Etiopatologija oboljenja je vrlo kompleksna i smatra se da niz genetskih, ra-zvojnih i socijalnih faktora dovodi do kliničkog ispoljavanja bolesti (2). Olney i sar. (1995) su predložili NMDA receptor-sku hipofunkciju kao primarni patogenetski mehanizam ovog oboljenja (3).

Brojni podaci ukazuju na uticaj i ulogu oksidativnog stresa u patogenezi shizofrenije. Oksidativni stres nastaje kao posledica disbalansa između stvaranja slobodnih radikala i njihove neutralizacije. Slobodni kiseonični radikali nastaju u normalnim fiziološkim metaboličkim reakcijama, ali u malim količinama i organizam može da ih neutrališe. Supeoksid an-jon radikal (O2

-) nastaje najvećim delom nekompletnom re-dukcijom kiseonika u respiratornom lancu mitohondrija. Enzim superoksid-dismutaza (SOD) katalizuje reakciju pre-vođenja slobodnih kiseoničnih radikala u vodonik-peroksid i vodu. Postoje tri izoforme ovog enzima i to: citosolna (CuZn SOD), mitohondrijalna (MnSOD), i ekstracelularna SOD (4).

Citosolna SOD je prisutna u svim tkivima a posebno visoku aktivnost ispoljava u mozgu, jetri, nadbubrežnim žle-zdama i srcu. Transgeni miševi sa prekomernom ekspresijom CuZn-SOD gena su se pokazali otpornijim od svojih srodnika na okisadtivni stres uključujući ishemijsko-reperfuzijsku po-vredu (5).

Mitohondrijalna SOD ima ključnu ulogu u regulaciji koncentracije superoksidnih anjona u ćeliji. Serumske prome-ne mitohondrijalne SOD povezane su sa brojnim neurodege-nerativnim oboljenjima uključujući i Parkinsonovu bolest, Dišenovu mišićnu distrofiju (6). Citokini kao sto su INF-γ, IL-1β i lipopolisaharidi mogu da indukuju ekspresiju mitohon-drijalne SOD (7, 8, 9, 10). Pokazano je da povećana ekspresija mitohondrijalne SOD može da spreči aktivaciju caspase-3 i apoptozu posredovanu TNF-α (11).

Podaci iz literature pokazuju da je aktivnost ukupne SOD povećana kod pacijenata sa hroničnom shizofrenijom (12, 13, 14, 15, 16), dok je aktivnost enzima kod pacijenata sa prvom epizodom bolesti koji nisu primali neuroleptike u pla-zmi snižena (17) .

Lipidna peroksidacija predstavlja oštećenje lipida će-lijske membrane, lipoproteina i durgih jedinjenja koja sadrže lipide pod dejstvom slobodnih radikala. Kao krajnji proizvod reakcije između lipida i slobodnih radikala nastaju isparljivi ugljovodonici i aldehidi, među kojima je najspecifičniji malo-nildialedhid (MDA). Odredjivanje koncentracije MDA koristi se za procenu stepena lipidne peroksidacije. Lipidni peroksidi dovode do oštećenja integriteta ćelijske membrane kao i pore-mećaja transporta kroz ćelijsku membranu. Visok nivo produ-kata lipidne peroksidacije je primećen u plazmi (18, 19), eri-trocitima (20) i u cerebrospinalnoj tečnosti shizofrenih pacije-nata (21).

Fenciklidin (PCP) je nekompetitvni antagonista NMDA receptora. Sintetisan je dvadesetih godina prošlog ve-ka. Pedesetih godina prošlog veka korišćen je kao opšti ane-stetik. Ubrzo je utvrđeno da izaziva brojna neželjena dejstva kao što su dezorijentisanost, halucinacije, paranoja, nakon čega je i povučen iz upotrebe i klasifikovan kao disocijativni anestetik (22). Pored delovanja na NMDA receptore on deluje još i na serotoninske, acetilholinske i GABAergičke recepto-re. Perinatalna primjena fenciklidina prihvaćena je kao aktu-elni animalni model shizofrenije (23, 24). Taj model se zasni-va hipofunkciji NMDA receptora, koja izaziva brojne biohe-mijske, struktrune, bihevioralne promene slične onima koje se javljaju kod pacijenata obolelih od shizofrenije. Blokada NMDA receptora ,takođe, dovodi do kognitivnih poremećaja kod ljudi (4).

Risperidon je razvijen devedestih godina prošlog veka kao druga generacija atipičnih antipsihotika. Koristi se u leče-nju shizofrenije, shizoafektivnih poremećaja, bihevioralnih problema ljudi koju boluju od autizma i bipolarnih poremeća-ja. Risperidon deluje kao antagonist D2 i 5-HT2 receptora. Upravo dejstvo na 5-HT2 receptore povezano je sa njegovim antipsihotičnim delovanjem i smanjenjem neželjnih ekstrapi-ramidalnih efekata koji su glavni nedostatci klasičnih antipsi-hotičnih lekova. Delovanje na 5-HT2 receptore je povezano i sa povećanjem telesne mase koja je posledica korištenja ovog leka. Pored delovanja na D2 i 5-HT2 receptore deluje jos i na α-adrenergičke receptore.

Cilj ovog rada bio je da se ispita uticaj risperidona na pokazatelje oksidativnog stresa kod pacova perinatalno treti-ranih fenciklidinom, i to na: aktivnost ukupne SOD i, ekspre-siju citosolne i mitohondrijalne forme SOD, kao i koncentra-ciju proizvoda lipidne peroksidacije u sinaptozomalnoj frakci-ji korteksa i hipokampusa mozga pacova.

Mater ija l i metodeŽivotinje

Četiri skotne ženke Wistar pacova su uzete u isto vre-me, u 14-om danu trudnoće. Životinje su smeštane individu-alno, u posebnim žičanim kavezima smeštenim u životinj-skom vivarijumu sa kontrolisanom temperaturom, održavani pod ciklusima 12:12h svetlo/mrak. Hrana i voda su bile do-stupne ad libium tokom kompletnog eksperimenta. Dvanaest časova nakon rođenja, mladunci iz različitih legala su pome-šani a onda nasumično raspoređeni ženkama na dojenje. Dan rođenja je uzet kao postnatalni (PN) dan 0. Životinje su treti-rane 2, 6, 9 i 12-og PN dana, ili sa fenciklidinom (dve grupe) ili fiziološkim rastvorom (NaCl 0,9%, dve grupe). PCP (Sigma, Sent Luis, MO) je rastvoren u 0,9% fiziološkom ras-tvoru (0,001 g/ml) i ubrizgavan je subkutano (s.c.) u interska-pularni region (10 mg/kg TT). Doza i vreme primene tretma-na usvojeni su iz objavljenih studija (25, 26, 27, 28). Kod kon-trolnih grupa fiziološki rastvor je ubrizgan s.c. u istoj zapre-mini kao i PCP. Mladunci su zadržani u istim leglima i doje-nje je prekinuto 30-og PN dana, kada su odvojeni od ženki i razdvojeni prema polu. U ovu studiju uključeni su samo muž-jaci.

Formirane su četiri grupe mužjaka pacova:

50



1. NaCl grupa – kontrola – perinatalna NaCl primena (n=9);

2. PCP grupa – perinatalno tretirani PCP-om (n=6)3. NaCl-RSP grupa – perinatalna NaCl primena (n=7);

35-og PN dana započeta terapija risperidonom (RSP) (Alkaloid, Skoplje) koji je rastvoren u vodi za piće u dozi od 0,84 mg/kg TT/dan (29, 30, 31, 32).

4. PCP-RSP grupa – prenatalna primena PCP-a (n=7). nakon koje je sledila terapija respiridonom opisana u prethodnom pasusu.Pacovi su žrtvovani cervikalnom dislokacijom i deka-

pitacijom 100. PN dana, a glave su odmah nakon toga uranja-ne u tečni azot, a zatim čuvane na temperaturi od -85oC. Izdvojene su strukture korteksa i hipokampusa. Nakon izola-cije uzorci su homogenizovani u saharoznom medijumu i cen-trifugirani 15 min na 3000 rpm. Supernatant je izdvojen dok je talog je resuspendovan u saharoznom medijumumu i cen-trifugiran 15 min na 3000 rpm. Nakon toga, supernatanti su spojeni i centrifugirani 30 min na 14000 rpm. Ovako dobijeni supernatant koji predstavlja neprečišćenu sinaptozomalnu frakciju korišćen je za određivanje enzimske aktivnosti SOD i koncentracije lipidnih peroksida.

Stepen lipidne peroksidacije određivan je na osnovu koncentracije malonildialdehida (MDA) u sinaptozomalnoj frakciji korteksa i hipokampusa (33). Tiobarbituratna kiselina (TBA) reaguje sa malonildialdehidom (MDA) stvarajući obo-jeni kompleks. Količina stvorenog MDA meri se spektrofoto-metrijski na 533 nm. Koncentracija proteina određivana je po metodi Lowry i sar. (34). Aktivnost SOD određivana je kao procenat inhibicije autooksidacije adrenalina u baznoj sredini (35). Aktivnost ukupne SOD određivana je kinetički, kao pro-mena ekstinkcije u vremenu (10 min) na talasnoj dužini od 480 nm.

Za odredjivanje ekspresije SOD izdvojeni su dorzola-teralni frontalni korteks i hipokampus. Dorzolateralni fron-talni korteks i hipokampus su homogenizovani u lizirajućem RIPA puferu (50 mMTris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM fenilmetilsulfonil fluorid i inhibitorni koktel prote-aza) nakon čega su inkubirani na ledu 30 minuta. Nakon zavr-šene inkubacije uzorci su centrifugirani na 14000 rpm (15 minuta na 4oC) a potom su izdvajani supernatanti. U superna-tantima je određena koncentracija proteina metodom po Bradfordu uz upotrebu Coomassie blue G-250 boje koja se specifično vezuje za pojedine amino kiseline. Standardna kri-va je pravljena pomoću različitih razblaženja BSA (bovine serum albumin) a apsorbanca čitana na 595 nm.

Da bi se omogućilo specifično vezivanje antitela za od-govarajući epitop, proteini u uzorcima su denaturisani. Za de-naturaciju je korišćen Laemmli pufer 2x (4% SDS; 10% 2- merkaptoetanol, 10% glicerol; 0.004% bromfenol plavo; 0.125M TRIS HCl; pH 8.8) koji je dodat u odnosu 1:1. SDS se vezuje za proteine i daje im negativno naelektrisanje, merkap-toetanol redukuje disulfidne veze, glicerol povećava gustinu uzorka i omogućava spuštanje u bunarić na gelu, a brom fenol plavo je boja koja omogućava da se prati migracija pojedinih komponenti u gelu. Boja je anjonska i male molekuske mase zbog čega se kreće pre svih ostalih komponenti. Ovako pri-premljeni uzorci su kuvani na 95°C -100°C 5 minuta. Ista ko-ličina proteina iz svakog uzorka razdvajana je SDS-PAGE

elektroforezom na 10% polikrilamidnom gelu. Za elektrofore-zu je korišćen standardni Tris-glicin puffer ( pH 8.3). Na ko n elektroforeze izvršen je transfer proteina na nitroceluloznu membranu (Bio-Rad). Zatim je izvršeno nespecifično blokira-nje mlekom (nemasno mleko) u toku 60 minuta na sobnoj tem-peraturi nakon čega su membrane inkubirane sa primarnim antitelom (polyclonal goat anti-SOD1,vpolyclonal goat anti SOD2, Santa Cruz) preko noći na +4°C uz mešanje. Kao kon-trolni (housekeeping) protein čija količina odražava količinu unetog uzorka određivana je ekspresija aktina (mouse, mo-noclonal anti-actin, 1:10000, Sigma-Aldrich, USA). Narednog dana membrane su ispirane i inkubirane 1h na sobnoj tempe-raturi sa sekundarnim antitelom (1: 2000) koje je konjugovano sa peroksidazom rena. Nakon ispiranja za detekciju proteina korišćena je tehnika pojačane luminiscencije (enhanced che-miluminescence –ECL) koja se bazira na emisiji svetlosti u toku oksidacije luminola koja se odigrava u toku reakcije iz-među peroksidaze rena i vodonik peroksida. Emitovana sve-tlost je registrovana na filmu. Blotovi su skenirani i denzito-metrijska analiza je vršena korišćenjem programa ImageQuant 5.2.

Rezultat iAktivnost SOD u korteksu (Grafikon 1) pacova perina-

talno tretiranih PCP-om bila je značajno niža nego kod paco-va perinatalno tretiranih NaCl-om.

Grafikon 1. Aktivnost SOD u korteksu životinja koje su pe-rinatalno tretirane sa NaCl-om (NaCl), ili PCP-om (PCP) ,odnosno, koje su perinatalno tretirane sa NaCl-om a zatim u toku 9 nedelja i risperidonom (NaCl-RSP), odnosno, perina-talno tretirane sa PCP-om a zatim u toku 9 nedelja i risperido-nom (PCP-RSP). Vrednosti su izražene kao srednja vrednost ± standradna greška; *- statistički značajna razlika u odnosu na NaCl grupu (p<0,05)

Aktivnost SOD u hipokampusu (Grafikon 2) pacova perinatalno tretiranih PCP-om je ,takodje, bila značajno niža nego kod pacova perinatalno tretiranih NaCl-om.

Primena risperidona dovela je do značajnog smanjenja aktivnosti SOD u NaCl-RSP grupi, dok u PCP-RSP grupi nije

51



došlo do značajne promene u odnosu na PCP grupu. Dakle, i perinatalna primena PCP-a i primena risperidona dovode do sniženja ukupne aktivnosti SOD u ispitivanim strukturama mozga pacova. Ove promene, međutim, nisu praćene značaj-nim promenama u ekspresiji SOD1 i SOD2 ni u korteksu (Slika 1) ni u hipokampusu (Slika 2).

Grafikon 2. Aktivnost SOD u hipokampusu životinja koje su perinatalno tretirane sa NaCl-om (NaCl), ili PCP-om (PCP) ,odnosno, koje su perinatalno tretirane sa NaCl-om a zatim u toku 9 nedelja i risperidonom (NaCl-RSP), odnosno, perina-talno tretirane sa PCP-om a zatim u toku 9 nedelja i risperido-nom (PCP-RSP).Vrednosti su izražene kao srednja vrednost ± standradna greška ; *- statistički značajna razlika u odnosu na NaCl grupu (p<0,05)

Slika 1. Ekspresija SOD 1 i SOD 2 u korteksu životinja koje su perinatalno tretirane sa NaCl-om (NaCl), ili PCP-om (PCP) ,odnosno, koje su perinatalno tretirane sa NaCl-om a zatim u toku 9 nedelja i risperidonom (NaCl-RSP), odnosno, perinatalno tretirane sa PCP-om a zatim u toku 9 nedelja i risperidonom (PCP-RSP).

Koncentracija proizvoda lipidne peroksidacije u kor-teksu pacova bila je povišena u svim ispitivanim grupama u odnosu na kontrolu, ali je statististički značajna razlika zapa-žena samo kod pacova perinatalno tretiranih PCP-om koji su kasnije dobijali i risperidon (PCP- RSP). (Grafikon 3.)

Koncentracija proizvoda lipidne peroksidacije u hipo-kampusu bila je značajno viša kod pacova koji su perinatalno

tretirani PCP-om u odnosu na kontrolnu grupu. Primena ri-speridona dovela je do vraćanja koncentracije lipidih peroksi-da u ovoj strukturi na nivo u kontroli (Grafikon 4.)

Slika 2. Ekspresija SOD 1 i SOD 2 u hipokampusu životinja koje su perinatalno tretirane sa NaCl-om (NaCl), ili PCP-om (PCP) ,odnosno, koje su perinatalno tretirane sa NaCl-om a zatim u toku 9 nedelja i risperidonom (NaCl-RSP), odnosno, perinatalno tretirane sa PCP-om a zatim u toku 9 nedelja i risperidonom (PCP-RSP).

Grafikon 3. Koncentracija MDA u korteksu životinja koje su perinatalno tretirane sa NaCl-om (NaCl), ili PCP-om (PCP) ,odnosno , koje su perinatalno tretirane sa NaCl-om a zatim u toku 9 nedelja i risperidonom (NaCl-RSP), odnosno, peri-natalno tretirane sa PCP-om a zatim u toku 9 nedelja i ris-peridonom (PCP-RSP). Vrednosti su izražene kao srednja vrednost ± standradna greška; *- statistički značajna razlika u odnosu na NaCl grupu (p<0,05); ζ – statistički značajna ra-zlika u odnosu na PCP grupu (p<0,05)

DiskusijaOksidativni stres nastaje kao posledica disbalansa iz-

među stvaranja slobodnih kiseoničnih radikala i njihove raz-gradnje. Slobodni kiseonični radikali mogu da reaguju sa brojnim biomolekulima (proteinima, fosfolipidima, nuklein-skim kiselinama). Abnormalnosti fosfolipida koje nastaju kao posledica oksidativnog stresa igraju važnu ulogu u nastanku shizofrenije (36, 37, 38).

52



Rezultati našeg istraživanja pokazali su smanjenu ak-tivnost SOD u korteksu i hipokampusu pacova perinatalno tretiranih fenciklidinom u odnosu na kontrolu (NaCl- grupa), dok nije uočena značajna razlika u aktivnosti ovog enzima kod pacova koji su počevši od 35. PN dana bili tretirani i RSP, i pacova perinatalno tretiranih PCP-om.

Ispitvanjem proizvoda lipidne peroksidacije u kortek-su je zapaženo povećanje koncentracije MDA u PCP-RSP grupi u odnosu na kontrolu, kao i u odnosu na NaCl-RSP gru-pu, dok je ispitivanjem proizvoda lipidne peroksidacije u hi-pokampusu pacova zapaženo povećanje MDA u PCP-grupi u odnosu na kontrolnu grupu, kao i sniženje lipidnih peroksida u PCP-RSP-grupi u odnosu na NaCl-RSP grupu.

Rezultati dobijeni u ovom istraživanju ukazuju na sni-ženje aktivnosti SOD a povećanje koncentracije proizvoda li-pidne peroksidacije, što ukazuje na postojanje oksidativnog stresa. Takođe, rezultati ukazuju na sniženje koncentracije li-pidnih peroksida u hipokampusu PCP-RSP grupe u odnosu na PCP grupu.

Istraživanja su pokazala da kako tipični tako i atipični antipsihotici podjedanko snižavaju vrednosti SOD (39). Oštećenje ćelijske membrane koje nastaje kao posledica oksi-dativnog stresa može da i dovede do poremećaja neuronalne funkcije i prenosa signala bilo preko promena na neurotran-smiterima ili preko promena na receptorima. Oksidativni stres može nastati bilo patofiziološkim mehanizmima same bolesti, ali i kao posledica terapije antipsihoticima (40, 41). Druga generacija atipičnih antipishotika,kojoj pripada i rispe-ridon, ima i određene antioksidante osobine (42). Dakhale i sar. Pronašli su značajno povećanje koncentracije MDA kao

pokazatelja lipidne peroksidacije kod shizofreničnih pacijena-ta lečenih tipičnim antipishoticima, sa tendecijom pada kon-centracije nakon primene atipičnih antipsihotika druge gene-racije.(43)

Na osnovu iznetih činjenica možemo zaključiti da PCP dovodi do promena pokazatelja oksidativnog stresa i da pri-mena risperidona ima različite efekte u korteksu i hipokam-pusu ispitivanih životinja. Neophodno je dalje ispitivanje uti-caja risperidona na pokazatelje oksidativnog stresa u cilju sa-gledavanja njegovih prednosti u odnosu na druge antipsihoti-ke i kao i njegovih eventualnih štetnih dejstava.

Literatura1. Carpenter, W., Buchanan, D. Medical progress: schizo-

phrenia. N Engl J Med. 1994; 330: 681–90.2. Crow, T.J. Brain changes and negative symptoms in

schizophrenia. Psychopatology 1995; 18–21.3. Olney, J.W., Farber, N.B. Glutamate receptor disfunction

and schizophrenia. Archives of General Psychiatry 1995; 52: 998–1007.

4. Radonjić, N., Odloženi centralni efekti perinatalne primene fenciklidina kod pacova. Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu 2006.

5. Chan, P.H. Oxygen radicals in focal cerebral ischemia-Brain Pathol 1994; 4: 59–65.

6. Yahara, O., Hashimoto, K., Taniguchi, N., Ishikawa, M., Sato, Y. ,Yamashita, H., Ohno, H. Serum manganese-su-peroxide dismutase in patients with neuromuscular disor-ders as judged by ELISA.Res Commun Chem Pathol Pharmacol 1991; 72: 315–26.

7. Gibbs, L.S., Del Vecchio, P.J., Shaer, J.B. Mn and Cu/Zn SOD expression in cells from LPS-sensitive and LPS-resistant mmice.Free Radic Biol Med 1992; 12: 107–11.

8. Jacoby, D.B., Choi, A.M. Influenza virus induces expres-sion of antioxidant genes in human epithelial cells.Free Radic Bio Med 1994; 16: 821–24.

9. Gwinner, W., Tisher, C.C., Nick, H.S. Regulation of man-ganese superoxide dismutase in glomerular epithelial cells:mechanism for Interleukin 1 induction. Kidney Int 1995; 48: 354–62.

10. Kifel, Y., Monnier ,J., Chesrown, S.E., Raizada, M.K., Nick, H.S. Regulation of manganese superoxide dismutase and inducible nitric oxide synthase gene in rat neuronal and glial cells.J Neurochem 1996; 66: 2128–35.

11. Manna, S.K., Zhang, H.J., Yan,T., Oberley,L.W., Aggarwal,BB. Overexpressopn of manganese superoxide dismutase suppresses tumor necrosis factor-induced apop-tosis and activation of nuclear transcription factor –kappa B and activated protein-1. J Biol Chem1998;273: 13245–54.

12. Lohr, J.B. Oxygen radicals and neuropsychiatric illness.Some speculations.Arch Gen psychiatry 1991; 48: 1097–106.

13. Lohr, J.B., Browning, J.A. Free radical involvement in neuropsychiatric illnes.Psychopharmacol 1995; 31: 159–65.

14. Mahadik, S.P., Mukherjee, S. Free pathology and antioxi-dant defense in schizophrenia:a review.Shizophr res.1996; 19: 1–17.

Grafikon 4. Koncentracija MDA u hipokampusu životinja koje su perinatalno tretirane sa NaCl-om (NaCl), ili PCP-om (PCP), odnosno, koje su perinatalno tretirane sa NaCl-om a zatim u toku 9 nedelja i risperidonom (NaCl-RSP), odnosno, perinatalno tretirane sa PCP-om a zatim u toku 9 nedelja i risperidonom (PCP-RSP).Vrednosti su izražene kao srednja vrednost ± standradna greška; *- statistički značajna razlika u odnosu na NaCl grupu (p<0,05); ζ – statistički značajna ra-zlika u odnosu na PCP grupu (p<0,05)

53



15. Yao, J.K., Reddy, R.D., van Kammen, D.P. Oxidative dam-age and schizophrenia:an overview of the evidence and its therapeutic implications.CNS Drugs 2001; 15: 287–10.

16. Reddy, R.D., Keshavan, M., Yao, J.K. Reduced plasma an-tioxidant in first-episode patients with schizophrenia.Schizophr Res 2003; 62: 205–12.

17. Mukherjee, S., Mahadik, S.P., Scheefer, R., Correnti, E.E, Klekar, H. Impared antioxidant defense at the onset of psychosis.Shizophr Res 1996; 19: 19–26.

18. McCreadie, R.G., Macdonald, E., Wiles, D., Campbell, G., Pateson, J.R. The Nithsdale Shizophrenia Surveys XIV:plasma lipid peroxide and serum vitamin E levels in patients with and without tardive dyskinesia and in normal subjects.Br J Psychiatry 1995; 167: 1–8.

19. Mahadik, S.P., Mukherjee, S., Correnti, E.E, Scheffer, R., Mahadik, J. Elevated plasma lipid peroxides at the onset of nonaffective psychosis.Biol Psychiatry 1998; 43: 674–79.

20. Herken, H., Uz, E., Ozyurt, H., Sogut, S., Virit, O., Akyol, O. Evidence that the activities of erythrocyte free radicals scavenging enzymes and the products of lipid peroxida-tion are increased in different forms of schizophrenia.Mol psychiatry 2001; 6: 66–73.

21. Lohr, J.B., Underhill, S., Moir, S., Jeste, D.V. Increasde indices of free radical activity in the cerebrospinal fluid of patients with tardive dyskinesia.Biol Psychiatry 1990; 28: 535–39.

22. Johnson, K.M., Jones, S.M. Neuropharmacology of phen-cyclidine: basic mechanisms and therapeutic potential. Rev Pharmacol Toxicol. 1990; 30: 707–50.

23. Javitt, D.C., Zukin, S.R. Recent advances in the phencycli-dine model of schizophrenia.Am J Psychiat 1991;148: 1301–8.

24. Nagai, T., Noda, Y., Une, T., Furukawa, K., Furukawa, H., Kan, Q.M., Nabeshima, T. Effects o AD-5423 on animal models of schizophrenia: phencyclidine-induced behav-ioral changes in mice.Neuroreport 2003;14: 269–72.

25. Adams, S.M., de Rivero Vaccari J.C., Corriveau R.A. Pronounced cell death in the absence of NMDA receptors in the developing somatosensory thalamus. J Neurosci 2004; 42: 9441–50.

26. Ikonomidou, C., Bosch, F., Miksa, M., Bittagau, P., Vockler, J., Dikranian, K., Tenkova, T.I, Stefovksa, V., Turski, L., Olney, J.W. Blockade of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing brain.Science 1999; 283: 70–74.

27. Wang, C., Mcinnis, J., Ross-Sanchez, M., Shinnick-Gallagher, P., Wiley, J.L., Johnson, K.M. Long-term be-havioral and neurodegenerative effects of perinatal phen-cyclidine administration: implications for schizophrenia.Neuroscience 2001; 107: 535–50.

28. Radonjić, N.V., Knezević, I.D., Vilimanovich, U., Kravić-Stevović, T., Marina, L.V.,Nikolić, T., Todorović, V., Bumbasirević, V., Petronijević, N.D. Decreased glutathi-one levels and altered antioxidant defense in an animal model of schizophrenia: long-term effects of perinatal phencyclidine administration. Neuropharmacology. 2010; 58(4–5):739–45.

29. Schotte, A., Janssen, P.F., Gommeren, W., Luyten, W.H, Van Gompel, P., Lesage, A.S., De Loore, K., Leysen, J.E.. Risperidone compared with new and reference antipsy-

chotic drugs: in vitro and in vivo receptor binding. Psychopharmacology 1996; 124: 57–73.

30. Kapur, S., VanderSpek, S.C, Brownlee, B.A, Nobrega, J.N. Antipsychotic dosing in preclinical models is often unrepresentative of the clinical condition: a suggested so-lution based on in vivo occupancy. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2003; 305: 625–31.

31. Choi, Y.K., Gardner M.P., Tarazi, F.I. Effects of risperi-done on glutamate receptor subtypes in developing rat brain. Eur. Neuropsychopharmacol. 2009; 19: 77–84.

32. Terry, A.V. Jr, Gearhart, D.A., Warner, S., Hohnadel, E.J., Middlemore, M.L., Zhang, G., Bartlett, M.G., Mahadik, S.P. Protracted effects of chronic oral haloperidol and ris-peridone on nerve growth factor, cholinergic neurons, and spatial reference learning in rats. Neuroscience 2007; 150: 413–24.

33. Renchrona ,S., Smith, S.D., Akcesson, B., Westenberg, E., Siesjo, K.B. Peroxidative changes in brain cortical fatty acids and phospholipids as characterized during Fe++ and ascorbic acid stimulated lipid peroxidation in vitro.J Neurochem 1980; 34: 1630–38.

34. Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.I., Randall, R.I. Protein measurement with the Folin phenol reagent.J Biol Chem 1951; 193: 265–75.

35. Sun, M., Zigman, S. An improved spectrophotometric as-say for superoxide dismutase based on ephinephrine auto-oxidation.Anal Biochem. 1978; 90: 81–89.

36. Fenton , W.S., Hibbeln, J.,Knable M. Essential fatty acids,lipid membrane abnormalities and the diagnosis and threatment of schizophrenia. Biol.Psychiatry 2000; 47: 8–21.

37. Yao, J.K., van Kammen, D.P., Gurkis, W.J. Correlation of fatty acid abnormalities with clinical measures in schizo-phrenia. Schizophr.Res.1993; 11: 124.

38. Reddy, R.D., Yao, J.K. Enviromental factors and membrane polyunsaturated fatty acids in schizophrenia. Prostaglandins Leukot.Essent.Fatty Acids 2003; 69: 385–91.

39. Zhang, X.Y., i sar. Effects of risperidone and haloperidol on superoxide dismutase and nitric oxide in schizophrenia Neuropharmacology 2012; 62: 1928–34.

40. Gamma, C.S., Salvador, M., Andreazza A.C., Kapczinski F., Silva Belmonte-de-Abreu P. Elevated serum superox-ide dismutase and thiobarbituric acid reactive substances in schizophrenia: a study of patients treated with haloperi-dol or clozapine. Prog Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry 2006; 30: 512–15.

41. Perić, S., Uticaj perinatalne primene fenciklidina na kon-centraciju lipidnih peroksida u mozgu pacova. Medicinski podmladak 2006; 57: 25–29.

42. Dietrich-Muszalska, A. The impact of different concentra-tions of clozapine on changes of lipid peroxidation in hu-man plasma – in vitro studies. Psychiatria i Psyhologia Klinczna 2005; 5: 18–25.

43. Dakhale, G., Khanzode, S., Khanzode, S., Saoji, A., Khobragade, I., Turankar, A. Oxidative damage and schizophrenia : the potential benefit by atypical antipsi-hotics. Neuropsyhobiology 2004; 49: 205–9.

54



Sažetak:Uvod: Divertikularna bolest creva nastaje herni-

jacijom mukoze i submukoze kroz mišićni omotač creva (lažna ili pseudodivertikuloza). Najčešće i najznačajnije komplikacije ove bolesti su: divertikulitis, krvarenje, ap-scesi, fistule, strikture.

Cilj: Analiza učestalosti i lokalizacije divertiku-larne bolesti creva, postojanje komplikacija ove bolesti i njenog značaja u odnosu na uzrok smrti.

Materijal i metode: Retrospektivna studija je za-snovana na analizi protokola i izveštaja sa obdukcija Instituta za patologiju Medicinskog fakulteta Univerziteta u Beogradu u trogodišnjem periodu (2008. – 2010. godi-ne). Analizirani su svi slučajevi sa divertikulumima cre-va. U statističkoj obradi korišćene su metode deskriptiv-ne statistike. Razlika je testirana χ2 – testom.

Rezultati: U ispitivanom periodu u 74 slučaja na obdukciji su nađeni divertikulumi creva. Divertikularna bolest creva je bila nešto češća kod osoba ženskog po-la–43 (58,1%), a prosečna starost obdukovanih pacije-nata iznosila je 78±7,4 godina. Divertikulumi su dija-gnostikovani isključivo kod pacijenata starije životne dobi, i to najčešće u osmoj deceniji života. Najčešća lo-kalizacija divertikuluma bila je u sigmoidnom kolonu. U 35 (47,3%) slučajeva divertikulumi su nađeni samo u sigmoidnom kolonu, dok je u manjem broju slučajeva di-vertikuloza zahvatala i descedentni kolon i rektum. U četvrtini slučajeva (19/74; 25,7%) sa divertikulozom di-vertikulumi su nađeni u celom kolonu. Divertikulumi tankog creva bili su ređi i nađeni su u samo 6 slučajeva. Divertikulitis je histološki dijagnostikovan u samo 6 (8,1%) slučajeva. U 1 slučaju difuzni peritonitis kao komplikacija divertikulitisa bio je uzrok smrti.

Zaključak: Neophodno je pažljivo pregledati cre-va i notirati postojanje divertikularne bolesti u obdukci-onom zapisniku zbog mogućeg značaja komplikacija di-vertikuloze na smrtni ishod.

Ključne reči: divertikulum, divertikulitis, crevo.

Abstract:Introduction: Colonic diverticulosis is, in general

,the most commonly acquired disease, developing as mucosal and submucosal herniations through the circu-lar muscle layer (false or pseudo-diverticulosis). The

most common and significant complications are: diver-ticular bleeding, diverticulitis, abscess, fistulas and strictures.

Aim: To investigate the frequency and localization of diverticular disease, its complications and their im-pact on the cause of death in autopsies.

Material and methods: Retrospective study was based on the analysis of protocols and reports from the autopsies of the Institute of Pathology, School of Medicine University of Belgrade, during period of three years, from 2008–2010. Causes with macroscopic prov-en diverticula in one segment of the small intestine and/or colon were taken for a more detailed analysis. Data were processed by descriptive statistics and χ2-test.

Results: During period 2008–2010, 74 cases with intestinal diverticula were diagnosed. Diverticular dis-ease was slightly more common in females – 43 (58.1%), and the average age of the autopsied patients was 78±7.4 years. The disease is only observed in elderly patients, and most of them were in the eight decade of life. The most common location of disease was the sigmoid colon, where 35 (47.3%) had diverticula only at this location, and a smaller number of cases were associated with di-verticula in descending colon and rectum. Diverticulosis in the entire colon was found in 19 (25.7%), and small intestine diverticula were found in 6 cases. From com-plications associated with diverticular disease, diver-ticulitis was histologically confirmed in only 6 (8.1%) cases, and in one case, diffuse peritonitis, as a result of diverticulitis, was the cause of death.

Conclusion: It is necessary to note the existence of diverticular disease in the autopsy report because of the potential complications of diverticulosis may be impor-tant for lethal outcome.

Key words: diverticulum, diverticulitis, intestines.

UvodDivertikularna bolest creva je stečena bolest koja nas-

taje hernijacijom mukoze i submukoze kroz mišićni omotač creva (lažna ili pseudodivertikuloza). Postoji i znatno manji broj, urođenih slučajeva, gde su svi slojevi zida creva pro-trudirali, te divertikulum sadrži i mišićni sloj (pravi diverti-kulumi) (1).

Divertikularna bolest je česta bolest u industrijski raz-vijenim zemljama i najčešće je asimptomatska. Kod simptom-

DIVERTIKULARNA BOLEST CREVA NA AUTOPSIJAMAAutori: Sanjin Kovačević1, Davor Kovačević1

Mentor: Asist. dr Radmila Janković 2

1Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu2Institut za patologiju, Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu

55



atske divertikularne bolesti bez komplikacija, pacijenti obično imaju abdominalne bolove bez dokaza infekcije ili inflamaci-je. Komplikacije divertikuloze mogu biti: divertikulitis, krva-renje, apsces, fistule, strikture, peritonitis i sepsa (2).

Divertikulumi mogu biti lokalizovani u svim delovima creva i najčešće su multipli. U zemljama Evrope najčešća lo-kalizacija divertikuluma je u sigmoidnom kolonu, uglavnom u njegovom distalnom delu (3). U 15% slučajeva divertikulu-mi se nalaze u čitavom debelom crevu. Divertikulumi su loka-lizovani na bočnim stranama tenija, na mestu prolaska krvnih sudova kroz mišićni sloj, veličine su od nekoliko milimetara do 2 cm u prečniku i obično sadrže fekolite u lumenu (4) (Slika 1).

Slika 1. Multipli divertikulumi debelog creva

Divertikulumi tankog creva su obično multipli, loka-lizovani na medijalnom zidu duodenuma,a u jejunumu između listova mezenterijuma. Javljaju se češće kod starijih osoba i u većini slučajeva se ne ispoljavaju simptomima (5) (Slika 2).

Slika 2. Divertikulum jejunuma

Na početku 20. veka, smatralo se da je divertikularna bolest izuzetno retka i predstavljala je patološki kuriozitet, što je navelo Burkitta i Paintera da je nazovu „bolešću 20. veka“, ili „bolešću Zapadne civilizacije”, usled male rasprostranjen-osti u zemljama u razvoju (6). Starenje i ishrana siromašna vlaknima prema većini autora spadaju u dva glavna faktora rizika za nastanak divertikuloze creva (1).

Ishrana bogata vlaknima povećava masu stolice, ubrzava pražnjenje creva i smanjuje intraluminalni pritisak (7). Nedostatak vlakana u ishrani rezultira sporijim tranzitom svarene hrane, dozvoljavajući veću apsorpciju vode, sa formi-

ranjem manjih, čvršćih stolica. Ovo može prouzrokovati preterane segmentacije creva, povećati intraluminalni priti-sak i olakšati stvaranje divertikuluma (1). Dokazana je pove-zanost između konzumiranja nerastvorljivih komponenata vlakana, naročito celuloze i smanjenja rizika oboljevanja od divertikularne bolesti (6). Moguće je i da oštećenje zrelog ko-lagena, sa sintezom novog, nezrelog kolagena dovodi do sla-bosti zida creva (3), a neka novija istraživanja povezuju i smanjenu holinergičku aktivnost u crevu koja je uslovljena starenjem sa nastankom divertikuluma (8). Nije dokazano da su kofein i alkohol faktori rizika za nastanak divertikuloze creva, dok pušenje cigareta u maloj meri doprinosi pojavi di-vertikuluma (9).

Cilj rada je da se u autopsijskom materijalu utvrde in-cidencija i lokalizacija divertikularne bolesti creva, postojanje njenih komplikacija i njihove povezanosti sa uzrokom umi-ranja.

Mater ija l i metodeU ovoj retrospektivnoj studiji analizirani su protokoli i

izveštaji sa obdukcija Instituta za patologiju Medicinskog fakulteta Univerziteta u Beogradu u trogodišnjem periodu, od 2008. – 2010. godine. U radu su analizirana 74 slučaja kod kojih je na obdukciji dijagnostikovano postojanje divertiku-luma u nekom segmentu tankog i/ili debelog creva.

Za obradu podataka primenjene su standardne statističke metode (metode deskriptivne statistike). Razlika je testirana χ2 – testom.

Rezultat iU trogodišnjem periodu (2008–2010.) na Institutu za

patologiju u Beogradu obdukovane su 1722 odrasle osobe. Divertikulumi su nađeni u 74 (4,3 %) slučaja.

Divertkularna bolest creva je češće dijagnostikovana kod osoba ženskog pola, i to u 43 (58,1%) slučaja (Grafikon1). Ova razlika nije statistički značajna (χ2=1,635; p>0,05).

31

43

0 5

10 15 20 25 30 35 40 45 50

muški pol ženski pol

Grafikon 1. Nalaz divertikularne bolesti creva na autopsi-jama u odnosu na pol

Najmlađi bolesnik kod koga je na obdukciji nađena di-vertikuloza creva, imao je 52 godine, dok je najstariji imao 91 godinu. Prosečna starost iznosila je 77,6±7,4 godina.

56



Divertikuloza je na obdukcijama uvek dijagnostikova-na kod bolesnika starijeg životnog doba, i to posle pedesete godine života, a najčešće u osmoj deceniji. Čak 63 (85,1%) osobe sa divertikulozom creva bile su starije od 70 godina (Grafikon2). Divertikuloza creva se statistički značajno češće dijagnostikovala na obdukcijama kod osoba starijih od 70 go-dina (χ2=35,149; p<0,01).

2

8

39

23

1 1 0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

VI VII VIII IX X nepoznato

Grafikon 2. Nalaz divertikularne bolesti creva na autopsi-jama u odnosu na decenije života

Najčešća lokalizacija divertikuluma bila je u sigmoid-nom kolonu, i to kod 35 (47,3%) slučajeva samo u ovoj lokali-zaciji, kod 6 (8,1%) slučajeva sa divertikulozom descedentnog kolona, a kod 2 (2,7%) slučaja uz divertikulozu u rektumu. Izolovana divertikuloza rektuma nađena je kod 2 (2,7%) slučaja, a izolovana divertikuloza descedentnog kolona kod 4 (5,4%) slučaja. Divertikuloza je zahvatala ceo kolon u četvrtini slučajeva kod kojih su nađeni divertikulumi (19/74; 25,7%). Divertikulumi tankog creva su ređe dijagnostikovani–u samo 6 slučajeva: kod 2 (2,7%) slučaja u duodenumu, a kod 4 (5,4%) u jejunumu i/ili ileumu (Grafikon 3).

49

0

19

6

0 10 20 30 40 50 60

leva polovina debelog creva

desna polovina debelog creva

celo debelo crevo tanko crevo

Grafikon 3. Lokalizacija divertikuluma na autopsijama

Divertikulitis kao komplikacija divertikularne bolesti creva, histološki je nađen samo kod 6 (8,1%) slučajeva i to češće kod žena (4/6; 66,7%) (Slika 3). Prosečna starost osoba sa divertikulitisom kao komplikacijom divertikularne bolesti (79,8 godine) i bez divertikulitisa (77,4 godina) bila je slična.

Difuzni peritonitis kao komplikacija divertikulitisa bio je uz-rok smrti u jednom slučaju.

Slika 3. Divertikulitis–širenje purulentnog zapaljenja u perikolično masno tkivo (HE, 200x)

DiskusijaBrojna istraživanja pokazuju da je pojava divertiku-

larne bolesti creva u savremeno doba u značajnom porastu. Postoji dilema da li je ovaj porast povezan sa stvarnim po-rastom prevalencije ovog oboljenja ili je posledica većeg udela starijih individua u populaciji, ili pak češćeg skrininga, što ostaje da se utvrdi (1). U našem istraživanju divertikularna bolest je nađena u 74 od 1722 obdukovana pacijenta sa preva-lencijom od 4,3%, dok je u autopsijskim studijama rađenim u Norveškoj i Hong Kongu prevalencija bila veća, i kretala se iznad 20% (10,11). Epidemiološka istraživanja ukazuju na postojanje geografskih varijacija u incidenciji i prevalenciji divertikularne bolesti creva. Njena prevalencija je velika u razvijenim zemljama, posebno u Evropi, SAD i Australiji, dok je znatno manja u Africi i Aziji. Poslednjih godina, i u manje razvijenim zemljama beleži se porast incidencije diver-tikuloze creva, posebno u Africi, usled promena načina života i menjanja navika u ishrani (2).

U našem uzorku divertikularna bolest bila je nešto za-stupljenija kod osoba ženskog pola. Prema pojedinim autori-ma bolest se javlja češće kod žena (10,11), dok drugi diverti-kularnu bolest creva češće nalaze kod osoba muškog pola (12). Ipak, većina današnjih studija ukazuje da nema značajne razlike u javljanju bolesti među polovima (2).

Prosečna starost obdukovanih bolesnika sa divertiku-larnom bolešću creva u našem uzorku iznosila je 78±7,4 go-dina. Divertikuloza creva je statistički visoko značajno češće dijagnostikovana kod bolesnika starijih od 70 godina. Divertikularna bolest se daleko češće javlja u starijem životnom dobu, i veoma je retka kod osoba mlađih od 40 go-dina, dok je kod osoba starijih od 65 godina učestalost veća za 60% (2). Većina autora, kada su u pitanju autopsijske studije, došla je do rezultata da je divertikuloza najčešća u starijem životnom dobu – i to u sedmoj i osmoj deceniji života (10 – 12). Gear et al. su u svojoj studiji pokazali snažnu povezanost između starenja i divertikularne bolesti creva, upućujući na to da 60% populacije iznad 70 godina ima ovu bolest (1). Ovakvi

57



rezultati govore u prilog hipotezi da je starenjem uzrokovano slabljenje zida creva jedan od glavnih uzroka za nastanak bolesti (1). Ipak, istraživanja rađena na osnovu obducijskih slučajeva mogu malo i da precene frekventnost javljanja di-vertikularne bolesti, uzimajući u obzir da se autopsije češće rade u starijim populacionim grupama (3). Mnogi autori in-sistiraju na važnosti ishrane siromašne vlaknima kao bitnom uzroku u nastanku divertikuloze creva zbog sve češće pojave divertikuloze u mlađem životnom dobu (6,7). Ono u čemu se svi slažu, jeste da divertikularnu bolest creva treba posma-trati kao multifaktorijalnu bolest (1,2,10).

Divetikuloza sigmoidnog kolona je nađena u 62 (83,8%) slučaja. Sigmoidni kolon bio je jedini segment sa di-vertikulozom kod 35 (47,3%) obdukovanih slučajeva. Lokalizacija divertikuluma u Norveškoj je slična našim rezul-tatima: sigmoidni kolon je zahvaćen divertikulozom u 89%, dok se u 40% slučajeva divertikulumi nalaze samo na ovoj lokalizaciji (11). Naši rezultati su slični rezultatima epidemioloških istraživanja u Evropi, SAD i Australiji, gde više od 90% pacijenata ima divertikulume u levoj polovini kolona (2), dok se razlikuju u odnosu na područje Azije, gde je divertikuloza češća u cekumu i ascedentnom kolonu. Ovakva razlika u dominantnom delu kolona gde se javlja di-vertikuloza, upućuje na ulogu genetskih faktora u nastanku ove bolesti (1). Ovu hipotezu je potvrdilo i istaživanje Stemmermanna i Yatanija (12) gde je pokazana veća učestalost javljanja divertikuluma u proksimalnoj polovini kolona kod Japanaca koji su doselili na Havaje i pored toga što su usvojili zapadnjački stil života, koji je za posledicu imao jedino porast učestalosti ovog oboljenja. Divertikoloza celog kolona je slično zastupljena u svim delovima sveta (10,12) i naši rezul-tati ne odstupaju od rezultata drugih istraživača. Izolovana divertikuloza rektuma nađena je u malom broju analiziranih slučajeva, što je slučaj i u drugim autopsijskim studijama (10 – 12).

Najčešće komplikacije divertikularne bolesti creva prema podacima iz literature su krvarenje iz donjih partija gastrointestinalnog trakta (5–15%) i infekcija koja može da rezultira apscesom, perforacijom i peritonitisom (15–20%). Komplikacije se sreću češće kod starijih pacijenata. Utvrđena je značajna povezanost perforacije divertikuluma i krvarenja kao mogućih komplikacija sa korišćenjem nesteroidnih anti-inflamatornih lekova (3). Smatra se da je lokalizacija diverti-kuluma u desnom kolonu češće povezana sa krvarenjem i di-vertikulitisom kao komplikacijama (2). U našem uzorku di-vertikulitis je histološki potvrđen kod malog broja obdu-kovanih bolesnika, najčešće u devetoj deceniji života, što ne umanjuje značaj ove komplikacije.

U zaključku, divertikularna bolest creva se najčešće dijagnostikuje kod bolesnika starijih od 50 godina života, najčešće u levoj polovini debelog creva. Komplikacije diverti-kularne bolesti mogu imati značajnu ulogu u nastanku smrti, zbog čega je neophodno pažljivo pregledati creva i notirati postojanje divertikularne bolesti u obdukcionom zapisniku.

Literatura1. Mimura T, Emanuel A, Kamm MA. Pathophysiology of

diverticular disease. Best Pract Res Clin Gastroenterol 2002; 16:563–576.

2. Jun S, Stollman N. Epidemiology of diverticular disease. Best Pract Res Clin Gastroenterol 2002; 16:529–542.

3. Delvaux M. Diverticular disease of the colon in Europe: epidemiology, impact on citizen health and prevention. Aliment Pharmacol Ther 2003; 18:71–4.

4. Laban A, Stojšić Z. Gastrointestinalni trakt, egzokrini pankreas, peritoneum i retroperitoneum. In: Atanacković M, et al., editors. Patologija. Beograd: Medcinski fakultet Univerziteta, Katedra za patologiju 2009; 405–463.

5. Popović O, Božanić M. Divertikuli i divertikuloze tankog i debelog creva. In: Kovačević N, et al., editors. Interna medicina. Beograd: Medicinski fakultet Univerziteta, Katedra Interne medicine 2009; 719–722.

6. Aldoori WH, Giovannucci EL, Rockett HRH, Sampson L, Rimm EB, Willett WC. A prospective stydy of dietary fi-ber types and symptomatic diverticular disease in men. J Nutr 1998; 128:714–9.

7. Murray CDR , Emmanuel AV. Medical menagment of di-verticular disease. Best Pract Res Clin Gastroenterol 2002; 16:611–620.

8. Yun AJ, Bazar KA, Lee PY. A new mechanism for diver-ticular diseases: aging-related vagal withdrawal. Med Hypotheses 2005; 64:252–5.

9. Aldoori WH, Giovannucci EL, Rimm EB, Wing AL, Trichopoulos DV, Willett WC. A prospective stydy of al-cohol, smoking, coffeine, and the risk of symptomatic di-verticular disease in men. Ann Epidemiol 1995; 5:221–8.

10. Chan CC, Lo KKL, Chung ECH, Lo SS, Hon TYW. Colonic diverticulosis in Hong Kong: distribution pattern and clinical significanse. Clinical Radiology 1998; 53:842–4.

11. Eide TJ, Stalsberg H. Diverticular disease of the large in-testine in Northern Norway. Gut 1979; 20:609–615.

12. Stemmerman GN, Yatani R. Diverticulosis and polyps of the large intestine. A necropsy study of Hawaii Japanese. Cancer 1973; 31:1260–1270.

58



SažetakUvod: Stalna magnetna polja (SMP) su vremenski

nezavisna polja konstantne snage koja slobodno prolaze biološka tkiva. Pored prirodnih SMP u savremenom sve-tu su rasprostranjena i veštačka SMP i neophodno je sprovesti dugoročne eksperimente da bi se procenio hronični efekat izloženosti.

Cilj rada: Ispitati delovanje dugotrajnog izlagnja SMP na parametre krvi, celularnost slezine i tibije kod starih pacova.

Materijali i metode: Mužjaci Wistar soja pacova stari trideset šest meseci su podeljeni u dve grupe (9 po grupi). Prva grupa je izlagana SMP intenziteta 30 mT celodnevno tokom 10 nedelja. Druga grupa pacova je činila kontrolu. Na kraju eksperimenta svi pacovi su žr-tvovani, a krv, slezina i tibija uzete su za dalju analizu.

Rezultati: U eksperimentalnoj grupi došlo je do smanjenja broja trombocita i limfocita, a povećao se broj neutrofila u krvi u odnosu na kontrolnu (p<0.01). Takođe, statistička analiza je pokazala značajno pove-ćanje celularnosti i slezine i tibije. Broj limfocita u slezi-ni eksperimentalne grupe bio je statistički značajno veći (p<0.05), a broj eritrocita značajno manji u odnosu na kontrolnu grupu (p<0,05). Nije pokazana značajna ra-zlika u broju granulocita između grupa.

Zaključak: Naš eksperiment je pokazao smanjenje broja limfocita i trombocita zajedno sa povećanjem bro-ja neutrofila u perifernoj krvi, kao i redistribuciju eri-trocita između krvi i slezine što odgovara promenama u okviru opšte reakcije organizma na stres. Izlaganje SMP dovelo je do pozitivnog efekta u smislu poboljšanja celu-larnosti slezine, a samim tim i funkcije ovog tkiva kao hematopoetskog organa kod starih pacova.

Ključne reči: Stalno magnetno polje, hematološki para-metri, celularnost slezine i tibije.

AbstractIntroduction: The static magnetic fields (SMF)

are time-independent constant strength fields that freely pass biological tissue. Besides natural, artificial SMFs are widely distributed in contemporary world and it is

necessary to implement long-term experiments to evalu-ate the effect of chronic exposure.

The aim: To examine the effects of long-term SMF exposure on the parameters of blood, spleen and tibia cellularity in old rats.

Materials and Methods: Wistar rats, 36 months old, were divided into two groups (9 per group). The first group was exposed to 30 mT intensity SMF all day for 10 weeks. The second group was non-exposed, control group. At the end of the experiment all rats were sacri-ficed and the blood, spleen and tibia were taken for anal-ysis.

Results: There was significant reduction in the number of platelets and lymphocytes, and increased number of neutrophils in the experimental group (p <0.01). Spleen and tibia cellularity also increased. The number of lymphocytes in the spleen of exposed rats was significantly higher (p <0.05), while the number of red blood cells was lower than in the control (p<0.05).

Conclusion: Reduction in number of lymphocytes and platelets together with the increased number of neu-trophils in the peripheral blood, and redistribution of red cells between the blood and spleen reflects changes in the general reaction to stress. Exposure to long-term SMF has led to a positive effect in improving the cellu-larity of the spleen, and consequently the function of this hematopoietic organ in old rats.

Key words: The static magnetic field, hematology, spleen and tibia celularity.

UvodŽivi organizmi su neprekidno izloženi uticaju magnet-

nih polja koja možemo podeliti na promenljiva i statična. Stalna magnetna polja (SMP) su vremenski nezavisna polja konstantne snage koja slobodno prolaze biološka tkiva.

Ona mogu biti prirodna, od kojih je najvažnije Zemljino magnetno polje koje je skoro stalno, jačine od 0,03 do 0,07 mT u zavisnosti od lokacije (1). Veštački izvori SMP obuhvataju širok spektar uređaja od baterijskih motora, magneta u zvuč-nicima, mikrotalasnih pećnica do trivijalnih kao što su mag-neti na frižiderima. Jačina ovih SMP se smanjuje sa kvadra-

HEMATOLOŠKI PARAMETRI, CELULARNOST SLEZINE I TIBIJE STARIH PACOVA POSLE DUGOTRAJNOG IZLAGANJA STALNOM

MAGNETNOM POLJU

Autori: Darko Radaković1, Rajko Rušnov1, Dejan Radaković1

Mentor: Doc. dr Silvio De Luka2

1 Medicinki fakultet, Univerzitet u Beogradu2 Institut za patološku fiziologiju „Ljubodrag Buba Mihailović“, Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu

59



tom rastojanja i kreće se u rasponu od par μT do 10 mT (2). Uvodjenjem u upotrebu aparata za magnetnu rezonancu (MRI) u ranim 1980-im došlo je do povećanja nivoa izlaganja ljudi jakim magnetnim poljima koja su imala logaritamski po-rast jačine i sada dostižu vrednosti i do 9,4 T (3).

Do sada su sprovedana mnoga istraživanja koja ne do-kazuju značajniji uticaj akutne izloženosti SMP na ćeliju i njene komponente, genetski materijal, embriogenezu i centralni nervni sistem (4,5). Zbog toga je potrebno sprovesti dugoročne eksperimente da bi se procenio hronični efekat izloženosti.

SMP interaguju sa biološkim tkivima putem tri usta-novljena mehanizma (6,7). Prvi je mehanizam magnetne in-dukcije. SMP utiču na elektrolite pobuđujući električna polja i struje, a takođe, i fizička polja tekuće krvi. Smatra se da je neto efekat ovih interakcija smanjenje brzine toka krvi do 7%, kod ljudi izloženih polju od 5 T. Magnetnomehanički efekat je drugi mehanizam. SMP utiču na odredjene molekule, kao i feromagnetne materijale (npr. magnetit). Smatra se da je ovaj efekat na ljude kod polja jačine ispod 10 T zanemarljiv, stoga je i dalje nejasno kakav bi uticaj na zdravlje ova SMP mogla imati. Treći mehanizam je mehanizam električne interakcije. SMP mogu da menjaju energetske nivoe, kao i orijentaciju spina elektrona, stoga ona mogu da u odredjenim hemijskim reakcijama utiču na tranziciju elektrona sa višeg na niži nivo. Smatra se da je ovaj efekat u biološkim inerakcijama ,takođe, zanemarljiv, osim kod onih u kojima učestvuju slobodni radi-kali (2). Kako su oni veoma važni u mnogim biološkim ka-skadnim reakcijama, uočljiv efekat se očekuje kod polja jačine već od 10 mT (8).

Proces starenja sa nastankom raznih poremećaja u gra-đi i funkciji ćelije tokom niza godina se tumači kao posledica progresivnog nakupljanja metaboličkih otpadaka što rezulti-ra: iscrpljivanjem mitohondrija, smanjenjom sintezom struk-turnih i enzimskih proteina, redukcijom ćelijskih receptora, smanjenjom sposobnošću popravljanja hromozomskih ošte-ćenja, kao i smanjenom sposobnošću unošenja hrane kod ostarelih ćelija (9,10). Prema grupi teorija „trošenja“, starenje se tumači kao posledica neprestane izloženosti ćelija štetnim egzogenim uticajima koji uzrokuju progresivno slabljenje sposobnosti ćelija za preživljavanje. Drugu grupu teorija sta-renja čine teorije na osnovi genoma, koje tumače da progre-sivno oštećenje ćelija nastaje usled genetski uzrokovanih pro-mena unutrašnjih osobina samih ćelija (10).

Broj eritrocita, koncentracija hemoglobina i hematokrit smanjuju se kod muškaraca u šestoj deceniji i kod žena u sedmoj deceniji života. Ove promene su sve izraženije tokom daljeg sta-renja posebno kod muškaraca. Broj leukocita i trombocita ,tako-đe, ima tendenciju snižavanja tokom starenja. Serumski nivoi ukupnog holesterola, ukupnih proteina i triglicerida takođe se smanjuju kod osoba starijih od 60 godina (11, 12).

Na osnovu gore navedenih podataka odlučili smo da cilj našeg rada bude ispitivanje delovanja dugotrajnog izlaga-nja stalnom magnetnog polju na parametre krvi, celularnost slezine i tibije kod starih pacova.

Mater ija l i i metodeŽivotinje

U eksperimentu su korišćeni mužjaci Wistar soja pa-cova stari trideset šest meseci dobijeni iz vivarijuma Vojnomedicinske akademije u Beogradu. Životinje su smešte-ne u kaveze u grupe od devet životinja, a voda i hrana bili su im dostupni ad libitum. Pri eksperimentalnom radu poštovan

je Etički kodeks naučnoistraživačkog rada Medicinskog fa-kulteta Univerziteta u Beogradu, a vršenje ogleda odobrio je Etički komitet za rad sa eksperimentalnim životinjama Medicinskog fakulteta u Beogradu. Svi eksperimentalni pro-tokoli su sprovedeni u saglasnosti sa procedurama opisanim u Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals (Washington, DC, USA).

Magnetno poljeZa izvor SMP korišćeni su potkovičasti magneti od

gvoždja. Magneti su postavljeni tik ispod kaveza sa pacovi-ma, koji su mogli slobodno da se kreću. Intenzitet magnetnog polja bio je 30 mT meren digitalnim Teslametrom DTM-151 (Group 3 Technology, Auckland, New Zealand) sa tačnošću od 0.005 mT.

Dizajn eksperimentaŽivotinje su nasumice podeljene u dve grupe (9 po gru-

pi), i držane pod jednakim uslovima. Prva grupa je bila ekspe-rimentalna i ona je bila izložena SMP. Drugu grupu su činili neizloženi pacovi koji su služili kao kontrola. Izlaganje SMP vršeno je pomoću gvozdenih potkovičastih magneta posta-vljenih ispod kaveza sa životinjama celodnevno tokom 10 ne-delja. Potrošnja hrane je merena dnevno, a telesna težina ne-deljno. Nakon 10 nedelja svi pacovi su žrtvovani u etarskoj anesteziji cervikalnom dislokacijom, a krv, slezina i kostna srž tibije uzeti su za dalju analizu.

Parametri krvi, slezine i tibijeBroj eritrocita, limfocita, monocita, neutrofila, bazofi-

la, eozonofila, vrednosti hemoglobina, hematokrita, MCV (srednja vrednost zapremine eritrocita), MCH (srednja vred-nost apsolutne količine hemoglobina u eritrocitu), MCHC (srednja vrednost koncentracije hemoglobina u eritrocitu)određivani su korišćenjem hematoloških brojača ABX Pentra 80X (Monpelje, Francuska) u skladu sa preporukama proizvo-đača. Ukupan broj granulocita dobijen je sabiranjem broja neutrofila, bazofila i eozinofila.

Uzorci slezine su ručno homogenizovani. Ukupna ce-lularnost homogenizata određena je brojanjem ćelija u Birkerovoj komori (Fein Optik, Jena, Nemačka) i izražena kao broj ćelija po mikrolitru rastvorenog, homogenizovanog tkiva. Razmazi slezina obojeni po Grunvald-Mej Gimza (Karlo Erba, Rodano, Italija) korišćeni su za brojanje eritroci-ta, limfocita i granulocita u deset vidnih polja komore. Broj jedne grupe ćelija je izražen kao procenat od ukupno prebro-janih ćelija (13).

Da bi se odredila celularnost tibije kostna srž je aspiri-rana iz kosti aspiracionom iglom u 0,5 ml slani rastvor, a po-tom homogenizovana uz pomoć šprica i 0.45 mm igle. Ukupna celularnost homogenizata određena je brojanjem u Birkerovoj komori (Fein Optik, Jena, Nemačka) i izražena kao broj ćelija po mikrolitru rastvorenog, homogenizovanog tkiva (13).

Statistička analizaRazlika između grupa procenjena je ANOVA testom i

korišćenjem Fišerovog LSD testa. Statistička značajnost je podešena na p<0.05.

60



RezultatiParametri krvi

Vrednosti parametara krvi kontrolnih pacova i pacova izloženih SMP prikazani su u tabeli 1. Statističkom analizom podataka utvrđeno je da postoji statistički značajna razlika u broju limfocita, neutrofila (p<0.01) i trombocita (p<0.05), od-nosno, izlaganje SMP smanjilo je broj trombocita i limfocita, a povećalo je broj neutrofila u krvi. Međutim, izlaganje SMP nije imalo uticaja na broj eritrocita, leukocita, monocita, eozi-nofila i bazofila; kao ni na vrednosti hemoglobina, hematokri-ta, MCV, MCH, MCHC i RDW-a (p>0.05), (Tabela 1).

Tabela 1. Parametri krvi pacova kontrolne i eksperimentalne grupe.

Krvni parametari K (n=9) SMP (n=9)Leukociti (x109/L) 9.57 ± 1.72 7.5 ± 0.59Eitrociti (x1012/L) 7.88 ± 0.38 8.74 ± 0.84Hemoglobin (g/L) 138.29 ± 5.55 158.33 ± 14.49Hematokrit (L/L) 0.43 ± 0.01 0.48 ± 0.04MCV (fL) 54.14 ± 1.53 55.17 ± 1.68MCH (pg) 17.71 ± 0.42 18.17 ± 0.70MCHC (g/L) 325.86 ± 3.62 330.17 ± 3.77RDW % 14.43 ± 0.38 14.13 ± 0.62Trombociti (x109/L) 1080 ± 45.70 827.67 ± 102.37*Limfociti (x109/L) 69.03 ± 2.47 56.58 ± 3.30**Monociti (%) 2.61 ± 0.59 1.98 ± 0.44 Neutrofili (%) 23.64 ± 0.96 34.18 ± 3.05**Eozinofili (%) 4.51 ± 1.38 7.08 ± 2.21 Bazofili (%) 0.20 ± 0.03 0.17 ± 0.02

K- kontrolna grupa pacova. SMP–pacovi izloženi stalnom magnetnom polju. (*p<0.05, **p<0.01 u odnosu na kontrolnu grupu).

Celularnost slezine i tibijeGrafikon 1. prikazuje ukupnu celularnost u slezini iz-

među grupa koje su bile izložene SMP i kontrole. Celularnost slezine kod pacova izloženih magnetnom polju 10 nedelja (17.52 ± 2.18) veća je nego celularnost kontrolne grupe pacova (11.19 ± 0.96), (p<0.01). Statističkom obradom podataka do-kazana je značajno veća celularnost tibije pacova izloženih SMP (49.50 ± 0.43) nego kontrolne grupe (40.57 ± 0.65), (Grafikon 1).

Ne postoji statistički značajna razlika između grupa u broju granulocita u slezini (p>0.05), (Grafikon 2).

Utvrđen je statistički značajno veći broj limfocita u slezini kod grupe koja je bila izložena SMP (27.97 ± 3.49) u odnosu na kontrolnu grupu (17.95 ± 1.61), (p<0.05), što je pri-kazano u Grafikonu 3. Nasuprot ovom nalazu, broj eritrocita u slezini eksperimentalne grupe pacova (70.90 ± 3.53) je zna-čajno manji nego kod kontrolne grupe (80.25 ± 1.83), (p<0.05), (Grafikon 4).

Grafikon 1. Vrednosti ukupne celularnosti slezine i tibije po mikrolitru. (**p<0.01 u odnosu na kontrolnu grupu)

Grafikon 2. Vrednosti broja granulocita u slezini u ispitiva-nim grupama.

Grafikon 3. Vrednosti broja limfocita slezine u ispitivanim grupama. (*p<0.05 u odnosu na kontrolnu grupu)

61



Grafikon 4. Vrednosti broja eritrocita slezine u ispitivanim grupama (*p<0.05 u odnosu na kontrolnu grupu)

DiskusijaNaše istraživanje je pokazalo povećanje ukupne celu-

larnosti u slezini i tibiji kod pacova izloženih SMP od 30 mT. Dodatno je pokazano da je procenat limfocita u slezini stati-stički značajno veći kod eksperimentalne grupe. Zbog toga pretpostavljamo da je to uzrok povećanja ukupne celularnosti u slezini pošto je ranije ustanovljeno da dominantnu grupu ćelija bele loze kod pacova čine limfociti (14). Povećanje broja limfocita u slezini kod izloženih pacova u suprotnosti je sa prethodnim studijama sprovedenim na pacovima koji su bili izloženi SMP-u od 2.9 µT tokom 30 dana (15). Razlika se mo-že objasniti činjenicom da je u našem istraživanju korišćen SMP oko 10000 puta jačeg intenziteta. Kalabekov i sar. (16) sugerišu da izlaganje SMP (60 mT) ima za posledicu poveća-nje nivoa kateholamina. Time možemo pretpostaviti da izla-ganje SMP-u vodi stresom indukovanom povećanju simpatič-ke aktivnosti autonomnog nervnog sistema. Na ovaj način mogle bi se objasniti promene u krvnoj slici izložene grupe pacova. Statistički pokazano smanjenje broja limfocita i trom-bocita, zajedno sa visoko značajnim povećanjem broja neutro-fila u perifernoj krvi zapravo je deo fizioloških promena u okviru opšteg adaptacionog sindroma (17) tj. opšte reakcije organizma na stres.

Tendencija povećanja broja eritrocita u perifernoj krvi i smanjenje njihovog broja u slezini slažu se sa rezultatima prethodnih studija (15), na osnovu čega bismo mogli reći da SMP od 30 mT dovodi do redistribucije eritrocita između krvi i slezine, što je, takodje, promena koja se registruje tokom adaptivne reakcije na stres.

Naše istrživnaje je prvi in vivo eksperiment u kojem su stari pacovi izlagani dugotrajnom dejstvu SMP od 30 mT. Dobijeni rezultati pokazuju statistički značajno povećanje ukupne celularnosti u slezini i tibiji kod životinja izloženih SMP. Dokazano je smanjenje broja limfocita i trombocita za-jedno sa povećanjem broja neutrofila u perifernoj krvi. Pretpostavljamo da se radi o promenama u okviru opšte reak-cije organizma na stres. Takođe, hronično celodnevno izlaga-nje SMP intenziteta 30 mT dovelo je do redistribucije eritroci-ta između krvi i slezine. Prema podacima prethodnih istraži-vanja (14) koji su pokazali da kod starih pacova dolazi do re-

gresije celularnosti u slezini i tibiji, možemo sugerisati da je izlaganje dugotrajnom SMP dovelo do pozitivnog efekta u smislu poboljšanja celularnosti slezine, a samim tim i funkcije ovog tkiva kao hematopoetskog organa kod starih pacova.

Literatura1. NGDC, 2006. http://www.ngdc.noaa.gov/ngdc.html.

National Geophysical Data Center.2. Kowalczuk CI, Sienkiewicz ZJ, Saunders RD. Biological

Effects of Exposure to Non-ionising Electromagnetic Fields and Radiation: Extremely low frequency electric and magnetic fields. Radiat. Protect. Board, Chilton, UK; (NRPB-R238) 1991.

3. Schenck JF. Safety of Strong, Static Magnetic Fields. Journal of magnetic resonance imaging 2000; 12:2–19.

4. Health effects of static magnetic fields–a review of the epidemiological evidence. Prog Biophys Mol Biol. 2005; 87(2–3):241–6.

5. WHO Fact Sheet. Electromagnetic fields and public health: Static electric and magnetic fields, 2006. WHO Fact Sheet #299, Geneva.

6. WHO. Environmental Health Criteria 69. Magnetic Fields Geneva, Switzerland 1987.

7. ICNIRP. Guidelines on limits of exposure to static mag-netic fields. Health Physics 2009; 96(4):504–514;

8. Grissom CB. Magnetic Field Effects in Biology: A Survey of Possible Mechanisms with Emphasis on Radical-Pair Recombination. Chem Rev. 1995; 95:3–24.

9. Kumar V, Cotran RS, Robbins SL. Basic Pathology. 7th edition, Philadelphia: W.B. Saunders Company, 2005. p.9–12.

10. Kirkwood TBL. Understanding the Odd Science of Aging. Cell 2005; 120(4):437–447.

11. Kubota K, Shirakura T, Orui T. et al. Change in the Blood Cell Counts with Age. Jpn J Geriat 1991; 28(4):509–514

12. Nakanishi N, Suzuki K, Tatara K. Age-related Change in Relationship between White Blood Cell Count and Some Features of the Metabolic Syndrome. Industrial Health 2004; 42(3):359–68

13. Vranić V, Savovski K, Dedović N, Dimitrijević B. Hematological toxicity associated with tiazofurin—influ-ence on erythropoiesis, Toxicol. Lett. 2000; 114(1–3):81–90.

14. Green EL. Biology of the laboratory mouse. New York: Dover publications, 1966.

15. Hashish AH, El-Missiry MA, Abdelkader HI, Abou-Saleh RH. Assessment of biological changes of continuous whole body exposure to static magnetic field and extreme-ly low frequency electromagnetic fields in mice. Ecotoxicol. Environ. Safety 2008; 71(3):895–902.

16. Kalabekov AL, Doeva AN, Medoeva ZN. The catechol-amine content of the mast cell system in rats exposed to a permanent magnetic field. Morfologia 1995; 108(3):43–4.

17. Beleslin B. i sar. Opšta patološka fiziologija, drugo izda-nje. Beograd: Data status, 2007. p.64–69.

62



SažetakUvod: Maligni tumori jedan su od najčešćih uzro-

ka mortaliteta u svetu, a i kod nas. Podaci ukazuju da maligne bolesti krvi, leukemije, uzimaju značajan udeo u ukupnom mortalitetu i morbiditetu, te da u SAD od le-ukemije boluje ili se oporavlja oko 250 000 ljudi. Poseban terapijski izazov predstavlja akutna promijelocitna leu-kemija (APL), kod koje je prisutna niska osetljivost na hemioterapijske lekove. Uvođenje lekova koji indukuju diferencijaciju leukemijskih blasta, u terapijske protoko-le za APL, pokazalo se korisnim, ali ne i dovoljno efika-snim. Usled toga, potreba za novim antitumorskim leko-vima ne jenjava. Našu pažnju je privukao etil estar eti-lendiamin dicikloheksil propanske kiseline (L3), koji je pokazao značajne citotoksične efekte na HL-60 ćelijama humane promijelocitne leukemije in vitro.

Cilj: Ispitivanje sposobnosti L3 da indukuje dife-rencijaciju HL-60 ćelija, in vitro.

Materijal i metode: Ispitivanje promene morfolo-gije HL-60 ćelija prema granulocitnom fenotipu nakon tretmana ispitivanom supstancom vršeno je nakon boje-nja toluidin plavim i analizom ukalupljenih uzoraka me-todom svetlosne mikroskopije, kao i na ultratankim iseč-cima tretiranih ćelija posmatranih elektronskim mikro-skopom. Ispitivanje ekspresije CD15 i CD11b membran-skih receptora kao pokazatelja granulocitne diferencija-cije na HL-60 ćelijama vršeno je metodom protočne ci-tometrije korišćenjem antitela obeleženih fluorohromi-ma.

Rezultati: Dobijeni rezultati pokazali su da u ćeli-jama nakon tretmana sa L3(48h; 12,5 μM) dolazi do for-miranja nuklearnih impresija (svetlosna mikroskopija), i primarnih granula (elektronska mikroskopija). Povećanje intenziteta relativne fluorescence u grupi tre-tiranih ćelija (protočna citometrija) govori u prilog po-većane ekspresije CD15 i CD11b markera granulocitne diferencijacije.

Zaključak: Na osnovu dobijenih rezultata može se zaključiti da L3 dovodi do diferencijacije HL-60 ćelija ka granulocitnom fenotipu.

Ključne reči: Etil estar etilendiamin dicikloheksil pro-panske kiseline, HL-60, diferencijacija.

AbstractIntroduction: Malignant tumors represent one of

the most common causes of mortality in the world. Data show that malignancies of blood, leukemias, take a sig-nificant part in total mortality and morbidity, and in USA 250 000 people have or are in remission from leu-kemia. Particular therapeutic challenge is acute promy-elocytic leukemia (APL), which has low sensitivity to chemotherapeutic drugs. Introduction of agents that dif-ferentiate leukemic blast cells into therapy protocols for APL is useful, but not efficient enough. The search for novel antitumor drugs is persistent. Our attention was brought to ethylenediamine dicyclohexyl propanoic acid ethyl ester (L3), since it exibited significant cytotoxic ef-fects against HL-60 human promyelocytic leukemia cells.

The Aim: To investigate ability of L3 to induce dif-ferentiation of HL-60 cells, in vitro.

Material and Methods: Changes in HL-60 cells morphology towards granulocytic phenotype, after the treatment with investigated substance, was assesed after toulidin blue staining and analysis of embedded sections under light microscope, as well as on ultra thin sections of treated cells observed under electron microscope. Examination of CD15 and CD11b membrane receptors expresion, as markers of granulocytic differentiation of HL-60 cells, was conducted using flow cytometry after fluorochrome conjugated antibodies application.

Results: Obtained results showed that nuclear in-dentations (light microscopy) and primary granules (electron microscopy) were formed in treated cells (48h; 12,5 µM). Increase of relative fluorescence intensity in treated cells (flow cytometry) suggests overexpression of CD15 and CD11b markers of granulocytic differentia-tion.

Conclusion: We can conclude that L3 induces dif-ferentiation of HL-60 cells towards granulocytic pheno-type.

Key words: Ethylenediamine dicyclohexyl propanoic acid ethyl ester, HL-60, differentiation.

UTICAJ NOVOSINTETISANOG JEDINJENJA ESTARSKE PRIRODE NA DIFERENCIJACIJU HUMANE PROMIJELOCITNE

LEUKEMIJSKE ĆELIJSKE LINIJE

Autori: Željko Antić1

Mentor: Asist. dr Sonja Misirlić Denčić2

1Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu2Institut za medicinsku i kliničku biohemiju, Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu

63



UvodMaligna oboljenja predstavljaju značajan uzrok morta-

liteta u svetu, a i kod nas. Prema statističkim podacima za 2011. godinu na teritoriji SAD je registrovano preko 1,5 mili-ona novoobolelih od kancera (1). Podaci dodatno ukazuju da preko 250 000 ljudi u SAD ima, ili se oporavlja od leukemija (2). Očekuje se da samo tokom 2012. godine, u SAD od leuke-mija umre preko 20 000 ljudi, sa blagim porastom mortaliteta kod osoba starijih od 65 godina, kod kojih je akutna mijeloid-na leukemija (AML) naročito česta (3,4).

Maligni tumori predstavljaju grupu hroničnih progre-sivnih oboljenja, čija je osnovna morfolološka i funkcionalna odlika postojanje maligno transformisanih ćelija. Maligna transformacija ćelije je složen proces, koji zahteva više sukce-sivnih događaja na nivou kontrole ekspresije gena koji kontro-lišu ćelijski ciklus, diferencijaciju i ćelijsku smrt (5–8). Uprkos monoklonalnom poreklu većine tumora, stalne steče-ne mutacije genetskog materijala dovode do pojave subpopu-lacija tumorskih ćelija od kojih neke pokazuju osobine koje im omogućavaju komparativnu prednost u uslovima izuzetno visokog selektivnog pritiska u odnosu na postojeće tumorske, kao i zdrave ćelije (9). Prvi dokazi da kancer kod čoveka može nastati malignom transformacijom stem ćelije, ili pak od pro-genitora u kome su mutacije dovele do disregulacije životnog ciklusa, pronađeni su upravo na hematološkim malignitetima (10). Naime, trenutno je aktuelan koncept postojanja tzv. leu-kemijskih stem ćelija koje su za razliku od ostalih leukemij-skih ćelija rezistentne na hemo i radio terapiju i odgovorne za relaps bolesti nakon inicijalne remisije (11).

Zahvaljujući obilju novih saznanja o citogenetskim i fenotipskim karakteristikama malignih bolesti hematopoe-znog tkiva u mnogome je poboljšan tretman obolelih (12). Pored jedine u terapijskom smislu optimalne metode – trans-plantacije koštane srži, danas su aktuelna tri farmakološka pristupa u onko-hematologiji: konvencionalni hemoterapeuti-ci (npr. nukleozidni analozi), ciljna terapija molekulima koji interferiraju sa signalnim putevima angažovanim u određe-nom tipu leukemija (npr. inhibitori tirozin kinaze u terapiji hronične mijeloidne leukemije) i terapija monoklonskim anti-telima (12).

Akutna promijelocitna leukemija (APL) je jedan od oblika AML (13). Oko 95% pacijenata obolelih od APL pose-duje balansiranu recipročnu translokaciju t(15;17) (q22;q11–12), koja dovodi do fuzije tumor supresorskog gena promijelocitne leukemije (PML) i gena za receptor za retino-ičnu kiselinu α (RARα). Hibridni protein, koji na ovaj način nastaje, onemogućava normalnu diferencijaciju hematopoe-znih progenitora (14,15). Danas se u standardnim terapijskim protokolima za lečenje APL koristi all-trans retinoična kiseli-na (ATRA) kao agens koji indukuje diferencijaciju leukemij-skih ćelija, nakon čega one postaju podložnije dejstvu hemio-terapeutika (16). Do uvođenja ATRA u terapijski protokol, APL je imala lošu prognozu zbog ozbiljnih krvarenja i prolon-giranog odgovora na primenjene hemioterapeutike, što je do-vodilo do smrtnog ishoda u roku od par nedelja (14).

U skladu sa permanentno rastućom incidencom obo-ljevanja od maligniteta hematopoetskog tkiva, traganje za no-vim, efikasnijim, selektivnijim i manje toksičnim hemiotera-peuticima ne jenjava. U tom smislu, našu pažnju je privukao

etil estar etilendiamin dicikloheksil propanske kiseline (L3) sintetisan od strane istraživača se Hemijskog fakulteta Univerziteta u Beogradu. Ovo jedinjenje je pokazalo izuzetan citotoksični efekat prema humanoj gliomskoj ćelijskoj liniji (U251), mišjem fibrosarkomu (L929) gliomu pacova (C6) kao i ćelijama mišjeg melanoma (B16) (17). Međutim, molekular-ni mehanizam na kome se zasniva citotoksičnost ovog jedinje-nja nije bio ispitan. U skladu sa tim, želja naše istraživačke grupe bila je da molekularni mehanizam citotoksičnog delo-vanja L3 ispita na paleti humanih leukemijskih ćelija. Rezultati naših prethodnih eksperimenata izdvojili su akutnu humanu promijelocitnu leukemiju (HL-60) kao najosetljiviju na citotoksično delovanje L3. U skladu sa prirodom ove leuke-mijske ćelijske linije, nametnula se i potreba ispitivanja mo-gućeg uticaja L3 na diferencijaciju HL-60. Cilj ovog istraživa-nja je ispitivanje L3 na diferencijaciju HL-60 ćelijske linije in vitro.

Mater ija l i metodeRastvori za kultivisanje ćelija i rastvaranje liganda

Za rad sa leukemijskom ćelijskom kulturom korišćen je medijum RPMI 1640 (PAA, Austrija), puferovan 20mM HEPES (Ph=7,3), uz dodatak 1% smeše antibiotika/antimiko-tika (penicilin 10 000 IJ, streptomicin 10 mg, amfotericin B 25 µg/kg), i fetalnog goveđeg seruma (FBS), u koncentraciji 10%. Ćelije su prane u fiziološkom rastvoru sa fosfatnim pu-ferom (PBS). L3 (m=497,546 g) je rastvaran u dimetilsulfok-sidu (DMSO), u skladu sa svojom rastvorljivošću (50 mg u 10 ml DMSO = 10 mM štok rastvor), i čuvan na sobnoj tempera-turi. Pri tretiranju ćelijske kulture, poštovano je pravilo da maksimalna finalna koncentracija DMSO pri tretmanu ne pre-lazi 1% .

Ćelijska kulturaEfekti L3 ispitivani su na ćelijskoj liniji akutne promi-

jelocitne leukemije (HL-60), nabavljene od European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Velika Britanija. Ćelije su zasejavane u petri šolje prečnika 100mm (Sarstedt, Nümbrecht, Germany), i gajene u inkubatoru na temperaturi 37ºC, u vlažnoj atmosferi sa 5% CO2. Ćelije su brojane u Neubauer-ovoj komori, pod svetlosnim mikrosko-pom, nakon bojenja sa 0,1% rastvorom tripan plavog u PBS-u. Ćelije prebojene plavom bojom smatrane su mrtvim.

Ispitivanje ekspresije markera granulocitne diferencijacijeDetekcija CD15 i CD11b kao markera granulocitne di-

ferencijacije, vršena je na protočnom citometru FACSCalibur (BD Heidelberg, Germany). Ćelije HL-60 su nakon tretmana (48h) sa 12,5µM L3 bojene FITC–konjugovanim anti-huma-nim CD15 antitelima i pikoeritrinom (PE)–konjugovanim an-ti-humanim CD11b antitelima. Kao negativna kontrola kori-šćena su anti-humana IgG1/IgG2 (FITC/PE) antitela (BD Pharmingen). Promene u ekspresiji CD15 i CD11b izražene su kao stepen porasta prosečnog intenziteta fluorescence (mean fluorescence), u odnosu na negativnu kontrolu za čiju je vred-nost arbitarno uzet broj 1. Eksperimenati su rađeni u triplika-tu.

64



Ispitivanje morfologije ćelijaU cilju ispitivanja granulocitne diferencijacije HL-60

ćelija, analizirana je njihova morfologija primenom svetlosne mikroskopije nakon bojenja isečaka debljine 1 µm toluidin plavim, kao i primenom elektronske mikroskopije na ultra-tankim isečcima ukalupljenim u EPON-u (Agar-Scientific). Korišćen je svetlosni mikroskop (Olympus BX41TF) pri uve-ličanju 100x, uz korišćenje uljane imerzije i fotografisanje uz pomoć digitalne kamere Olympus C5060. Ultratanki isečci za elektronsku mikroskopiju su nakon postavljanja na bakarne mrežice bojeni uranil acetatom i analizirani na elektronskom mikroskopu Morgagni 268D (FEI).

Rezultat iU našim eksperimentima ispitivana je ekspresija CD15

i CD11b markera granulocitne diferencijacije, pomoću mono-klonskih antitela obeleženih odgovarajućim fluorohromom, metodom protočne citometrije. Reprezentativni histogrami promene relativnog intenziteta fluorescence u ćelijama treti-ranim L3 (48h; 12,5 µM) u odnosu na kontrolu (netretirane ćelije), dati su na slici 1.

Slika 1. Reprezentativni histogrami promene relativnog in-tenziteta fluorescence CD15 i CD11b markera granulocitne diferencijacije na HL-60 ćelijama nakon tretmana sa L3.

Povećanje relativnog intenziteta fluorescence (pomak u desno), u tretiranim ćelijama u odnosu na kontrolu govori u prilog povećanja ekspresije CD15 i CD11b markera granulo-citne diferencijacije. Ovakav rezultat ukazuje da dvodnevna inkubacija HL-60 ćelija sa L3 uzrokuje diferencijaciju ovih ćelija u granulocitni fenotip.

Odnos intenziteta relativne fluorescence CD15 i CD11b markera granulocitne diferencijacije, prikazan je na grafikonu 1.

Stubičastim dijagramom predstavljene su prosečne vrednosti (aritmetička sredina ± standardna devijacija) rela-tivnog intenziteta fluorescence CD15 i CD11b markera granu-

locitne diferencijacije iz tri nezavisna eksperimenta rađena u triplikatu. Povećanje prosečne vrednosti relativnog intenzite-ta fluorescence sa 1,0 u kontroli na 1,2 u tretmanu, govori u prilog statistički značajnog (p<0.05) povećanja ekspresije ovih markera granulocitne diferencijacije. Ovaj rezultat do-datno potvrđuje da L3 dovodi do diferencijacije humane pro-mijelocitne leukemijske ćelijske linije.

Grafikon 1. Stubičasti dijagram porasta relativnog intenziteta fluorescence CD15 i CD11b markera granulocitne diferencija-cije nakon tretmana sa L3.

U našem istraživanju morfologija HL-60 ćelija je ispi-tivana metodama svetlosne i elektronske mikroskopije. Reprezentativne mikrografije (svetlosna mikroskopija isečaka debljine 1 µm) ćelija tretiranih sa L3, kao i kontrole (netretira-ne ćelije), date su na slici 2.

Na mikrografiji tretiranih ćelija uočavaju se mnogo-brojne nuklearne impresije, u poređenju sa mikrografijom kontrole, što, uzimajući u obzir da je reč o isečcima dobijenim sečenjem kalupljenih ćelija, odgovara dvodimenzionalnom prikazu segmentiranog jedra granulocita. Na slici 3 date su reprezentativne mikrografije dobijene elektronskom mikro-skopijom ćelija tretiranih sa L3 (48h; 12,5 µM), kao i kontrole (netretirane ćelije).

Na mikrografiji tretiranih ćelija, u odnosu na kontrol-ne, uočava se prisustvo velikog broja primarnih granula, što predstavlja još jedan od morfoloških markera diferencijacije HL-60 ćelija u pravcu granulocitnog fenotipa.

65



Slika 3. A. Reprezentativne elektronske mikrografije kontrolnih (netretiranih) i HL-60 ćelija nakon tretmana sa L3. Skala za procenu veličine 5 µm. B. Prikaz detalja. Skala za procenu veličine 5 µm.

DiskusijaLogika terapije APL zasnovana je na primeni lekova

koji dovode do indukcije smrti leukemijskih ćelija. Efikasnom terapijskom strategijom ,takođe, smatra se i primena ATRA kao agensa koji indukuje diferencijaciju leukemijskih blasta. Na ovaj način omogućeno je da one postanu podložnije delo-vanju hemioterapeutiku, što vodi bržem uvođenju obolelog u remisiju (16). Brzina postizanja remisije kod obolelog od APL

od presudnog je značaja kada je reč o prognozi bolesti (18). Pre uvođenja ATRA u terapijski protokol, terapijski odgovor na primenjene hemioterapeutike bio je spor, što je dovodilo do visokog mortaliteta u populaciji obolelih od APL (14).

U terapijskim protokolima za lečenje leukemija, lekovi sposobni da indukuju ćelijsku smrt nalaze vrlo široku primenu posebno onda kada terapijski optimalna transplantacija košta-ne srži iz nekog razloga nije moguća (12). Naime, njihova upo-

Slika 2. Reprezentativne svetlosne mikrografije kontrolnih (A) i HL-60 ćelija tretiranih sa L3 (B) nakon bojenja toluidin pla-vim. Skala za procenu veličine 20 µm.

66



treba zajedno sa drugim lekovima (monoklonalna antitela, inhibitori signalnih puteva), pokazala se efikasnom za postiza-nje relativno brze i dugotrajne remisije u ovim okolnostima. Ipak, pojedini oblici maligniteta hematopoeznog tkiva, kao što je APL, karakterišu se izrazitom rezistencijom i sporim terapijskim odgovorom na primenjene lekove. Glavni razlog slabog terapijskog odgovora APL blasta na primenjene lekove je upravo njihov izrazito nizak stepen diferencijacije (16). ATRA koja je u stanju da indukuje diferencijaciju leukemij-skih blasta i na ovaj način poboljša terapijski odgovor na pri-menjene lekove, najverovatnije deluje na nivou himernog pro-teina PML/RARα (15, 16) . RARα je član familije retinoična kiselina inducibilnih transkripcionih faktora (15). U odsustvu retinoične kiseline (RA) RARα gradi heterodimer sa recepto-rom za retinodid X (RXR), koji, potom, regrutuje korepresor-ski kompleks sa histon deacetilazom (HDAC) koji za posledi-cu ima kondenzaciju hromatina i gensku represiju. U malim koncetracijama (1 x 10–9 M) RA je u stanju da dovede do otpu-štanja korepresora sa kompleksa RARα/RXR i regrutovanja koaktivatorskog kompleksa sa histon acetiltransferazom (HAT), što za posledicu ima acetilovanje RARE regiona (spe-cifični promotorski region za koji se vezuje RARα) (19, 20).

PML je tumor supresorski gen čiji produkti u ćeliji re-gulišu genomsku stabilnost, indukuju apoptozu, supresiju će-lijskog rasta, a takođe, predstavljaju i intracelularne senzore oštećenja ćelija jonizujućim zračenjem i malignom trasforma-cijom. PML se nalazi u jedru u vidu multiproteinskog kom-pleksa (nuclear bodies) sa p53, pRB, Daxx, CBP (21, 22). PML/RARα himerizacija dovodi do delokalizacije PML u je-dru (rasut u vidu mikročestica), menja mesto za vezivanje PML na DNK, i dovodi do RA signalne represije. PML/RARα gradi homodimerne komplekse koji mnogo jačim afinitetom vezuju korepresorski kompleks sa HDAC (23). PML/RARα je ,takođe, u stanju da veže DNK metilujuće enzime Dnmt1 i Dnmt3a, uzrokujući metilovanje promotera koji predstavljaju metu za RA (24, 25).

U prisustvu farmakoloških doza ATRA (10–6 M) ho-modimerski kompleks fuzionog proteina PML/RARα otpušta korepresorski kompleks. Smatra se da upravo ovim mehani-zmom dejstva ATRA omogućava prevazilaženje bloka tran-skripcije, dovodeći do diferencijacije leukemijskih blasta (15). HL-60 ćelije je u in vitro uslovima lako diferentovati pomoću ATRA, te su kao takve pogodan model za proučavanje granu-locitne diferencijacije (26). Uzevši u obzir značajne citotok-sične efekte koje etilni estar (L3) pokazuje u in vitro uslovima (17), kao i da do sada nije ispitivana njegova sposobnost da indukuje diferencijaciju HL-60 ćelija, naš cilj u ovom istraži-vanju bio je da ispitamo njegovu sposobnost da indukuje dife-rencijaciju HL-60 ćelija pri prolongiranom tretmanu niskim koncetracijama (48h; 12,5 µM) (17).

Potvrda granulocitne diferencijacije može se dobiti is-pitivanjem ekspresije odgovarajućih CD markera (cluster of differentiation) na površini ćelijske membrane HL-60 ćelija, korišćenjem monoklonalnih antitela obeleženih fluorohromi-ma. U literaturi se kao najčešće ispitivani koriste CD11b, CD13, CD14, CD15, CD33, CD34, CD41 markeri granulocitne diferencijacije (27).

CD15 je maker spercifičan za neutrofile, ćelije Hodgkin limfoma, akutne limfoblastne leukemije, nekih formi hronič-

nih B-ćelijskih leukemija, i nekih akutnih nelimfocitnih leu-kemija (28). CD11b je površinski maker koji se može naći na makrofazima, monocitima, neutrofilima, NK ćelijama (29). Oba markera imaju značaja u hemotaksi i fagocitozi, kao spe-cifični receptori uključeni u ovaj proces (28, 29). Porast nivoa intenziteta relativne fluorescence, kao i prosečne vrednosti relativnog intenziteta fluorescence iz tri nezavisna eksperi-menta za markere CD15 i CD11b, ukazuje na povećanje njiho-ve ekspresije, što je karakteristika ćelija koje se diferentuju u pravcu granulocitnog fenotipa. (30, 31). Prema podacima iz literature ATRA dovodi do statistički značajnog povećanja (p<0,05) prosečne vrednosti relativnog intenziteta fluorescen-ce za CD11b marker granulocitne diferencijacije na primar-nim APL ćelijama. Ovakav efekat postignut je u kratkim (do 18h), odnosno dugim (do 72h) vremenskim intervalima, pri čemu je koncetracija ATRA bila 1 µM. (30, 31). Uzevši u obzir da do statistički značajnog povećanja (p<0,05) ekspresije CD11b markera granulocitne diferencijacije nakon primene 3 dolazi tek pri produženom tretmanu većim koncentracijama (48h; 12,5 µM), može se zaključiti da je ATRA, očekivano, efikasnija kao indukujući agens. Jedan od često primenjivanih lekova u terapijskim protokolima za APL, arsen trioksid (ATO), takođe, dovodi do diferencijacije HL-60 ćelija (30–32). Prema podacima iz literature, ATO pri koncetraciji od 0,1 µM već nakon 5 dana dovodi po povećanja intenziteta relativ-ne fluorescence markera granulocitne diferencijacije CD11b na 36,2%, odnosno 57,4% nakon 7 dana, u odnosu na kontrolu (32). Međutim, ATO dovodi do slabijeg stepena diferentova-nja APL ćelija u odnosu na ATRA, čime se objašnjava njegov veći stepen citotoksičnosti (već pri 1 µM) u odnosu na ATRA (30, 33). Uzevši u obzir da ATO dovodi do značajnog poveća-nja intenziteta relativne fluorescence markera granulocitne diferencijacije CD11b, može se zaključiti da je ATO potentniji induktor diferencijacije ćelija promijelocitne leukemije, kako u odnosu na L3, tako i u odnosu na ATRA. Međutim, i ATRA i ATO svoje citotoksične efekte ispoljavaju pri nižim konce-tracijama u odnosu na L3, što uz ozbiljan profil neželjenih efe-kata (ATRA sindrom, ARDS, koagulopatije, tromboze) i ra-zvoj rezistencije prema ATRA, predstavlja ozbiljne ograniča-vajuće faktore u tretmanu obolelih od APL (34).

Proces diferencijacije ćelija podrazumeva postupnu promenu morfologije ćelija u pravcu odgovarajućeg fenotipa, a kao posledica prisustva odgovarajućih faktora koji indukuju diferencijaciju. Ćelije granulocitne loze odlikuju se specifič-nim morfološkim karakteristikama kao što su segmentirano jedro, prisustvo primarnih (azurofilnih ili nespecifičnih) i se-kundarnih (specifičnih) granula (35, 36). Neke od ovih morfo-loških karakteristika moguće je zapaziti prilikom in vitro di-ferencijacije HL-60 ćelija odgovarajućim induktorima (ATRA, Actinomycin D, Hipoksantin) (37).

Na osnovu eksperimentalnih rezultata, do kojih smo došli u ovom istraživanju, možemo zaključiti da ispitivani etilni estar (L3) dovodi do povećanja ekspresije markera gra-nulocitne diferencijacije CD15 i CD11b na HL-60 ćelijama, kao i pojave morfoloških markera granulocitne diferencijaci-je. Ovakvi rezultati nedvosmisleno upućuju na značaj daljeg ispitivanja molekularnog mehanizma delovanja ovog jedinje-nja na leukemijskim ćelijama.

67



Literatura1. Siegel R, Ward E, Brawley O, Jemal A. Cancer statistics,

2011: the impact of eliminating socioeconomic and racial disparities on premature cancer deaths. CA Cancer J Clin. 2011; 61(4):212–36.

2. http://www.lls.org/#/resourcecenter/freeeducationmateri-als/generalcancer/facts

3. Ferlay J, Shin HR, Bray F, Forman D, Mathers C and Parkin DM. GLOBOCAN 2008, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC CancerBase No. 10 [Internet]. Lyon, France: International Agency for Research on Cancer; 2010.

4. World Health Organization, mortality database; http://www.who.int/whosis/mort/download/en/index.html

5. Fulda S. Therapeutic opportunities for counteracting apoptosis resistance in childhood leukaemia. Br J Haematol. 2009; 145(4):441–54.

6. Gilliland DG, Griffin JD. The roles of FLT3 in hematopoi-esis and leukemia. Blood. 2002; 100(5):1532–42.

7. Fröhling S, Scholl C, Gilliland DG, Levine RL. Genetics of myeloid malignancies: pathogenetic and clinical impli-cations. J Clin Oncol. 2005;23(26):6285–95.

8. Kelly LM, Gilliland DG. Genetics of myeloid leukemias. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2002; 3:179–98.

9. Mimeault M, Batra SK. New advances on critical implica-tions of tumor- and metastasis-initiating cells in cancer progression, treatment resistance and disease recurrence. Histol Histopathol. 2010; 25(8):1057–73.

10. Lapidot T, Sirard C, et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 1994; 367(6464):645–8.

11. Buss EC, Ho AD. Leukemia stem cells. Int J Cancer. 2011; 129(10):2328–36.

12. Baleydier F, Domenech C, Thomas X. [Novel convention-al therapies in onco-hemathology]. Bull Cancer. 2011; 98(8):901–13.

13. Vardiman JW, Harris NL, Brunning RD. The World Health Organization (WHO) classification of the myeloid neoplasms. Blood. 2002; 100(7):2292–302.

14. Wang ZY, Chen Z. Acute promyelocytic leukemia: from highly fatal to highly curable. Blood. 2008; 111(5):2505–15.

15. Lo-Coco F, Ammatuna E. The biology of acute promyelo-cytic leukemia and its impact on diagnosis and treatment. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2006; 156–61, 514.

16. Sanz MA, Grimwade D, et al. Management of acute pro-myelocytic leukemia: recommendations from an expert panel on behalf of the European LeukemiaNet. Blood. 2009; 113(9):1875–91.

17. Lazić JM, Vucićević L, et al. Synthesis and in vitro anti-cancer activity of octahedral platinum(IV) complexes with cyclohexyl-functionalized ethylenediamine-N,N’-di-acetate-type ligands. ChemMedChem. 2010; 5(6):881–9.

18. Falanga A, Russo L, Tartari CJ. Pathogenesis and treat-ment of thrombohemorrhagic diathesis in acute promyelo-cytic leukemia. Mediterr J Hematol Infect Dis. 2011;3(1):e2011068.

19. Dilworth FJ, Chambon P. Nuclear receptors coordinate the activities of chromatin remodeling complexes and coacti-

vators to facilitate initiation of transcription. Oncogene. 2000; 20:3047–3054.

20. Glass CK, Rosenfeld MG. The coregulator exchange in transcriptional functions of nuclear receptors. Genes Dev. 2000; 14:121–141.

21. Zhong S, Salomoni P, Pandolfi PP. The transcriptional role of PML and the nuclear body. Nat Cell Biol. 2000; 2:E85–90

22. Gurrieri C, Capodieci P, Bernardi R, et al. Loss of the tu-mor suppressor PML in human cancers of multiple histo-logic origins. J Natl Cancer Inst. 2004; 96(4):269–79.

23. Pandolfi PP. In vivo analysis of the molecular genetics of acute promyelocytic leukemia. Oncogene. 2001; 20:5726–5735.

24. Di Croce L, Raker VA, Corsaro M, et al. Methyltransferase recruitment and DNA hypermethylation of target promot-ers by an oncogenic transcription factor. Science. 2002; 295:1079–1082.

25. Villa R, Morey L, Raker VA, et al. The methyl-CpG bind-ing protein MBD1 is required for PML-RARalpha func-tion. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006; 103:1400–1405.

26. Baxter SS, Carlson LA, Mayer AM, Hall ML, Fay MJ. Granulocytic differentiation of HL-60 promyelocytic leu-kemia cells is associated with increased expression of Cul5. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2009; 45(5–6):264–74.

27. Oka S, Nagatsuka Y, et al. Preferential expression of phos-phatidylglucoside along neutrophil differentiation path-way. Leuk Lymphoma. 2009; 50(7):1190–7.

28. Kerr MA, Stocks SC. The role of CD15-(Le(X))-related carbohydrates in neutrophil adhesion. Histochem J. 1992; 24(11):811–26.

29. Stewart M, Thiel M, Hogg N. Leukocyte integrins. Curr Opin Cell Biol. 1995;7(5):690–6.

30. Chen GQ, Shi XG, et al. Use of arsenic trioxide (As2O3) in the treatment of acute promyelocytic leukemia (APL): I. As2O3 exerts dose-dependent dual effects on APL cells. Blood. 1997; 89(9):3345–53.

31. Cunha De Santis G, Tamarozzi MB, et al. Adhesion mol-ecules and Differentiation Syndrome: phenotypic and functional analysis of the effect of ATRA, As2O3, phenyl-butyrate, and G-CSF in acute promyelocytic leukemia. Haematologica. 2007; 92(12):1615–22.

32. Cai X, Shen YL, et al. Arsenic trioxide-induced apoptosis and differentiation are associated respectively with mito-chondrial transmembrane potential collapse and retinoic acid signaling pathways in acute promyelocytic leukemia. Leukemia. 2000; 14(2):262–70.

33. Chomienne C, Fenaux P, Degos L. Retinoid differentiation therapy in promyelocytic leukemia. FASEB J. 1996; 10(9):1025–30. Review.

34. Ralph SJ. Arsenic-based antineoplastic drugs and their mechanisms of action. Met Based Drugs. 2008; 2008:260146.

35. Lawson ND, Berliner N. Neutrophil maturation and the role of retinoic acid. Exp Hematol. 1999; 27(9):1355–67.

36. Borregaard N, Cowland JB. Granules of the human neu-trophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood. 1997; 89(10):3503–21.

37. Collins SJ. The HL-60 promyelocytic leukemia cell line: proliferation, differentiation, and cellular oncogene ex-pression. Blood. 1987; 70(5):1233–44.

68



Sažetak:Uvod: Bakterijske infekcije danas nisu toliko le-

talne zahvaljujući brojnim antibioticima, ali svakako brine sve češća pojava multirezistentnih sojeva. Istraživanje novih antibakterijskih agenasa svakako je prioritet i prirodni izvori su posebno značajni. Zmijski toksini se pominju kao jedan od mogućih agenasa.

Cilj rada: Ispitivanje moguće antibakterijske ak-tivnosti toksina Viperae ammodytes ammodytes na oda-brane mikroorganizme.

Materijal i metode: Toksin je elektroforetski (SDS-PAGE) profilisan i denzitometrisan. Difuzionom meto-dom antibiograma je ispitivan antibakterijski efekat tok-sina u različitim koncentracijama na sojeve Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 35218), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) i Enterococcus faecalis (ATCC 29212), kao i kliničke izo-late. Minimalna inhibitorna koncentracija (MIK) je određivan mikrobujon dilucijom.

Rezultati: Osetljivost odabranih bakterija je naji-zraženija kod S.aureus>Pseudomonas aeruginosa> Escherichia coli >Enterococcus faecalis kod koga nije bilo efekta, kao i njihovih kliničkih izolata. MIK je bila najizraženija kod S.aureusa. Elektroforetski–denzito-metrijom utvrđeno 11 proteinskih frakcija toksina.

Zaključak: Demonstrirano antibakterijsko delovanje toksina Viperae ammodytes ammodytes otvara mogučnosti za dalje ispitivanje komponenti toksina i njihovog potencijal-nog efekta i upotrebe.

Ključne reči: Vipera ammodytes ammodytes, zmijski tok-sin, antibakterijski efekat, MIK, SDS-PAGE.

Abstract:Introduction: Bacterial infection today are not as

lethal due to a number of antibiotics, but there is a con-stant increase in the number of multiresistant strains. Constant research of new antibacterial agents is certainly a priority, and natural resources are particu-larly important. Snake toxins are mentioned as one of the possible agents.

Аim: To investigate the possible antibacterial ac-tivity of Viperae ammodytes ammodytes venom on se-lected microorganisms.

Methods: The venom was electrophoretically (SDS-PAGE) and densitometrically profiled. The anti-bacterial effect was investigated by disk-diffusion meth-od on various concentrations of venom on selected strains Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 35218), Pseudomonas aerugi-nosa (ATCC 27853) and Enterococcus faecalis (ATCC 29212), as well as on their clinical isolates. Minimal in-hibitory concentration (MIC) was determined by broth dilution method.

Results: The sensitivity of selected bacteria is most pronounced in S.aureus>Pseudomonas aerugino-sa> Escherichia col >Enterococcus faecalis, which did not have an antibacterial effect, as well as their clinical isolates. MIC was the most pronounced in S.aureus. Electrophoresis–densitometry showed 11 protein frac-tions of venom.

Conclusion: The demonstrated antibacterial property of Viperae ammodytes ammodytes venom high-light it for further studies in order to detect which com-ponent is/are responsible for this activity and their po-tential use

Key words: Vipera ammodytes ammodytes, snake ven-om, antibacterial effect, MIC, SDS-PAGE.

UvodOtkriće penicilina 1928. godine, promenilo je tok me-

dicine i lečenja bakterijskih infekcija. Međutim, ubrzo se po-javio novi izazov u vidu rezistencije bakterija na antimikrob-ne agense. Bakterije brojnih rodova (Pseudomonas, Klebsiella, Enterobacter, Acinetobacter, Salmonella, Staphylococcus, Enterococcus i Streptococcus) su razvile različite mehanizme rezistencije, što postaje veliki problem savremene medicine (1,2). Stoga je neophodno konstantno ispitivanje i pronalaže-nje novih antibakterijskih supstanci, bilo prirodnih ili sinte-tičkih, kako bi bili u koraku sa razvojem novih multirezistent-nih sojeva.

EFEKTI TOKSINA VIPERA AMMODYTES AMMODYTES NA ODABRANE BAKTERIJSKE VRSTE

Autor: Dušan Kekić1

Mentori: Prof. dr Kristina Gopčević2, Prof. dr Nataša Vučković Opavski3, sar. u nast. dr Ina Gajić3

1Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu2Institut za hemiju u medicini, Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu3Institut za mikrobiologiju i imunologiju, Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu

69



Prirodni proizvodi predstavljaju važan izvor različitih medicinski aktivnih supstanci. Brojni organizmi produkuju biološki aktivne materije, a neke od njih se mogu koristiti u svrhu antimikrobne aktivnosti. Zmijski toksin je prirodni pro-izvod koji, iako smrtonosan, sadrži brojne komponente koje se potencijalno mogu terapeutski upotrebljavati. Komponente otrova nekih zmija se već koriste u terapeutske svrhe u razli-čitim patološkim stanjima u savremenoj, istočnjačkoj, home-opatskoj i narodnoj medicini (3). Otrov je smeša brojnih bio-loški aktivnih materija, među kojima su proteini i peptidi (90–95%), uključujući amino kiseline, nukleotide, lipide, ugljene hidrate i metalo-proteine (5%) (4–7). Enzimi zmijskog toksina pokazuju višestruko toksično dejstvo – neurotoksič-no, miotoksično, kardiotoksično, hemoragično, hemolitičko, pro i antikoagulantno (8,9). U Viperidae familiji, kojoj pripa-da ovaj zmijski toksin, proteini su klasifikovani u kategorije: serinproteaza, metaloproteinaza, fosfolipaza A2, C-lektini i dezintegrini (10). Iz ove familije potiče i prvi lek koji je pro-našao upotrebu u humanoj medicini – kaptopril (11,12). Envenomacija, odnosno injektiranje toksina, predstavlja pro-ces koji je povezan sa niskom incidencijom bakterijske infek-cije. Ovo može da ukazuje na postojanje antibakterijskih mo-lekula u zmijskom otrovu koji štiti zmije od infekcija tokom hranjenja (13). Nekoliko studija koje su se bavile uticajem toksina zmija iz različitih regiona, opisuju moguću antibakte-rijsku aktivnost njihovih enzima kao što su fosfolipaza A2 (PLA2), oksidaza L-aminokiselina (LAAO) i metaloproteina-ze (MMP) (14). Prvi radovi koji su se bavili ovom problemati-kom potiču iz 1948. i 1968. god., dok danas brojni radovi na različitim vrstama zmija takođe ispituju antimikrobnu aktiv-nost (14). Uprkos radovima iz ove oblasti, opis antimikrobne aktivnosti toksina Vipera ammodytes ammodytes nije još opi-san.

Cilj ovog rada je ispitivanje mogućeg antibakterijskog efekta toksina Vipera ammodytes ammodytes na odabrane Gram-pozitivne i Gram-negativne bakterijiske sojeve, kao i njegovo elektroforetsko profilisanje i denzitrometrisanje tra-ka.

Mater ija l i metode

ToksinU istraživanju je korišćen liofilizovani toksin Vipera

ammodytes ammodytes (Institut za virusologiju, vakcine i se-rume Torlak) koji je pripreman ex tempore u Tris-HCl puferu pri svakoj primeni.

Bakterijski sojeviKorišćeni su referentni ATCC (American Type Culture

Collection) bakterijski sojevi Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 35218), Pseudomonas aeru-ginosa (ATCC 27853) i Enterococcus faecalis (ATCC 29212), kao i klinički izolati meticillin resistentan Staphylococcus au-reus–MRSA, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa i vankomicin rezistentan Enterococcus faecalis (VRE), koji su izolovani u dijagnostičkoj laboratoriji, Institutu za mikrobio-logiju i imunologiju, Medicinskog fakulteta u Beogradu, u periodu od juna do decembra 2011. godine.

Standardi antibiotikaStandardi antibiotskih diskova ( BioRad, USA ) su ko-

rišćeni kao antibiotska kontrola prema CLSI ( Clinical and Laboratory Standards Institut ) preporukama (15) : (za Staphylococcus aureus – penicilin ( 10 IU), cefoksitin ( 30µ g), ciprofloksacin ( 5µg ), gentamicin ( 10µg ), linezolid ( 30µ g), hloramfenikol ( 30µg ); Enterococcus faecalis – penicilin ( 10 IU ), linezolid ( 30µg ), ampicilin ( 10µg ), gentamicin ( 120µg ), vankomicin ( 30µg ), tigeciklin ( 15µg ); Escherichia coli–gentamicin (10µg), ampicilin ( 10µg ), amoksicilin i kla-vulonska kiselina ( 20/10µg ), imipenem ( 10µg ), ceftriakson ( 30µg ), trimetoprim + sulfametoksazol ( 1 ,25 / 23, 75µg ); Pseudomonas aeruginosa – ciprofloksacin ( 5µg ), imipenem ( 10 µg ), piperacilin + tazobaktam ( 100/10µg ), tikarcilin ( 75 µg ), ceftazidim ( 30µg ), amikacin ( 30µg )).

SDS- denaturišuća gel elektroforezaDenaturišuća gel elektroforeza (SDS-PAGE) je rađena

po metodi Laemlia (16). U bunare 10.5 % (m/v) denaturišućeg poliakrilamidnog gela debljine d = 0,75 mm nanošeno je po 20 μL smeše (10 μL toksina i 10 μL pufera za tretiranje uzoraka koji sadrži 50 mmol/L Tris-HCl pH 7.4 sa 2% SDS, 10 % (v/v) glicerola i 0.02 % (m/v) bromfenol plavog). Elektroforetsko razdvajanje je vršeno na 4°C pod uslovima: napon U=150 V i jačina struje I=25 mA i trajanje od 120 minuta. Gelovi su po-tom fiksirani u 5% sirćetnoj kiselini i bojeni 2 sata u 0.2% rastvoru boje CBB (Commassie brilliant blue) G-250. Obezbojenje je vršeno u rastvoru 35% metanola i 7% sirćetne kiseline do ukazivanja traka. Gelovi su skenirani i čuvani u 3,5 % (v/v) vodenom rastvoru sirćetne kiseline.

Određivanje antibakterijskog efekta toksina Viperae ammodytes ammodytes

Toksin je za ovu namenu rastvoran ex tempore u 50 mM Tris-HCl puferu (pH 7.4). Antibakterijski potencijal celo-vitog toksina određivan je difuzionom metodom antibiogra-ma sa modifikacijama (17). Korišćeni su bakterijski sojevi Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 35218), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) i Enterococcus faecalis (ATCC 29212), kao i klinički izolati is-tih bakterija, izolovani u dijagnostičkoj laboratoriji, Instituta za mikrobiologiju i imunologiju, Medicinkog fakulteta u Beogradu. Bakterijske kulture su kultivisane na sterilnom krvnom agaru i inkubirane 24 časa na 37°C aerobnim uslovi-ma. Potom su suspendovane u sterilnom fizilološkom rastvoru do turbiditeta 0.5 McFarland skale (108 CFU/mL). Bakterijska suspenzija je zatim sterilnim pamučnim štapićem zasejavana na površini sterilnog Mueller-Hinton agara (Torlak, Beograd). Nakon 5 minuta pravljeni su bunarići u agaru (5-mm prečni-ka) korišćenjem sterilnog bušača. U ove bunariće je dodavano 40 μL toksina u različitim koncentracijama (2, 1, 0.5, 0.25 i 0.125 mg/mL). Komercijalni antibiogram diskovi (BioRad, USA) su korišćeni kao pozitivna kontrola, dok je sam sterilni Tris-HCl pufer (pH 7.4) služio kao negativna kontrola. Nakon inkubacije od 24 časa na 37°C u aerobnim uslovima, meren je prečnik zona inhibicija rasta bakterija. Dobijeni rezultati zona inhibicije kod antibiogram diskova su interpretirani kao S – senzitivan, I– intermedijarno osetljiv i kao R – rezistentan prema preporukama CLSI (15).

70



Određivanje minimalne inhibitorne koncentracijeMinimalna inhibitorna koncentracija (MIK) je određi-

vana korišćenjem mikrobujon dilucijonog metoda antibiogra-ma na 96- bunarnim mikrotitar pločama (Spektar, Čačak) (18). Toksin je ex tempore pripreman rastvaranjem u 1 M Tris-HCl puferu (pH 7.4) u različitim koncentracijama (200, 100, 50, 25 i 12,5 μg/mL). Bakterijske kulture su pripremljene na prethodno opisan način, s tim da je turbiditet suspenzija soje-va u sterilnom fiziološkom rastvoru za ovu metodu bio 105 CFU/mL. Ispitivani su sojevi Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 35218), Pseudomonas aeru-ginosa (ATCC 27853), Enterococcus faecalis (ATCC 29212) i Streptococcus pneumoniae (ATCC 49619), kao i klinički izo-lati navedenih bakterijskih sojeva, uz kliničke izolate Streptococcus pyognenes i Streptococcus agalactiae. U bu-nariće mikrotitar ploča dodavano je 125 μL suspenzije bakte-rija navedenog turbiditeta, 25 μL uzorka toksina u navedenim koncentracijama i 100 μL BHI (Brain Hearth Infusion – Torlak, Beograd) bujona. Kao negativna kontrola služio je Tris-HCl pufer (pH 7.4) i BHI bujon. Bakterijske kontrole či-nili su bakterijski inokulumi sa BHI bujonom i Tris-HCl pufe-rom u navedenim zapreminama, bez antibakterijskog agensa. Ploče su inkubirane na 37°C 24 časa pod aerobnim uslovima, nakon čega su očitavani rezultati.

Statistička obrada podataka i prikaz rezultataDobijeni rezultati su statistički, grafički i tabelarno ob-

rađeni u programu „Microsoft Excel 2003” i izraženi kao srednje vrednosti odgovarajućih pojedinih grupa uz standard-nu grešku (X ± SE). Elektroforegrami su skenirani na HP LaserJet M1120 MFP i obrađeni u programu „ImageJ 1.42q” denzitometrisanjem pojedinačnih traka. Agari su slikani apa-ratom Nikon Coolpix L10.

Rezultat i

Elektroforeza i denzitometrijaDa bi se elektroforetski profilisao toksin, rađena je de-

naturišuća poliakrilamid gel elektroforeza (SDS-PAGE), kako bi se odredile molekulske mase pojedinačnih frakcija toksina. Reprezentativni elektroforegram uzorka standarda proteina (ST) i uzorka toksina Vipera ammodytes ammodytes (VAA) prikazani su na slici 1.

Na elektroforegramu se vidi veći broj proteinskih kom-ponenti, kojih budući da su bojene CBB bojom verovatno ima i više. Denzitometrisanjem dobijenih traka uzorka toksina, uočava se postojanje 11 jasno razdvojenih pikova, tj. frakcija, što ukazuje na veoma složenu strukturu ovog toksina sa širo-kim opsegom molekulskih masa od 250 do 10 KDa. Denzitogram uzorka toksina prikazan je na slici 2.

Antimikrobna aktivnostZa ispitivanje potencijalnog antibakterijskog efekata

toksina Viperae ammodytes ammodytes, korišćen je modifi-kovani difuzioni metod antibiograma i poređenje sa standard-nim antibiogram diskovima. Dobijeni rezultati pokazuju da toksin nije imao antibakterijsko dejstvo na ispitivane sojeve Enterococcus faecalis, kako na ATCC, tako i na divlji soj, a umereno dejstvo na ispitivane sojeve Escherichia coli i

Pseudomonas aeruginosa, na strandardizovane ATCC sojeve i na kliničke izolate. Toksin je pokazao najbolji inhibitorni efekat na ispitivane sojeve Staphylococcus aureus ATCC i klinički izolat MRSA, što se može videti na slici 3. Kumulativni prikaz efekta toksina na ispitivane sojeve po me-todi antibiograma je prikazan na slici br. 4. Kako bi se upore-dila efikasnost toksina na testirane sojeve bakterija, urađeni su antibiogrami na istim bakterijskim sojevima upotrebom diskova standardnih antibiotika po preporuci CLSI. Prikaz efekata diskova standardnih antibiotika na testirane mikroor-ganizme po metodi difuzionog antibiograma prikazan je u tabeli 1.

Slika 1. Prikaz reprezentativnog elektroforegrama sa prika-zanim standardom (ST) i uzorkom toksina Vipera ammodytes ammodytes (VAA).

Minimalna inhibitorna koncentracijaZa određivanje MIK-a uzorka toksina na ispitivane

bakterijske sojeve korišćen je mikrobujon dilucioni metod. Utvrđeno je postojanje MIK kod sojeva Staphylococcus aure-usa, Escherichia coli i Pseudomonas aeruginosae, dok su Enterococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes i Streptococcus agalactiae uniform-no rasli u prisustvu uzorka toksina, na svim ispitivanim kon-centracijama (tabela 2).

71



Slika 2. Denzitogram reprezentativnog elektroforegrama do-bijenog razdvajanjem toksina Vipera ammodytes ammodytes denaturišućom SDS-PAGE elektroforezom

Slika 3. Prikaz reprezentativnih Mueller-Hinton agara sa zo-nama inhibicije rasta: dejstvo standardnih antibiogram disk antibiotika na klinički izolat MRSA (b) i uzorka toksina Vi-pera ammodytes ammodytes u različitim koncentracijama na klinički izolat MRSA (a) i ATCC soj Staphylococcus aureus (c).

DiskusijaU savremenoj medicini, pojava sve većeg broja multi-

rezistentnih sojeva bakterija, tj. infekcija koje one izazivaju, predstavlja veliki problem i izazov. Mnogi uspešni i dokazani antibiotici gube borbu sa čestom pojavom rezistentnih sojeva. Modifikacija postojećih i razvoj novih antibiotika je neophod-nost kako bi mogli da odgovorimo na ove pojave. U prirodi postoje brojni proizvodi sa potencijalnim farmakološkim efektom. Zmijski toksini su interesantni izvori supstanci bu-dući da predstavljaju složenu prirodnu smešu i pokazuju širok spektar farmakoloških aktivnosti. Izolovanje i karakterizacija

komponenti zmijskog otrova može dati nova saznanja o no-vim mehanizmima ili modelima upotrebe ovih komponenti (19,20). Iz radova koji su od sada objavljeni može se zaključiti da proteini iz toksina mogu biti dobri kandidati za testiranje mogućeg antibakterijskog efekta, posebno na multirezistent-ne sojeve, ali i antitumorskog i antimikotičnog efekta. U pore-đenju sa drugim biološkim aktivnostima toksina, antibakterij-sko profilisanje nije detaljnije ispitivano i pored jasnih indicija da takvo delovanje verovatno postoji (21).

U ovom radu se ispitivalo moguće antibakterijsko de-lovanje toksina Vipera ammodytes ammodytes, tj. poskoka, dominantne vrste zmije otrovnice u našoj zemlji. Takođe, vr-šilo se i proteinsko profilisanje toksina pomoću SDS-PAGE elektroforeze. Toksini zmija koje pripadaju familiji Viperidae, kojoj pripada i poskok, spadaju u grupu toksina bogatih po-tencijalnim farmakološkim molekulima (21). Radovi slične tematike, ukazuju da toksini zmija za koje se predpostavlja da poseduju antibakterijski efekat, imaju grupe proteina u dome-nu između 10–15 kDa, kao i grupe između 25–50 kDa (21, 22, 23, 24, 25, 26). Elektroforetskim profilom uzorka ispitivanog toksina uočeno je postojanje pomenutih grupa. Takođe, denzi-tometrisanjem traka toksina vidi se postojanje 11 pikova, od-nosno frakcija.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

2 1 0,5 0,25 0,125 /

preč

nik

zona

u m

m m

ean

+/- S

D

koncentracije toksina mg/mL

Antibiogram uzoraka toksina

S. aureus ATCCS. aureus wildEnterococcus ATCCEnterococcus wildE. coli ATCCP. aeruginosa ATCCP. aeruginosa wild

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

2 1 0,5 0,25 0,125 /

preč

nik

zona

u m

m m

ean

+/- S

D

koncentracije toksina mg/mL

Antibiogram uzoraka toksina

S. aureus ATCCS. aureus wildEnterococcus ATCCEnterococcus wildE. coli ATCCP. aeruginosa ATCCP. aeruginosa wild

Grafikon 1. Grafički prikaz efekta toksina Vipera ammodytes ammodytes u različitim koncentracijama na ispitivane bakte-rijske sojeve

72



Tabela 1. Antibakterijski efekat standardnih antibiograma na ispitivane bakterijske sojeve

Sojevi /Antibiotici

S.aureusATCC

S.aureusdivlji soj

EnteroccocuATCC

Enteroccocus divlji soj

E.coliATCC

P.aeruginosaATCC

P.aeruginosadivlji soj

Penicilin S-40 R-8 S-22 S-23Cefoksitin S-32 R-12Ciprofloksacin S-25 R-8 S-30 R-0Gentamicin S-20 R-0 S-15Linezolid S-28 S-23 S-24 S-25Chloramfeniko 1 S-26 S-28Ampicilin S-30 S-30 S-21Gentamicin (v.d.) S-18 S+20Vankomicin S-17 S-18Tigeciklin S-20 S-21Amoksiklav S-22Imipenem S-25 S-23 R-0Ceftriakson S-28Trimetoprim + sulfametokazol S-25

Piperacilin + tazobaktam S-28 S17

Tikardilin S-25 S25Ceftazidim S-26 R-0Amikacin S-21 R-0

Tabela 2. Vrednosti MIK uzorka toksina na ispitivane bakte-rijske sojeve.Bakterijski soj toksin μg/mlP. aeruginosa ATCC 100P.aeuriginosa divlji soj 50E. Coli ATCC 100E.Coli divlji soj 50Enteroccocus ATCC 0Enteroccocus divlji soj 0S.Aureus ATCC 12,5S.Aureus divlji soj 12,5S. Pneumoniae ATCC 0S. Pneumoniae divlji soj 0S. pyogenes 0S. agalactiae 0

Denzitogram pokazuje da ovaj toksin predstavlja veo-ma složenu smešu proteina, koje se mogu frakcionisati u pulo-ve bliskih molekulskih masa i elektroforetski jasno razdvojiti. Antibakterijski efekat toksina je ispitivan disk difuzionim metodom antibiograma na odabranim bakterijskim sojevima. Korišćeni su ATCC sojevi, ali i klinički izolati istih vrsta bak-terija, kako bi se procenila efikasnost toksina između standar-dizovanih sojeva i kliničkih izolata. U tu svrhu, rađeni su i antibiogrami sojeva kliničkih izolata upotrebom standardnih disk antibiotika prema preporukama CLSI za svaki soj. Utvrđeno je postojanje antibakterijskog efekta: na sojeve Staphylococcus aureus ATCC i MRSA toksin je pokazao naj-efikasnije delovanje; umerenu efikasnost na sojeve Escherichia

coli i Pseudomonas aeruginosae, ATCC i kliničke izolate; jedino na sojeve Enterococcus faecalis toksin nije pokazao antibakterijsko dejstvo. Treba istaći i dobru efikasnost koju je pokazao toksin na kliničke izolate sojeva MRSA i Pseudomonas aeruginosae, koji su bili rezistentni na većinu preporučenih standardnih antibiotika. Minimalna inhibitorna koncentracija je ispitivana mikrobujon dilucionom metodom, kojom su utvrđene vrednosti MIK-a kod sojeva koji su poka-zali pozitivni antibakterijski efekat na disk difuzionom testu. Takođe, vrednosti MIK-a nisu utvrđene ni kod Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes i Streptococcus agalac-tiae.

Kao zaključak ovog istraživanja treba istaći očigledno postojanje antibakterijskog delovanja celovitog toksina Viperae ammodytes ammodytes na pojedine odabrane bakte-rijske sojeve, kao i postojanje 11 frakcija u okviru toksina ko-je bi svakako trebalo pojedinačno i detaljnije ispitati. Stoga, ovo ispitivanje treba da bude samo početak šireg istraživanja mogućnosti ovog prirodnog resursa i njegovih komponenti.

ZahvalniceAutor i mentori žele da se posebno zahvale dr

Branislavu Laziću, direktoru Instituta za virusologiju, vakci-ne i serume Torlak i dr Miroslavu Stajiću, dipl. biol. na izuzet-noj saradnji.

Literatura1. Paraje MG, Albesa I, Eraso AJ. Conservation in probiotic

preparations of Lactobacillus with inhibitory capacity on other species. N Microbiol 2000;23:423–431.

73



2. Ang JY, Ezike E, Asmar BI. Antibacterial resistance. Symp Ser Soc Appl Microbiol 2004;3:229–39.

3. Koh DCI, Armugam A, Jeyaseelan K. Snake venom com-ponents and their applications in biomedicine. Cellular and Molecular Life Sciences 2006;63:3030–3041.

4. Heise PJ, Maxson LR, Dowling HG, Hedges SB. Higher-level snake phylogeny inferred from mitochondrial DNA sequences of 12S rRNA genes. Mol Biol Evol 1995;12:259–65.

5. Fry BG, Wuster W. Assembling an arsenal: origin and evolution of the snake venom proteome inferred from phy-logenetic analysis of toxin sequences. Mol Biol Evol 2004;5:870–83.

6. Russell FE. Snake Venom Poisoning. Philadelphia: Lippincott , 1980.

7. Tu AT. Snake venoms: general background and composi-tion. Chemistry and Molecular Biology. 1988;1: 1–19.

8. Kini RM. Venom phospholipase A2 enzymes: structure, function and mechanism. Chichester, UK: John Wiley & Sons, 1997.

9. Bailey P, Wilce J. Venom as a source of useful biologically active molecules. Emerg Med 2001;13(1):28–36.

10. Markland FS Jr. Snake venoms. Drugs Suppl 1997;54:31–40

11. Ferreira S. A bradykinin-potentiating factor (bpf) present in the venom of Bothrops jararaca. Br J Pharmacol 1965;24:163–9.

12. Ferreira SH, Bartelt DC, Greene LJ. Isolation of bradyki-nin-potentiating peptides from Bothrops jararaca venom. Biochemistry 1970;9:2583–93

13. Deivy Clementino de Lima, Paula Alvarez Abreu et al. Snake Venom: Any Clue for Antibiotics and CAM?.Evid Based Complement Alternat Med 2005;2(1):39–47.

14. Bustillo S, Leiva LC, Merino L, Acosta O, Joffé EBK, Gorodner JO. Antimicrobial activity of Bothrops alterna-tus venom from the Northeast of Argentine. Rev Latinoam Microbiol 2008;50 (3–4): 79–82.

15. CLSI. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-First Informational Supplement. CLSI document M100-S21. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2011.

16. U.K. Laemmli. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970;227:680–685.

17. Bauer, AW, Kirby WM, Sherris JC, Turck M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk meth-od. Am J Clin Path 1966;45:493–496.

18. Hecht DW, Citron DM et al. Methods for dilution antimi-crobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobi-cally; approved standard – sixth edition. NCCLS 2003;27(2):19087–1898.

19. Harvey AL, Bradley KN et al. What can toxins tell us for drug discovery? Toxicon 1998;36(11):1635–40.

20. Mortari MR, Cunha AO, Ferreira LB, dos Santos WF. Neurotoxins from invertebrates as anticonvulsants: from basic research to therapeutic application. Pharmacol Ther 2007;114(2):171–83.

21. Perumal Samy R, Gopalakrishnakone P et al. Antibacterial activity of snake, scorpion and bee venoms: a comparison with purified venom phospholipase A2 enzymes. Journal of Applied Microbiology 2007;102:650–659.

22. Atena Jami al ahmadi, Behrooz Fathi, Abdoula Jamshidi, Hosein Zolfagharian and Abbase Zare Mirakabbadi. Investigation of the Antibacterial Effect of Venom of the Iranian Snake Echis carinatus. Iranian Journal of Veterinary Science and Technology 2010;2(2): 93–100.

23. T.M.San, J. Vejayan, K. Shanmugan and H. Ibrahim. Screening Antimicrobial Activity of Venoms from Snakes Commonly found in Malaysia. Journal of Applied Sciences 2010;10(19):2328–2332.

24. R Perumal Samy, A Pachiappan et al. In vitro antimicro-bial activity of natural toxins and animal venoms tested against Burkholderia pseudomallei. BMC Infectious Diseases 2006;6:100–116.

25. Sachidananda M. K., Murari S. K., Channe Gowda D. Characterization of an antibacterial peptide from Indian cobra (Naja naja) venom. J. Venom. Anim. Toxins incl. Trop. Dis 2007;13:446–461.

26. Torres AFC, Dantas RT et al. Antimicrobial activity of an L-amino acid oxidase isolated from Bothrops leucurus snake venom. JVATTD 2010;16(4):614–622.

74



SažetakUvod: Pored glikogena i masno tkivo obezbeđuje

supstance neophodne za mišićnu kontrakciju (u miru i pri fizičkoj aktivnosti). Glavni izvor slobodnih masnih kiselina tokom vežbanja su trigliceridi, koji su smešteni u masnom tkivu i u mišićnim vlaknima. Pri vežbanju vi-sokog intenziteta (≥85% VO2max) energija se dobija iz drugih izvora, kao što su glukoza u plazmi i mišićni gli-kogen.

Cilj: Cilj ovog rada bio je da se ispita da li posle testa fizičkog opterećenja postoje razlike u metabolič-kom odgovoru kod fizički aktivnih i neaktivnih ispitani-ka.

Materijal i metode: Ovim istraživanjem obuhva-ćeno je 10 vrhunskih sportista, vaterpolista i 10 ispitani-ka muškog pola, koji se ne bave fizičkom aktivnošću >10h. Svi ispitanici su bili podvrgnuti testu fizičkog op-terećenja na tredmilu. Svim ispitanicima je uzimana krv u mirovanju, na kraju testa i u 30. minutu oporavka iz koje je određivan nivo glukoze i slobodnih masnih kise-lina (FFA).

Rezultati: Nivo glukoze kod fizički neaktivnih ispi-tanika bio je statistički značajno veći na kraju testa (p<0.01) kao i u 30. minutu oporavka (p<0.05) u odnosu na početak testa. Nivo FFA u mirovanju bio je statistički značajno veći kod fizički aktivnih u odnosu na fizički ne-aktivne ispitanike (p<0.05). Takođe, nivo FFA kod fizički aktivnih ispitanika bio je statistički značajno niži na kra-ju testa (p<0.01) kao i u 30. minutu oporavka (p<0.05) u odnosu na početak testa.

Zaključak: Rezultati ovog istraživanja pokazuju da je višegodišnji specifični trenažni proces doveo do fi-zioloških adaptivnih promena metabolizma fizički aktiv-nih ispitanika (vaterpolista) u poređenju sa fizički neak-tivnim ispitanicima. Ovo istraživanje ukazuje da se kod vrhunskih sportista pri akutnoj fizičkoj aktivnosti ener-gija neophodna za kontrakciju mišića dobija oksidaci-jom masnih kiselina, dok se kod fizički neaktivnih ispita-nika energija prvenstveno dobija iz rezervi glukoze u organizmu.

Ključne reči: fizička aktivnost, glikemija, slobodne ma-sne kiseline.

AbstractIntroduction: Fat is an important substrate for

muscule contraction at rest and during exercise. Triglycerides, stored in adipose tissue and within muscle fibres, are considered to be the main source of free fatty acids oxidised during exercise. At 85% VO2max work in-tensity energy must be obtained from muscule glycogen and plasma glucose.

The aim: The aim of this study was to investigate if there is a difference between metabolism of athletes and physically inactive subjects after physical exercise test on the treadmill.

Material and methods: This study included 10 athletes and 10 physically inactive subjects. All partici-pans were subjected to physical exercise test on the treadmill. Blood samples were taken from all partici-pants durning the rest, at the end of the test and 30. min-utes after the recovery. Serum concentrations of glucose and free fatty acids were determined from those sam-ples.

Results: The level of glucose in physical inactive subjects was significantly higher at the end of the test (p<0.01) and at the 30th. minute of recovery (p<0.05) compared to the beginning of the test. The level of free fatty acids in athlets was significantly higher compared to physically inactive subjects at the 30th minute of re-covery (p<0.05). The level of free fatty acids in athlets was significantly lower at the end of the test (p<0.01) and at the 30th. minute of recovery (p<0.05) compared to the beginning of the test.

Conclusion: Results of this investigation show that in highly endurance trained subjects metabolism has been physiologically changed compared to physi-cally inactive subjects. This study shows that in athletes energy necessary for contraction is obtained from free fatty acids that are oxidised during acute physical activ-ity, while energy necessary for contraction in physically inactive subjects is obtained from glucose, from glico-gen depo.

Key words: physical activity, glucose, free fatty acids.

METABOLIČKI ODGOVOR NA TEST FIZIČKOG OPTEREĆENJA KOD FIZIČKI AKTIVNIH I NEAKTIVNIH ISPITANIKA

Autori: Rada Jeremić1, Ankica Bjelić1, Nebojša Skorupan1

Mentor: Asist. dr Marina Đelić2

1Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu2 Institut za medicinsku fiziologiju „Rihard Burijan“, Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu

75



UvodGojaznost, stanje povećanog nakupljanja masnog tkiva

u organizmu, bolest je savremenog društva. Lečenje gojazno-sti podrazumeva smanjenje unosa kalorija (kalorijska restrik-cija), uz istovremeno povećanje fizičke aktivnosti. Poznato je da fizička aktivnost pomaže i u sprečavanju drugih metabo-ličkih poremećaja, kao što su diabetes melitus tip II i atero-skleroza (1).

Masno tkivo obezbeđuje supstance neophodne za mi-šićnu kontrakciju u miru i pri fizičkoj aktivnosti normalnog intenziteta. Trigliceridi smešteni u masnom tkivu i mišićnim vlaknima smatraju se glavnim izvorom slobodnih masnih ki-selina tokom vežbanja normalnog intenziteta (2). Smatra se da su za stvaranje energije tokom vežbanja niskog intenziteta (20 do 45% VO2max) odgovorne slobodne masne kiseline koje se nalaze u plazmi, dok se pri vežbanju srednjeg intenziteta u obezbeđivanju energije za kontrakciju koriste i slobodne ma-sne kiseline koje se nalaze u mišićima (3). Pri vežbanju viso-kog intenziteta (≥85% VO2max) energija se dobija iz drugih izvora, kao što su glukoza u plazmi i mišićni glikogen (4). Prema tome, glikogen je ključni faktor aerobnog kapaciteta u prolongiranim vežbanjima visokog intenziteta (5).

Vaterpolisti imaju najveći procenat telesnih masti u odnosu na ostale vrhunske sportiste i približno isti procenat masti kao fizički neaktivne osobe (6). Upravo iz ovog razloga oni predstavljaju specifičnu grupu sportista na kojoj se može vršiti ispitivanje metaboličkog odgovora tokom akutne fizičke aktivnosti. Međutim, trenutno je malo podataka u literaturi koji govore o tome kako je regulisana upotreba glukoze i ma-snih kiselina tokom fizičke aktivnosti kod fizički aktivnih i neaktivnih osoba.

Cilj ovog rada bio je da se ispita da li posle testa fizič-kog opterećenja postoje razlike u metaboličkom odgovoru kod fizički aktivnih i neaktivnih ispitanika.

Mater ija l i metodeOvim istraživanjem obuhvaćeno je 10 vrhunskih spor-

tista, vaterpolista (X±SD godina; 20,40±2,01 godina) i 10 is-pitanika muškog pola, koji se ne bave fizičkom aktivnošću >10h (X±SD godina; 20,50±1,08 godina). Vrhunskim sporti-stom smatrao se sportista nacionalne selekcije koji se najma-nje pet godina aktivno, takmičarski bavi sportom i trenira najmanje 10–15 sati nedeljno. Kriterujm vrhunski sportista odredio je i veličinu uzorka. Naime, vaterpolista nacionalne selekcije ima 16, od kojih u datom trenutku nisu svi pristupili testu fizičkog opterećenja zbog zdravstvenih razloga. Kontrolnu grupu činile su osobe muškog pola sličnog uzrasta (±2SD) koje se ne bave fizičkom aktivnošću, više od 10 sati nedeljno. Ispitanici kontrolne grupe izabrani su slučajnim odabirom studenata Medicinskog fakulteta u Beogradu. Kontrolna grupa bila je ispitana anamnestički i fizikalnim pregledom o prisustvu komorbiditeta (alergija, astme, poviše-nog pritiska- sistolni>140mmHg, a dijastolni>90mmHg), kao i o socijalnim navikama (pušenje cigareta, konzumiranje al-koholnih pića, narkotika), što bi bili kriterijumi za iskjučiva-nje iz studije. Ispitanici iz grupa fizički aktivnih i neaktivnih, mečovani su prema polu i starosti ispitanika. Svi ispitanici su bili upoznati sa procedurom i ciljevima istraživanja i svojim potpisom dali su pristanak za testiranje.

Antropometrijska i biohemijska merenja vršena su u la-boratorijskim uslovima uvek u isto doba dana, istim instrumen-tima, istom tehnikom i po standardnoj proceduri. Pre izvođenja istraživanja određeni su antropometrijski parametri ispitanika. Telesna masa (TM) i procenat telesnih masti (%BF) direktno je očitavan na vagi tipa bioimpedance (BC-418 Segmental Body Composition Analyzer, Tanita, Illinois, USA). Pri merenju tele-sne visine (TV) korišćen je antropometar Seca (Seca709, Hamburg, Germany) sa tačnošću od 0.1cm. Iz neposredno iz-merenih vrednosti TM i TV, preračunat je indeks telesne mase (BMI) fizički aktivnih i neaktivnih ispitanika.

Protokol ergospirometrijskog testiranjaSvi ispitanici su bili podvrgnuti testu fizičkog optere-

ćenja u kome je kao ergometar korišćen tredmil (Treadmill T200, Cosmed, Italy), a za kontinuirani (12-to kanalni) EKG monitoring korišćen je ergospirometar (Jaeger, Oxycon pro, Wurzburg, Germany). Test se sastojao iz tri faze. Prva faza, faza mirovanja trajala je 3 minuta i tokom nje su ispitanici bili u stojećem položaju. Druga faza otpočinjana je brzinom pokretanja trake od 4km/h, te je svakog narednog minuta br-zina pokretanja trake bila veća za po 1km/h. Treća faza, faza oporavka trajala je 3 minuta. Kriterijumi za završetak testa bili su dostizanje maksimalne srčane frekvencije, platoa u po-trošnji kiseonika, vrednosti RER veće od 1.1 ili subjektivni razlozi ispitanika, kada su ispitanici lično tražili prekid testa. Maksimalna srčana frekvencija (HRmax) dobijena je kada je vrednost 220 oduzimana od broja godina starosti ispitanika.

Protokol uzimanja uzoraka krvi za analizeRadi kontinuiranog uzimanja krvi, svim ispitanicima

se plasirala braunila u antekubitalnu venu. Uzorci krvi su se uzimali pre, neposredno nakon testa opterećenja, kao i u 30. minutu oporavka. Odmah po punjenju epruveta, laganim okretanjem epruvete za 180° (8 – 10 puta), promešan je sadr-žaj i ostavljen da odstoji pola sata. Nakon toga epruvete su centrifugirane (na 3000 obrtaja u trajanju od 5 minuta) i iz-dvojen je serum i/ili plazma u prethodno obeležene ependorf epruvetice i zamrznute na – 20 °C. Nivo glikemije u serumu određivan je heksokinaza/glukozo-6-fosfat dehidrogenaza metodom korišćenjem komercijalnog kita (Boehringer, Mannheim, Germany). Plazma koncentracija FFA određivana je kolorimetrijskom metodom korišćenjem Randox NEFA test kita (Randox Laboratories, Crumlin, UK).

Statistička analizaRezultati istraživanja obrađeni su deskriptivnom stati-

stikom. Od mera centralne tendencije korišćene su aritmetič-ka sredina i medijana, a od mera varijabiliteta standardna de-vijacija, minimalna i maksimalna vrednost. Srednje vrednosti obeležja posmatranja nivoa glukoze poredile su Studentovim t testom za dva nezavisna uzorka, dok se nivo FFA poredio neparametarskim Mann–Whitney testom. Statisticki značaj-na razlika smatrana je na nivou p<0.05.

Rezultat iVrednosti telesne mase i telesne visine se statistički

značajno razlikuju kod posmatranih grupa ispitanika i bile su značajno veće kod fizički aktivne grupe ispitanika (p<0.05).

76



Između fizički aktivne i neaktivne grupe ispitanika nema sta-tistički značajne razlike u odnosu na indeks telesne mase i procenat masti u organizmu (p>0.05). Vrednost bezmasne te-

lesne mase bila je statistički značajno veća u grupi fizički ak-tivnih ispitanika u odnosu na grupu fizički neaktivnih ispita-nika (Tabela 1).

Tabela 1. Antropometrijski parametri kod fizički aktivnih i neaktivnih ispitanika

Fizički aktivni ispitanici (n=10) Fizički neaktivni ispitanici (n=10) X ± SD Min Max X ± SD Min Max PTM (kg) 100.5 ± 13.7 77.4 127.9 90.2 ± 7.8 77.8 101.0 <0.05TV (cm) 195.0 ± 4.1 190.0 202.0 184.5 ± 6.0 178.0 197.0 <0.05BMI (kgm-2) 26.4 ± 3.3 19.5 31.3 26.5 ± 1.3 24.2 28.0 NSBF% (%) 17.0 ± 2.9 13.5 22.4 17.3 ± 1.4 15.5 20.1 NSLBM (kg) 83.1 ± 9.3 65.4 99.3 74.4 ± 6.2 62.9 84.2 <0.05

Sve vrednosti su prikazane kao srednja vrednost ± SD, TM – telesna masa, TV–telesna visina, BMI – indeks telesne mase, BF – procenat masti, LBM – bezmasna telena masa

Nivo glukoze u sva tri stanja nije se statistički razliko-vao između ispitivanih grupa. Statistički značajne promene nivoa glukoze u okviru grupe u toku testa uočene su samo u grupi fizički neaktivnih ispitanika. Naime, nivo glukoze u kontrolnoj grupi bio je statistički značajno veći na kraju testa (p=0.00) kao i u 30. minutu oporavka (p=0.02) u odnosu na početak testa (Grafikon 1).

Grafikon 1. Promena koncentracije glukoze kod fizički ak-tivnih (n=10) i neaktivnih ispitanika (n=10) pre, neposredno nakon testa opterećenja i u 30. minutu oporavka. Sve vredno-sti prikazane su kao srednje vrednosti, # p<0.05 u odnosu na početak testa

Nivo FFA na početku testa (mirovanje) bio je statistički značajno veći kod fizički aktivnih u odnosu na fizički neaktiv-ne ispitanike (p=0.03), dok se nivoi FFA na kraju testa i u 30. minutu oporavka nisu statistički razlikovali između ispitivanih grupa. Nivo FFA kod fizički aktivnih ispitanika bio je statistič-ki značajno niži na kraju testa (p=0.01) kao i u 30. minutu opo-ravka (p=0.05) u odnosu na početak testa (Grafikon 2).

Grafikon 2. Promena koncentracije slobodnih masnih kiseli-na kod fizički aktivnih (n=10) i neaktivnih ispitanika (n=10) pre, neposredno nakon testa opterećenja i u 30. minutu opo-ravka. Sve vrednosti prikazane su kao medijane, *p<0.05 kontrolnu grupu, # p<0.05 u odnosu na početak testa

DiskusijaU ovoj studiji pokazano je da je nivo FFA u mirovanju

značajno veći u grupi fizički aktivnih ispitanika, dok je nivo glukoze bio značajno veći u grupi fizički neaktivnih ispitani-ka na kraju testa i u 30. minutu oporavka u odnosu na početak testa. Takođe, nivo FFA kod fizički aktivnih ispitanika bio je značajno niži na kraju testa kao i u 30. minutu oporavka u odnosu na početak testa.

Ranije studije koje su se bavile istraživanjem metaboli-zma tokom fizičke aktivnosti, pokazale su da se glikemija u miru nije razlikovala između sportista i nesportista (7). Jurimae i sar. ukazuju da se radi o mladoj zdravoj populaciji i da prolongirana fizička aktivnost kao kod vrhunskih sportista ne utiče na nivo glukoze u mirovanju (8). Međutim, sve češće se postavlja pitanje šta se dešava sa nivoom glukoze tokom

77



akutne fizičke aktivnosti. U našoj studiji u grupi vaterpolista nivo glikemije se nije značajno menjao, dok je kod fizički ne-aktivnih ispitanika nivo glukoze bio značajno veći na kraju testa i u 30. minutu oporavka u odnosu na početak testa. Ovi naši rezultati su u skladu sa dosadašnjim istraživanjima, koja pokazuju da se pri vežbanju visokog intenziteta (≥85% VO2max) energija dobija iz glukoze i mišićnog glikogena (9). Razlika u koncentraciji glukoze u odnosu na početak testa u kontrolnoj grupi može se objasniti činjenicom da je metabolizam osoba koje se ne bave fizičkom aktivnošću prvenstveno zasnovan na upotrebi glukoze kao metabolita (4). Ranilo i sar. ukazuju da trigliceridi ne mogu da obezbede dovoljnu količinu energije, koja je neophodna za kontrakciju mišića, pa se zbog toga osta-tak energije obezbeđuje iz ugljenih hidrata, odnosno glikogena (4). Kod vaterpolista ne postoji statistički značajna razlika, jer oksidacijom FFA postižu dovoljnu količinu energije neophod-nu za kontrakciju mišića (4). Takođe, razlike u koncentraciji glukoze u toku testa opterećenja kod fizički aktivnih i neaktiv-nih ispitanika mogu se objasniti i individualnim opterećenjem kao i načinom izvođenja fizičke aktivnosti (5).

Poznato je da postoje dva glavna izvora slobodnih ma-snih kiselina, masno tkivo i mišićna vlakna. Masne kiseline su u ovim depoima skladištene u obliku triglicerida. U fizič-kom naporu dolazi do povećanja koncentracije lipolitičkih hormona, kao što je adrenalin. Ovaj hormon deluje na β2 re-ceptore, koji stimulišu iskorišćavanje mišićnih tiglicerida. Iskorišćavanje mišičnih triglicerida javlja se u mišićnim vlak-nima tip I i IIa. Tip I vlakna više koriste slobodne masne kise-line oslobođene iz adipocita (4). Međutim, u literaturi postoje kontradiktorni rezultati o nivou FFA kod fizički aktivnih i neaktivnih ispitanika (10–14). Naši rezultati u ovoj studiji po-kazuju da se nivoi FFA u kontrolnoj grupi i u grupi vaterpoli-sta razlikuju u mirovanju i da je nivo FFA veći kod vaterpoli-sta. Ovde bi trebalo naglasiti da se naši ispitanici ne razlikuju u odnosu na procenat telesne masti, ali da se razlikuju u mi-šićnoj masi. Samim tim, za razliku koncentracije slobodnih masnih kiselina između vaterpolista i fizički neaktivnih ispi-tanika odgovorna je mišićna masa iz koje se prvenstveno obezbeđuje energija za kontrakciju mišića (10). Naši rezultati u skladu su sa rezultatima Yan i sar. koji ukazuju da se za kontrakciju mišića kod vrhunskih sportista, obezbeđuje ener-gija oksidacijom FFA, koja potiče iz triglicerida skladištenih u masnom tkivu i u mišićnim vlakanima (14).

Takođe, poznato je da se pri akutnoj fizičkoj aktivnosti, aktivira simpatički nervni sistem i dovodi do lipolize u ma-snom tkivu i iskorišćavanja slobodnih masnih kiselina u mišići-ma kod vrhunskih sportista (4). Naši rezultati u skladu su sa prethodnom tvrdnjom. U grupi vaterpolista nivo FFA bio je značajno niži na kraju testa kao i u 30. minutu oporavka u od-nosu na početak testa. Ova razlika u koncentraciji slobodnih masnih kiselina kod vaterpolista u odnosu na početak testa mo-že se objasniti i činjenicom da su na početku testa vaterpolisti imali značajno više vrednosti FFA koje su, najverovatnije, isko-rišćene neposredno po započinjanju fizičke aktivnosti (15).

Rezultati ovih istraživanja pokazuju da je višegodišnji specifični trenažni proces doveo do fizioloških adaptivnih promena metabolizma fizički aktivnih ispitanika (vaterpoli-sta) u poređenju sa fizički neaktivnim ispitanicima. Nivo FFA u mirovanju bio je značajno veći kod vaterpolista. Takođe, kod vaterpolista, nivo FFA bio je značajno niži na kraju testa kao i u 30. minutu oporavka u odnosu na početak testa. Nivo glukoze u sva tri stanja nije se statistički razlikovao između

ispitivanih grupa dok je u kontrolnoj grupi bio značajno veći na kraju testa kao i u 30. minutu oporavka u odnosu na poče-tak testa. Ovo istraživanje ukazuje da se kod vrhunskih spor-tista pri akutnoj fizičkoj aktivnosti energija neophodna za kontrakciju mišića dobija oksidacijom masnih kiselina, dok se kod fizički neaktivnih ispitanika energija prvenstveno dobija iz rezervi glukoze u organizmu.

Literatura1. Petibois C, Cassaigne A, Gin H et al. Lipid profile disor-

ders induced by long-term cessation of physical activity in previously highly endurance-trained subjects. J Clin End Met 2004; 89(7): 3377–3384.

2. Hargreaves M. Pre-exercise nutritional strategies: effects on metabolism and performance. Can J Appl Physiol 2001; 26: S64-S70.

3. Coggan AR, Raguso CA, Gastaldelli A et al. Fat metabo-lism during high-intensity exercise in endurance-trained and untrained men. Metabolism 2000; 49(1): 122–128.

4. Ranallo FR and Rhodes EC. Lipid metabolism during ex-ercise. Sports med 1998; 26(1): 29–42.

5. Knoepfli B, Riddell MC, Ganzoni E, Burki A, Villiger B, von Duvillard SP. Off seasonal and pre-seasonal assess-ment of circulating energy sources during prolonged run-ning at the anaerobic threshold in competitive triathletes. Br J Sports Med 2004; 38(4): 402–407.

6. Smith HK. Applied physiology of water polo. Sports Med 1998; 26: 317–334.

7. Jürimäe J, Mäestu J, Jürimäe T. Leptin as a marker of training stress in highly trained male rowers? Eur J Appl Physiol 2003; 90: 533–538.

8. Jürimäe J, Mäestu J, Jürimäe T et al. Peripheral signals of energy homeostasis as possible markers of training stress in athletes: a review. Metabolism 2011; 60: 335–350.

9. Wee Kian Yeo, Carey AL, Burke L et al. Fat adaptation in well-trained athletes: effects on cell metabolism. Appl Physiol Nutr Metab 2011; 36: 12–22.

10. Mikulski T, Ziemba A, Nazar K. Metabolic and hormonal responses to body carbohydrate store depletion followed by high or low carbohydrate meal in sedentary and physi-cally active subjects. J Physiol Pharmacol 2010; 61(2): 193–200.

11. Bouassida A, Chamari K, Zaouali M et al. Review on leptin and adiponectin responses and adaptations to acute and chronic exercise. Br J Sports Med 2010; 44(9): 620–630.

12. Rønsen O, Børsheim E, Bahr R et al. Immuno-endocrine and metabolic responses to long distance ski racing in world-class male and female cross-country skiers. Scand J Med Sci Sports 2004; 14(1): 39–48.

13. Wigernaes I, Høstmark AT, Strømme SB el al. Active re-covery and post-exercise white blood cell count, free fatty acids, and hormones in endurance athletes. Eur J Appl Physiol 2001; 84(4): 358–366.

14. Yan B, Jiye A, Wang G et al. Metabolomic investigation into variation of endogenous metabolitesin professional athletes subject to strength-endurance training. J Appl Physiol 2009; 106: 531–538.

15. van Loon LJ, Koopman R, Stegen JH et al. Intramyocellular lipids form an important substrate source during moderate intensity exercise in endurance-trained males in a fasted state. J Physiol 2003; 553(2): 611–625.

78



Sažetak:Uvod: Jedan od faktora rizika za KB je ivisok od-

nos Tg/HDL,koji je povezan sa pojavom malih i gustih LDL čestica, za koje je poznato da su veoma aterogene. Takođe, ovaj odnos (Tg/HDL) je pokazan kao marker in-sulinske rezistencije, koja je značajna za pojavu KB, ali iT2D.

Cilj: Analizira korelacije između Tg/HDL, insulin-ske rezistencije i intenziteta koronarne bolesti u dijabe-tičara i nedijabetičara.

Materijal i metode:Istraživanje je sprovedeno me-đu 192 pacijenta, podeljenih u 4 grupe. T2D je imalo 104 pacijenta: 60 sa KB i 44 bez KB (grupe A i B) i 88 paci-jenata bez T2D, od kojih je 60 imalo KB i 28 zdravih is-pitanika (grupe C i D). Mereni su: intenzitet KB, glike-mija, HbA1C, ukupni holesterol, HDL, LDL i Tg,Tg/HDL i učestalost nivoa Tg/HDL>1.33. Homeostaznim mode-lom određena je insulinska rezistencija na osnovu vred-nosti glikemije i insulinemije u bazalnim uslovima.

Rezultati: Vrednostilipida su bile znatno više u grupama A, B i C , ali i kod obolelih od KB u odnosu na pacijente bez KB. Tg/HDL, kao i učestalost nivoa TG/HDL iznad 1.33, bio je značajno povišen kod pacijenata sa KB, bez obzira na prisustvo T2D.Odnos Tg/HDL, in-sulinemija kao i insulinska rezistencija, korelirali su sa intenzitetom KB, a insulinska rezistencija je bila značaj-no viša u grupama A i C u odnosu na grupe B i D. Nađena je povezanost nivoa Tg/HDL i HOMA-IR u gru-pama dijabetičara i nedijabetičara.Svi podaci su obra-đeni uz pomo ćkompjuterskog programskog paketa SPSS Windows, verzija 17.0, Microsoft.

Zaključak: Rezultati pokazuju da bi jednostavan klinički parametar, kao što je odnos Tg/HDL mogao biti dobar pokazatelj prisustva KB, kod dijabetičara i nedi-jabetičara.

Ključne reči: Koronarna bolest, dijabetes mellitus, tri-gliceridi, HDL, insulinska rezistencija.

Abstract:Introduction: One of the risk factors for CHD is

high Tg/HDL ratio, which is associated with appearance of small and dense LDL particles, which are known as very atherogenic. Also, this ratio (Tg/HDL) is shown to be a marker of insulin resistance, which is important for development of CHD as well as T2D.

Aim: Analyzing the correlation between Tg/HDL, insulin resistance and intensity of coronary disease among diabetics and non-diabetics.

Material and methods: The study was conducted among 192 patients, divided into 4 groups. Hundred and four patients had T2D: 60 with CHD and 44 without CHD (groups A and B), and 88 patients without T2D of which 60 had CHD and 28 control patients (groups C and D). Intensity of CHD, glycaemia, HbA1C, total cho-lesterol, HDL, LDL and Tg, Tg/HDL and frequency of level Tg/HDL>1.33 were measured. By homeostatic model, insulin resistance was determined based on lev-els of glycaemia and insulinemia in basal conditions.

Results: Values of lipids were significantly higher in groups A, B and C, but also between patients with CHD compared to patients without CHD.Tg/HDL, as well as frequency of level Tg/HDL>1.33 were higher among patients with CHD, regardless of T2D. Tg/HDL ratio, insulinemia and insulin resistance correlated with intensity of CHD, and insulin resistance was higher in groups A and C compared to groups B and D. A connec-tion between levels of Tg/HDL and HOMA-IR was found in groups of diabetics and non-diabetics.All data was processed by computer programme package SPSS Windows, version 17.0, Microsoft.

Conclusion: The results show that a simple clini-cal parameter such is Tg/HDL could be a good indicator of CHD among diabetics and non-diabetics.

Key words: coronary heart disease (CHD), diabetes mellitus type 2 (T2D), triglycerides (Tg), HDL, insulin resistance.

POVEZANOST ODNOSA TG/HDL, INSULINSKE REZISTENCIJE I POJAVE I INTENZITETA KORONARNE BOLESTI

KOD PACIJENATA SA TIPOM 2 DIJABETESA I NEDIJABETIČARA

Autori: Iva Kadić¹, Lucija Kosi¹Mentor: Doc. dr Katarina Lalić²

¹Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu²Institut za endokrinologiju, dijabetes i bolesti metabolizma, Klinički centar Srbije, Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu

79



UvodKoronarna bolest je vodeći uzrok smrti u SAD i Evropi

(1). Nekoliko faktora rizika, kao što su godine, muški pol, dija-betes, hipertenzija, gojaznost, visok nivo LDL holesterola i ni-zak nivo HDL holesterola su već dokazani. Mnogi drugi pre-diktori koronarne bolesti još uvek su predmet istraživanja, uključujući koncentraciju Tg u plazmi, veličinu lipoproteinskih čestica, apoB, lipoprotein(a), homocistein, CRP, i ostale (2).

LDL holesterol je glavni pokazatelj dislipidemije, me-đutim danas se sve više govori i o drugim varijacijama u lipid-nom statusu, koje su vrlo zastupljene u opštoj populaciji, kao što su nizak HDL ili visok nivo Tg, a koje su povezane sa pora-stom kardiovaskularnog rizika(3). Istraživanja su pokazala da je odnos Tg/HDL >4 mg/dl najmoćniji prediktor koronarne bo-lesti(4), a postoje studije koje su pokazale da je i odnos veći od 3.5 mg/dl povezan sa porastom rizika od koronarne bolesti(1).

Mnogi razlozi mogu objasniti visoku prediktivnu vrednost odnosa Tg/HDL(3). Prvo, odnos Tg/HDL je identifi-kovan kao pokazatelj insulinske rezistencije i metaboličkog sindroma, koji su nezavisni faktori rizika za koronarnu bo-lest(3). Metabolički sindrom je blisko povezan sa tipom 2 di-jabetesa(1) i uključuje hiperglikemiju, dislipidemiju, hiper-tenziju i centralnu gojaznost(5). Insulinska rezistencija pred-stavlja ključni patofiziološki događaj metaboličkog sindro-ma(6) i definisana je kao neadekvatan fiziološki odgovor na insulin(7). Dokazano je da je insulinska rezistencija povezana sa kardiovaskularnim oboljenjima(7), a takođe, postoje istra-živanja koja su pokazala korelaciju između koronarne bolesti u dijabetes melitusu tip 2 i insulinske rezistencije(8). Povećane količine insulina deluju direktno na zid krvnog suda, gde do-lazi do nakupljanja lipida i bubrenja medije arterijskog zida. Insulin direktnim dejstvom stimuliše proliferaciju glatkih mi-šićnih ćelija, te tako deluje kao faktor rasta(8).

Drugi razlog zbog kojeg se visok odnos Tg/HDL sma-tra faktorom rizika za kardiovaskularna oboljenja je to što je pokazano da vrednosti ovog odnosa iznad 1.33 najbolje poka-zuju prisustvo malih gustih LDL čestica(9). Male guste LDL partikule pokazane su kao visoko aterogene, jer imaju tenden-ciju visoke penetrantnosti u arterijski zid, smanjeni afinitet ka LDL receptorima, produženi polu-život u plazmi i lakše oksi-duju(10). Takođe, već je dobro poznato da je visok nivo Tg i smanjen nivo HDL holesterola, kao i porast malih gustih LDL čestica povezan sa dijabetes melitusom tip 2. Pored ovih, i mnoge druge lipidne abnormalnosti javljaju se kod ovog obo-ljenja(11).

Cilj ovog rada je da dokažemo da li postoji korelacija između nivoa Tg/HDL, insulinske rezistencije i intenziteta koronarne bolesti, kao i da li postoje razlike između pacijena-ta obolelih od tipa 2 dijabetesa i nedijabetičara.

Mater ija l i metodeU istraživanje je uključeno 192 pacijenta iz baze poda-

taka Klinike za endokrinologiju, dijabetes i bolesti metaboli-zma Kliničkog centra Srbije. Svi ispitanici su podeljeni u 4 grupe prema sledećim kriterijumima: prisustvo ,odnosno, od-sustvo tipa 2 dijabetesa (T2D) i prisustvo/ odsustvo koronarne bolesti (KB). Prema navedenim kriterijumima pacijenti su podeljeni u sledeće grupe: grupa A: 60 pacijenata sa T2D i KB; grupa B: 44 pacijenta sa T2D bez KB; grupa C: 60 paci-

jenata bez T2D i sa KB; grupa D: 28 zdravih ispitanika usa-glašenih po polu i godinama starosti. Karakteristike navede-nih grupa prikazane su na Tabeli 1.

Dijagnoza KB postavljena je na osnovu detaljnih ispi-tivanja koja su sprovedena u Institutu za kardiovaskularne bolesti KCS od strane kardiologa, a utvrđena je na osnovu arteriografski verifikovanih promena na koronarnim krvnim sudovima. Suženje dijametra lumena krvnog suda za > 75% na sledećim koronarnim krvnim sudovima: leva koronarna arterija, cirkumfleksna arterija i desna koronarna arterija određeno je kao hemodinamski značajno, a suženje lumena dijametra za > 50% na glavnom stablu leve koronarne arterije (“left main”) određeno je kao hemodinamski značajno. Postojanje ateromatoznih promena na navedenim suženjima lumena na jednom od opisanih krvnih sudova označeno je kao “jednosudovna KB”, a postojanje suženja na više od jed-nog krvnog suda ili na glavnom stablu leve koronarne arterije, označeno je kao “višesudovna KB”. Na osnovu dobijenih po-dataka izračunata je učestalost višesudovne KB kod dijabeti-čara i nedijabetičara.

Pacijetni sa T2D lečeni su isključivo dijetom i/ili oral-nim hipoglikemicima, odnosno niko od ispitivanih pacijenata nije primao insulin. Takođe, niko od ispitivanih pacijenata nije primao sredstva koja mogu uticati na promene vrednosti nivoa lipoproteina.

Kod svih ispitivanih pacijenata kao i u kontrolnoj gru-pi zdravih ispitanika, sprovedeno je ispitivanje ujutro, našte, parametara glikoregulacije određivanjem nivoa glikemije (metodom glukozo-oksidaze) i glikoziliranog hemoglobina (HbA1c, imunohemijskom metodom na priboru DCA 2000) i parametara lipidnog statusa (vrednost nivoa ukupnog holeste-rola, njegovih subfrakcija HDL i LDL i triglicerida u serumu određena je enzimskom metodom). Kod svakog od ispitivanih pacijenata na osnovu nivoa triglicerida (Tg) i nivoa HDL-h izračunat je indeks Tg / HDL, a takodje, i učestalost poviše-nog nivoa (>1,33) Tg/HDL za koji je prethodno pokazano da najbolje korelira sa strukturnim promenama LDL-a.

Insulinska rezistencija evaluirana je homeostaznim modelom (HOMA-IR) na osnovu vrednosti glikemije i insuli-nemije (određene metodom RIA) u bazalnim uslovima. Vrednost HOMA-IR izračunata je po sledećoj formuli:HOMA-IR = insulinemija (mU/l) x glikemija (mmol/l) / 22.5

Kod svakog ispitanika obavljeno je merenje telesne te-žine (TT) i telesne visine (TV) i na osnovu toga izračunat ITM prema sledećoj formuli: ITM (kg/m2) = TT (kg)/ TV (m2).

Rezultati su izraženi kao srednja vrednost +/- stan-dardna greška.Značajnost razlika ispitivana je Studentovim t-testom, jednosmernom i dvosmernom analizom varijanse, neparametarskim testovima ili drugim metodama čija prime-na je naglašena u tekstu, dok je značajnost korelacija između varijabli ispitivana Spirmanovim korealcionim koeficijentom. Sva ispitivanja urađena su uz pomoć kompjuterskog program-skog paketa SPSS Windows, verzija 17.0, Microsoft.

Rezultat iNaši rezultati su pokazali da nije bilo značajne razlike

u nivou glikemije i HbA1c poredeći grupe A i B, dok je ova razlika bila statistički značajna poredeći grupe C i D. Slično,

80



grupe A i B se nisu razlikovale u ITM, ali je ITM u grupi C bio značajno viši u poređenju sa grupom D (Tabela 1).

Tabela 1. Karakteristike ispitivanih pacijenata, antropome-trijski parametri i parametri glikoregulacije

Parametar Grupa AT2D+KB+

Grupa BT2D+KB-

Grupa CT2D-KB+

Grupa DZdravi

Broj 60 44 60 28Pol (m/ž) 40/20 26/18 38/22 28Starost (god) 51,9+/-1,7a 55,5+/-2,4 50,2+/-1,5 52,9+/-1,5Dužina T2D (god) 12,2+/-0,7 9,9+/-0,8 - -Dužina KB (god) 3,2+/-0,4 - 3,9+/-0,4 -

Jednosudovna KB (%) 16 - 43 -

Višesudovna KB (%) 84 - 57 -

ITM(kg/m²) 27,7+/-0,4 27,5+/-0,7 26,4+/-0,3 24,7+/-

0,7#Glikemija (mmol/l) 8,9+/-0,3 8,5+/-0,4 5,1+/-0,1 4,7+/-0,2#

HbA1c (%) 7,8+/-0,2 7,5+/-0,3 5,8+/-0,1 5,2+/-0,1#a–rezultati su izraženi kao srednja vrednost; +/- standardna greška; # p < 0,01 vs grupa C

Nismo našli razliku u nivou ukupnog holesterola kada smo poredili grupu A i B, kao ni kada smo poredili grupu C i D, mada je u obe grupe sa KB (grupe A i C) nivo ukupnog holesterola bio nešto viši, ali bez statistički značajne razlike. Nivo HDL-h je bio značajno niži u grupi A nego u grupi B, ali i u grupi C nego u grupi D. Istovremeno, nivo LDL-h je bio značajno viši u grupi A u poređenju sa grupom B, ali i u grupi C u poređenju sa grupom D. Poredeći grupe A i B nije nađena značajna razlika u nivou triglicerida, iako je u obe grupe dija-betičara nivo triglicerida bio značajno viši u poređenju sa gru-pom D. Međutim, nivo triglicerida u grupi C je bio značajno viši nego u grupi D, ali poredeći sve tri grupe pacijenata (A,B i C) nisu uočene razlike u nivou triglicerida (Tabela 2).

Poredeći vrednost odnosa Tg/HDL i učestalost poviše-nog nivoa (>1,33) Tg/HDL između grupa utvrđeno je da u grupi A u poređenju sa grupom B postoji značajno viša vred-nost Tg/HDL kao i veća učestalost povišenog Tg/HDL odnosa u poređenju sa grupom B. Slično, i u grupi C u poređenju sa grupom D postoji značajno viša vrednost Tg/HDL kao i veća učestalost povišenog Tg/HDL odnosa (Tabela 2).

Nivo Tg/HDL odnosa u grupi dijabetičara sa višesu-dovnom KB bio je značajno viši u poređenju sa grupom dija-betičara sa jednosudovnom KB. Slično, i u nedijabetičara sa višesudovnom KB uočen je značajno viši nivo Tg/HDL odno-sa u poređenju sa nedijabetičarima sa jednosudovnom KB (Tabela 3).

Nivo insulinemije u bazalnim uslovima u grupi A bio je značajno viši u poređenju sa grupom B, a u obe grupe dija-betičara ovaj nivo insulinemije je bio značajno viši u poređe-nju sa grupom D. Takođe, nivo insulinemije u bazalnim uslo-vima u grupi C je bio značajno viši u poređenju sa grupom D (Grafikon 1).

Tabela 2. Vrednosti ukupnog holesterola, njegovih supfrak-cija, triglicerida i nivo i učestalost povišenog nivoa Tg/HDL odnosa kod ispitivanih pacijenata.

ParametarGrupa A

T2D+ KB+

Grupa BT2D+ KB-

Grupa CT2D- KB+

Grupa D Zdravi

Holesterol (mmol/l) 6,7 +/-0,2a 6,2+/-0,2 6,5+/-0,2 6,1+/-0,3

HDL-h (mmol/l)

1,16+/-0,04

1,49+/-0,06*

1,17+/-0,04

1,53+/-0,07#

LDL-h (mmol/l) 4,5+/-0,1 3,6+/-0,2* 4,4+/-0,1 3,5+/-0,3#

Trigliceridi (mmol/l) 2,3+/-0,2 2,1+/-0,2 2,2+/-0,2 1,4+/-0,1#

Tg/HDL 2,66+/-0,19

1,52+/-0,14*

2,21+/-0,22

1,01+/-0,11#

Učestalost Tg/HDL>1.33 (%)

66 41b 72 24c

a–rezultati su izraženi kao srednja vrednost +/- standardna greška; b – p < 0,05 vs grupa A; c – p < 0,01 vs grupa C (zna-čajnost razlika ispitivana je Pirsonovim hi-kvadrat testom); * p < 0,05 vs grupa A; # p < 0,01 vs grupa C

Nivo insulinemije u bazalnim uslovima u grupi dijabe-tičara sa višesudovnom KB bio je značajno viši u poređenju sa grupom dijabetičara sa jednosudovnom KB. Slično, i kod ne-dijabetičara sa višesudovnom KB uočen je značajno viši nivo insulinemije u bazalnim uslovima u poređenju sa nedijabeti-čarima sa jednosudovnom KB (Tabela 3).

Tabela 3. Vrednosti nivoa Tg/HDL odnosa i parametara insu-linske rezistencije kod dijabetičara i nedijabetičara sa jedno-sudovnom i višesudovnom KB

Parametar

Pacijenti sa T2D Pacijenti bez T2D

Jedn

osud

ovna

K

B

Viš

esud

ovna

K

B

Jedn

osud

ovna

K

B

Viš

esud

ovna

K

B

Tg/HDL 2,06+/-0,31ª 2,53+/-0,52* 1,88+/-0,19 2,79+/-0,57#Insulinemija (mU/l) 15,9+/-2,6 22,4+/-1,5* 14,7+/-2,1 20,3+/-2,8#

HOMA-IR 5,2+/-1,1 8,8+/-0,8* 3,7+/-0,8 5,5+/-0,7#a–rezultati su izraženi kao srednja vrednost +/- standardna greška; * p < 0,05 vs jednosudovna bolest kod pacijenata sa T2D; # p < 0,05 vs jednosudovna bolest kod pacijenata bez T2D

Slično, nivo HOMA-IR bio je značajno viši (veći stepen insulinske rezistencije) u grupi A u poređenju sa grupom B, a u obe grupe dijabetičara nivo HOMA-IR je bio značajno viši u poređenju sa grupom D. Takođe, nivo HOMA-IR bio je značaj-no viši u grupi C u poređenju sa grupom D (Grafikon 2).

Našli smo i da je nivo HOMA-IR bio značajno viši (ve-ći stepen insulinske rezistencije) u grupi dijabetičara sa više-sudovnom KB, ali i u grupi nedijabetičara sa višesudovnom

81



KB u poređenju sa odgovarajućim grupama sa jednosudov-nom KB (Tabela 3).

0

5

10

15

20

25

30

Grupa A Grupa B Grupa C Grupa D

insu

lin m

U/I

Grafikon 1. Vrednosti nivoa insulinemije u bazalnim uslovi-ma kod pacijenata sa tipom 2 dijabetesa (T2D) i koronarnom bolešću (KB) (grupa A), kod pacijenata sa T2D bez KB (gru-pa B), nedijabetičara sa KB (grupa C) i u grupi zdravih ispi-tanika (grupa D). Rezultati su izraženi kao srednja vrednost +/- standardna greška. Statistički značajne razlike, ispitane jednosmernom analizom varijanse u prethodno logaritamski transformisanim podacima da bi se obezbedila normalna ras-podela, su izmedju grupe A i grupe B (p < 0,05); grupe C i grupe D (p < 0,001); grupa A,B i grupe D (p < 0,001) i grupe A i grupe C (p < 0,01), dok poredeći grupu B i C nije uočena značajna razlika.

Grafikon 2. Vrednosti parametra insulinske rezistencije odre-djenih HOMA-IR modelom u pacijenata sa tipom 2 dijabetesa (T2D) i koronarnom bolešću (KB) (grupa A), kod pacijenata sa T2D bez KB (grupa B), nedijabetičara sa KB (grupa C) i u grupi zdravih ispitanika (grupa D). Rezultati su izraženi kao srednja vrednost +/- standardna greška. Statistički značajne razlike, ispitane jednosmernom analizom varijanse, su izme-dju grupe A i grupe B (p < 0,01); grupe C i grupe D (p < 0,01); grupa A,B i grupe D (p < 0,001) i grupe A i grupe C (p < 0,01), ali ne i izmedju grupe B i grupe C.

U grupi dijabetičara, metodom korelacije uočena je po-vezanost nivoa Tg/HDL i HOMA-IR (r=0,279; p<0,05).

Slično, i u grupi nedijabetičara nivo Tg/HDL je značajno ko-relirao sa HOMA-IR (r=0,336; p<0,05).

DiskusijaPrema našim rezultatima, poredeći grupu dijabetičara

(A i B) sa nedijabetičarima (C i D), dobili smo statistički zna-čajnu razliku u nivou glikemije i HbA1c, ali i statistički zna-čajnu razliku u ITM poredeći obolele (A,B i C) i zdravu kon-trolu (D) , što je u skladu sa brojnim istraživanjima (1).

Dijabetes melitus tip 2 je bez sumnje uzrok brojnih kar-diovaskularnih komplikacija, što potvrđuju rezultati mnogih studija. Na njihovu pojavu utiče i regulacija dijabetesa, ali i često prisutni poremećaji lipida (12). Naši nalazi ,takođe, po-kazuju značajno više vrednosti lipida u krvi kod obolelih od dijabetesa tip 2 u odnosu na kontrolnu grupu zdravih, među-tim, nismo pronašli statistički značajne razlike između obole-lih od KB, sa ili bez dijabetesa. Prema našim rezultatima nivo ukupnog holesterola se nije značajno razlikovao među oboleli-ma od KB (A i C) i onima bez KB (B i D), mada je bio nešto viši u grupama A i C. Ovo ne ide u prilog studijama, koje su pokazale da visok nivo ukupnog holesterola predstavlja zna-čajni faktor rizika za KB, kako kod nedijabetičara tako i kod dijabetičara (11). Sa druge strane, u jednom istraživanju spro-vedenom među japanskom populacijom, dobijeni su rezultati koji su pokazivali snižen nivo ukupnog holesterola među paci-jentima sa KB, mada to može biti povezano sa terapijom stati-nima, koja nije mogla biti ukinuta kod pojedinih pacijenata(1).

Naši rezultati pokazali su statistički značajnu razliku u nivou LDL-h kod pacijenata sa KB u odnosu na pacijente bez KB, odnosno pronašli smo značajno viši nivo LDL-h u grupi A u poređenju sa grupom B, ali i u grupi C u odnosu na grupu D. Kontradiktorno našim rezultatima, u istraživanju sprove-denom među Japancima, dobijene su niže vrednosti LDL-h među pacijentima sa KB u odnosu na pacijenete bez KB, što bi moglo ići u prilog tome da postoje drugi faktori rizika koji doprinose nastanku KB među japanskim stanovništvom, kao npr. veličina LDL čestica(1).

Onat i saradnici pokazali su da u populaciji nedijabeti-čara porast HDL-h smanjuje rizik za razvoj KB, a da je sa druge strane kod dijabetičara pozitivan efekat HDL-h defici-jentan, što je potvrdilo i istraživanje među iranskim pacijenti-ma(13). Naši nalazi pokazali su da postoje značajne razlike među pacijentima sa KB i bez iste, bilo da su u pitanju dijabe-tičari ili nedijabetičari. Nivo HDL-h je bio značajno niži među pacijentima u grupi A i C nego kod pacijenata u grupi B i D, što bi išlo u prilog HDL-h kao protektivnom faktoru (13). Sa druge strane, nivo Tg kod naših pacijenata nije se značajno razlikovao između nedijabetičara i dijabetičara koji imaju KB, ali je bio značajno viši i kod jednih i drugih u odnosu na kontrolnu grupu zdravih.

Brojne studije pokazale su važnost odnosa Tg/HDL kao jednog od glavnih faktora rizika za razvoj KB, kao i uti-caj ovog odnosa na intenzitet KB(1,4,9,14,15). Naročito se go-vori o odnosu Tg/HDL kao značajnom pokazatelju prisustva malih gustih LDL čestica, koje su vrlo aterogene(10). Nivo Tg/HDL >1.33 ukazuje na prisustvo ovih LDL čestica(9). Naši rezultati idu u prilog ovim tezama, jer smo pronašli daje od-nos Tg/HDL kao i učestalost ovog odnosa iznad 1.33 značajno povišen kod pacijenata sa KB u odnosu na pacijente bez KB,

82



bez obzira na prisustvo dijabetesa. Takođe, pronašli smo da je u grupi dijabetičara koji imaju „višesudovnu KB“ nivo Tg/HDL značajno viši nego kod dijabetičara sa „jednosudov-nom“ bolešću, što je pokazano i za grupu nedijabetičara, a odgovara ranijim studijama(4). U skladu sa našim rezultatima rađeno je istraživanje u kome su mereni nivoi malih gustih LDL čestica kod dijabetičara i nedijabetičara i korelacija sa intenzitetom KB, gde je pokazano je nivo ovih partikula zna-čajno viši kod pacijenata sa teškim oblikom KB nego kod onih sa lakšom KB(10).

Nivo insulina je važan faktor ateroskleroze i dovodi do brojnih promena na krvnim sudovima(8), što pokazuju i naši rezultati. Kod pacijenata sa dijabetesom i „višesudovnom KB“dobijen je značajno viši nivo insulinemije u odnosu na dijabetičare sa „jednosudovnom KB“. Sličan odnos nađen je i kod nedijabetičara, što bi moglo ukazati na korelaciju između insulinemije i intenziteta KB. Takođe, i nivo insulinske rezi-stencije pokazan je kao bitan faktor u razvoju kardiovaskular-nih oboljenja(7). Naime, mehanizam kojim insulinska rezi-stencija dovodi do ovih oboljenja je kompleksan i svodi se na promenu intraćelijskih signalnih puteva, što rezultira poveća-nom produkcijom endotelina i stimulacijom transkripcije pro-inflamatornih gena, i na kraju povećanom tendencijom ka koagulaciji(14). U našem istraživanju merili smo insulinsku rezistenciju homeostaznim modelom (HOMA-IR) i dobili smo značajno više nivoe insulinske rezistencije u grupama obolelih od KB (A i C) u odnosu na pacijente koji nisu imali KB (B i D), što je korespondiralo sa drugim istraživanji-ma(14). Takođe, rezultati su pokazali značajno viši nivo insu-linske rezistencije kod dijabetičara sa višesudovnom KB u odnosu na dijabetičare sa jednosudovnom KB i sličan takav odnos nađen je i među nedijabetičarima.

Metodom korelacije našli smo povezanost nivoa Tg/HDL i insulinske rezistencije u grupi dijabetičara, kao i kod nedijabetičara, što podržava već postojeće teorije o odnosu Tg/GDL kao pokazatelju insulinske rezistencije(7,14). Međutim, neki podaci ukazuju na etničke razlike u odnosu na to da li je Tg/HDL zaista marker insulinske rezistencije, te tako istraživanja govore u prilog tome da kod Afroamerikanaca ovaj odnos nije pokazatelj insulinske rezistencije, kao i da po-stoje različite granične vrednosti Tg/HDL koje upućuju na insulinsku rezistenciju među različitim etničkim grupa-ma(5,7,16).

U zaključku se može istaći da postoji značajna razlika u lipidnom statusu kod pacijenata sa KB u odnosu na pacijenete bez KB i u grupi dijabetičara i u grupi nedijabetičara, naročito kada je u pitanju odnos Tg/HDL. Ovaj jednostavni klinički pa-tametar bi stoga mogao biti korišćen u svakodnevnoj praksi za procenu rizika za razvoj koronarne bolesti, kako kod nedijabe-tičara tako i kod pacijenata obolelih od dijabetesa tip 2.

Literatura1. Hirano T, Yoshino G, et al. Remarkably high prevalence of

small dense low-density lipoprotein in Japanese men with coronary artery disease, irrespective of the presence of diabetes.Atherosclerosis 2002; 160(1):249–56.

2. Frohlich J, Dobiásová M.Fractional esterification rate of cholesterol and ratio of triglycerides to HDL-cholesterol are powerful predictors of positive findings on coronary angiography. Clin Chem. 2003;49(11):1873–80.

3. Cordero A, Andrés E, Ordoñez B, et al. Usefulness of tri-glycerides-to-high-density lipoprotein cholesterol ratio for predicting the first coronary event in men. Am J Cardiol. 2009;104(10):1393–7.

4. Da Luz PL, Favarato D, Faria-Neto JR Jr, Lemos P, Chagas AC.High ratio of triglycerides to HDL-cholesterol pre-dicts extensive coronary disease. Clinics (Sao Paulo). 2008; 63(4):427–32.

5. Chiang JK, Lai NS, Chang JK, Koo M.Predicting insulin resistance using the triglyceride-to-high-density lipopro-tein cholesterol ratio in Taiwanese adults.Cardiovasc Diabetol. 2011; 10:93.

6. Marotta T, Russo BF, Ferrara LA.Triglyceride-to-HDL-cholesterol ratio and metabolic syndrome as contributors to cardiovascular risk in overweight patients.Obesity (Silver Spring). 2010; 18(8):1608–13.

7. Kim-Dorner SJ, Deuster PA, Zeno SA, Remaley AT, Poth M.Should triglycerides and the triglycerides to high-den-sity lipoprotein cholesterol ratio be used as surrogates for insulin resistance? Metabolism. 2010; 59(2):299–304.

8. Bogić M, Bošnjak-Petrović V, Bulajić M, i saradnici. Interna medicina. 2009. Zavod za udžbenike. Beograd.

9. Boizel R, Benhamou PY, Lardy B, Laporte F, Foulon T, Halimi S.Ratio of triglycerides to HDL cholesterol is an indicator of LDL particle size in patients with type 2 dia-betes and normal HDL cholesterol levels. Diabetes Care. 2000; 23(11):1679–85.

10. Koba S, Hirano T, Ito Y, et al. Significance of small dense low-density lipoprotein-cholesterol concentrations in rela-tion to the severity of coronary heart diseases. Atherosclerosis. 2006; 189(1):206–14.

11. Tohidi M, Hatami M, Hadaegh F, Safarkhani M, Harati H, Azizi F.Lipid measures for prediction of incident cardio-vascular disease in diabetic and non-diabetic adults: re-sults of the 8.6 years follow-up of a population based co-hort study. Lipids Health Dis. 2010; 9:6.

12. Zamaklar M, Lalić K, Rajković N, i saradnici.Oxidized LDL and lipids as risk factors for ischemic heart disease in type 2 diabetes.Vojnosanit Pregl. 2005; 62(7–8):529–36.

13. Onat A, Can G, Ayhan E, Kaya Z, Hergenç G.Impaired protection against diabetes and coronary heart disease by high-density lipoproteins in Turks.Metabolism. 2009; 58(10):1393–9.

14. Ostfeld R, Mookherjee D, Spinelli M, et al. A triglyceride/high-density lipoprotein ratio > or = 3.5 is associated with an increased burden of coronary artery disease on cardiac catheterization. J Cardiometab Syndr. 2006; 1(1):13–5.

15. Bittner V, Johnson BD, Zineh I, et al. The triglyceride/high-density lipoprotein cholesterol ratio predicts all-cause mortality in women with suspected myocardial ischemia: a report from the Women’s Ischemia Syndrome Evaluation (WISE).Am Heart J. 2009; 157(3):548–55.

16. Sumner AE, Finley KB, Genovese DJ, Criqui MH, Boston RC.Fasting triglyceride and the triglyceride-HDL choles-terol ratio are not markers of insulin resistance in African Americans. Arch Intern Med. 2005; 165(12):1395–400.

83



Sažetak:Uvod: Sport i fizička aktivnost najčešće imaju va-

žan i pozitivan uticaj na kvalitet života dece i adolesce-nata koji boluju od epilepsije. Međutim, vrlo često ovim osobama nije dozvoljeno da budu fizički aktivne.

Cilj: Naš cilj bio je da utvrdimo koliko se i kojim oblicima fizičke aktivnosti i sporta bave deca i mladi ko-ji boluju od epilepsije u našem društvu.

Pacijenti i metode: Analizirali smo pet parameta-ra fizičke aktivnosti u grupi od 80 dece i mladih sa epi-lepsijom i kontrolnoj grupi od 43 zdrave dece i adolesce-nata. Podaci su prikupljani specijalno dizajniranim upitnikom i analizirani standardnim statisičkim metoda-ma.

Rezultati: Manje od dve trećine (61,19%) ispitani-ka koji su u istoriji bolesti imali generalizovani toničko-klonički napad učestvovalo je u nastavi fizičkog vaspi-tanja, pri čemu je postojala statistički visoko značajna razlika (P<0,01) u odnosu na kontrolnu grupu. Razlika između grupe obolelih i kontrolne grupe u bavljenju pre-poručenim vežbama za obolele od epilepsije u nastavi fizičkog vaspitanja visoko je statistički značajna, a za potencijalno opasne vežbe na visini nije značajna. Polovina dece i mladih sa epilepsijom trenirala je neki sport .

Zaključak: Postoji značajan broj dece i mladih sa epilepsijom koji se ne bave dovoljno fizičkom aktivnošću uprkos normalnom neurološkom nalazu i dobroj kontro-li napada. Sa druge strane, značajan je broj pacijenata koji se bave fizičkim aktivnostima koje nisu preporučlji-ve za osobe sa epilepsijom. Iako su predrasude protiv bavljenja obolelih sportom umanjene, fizička aktivnost obolelih od epilepsije mora se i dalje ohrabrivati

Ključne reči: Epilepsija, sport, fizička aktivnost, deca, omladina.

Abstract:Introduction: Sport and physical activity mostly

have an important and positive impact on the quality of life of children and young people suffering from epilep-sy. However, very often these persons are not allowed to be physically active.

Aim: Our aim was to determine the degree and type of physical and sports activity of the children and young people suffering from epilepsy in our community.

Patients and methods: We analysed five parame-ters of physical activity in a group of 80 children and young people with epilepsy and a control group of 43 healthy children and adolescents. We collected data us-ing specifically designed questionnaire and analyzed them using standard statistical techniques.

Results: Less than two thirds (61.19%) of patients who had generalised tonic-clonic seizure in their per-sonal history were included in the school physical edu-cation classes and there was a highly statistical differ-ence (P<0.01) compared to the control group. The differ-ence between the two groups in practicing school physi-cal exercises recommended for people with epilepsy was statistically highly significant, but in practicing poten-tially dangerous exercises on height was not significant. One half of young people with epilepsy practiced some sports activities.

Conclusion: There is a significant number of chil-dren and adolescents with epilepsy who are not engaged enough in physical activity despite of normal neurologi-cal status and favourable seizure control. On the other side, there is considerable number of patients who deal with physical activities that are not recommended for people with epilepsy. Although the prejudice against sports activities become lower, physical activity of pa-tients with epilepsy must be further encouraged.

Keywords: Epilepsy, sport, physical activity, children, youth.

UvodKvalitet života dece i mladih sa epilepsijom zavisi od

mnogih faktora, među kojima bavljenje fizičkom aktivnošću i sportom svakako zauzima značajno mesto. Ono poboljšava opšte zdravlje bolesnika, smanjuje rizike za pojavu mnogih bolesti, obezbeđuje rast samopouzdanja i samopoštovanja i bolju socijalnu integraciju (1). Za pojedine tipove epilepsija smatra se da bavljenje fizičkom aktivnošću smanjuje učesta-lost napada (2).

Pojedini tipovi fizičke aktivnosti nisu preporučljivi za obolele od epilepsije jer u slučaju napada u toku aktivnosti

FIZIČKA AKTIVNOST I BAVLJENJE SPORTOM DECE I ADOLESCENATA SA EPILEPSIJOM

Autori: Mihailo Belaćević1, Miloš Babić1

Mentor: Prof. dr Nebojša Jović2

1Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu2Klinika za neurologiju i psihijatriju za decu i omladinu, Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu

84



može doći do povreda i drugih ozbiljnih posledica. Takođe, kod pojedinih tipova epilepsija intenzivnija fizička aktivnost se ne preporučuje jer može da provocira napade (3,4). Međutim, u većini slučajeva bavljenje sportom i fizičkom ak-tivnošću je dozvoljeno, potrebno i ohrabruje se (5).

Prema nekadašnjem shvatanju za obolele od epilepsije nije poželjno da se bave fizičkom aktivnošću jer rizikuju da se povrede i da im se pogorša kontrola napada. Ovakav stav, iako štetan i davno naučno odbačen, održava se u opštoj populaciji. (6,7) Za decu i mlade ovakvo shvatanje je posebno opasno, uzimajući u obzir da se oni nalaze u procesu punog fizičkog i mentalnog razvoja, a da, sa druge strane, odluku o njihovom bavljenju fizičkom aktivnošću najčešće donosi neko drugi.

Cilj našeg rada bio je da ispitamo koliko se deca i mla-di lečeni od epilepsije u Klinici za neurologiju i psihijatriju za decu i omladinu bave fizičkom aktivnošću u okviru nastave fizičkog vaspitanja i van nje. Takođe, želeli smo da utvrdimo koliko se fizički aktivni pacijenti bave preporučenim oblicima fizičke aktivnosti, a koliko rizičnim i potencijalno opasnim.

Mater ija l i metodeIstraživanje je sprovedeno u Klinici za neurologiju i

psihijatriju za decu i omladinu, u Beogradu tokom 2011. i 2012. godine. U istraživanje su uključene 123 osobe. Njih 43 činilo je kontrolnu grupu, a 80 grupu obolelih od nekog epi-leptičkog sindroma. Kontrolnu grupu činila su zdrava deca i mladi, poredivi po polu i uzrastu sa ispitivanom grupom oso-ba s epilepsijom. Grupu obolelih činilo je 80 osoba sa posta-vljenom sigurnom dijagnozom epilepsije i njenim aktivnim trajanjem dužim od 6 meseci. U pogledu etiologije epilepsije pacijenti sa idiopatskom i kriptogenom etiologijom posmatra-ni su kao jedna celina. Pacijenti su, prema kontroli napada, podeljeni u tri podgrupe: Podgrupu A činili su pacijenti sa stoprocentnom kontrolom napada, podgrupu B činili su paci-jenti sa kontrolom napada između 50% i 100%, a podgrupu C činili su pacijenti sa kontrolom napada ispod 50%.

Podaci su prikupljeni specijalno dizajniranim, nestan-dardizovanim upitnikom koji, osim demografskih karakteri-stika, sadrži još četiri domena: učešće u nastavi fizičkog va-spitanja, aktivnosti na časovima fizičkog vaspitanja koje su preporučljive za pacijente sa dobrom kontrolom napada (trča-nje, vežbe zagrevanja, sportovi s loptom), aktivnosti na časo-vima fizičkog vaspitanja koje nisu preporučljive za obolele od epilepsije (penjanje uz konopac i hodanje po gredi) i aktivno bavljenje sportom. Tako prikupljeni podaci zatim su iskori-šćeni za dobijanje četiri odgovarajuća parametara fizičke ak-tivnosti koji su odgovarali domenima u upitniku. Ovi parame-tri su analizirani i poređeni između grupe obolelih i kontrolne grupe. Korišćene su standardne deskriptivne metode i hi kva-drat test sa Jetsovom korelacijom za sređivanje podataka.

Svi ispitanici (oboleli i kontrolni ispitanici), odnosno, njihovi roditelji ili staratelji dali su informisani pristanak za učešće u studiji.

Rezultat iGrupu obolelih činilo je 80 pacijenata čije su kliničke i

demografske karakteristike prikazane na tabeli 1. Grupa obo-lelih i kontrolna grupa nisu se značajno razlikovale po polu (p > 0.05) ni po uzrastu (p > 0.05).

Tabela1. Demografske i kliničke karakteristike grupe obo-lelih.

Pol (m:ž)M:46 (57,50%) Ž: 34 (42,50%)

Uzrast (god.) 18,37 ± 5,29 (10–31)Uzrast u vreme prvog napada (god.) 7,01± 4,77 (0–19)

Trajanje bolesti (god.) 11,2± 6,36 (0,5–26)

Stepen kontrole napadaA: 49 (61,25%)B: 22 (27,5%)C: 7 (8,75%)

Istorija GTK napadaDa 53 (66,25%)Ne (27) (33,75%)

Neurološki nalazNeurološki ispadi: 59 (26,25%)Normalan: 21 (73,75%)

Mentalna retardacijaDa 14 (15,90%)Ne: 66 (84,10%)

EtiologijaIdiopatska+kripogena: 46 (57,75%)Simptomatska: 34 (42,25%)

Antiepileptička terapijaObustavljena:19 (23,75%)Monoterapija: 40 (50%)Politerapija: 21 (26,25%)

Stepen kontrole napada nije bio poznat za 2 (0,25%) ispitani-ka; GTK=generalizovani toničko-klonički napad; Stepen kon-trole napada: A=100%; B=između 50%100%; C=niža od 50%

U nastavi fizičkog vaspitanja učestvovalo je 83,75% dece i mladih sa epilepsijom. Nije bilo značajne razlike izme-đu grupe obolelih i kontrolne grupe u pogledu formalnog po-hađanja nastave fizičkog vaspitanja (P>0,05). U podgrupi A obolelih u nastavi fizičkog vaspitanja učestvovalo je 89,8% ispitanih, u podgrupi B 80%, a u podgrupi C 85,71% (6 od 7) ispitanih. Manje od dve trećine (61,19%) ispitanika koji su u istoriji bolesti imali generalizovani toničko-klonički napad (GTK) učestvovalo je u nastavi fizičkog vaspitanja, pri čemu je postojala statistički visoko značajna razlika (P<0,01) u od-nosu na kontrolnu grupu.

Tabela 2. Učešće ispitanika iz podgrupe obolelih bez neuro-loških ispada u nastavi fizičkog vaspitanja. (N=59)

Fizička aktivnost Da Ne Delimično

Vežbe zagrevanja 43 (72,88%) 11 (18,64%) 5 (8,47%)Trčanje 48 (81,36%) 11 (18,64%) 0Vežbe s loptom 48 (81,36%) 11 (18,64%) 0

Istovremeno je sve tri analizirane poželjne aktivnosti za većinu pacijenata sa epilepsijom u okviru nastave (vežbe zagrevanja, trčanje, vežbe sa loptom) radilo 72,88% pacijena-ta s epilepsijom, bez neuroloških ispada, pri čemu je postojala statistički visoko značajna razlika između ove podgrupe obo-lelih i kontrolne grupe (P<0,01). U toku same nastave od onih ispitanika sa epilepsijom koji su u njoj učestvovali više od tre-ćine izvodilo je vežbe koje se za njih ne preporučuju (hodanje po gredi 43,28%, penjanje uz šipku i konopac 31.34%). Procenat svih ispitanika sa epilepsijom koji su radili jednu od ove dve aktivnosti iznosio je 37,5%. Značajna razlika u uče-stvovanju u vežbama na visini koje se ne preporučuju za obo-

85



lele od epilepsije (penjanje uz konopac ili hodanje po gredi) u odnosu na kontrolnu grupu nije postojala (P>0,05).

Polovina obolelih od epilepsije (50%) navela je da se aktivno bavila sportom uz odlaske na treninge bar jednom ne-deljno u periodu nakon početka bolesti. U podgrupi A obole-lih aktivno se bavilo sportom 57,14% obolelih, u podgrupi B 36,36%, a u podgrupi C 42,86% (3 od 7) ispitanih.

DiskusijaFizička aktivnost dece i mladih obolelih od epilepsije

је heterogena, što se ogleda u razlikama u bavljenju različitim tipovima fizičke aktivnosti u okviru školske nastave i van nje Podatak da u nastavi fizičkog vaspitanja učestvuje 83,75% obolelih i da nema značajne razlike u odnosu na kontrolnu grupu na prvi pogled deluje ohrabrujuće, pogotovo ako se uz-me u obzir da je ovaj procenat pre nekoliko godina u našoj sredini bio daleko manji (1). Utisak se drastično menja ukoli-ko uzmemo u obzir procenat pacijenata koji su imali GTK i učestvovali u nastavi fizičkog (61,19%) i visoko značajnu ra-zliku po tom pitanju između njih i kontrolne grupe. Međutim, ono što se ističe u prvi plan jeste zastupljenost pojedinih obli-ka fizičke aktivnosti u nastavi (8). Naime, postoji nimalo be-značajan procenat obolelih koji, iako imaju uredan neurološki nalaz i dobru kontrolu napada, ne rade nikakve vežbe sa lop-tom, odnosno ne trče ili ne rade vežbe zagrevanja (tabela 2), a razlika u ravnopravnom učešću pojedinaca sa epilepsijom bez neuroloških ispada u sve tri aktivnosti visoko je statistički značajna u odnosu na kontrolnu grupu. Sa druge strane, izme-đu podgrupe obolelih koji su učestvovali u nastavi fizičkog i kontrolne grupe nema značajne razlike u učestvovanju u ve-žbama na visini koje su, za obolele od epilepsije, potencijalno vrlo opasne (3). Tako se, od svih obolelih čak 37,5% penje uz konopac ili hoda po gredi, rizikujući na taj način mogući pad i povredu. Ovi rezultati otvaraju mnoga pitanja, a jedno od njih je svakako to koliko su zapravo nastavnici fizičkog vaspi-tanja obavešteni o tome da njihovi đaci imaju epilepsiju, kao i o tome koje su vežbe preporučene i korisne, a koje opasne za obolele od epilepsije. Osim toga, treba obratiti pažnju na mo-gući štetan uticaj niskog samopoštovanja, straha od obeleža-vanja i socijalne izolacije među decom i mladima sa epilepsi-jom na njihovo bavljenje fizičkom aktivnošću i na loš odnos između dece, roditelja, lekara i nastavnika fiskulture (6,10).

Prema našim rezultatima, jedna polovina dece i mla-dih sa epilepsijom aktivno se bavila nekim sportom nakon početka bolesti. Ovaj podatak pokazuje pomak u pozitivnom pravcu u odnosu na raniji period (1).

U nekim radovima (9) gde u obzir nije uzeto postojanje GTK napada u istoriji bolesti, navodi se da nema značajne ra-zlike između pacijenata sa epilepsijom i zdravih osoba.Rezultati našeg istraživanja ukazuju na neopravdan uticaj GTK napada na učestvovanje u nastavi fiskulture kod pacijenata bez neuro-loškog nalaza i sa odličnom kontrolom napada. Stoga možemo pretpostaviti da sam dramatičan izgled GTK napada koji se obolelom desio nekad u prošlosti može dovesti do značajnog pogoršanja situacije kada je fizička aktivnost u pitanju.

Naš upitnik uključio je i mnoge druge pokazatelje psi-hosocijalnog funkcionisanja, ali će ostali rezultati biti pred-stavljeni u okviru neke od sledećih studija.

U ovom radu, međutim, nisu procenjeni drugi oblici fizičke aktvinosti (npr. ekstremni sportovi) koji bi mogli da budu od koristi u opštoj proceni ove problematike. Zatim, nisu

analizirani drugi oblici stigmatizacije kojoj su mladi sa epi-lepsijom izloženi (10). Ovo istraživanje se ,takođe, nije bavilo stavovima prema fizičkoj aktivnosti kako obolelih, tako i nji-hovih roditelja, lekara, nastavnika, trenera i drugih koji odlu-čuju o učestvovanju dece i mladih u fizičkoj aktivnosti (6, 11) što bi se ujedno moglo smatrati najvećim nedostatkom naše studije. Dalja istraživanja mogla bi da rasvetle uticaj pomenu-tih stavki na bavljenje dece i mladih sa epilepsijom fizičkom aktivnošću i sportom.

Uzimajući u obzir sve rezultate do kojih smo došli i poredeći ovo sa drugim istraživanjima o istoj tematici, mogli bismo da zaključimo da postoji značajan broj dece i mladih sa epilepsijom koji ne učestvuju dovoljno u fizičkoj aktivnosti i sportu iako za to ne postoje objektivni razlozi. Od faktora ko-ji na ovu pojavu utiču, posebno se ističe GTK napad. Sa druge strane, ozbiljan broj obolelih bavi se fizičkim aktivnostima koje su za njih potencijalno ugrožavajuće. Iako u procentu obolelih koji učestvuju u nastavi fizičkog vaspitanja i procen-tu onih koji se aktivno bave nekim sportom postoji vidan po-mak u odnosu na raniji period, ovi podaci su i dalje zabrinja-vajući i zahtevaju veću posvećenost ovom pitanju u budućno-sti. Lekari, zdravstveni vaspitači, mediji i drugi koji mogu da utiču na stavove ovog dela populacije, trebalo bi da ulože na-por kako bi što više mladih i onih koji o njihovoj fizičkoj ak-tivnosti odlučuju bilo informisano o tome koji su oblici fizičke aktivnosti za pojedine bolesnike dozvoljene i potrebne, a koje bi trebalo izbegavati. Postojeće predrasude koje nemaju nauč-nu osnovu trebalo bi upornije suzbijati.

Literatura1. Stevanović D, Jović N. Učešće dece i adolescenata sa epi-

lepsijom u fizičkim2. ME- 9:1–5 aktivnostima. Zbornik radova 2. kongres epi-

leptologa Srbije са međunarodnim učešćem 2004;3. Esquivel E et al. Physical exercise and voluntary hiperven-

tilation in childhood absence epilepsy. Electroencephalography and clinical Neurophysiology, 1991; 79: 127–132.

4. Commission of Pediatrics of the ILAE. Restrictions for Children with Epilepsy. Epilepsia, 1997; 38(9): 1054–1056.

5. A. D. Rothner. Sports Participation in Children and Adolescents with Neurological Impairments. VMQ 1996; 123(2): 96–97

6. J Wong, E. Wirrel. Physical Activity in Children/Teens with Epilepsy Compared with That in Their Siblings with-out Epilepsy. Epilepsia 2006; 47(3): 631–639

7. J. Spatt et al. Predictors for Negative attitudes toward Subjects with Epilepsy: A Representative Survey in General Public in Austria. Epilepsia 2005; 46(5):736–742

8. Jovic N. J. La pratique sportive des enfants et desadoles-cents avec epilepsie stabilisee. Epilepsies 2004; 16: 87–94

9. Howard GM, Radloff M, Sevier TL. Epilepsy and sports participation. Curr sports med. Rep. 2004; 3(1):15–19.

10. Jordan S. et al. Epilepsy in Sports and Recreation. Sports Med 2003; 33 (7): 499–516

11. Howell E. Epilepsy stigma: Moving from a global problem to global solutions. Seizure: Eur. J. Epilepsy 2010;19(10): 630–6.

12. Arida RM et al. Physical Activity and Epilepsy: Proven and Predicted Benefits. Sports Med 2008; 38 (7): 607–615

86



Sažetak:Uvod:Pojačano stvaranje kiseoničnih slobodnih

radikala pokazano je kod bolesnika sa akutnim možda-nim udarom (AMU), kako u toku ishemije, tako i tokom reperfuzije. Reperfuzija izazvana trombolitičkom terapi-jom može imati i štetne efekte zbog oksidativnog stresa usled uspostavljanja reoksigenacije tkiva.

Cilj: Procena stepena oksidativnog oštećenja pro-teina i lipida kod bolesnika sa AMU kod kojih je prime-njena trombolitička terapija.

Materijal i metode:U istraživanje je uključeno 37 bolesnika sa AMU kod kojih je primenjena trombolitička terapija (t-PA) i 40 zdravih kontrola. Pokazatelji oksida-tivnog oštećenja proteina (sadržaj karbonilnih grupa, KG i koncentracija proteinskih tiol grupa,P-SH) određi-vani su spektrofotometrijski, a oštećenja lipida (koncen-tracije urinarnih izoprostana, 8-epi-PGF2α) metodom imunoeseja.

Rezultati: Kod bolesnika sa AMU pre primenjene terapije postoji statistički značajno sniženje koncentra-cija P-SH i značajno povećan sadržaj KG u poređenju sa zdravom kontrolnom grupom ispitanika (p=0,001). Sličan stepen oksidativnog oštećenja proteina uočava se i 24h nakon primenjene trombolitičke terapije. Koncentracije P-SH postepeno se povećavaju, pa nakon 72h nema značajne razlike između bolesnika i kontrola (p>0,05), dok sadržaj KG ostaje za oko 30% veći od vrednosti u kontrolama (p>0,05). Koncentracija 8-epi-PGF2α kod bolesnika sa AMU značajno je povećana u odnosu na kontrole 24h i 48h nakon primene t-PA (p=0,001). Umereno smanjenje može se videti nakon 72h, mada su vrednosti i dalje1,5 puta veće u odnosu na kontrole (p=0,008).

Zaključak:Prikazani rezultati ukazuju na visok stepen oksidativnog oštećenja proteina i lipida kod bole-snika sa AMU nakon primene trombolitičke terapije.

Ključne reči: oksidativni stres, moždani udar, tromboli-tička terapija, izoprostani.

Abstract:Introduction: Increased reactive oxygen species

production has been demonstrated in ischemic stroke, both during ischemia and reperfusion. The reperfusion might have some deleterious effects because oxidative stress can rapidly take place in reoxygenation.

The Aim: We aimed to determine the level of oxi-dative damage of proteins and lipids in patients with ischemic stroke treated with thrombolytic therapy.

Material and methods: A total of 37 patients with stroke, treated with tissue plasminogen activator (t-PA) and 40 healthy controls were included in the study. Byproducts of protein (reactive carbonyl derivatives, RCD and protein thiol groups, P-SH) as well as lipid (urinary isoprostanes, 8-epi-PGF2α) oxidative damage were measured spectrophotometrically and by enzyme immunoassay, respectively.

Results: P-SH levels were significantly decreased and the content of RSD was significantly increased in stroke patients prior to t-PA administration in compari-son with controls (p=0.001). Similar level of protein oxi-dative damage was found 24h after thrombolysis. Due to gradual increase in P-SH concentration, after 72h there was no significant difference between patients and con-trols (p>0.05) while the RCD content remained approxi-mately 30% higher than in controls (p>0.05). The con-centration of 8-epi-PGF2α was significantly increased in stroke patients 24h and 48h after t-PA administration in comparison with controls (p=0.001). Mild decrease was observed after 72h, although concentration was still 1.5 times higher than in controls (p=0.008).

Conclusion: Based on our results, it may be con-cluded that a high degree of thrombolysis-induced oxi-dative damage of proteins and lipids is present in pa-tients with stroke.

Keywords: oxidative stress, stroke, thrombolytic thera-py, isoprostanes.

OKSIDATIVNI STRES NAKON REPERFUZIONOG OŠTEĆENJAIZAZVANOG TROMBOLITIČKOM TERAPIJOM KOD BOLESNIKA

SA MOŽDANIM UDAROM

Autori: Bojana Tasić1

Mentor: Doc. dr Marija Plješa Ercegovac2

1Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu2Institut za medicinsku i kliničku biohemiju , Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu

87



UvodOksidativni stres predstavlja stanje u kom je ravnoteža

između prooksidanasa i antioksidanasa pomerena na stranu prooksidanasa (1). Naime, kiseonični slobodni radikali (KSR) se kontinuirano i kontrolisano stvaraju u toku normalne meta-boličke aktivnosti ćelija ili u patološkim uslovima. S obzirom na to da imaju jedan nesparen elektron, slobodni radikali su veoma nestabilni i veoma reaktivni. Usled njihovog nekontro-lisanog stvaranja, kada njihova količina prevazilazi antioksi-dantni kapacitet ćelije i vanćelijske tečnosti, mogu oštetiti brojne biološke makromolekule uključujući proteine, lipide i DNK (2).

Smatra se da oksidativni stres može doprinositi na-stanku bolesti, ali ,takođe, može nastati i kao posledica pato-loškog procesa (3). Grupi „oksidativnih oboljenja“ pripadaju kardiovaskularne bolesti, dijabetes, hronična bolest bubrega, karcinomi, ali i veliki broj neuroloških bolesti, uključujući i ishemijski moždani udar (4, 5, 6).

Moždani udar predstavlja naglo nastali fokalni neuro-loški deficit, prouzrokovan poremećajem moždane cirkulacije koji dovodi do značajnog smanjenja ili potpunog prekida do-toka krvi u određenom delu mozga (7). Prema Svetskoj zdrav-stvenoj organizaciji, predstavlja jedan od vodećih uzroka morbiditeta i mortaliteta u svetu (8). U akutnom moždanom udaru, povećana produkcija KSR je pokazana, kako u toku ishemije, tako i tokom reperfuzije koja predstavlja važan tera-pijski pristup u rekanalizaciji okludirane arterije i usposta-vljanju cirkulacije čime se štiti moždano tkivo. Ipak, reperfu-zija usled primene trombolitičke terapije može imati i štetne efekte, zbog nastanka oksidativnog stresa usled uspostavlja-nja reoksigenacije tkiva (9, 10). Mada su rezultati na eksperi-mentalnim životinjama ukazali na ključnu ulogu oksidativ-nog stresa u oštećenju izazvanom ishemijom/reperfuzijom, ima veoma malo dokaza o postojanju ovog tipa oštećenja kod ljudi sa akutnim moždanim udarom (11, 12).

Kiseonični slobodni radikali stvoreni u toku ishemije/reperfuzije mogu reagovati sa nezasićenim lipidima u mem-branama, usled čega dolazi do stvaranja proizvoda lipidne peroksidacije. U dosadašnjim istraživanjima, oksidativno oštećenje lipida kod bolesnika sa moždanim udarom procenji-vano je samo određivanjem koncentracije malondialdehida (MDA) (13–16), dok nema rezultata koji se odnose na određi-vanje urinarne ekskrecije izoprostana (iPF2α-III), grupe bio-aktivnih prostaglandinu F2-sličnih jedinjenja, koja nastaju oksidacijom arahidonske kiseline, a smatraju se najpouzdani-jim in vivo markerom procesa lipidne peroksidacije (17). Pored toga, oksidativno oštećenje proteina, koje predstavlja jedan od osnovnih mehanizama koji dovode do oštećenja nervnih ćelija (18), kod bolesnika sa akutnim moždanim uda-rom procenjivano je samo na osnovu ukupne koncentracije svih proizvoda uznapredovale oksidacije proteina (engl. Advanced oxidation protein products, AOPP) ili tzv. indeksa oksidovanog albumina (16). Interesantno je da u literaturi ne-ma podataka o oksidativnom oštećenju bočnih grupa amino-kiselina, koje se može pokazati prisustvom povećanih nivoa reaktivnih karbonilnih grupa (19) ili smanjenoj koncentraciji-proteinskih tiol grupa (P-SH) u plazmi, koje se smatraju „žr-tvenim“ antioksidansima jer zaustavljaju lančane reakcije slo-bodnih radikala i (20).

Zbog toga je cilj ovog istraživanja bio da se proceni stepen oksidativnog oštećenja proteina i lipida, određivanjem sadržaja karbonilnih grupa proteina i koncentracije protein-skih tiol grupa, kao i koncentracije urinarnih izoprostana kod bolesnika sa akutnim moždanim udarom kod kojih je prime-njena trombolitička terapija.

Mater ija l i metodeIspitanici

Istraživanjem je obuhvaćeno 37 bolesnika koji su zbog akutnog moždanog udara primljeni na odeljenje Urgentne ne-urologije Kliničkog centra Srbije i kod kojih je primenjena trombolitička terapija. Kontrolnu grupu činilo je 40 zdravih osoba, uparenih po polu i starosti. Prosečno starosnо doba bo-lesnika sa akutnim moždanim udarom koji su bili uključeni u studiju iznosilо je 44,43 ± 13,46 godina, dok je u kontrolnoj grupi iznosilо 45,20 ± 11,62 godine. Populaciju bolesnika či-nilo je 16 žena (43%) i 21 muškarac (57%), dok je u kontrolnoj grupi bilo 18 žena (45%) i 22 muškaraca (55%). Bolesnici su intravenski primili trombolitičku terapiju, tkivni aktivator plazminogena (t-PA) u standardnoj dozi od 0,9 mg/kg (10% bolus; 90% u infuziji u trajanju od 1h) unutar 3 sata od pojave simptoma, prema preporuci Nacionalnog instituta za neurolo-ška oboljenja i moždani udar (21). Kriterijumi za isključenje iz ispitivanja bili su postojanje intracerebralne hemoragije ili elementi sistemskog krvarenja, upotreba antiokoagulatne te-rapije (sa INR-om većim od 2), kao i prisustvo bolesti koje mogu uticati na stepen oksidativnog stresa (šećerna bolest, arterijska hipertenzija i maligna obolenja). Istraživanje je pla-nirano u skladu sa etičkim standardima datim u Helsinškoj deklaraciji (prema revidiranoj verziji iz 1983. godine) i u skla-du sa pravilima Etičkog odbora Medicinskog fakulteta u Beogradu.

Priprema plazme i urinaU epruvete sa heparinom uzimano je za analizu pet ml

periferne krvi (u kojima nije bilo elemenata u tragovima) pre primene trombolitičke terapije (inicijalno ili nulto vreme), kao i 24, 48 i 72 časa od primene t-PA. Plazma je odvojena centri-fugiranjem na 3000 obr/min u trajanju od 15 minuta u centri-fugi sa hlađenjem (+4ºС), a zatim čuvana na -80ºС do izvođe-nja biohemijskih analiza.

Uzorci urina u zapremini od 20ml prikupljeni su pre primene trombolitičke terapije, kao i 24, 48 i 72 časa od pri-mene t-PA. Uzorci su centrifugirani na 3000 obr/min u traja-nju od 15 minuta u centrifugi sa hlađenjem (+4ºС), alikvotira-ni i čuvani na -80ºС. Butilirani hidroksitoluen (10µl alkohol-nog rastvora po 1ml plazme) je dodavan u uzorke da bi se sprečila oksidacija u toku obrade uzoraka.

Određivanje koncentracije proteinskih tiol grupaProteinske tiol grupe u plazmi bolesnika sa moždanim

udarom su, zbog nestabilnosti, određivane neposredno po odvajanju plazme iz uzoraka periferne krvi. Koncentracija proteinskih tiol grupa u plazmi određivana je spektrofotome-trijski, upotrebom Ellman-ovog reagensa (DTNB), prema me-todi Jocelyn-a (22). Ukratko, proteinske tiol grupe (P-SH) re-dukuju DNTB stvarajući žuto obojen anjon 5-tio 2-nitroben-zoeve kiseline (TNB). Molarni apsorpcioni koeficijent TNB

88



anjona na talasnoj dužini od 412nm iznosi 13,6 x 103 L mol -1 cm-1. Koncentracija proteinskih tiol grupa izražena je u μmo-l/g proteina. Koncentracija proteina određivana je po metodi Lowry-ja i saradnika (23).

Određivanje količine karbonilnih grupa proteinaNivo proteinske oksidacije praćen je određivanjem ak-

tivnosti 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNHP). Sadržaj karbonil-nih grupa u proteinima plazme određivan je spektrofotome-trijski, korišćenjem metode Levin-e i saradnika (24). Ukratko, proteini, prethodno istaloženi uz pomoć trihlorsirćetne kiseli-ne, resuspendovani su i inkubirani u rastvoru 10mmol/l DNHP na 37ºC tokom 50min. Sadržaj je potom centrifugiran na 3000obrt/min u trajanju od 15 min. Ponovljenim pranjem, iz precipitata uklonjen je višak DNPH, a proteinski precipitat je zatim rastvoren u 1ml 8M uree na +4ºC tokom šest sati. Molarni apsorpcioni koeficijent nastalih DNPH reaktivnih karbonilnih derivata u precipitatu na talasnoj dužini od 370nm iznosi 22 x 103 L mol -1 cm-1. Količina karbonilnih grupa je izražena u μmol/g proteina.

Određivanje koncentracije urinarnih izoprostanaMetoda se zasniva na određivanju koncentracije 8-epi

-PGF2α-III u urinu kompetitivnom ELISA metodom (engl. Enzyme-linked immunoabsorbent assay) (OxisResearch, BIOXYTECH). Ukratko, bunarčići na ploči obloženi su anti-telom koje je specifično za 8-epi-PGF2α-III. Postoji kompeti-cija izmedju 8-epi-PGF2α-III u uzorcima/standardima i 8-epi-PGF2α-III konjugovanim sa peroksidazom za vezivanje za antitelo. Nakon dodavanja supstrata, peroksidazna aktivnost dovodi do razvijanja boje čiji je intenzitet obrnuto proporcio-nalan količini 8-epi-PGF2α-III u standardima i uzorcima. Koncencentracija 8-epi-PGF2α-III izražavana je u ng/mg kre-atinina. Za određivanje kreatinina u urinu korišćena je Jaffe-ova metoda (25).

Statistička analizaStatistička analiza dobijenih rezultata urađena je kori-

šćenjem kompjuterskih programa Microcal Origin 5,0 i SPSS 10,0. Za svaku varijablu, vrednosti su predstavljene kao medi-jana i interval poverenja. Razlika između ispitivanih grupa testirana je primenom neparametarskog testa Mann-Whitney. Kao granica statističke značajnosti uzeto je p< 0,05.

Rezultat iPokazatelji oksidativnog oštećenja proteina

U cilju procene stepena oksidativnog oštećenja protei-na kod bolesnika sa akutnim moždanim udarom određivana je koncentracija tiol (P-SH) i sadržaj karbonilnih grupa prote-ina u plazmi ovih bolesnika po prijemu u bolnicu, 24h, 48h i 72h nakon primenjene trombolitičke terapije.

Iz rezultata prikazanih u Tabeli 1 vidi se da kod bole-snika sa akutnim moždnim udarom pre primenjene terapije postoji povećano oksidativno oštećenje proteina, na osnovu sniženih koncentracija tiol grupa i značajno povećanog sadr-žaja karbonilnih grupa u poređenju sa zdravom kontrolnom grupom ispitanika (p=0,001). Sličan stepen oksidativnog oštećenja proteina uočava se i 24h nakon primenjene trombo-litičke terapije.

Nakon 48h, dolazi do postepenog porasta u koncentra-ciji P-SH, pri čemu vrednosti i dalje ostaju statistički značajno manje u odnosu na kontrolne vrednosti (p=0,042). Koncentracija P-SH izmerena 72h nakon intravenske primene t-PA nije bila statistički značajna u odnosu na kontrolnu grupu (p> 0,05) (Tabela 1, Grafikon 1). Iako je sadržaj karbonilnih grupa proteina 48h i 72h nakon primenjene trombolitičke te-rapije bio za oko 30% veći od vrednosti izmerenih u kontrol-noj grupi, uočena razlika nije pokazala statističku značajnost (Grafikon 2).

Tabela 1.Pokazatelji oksidativnog oštećenja proteina i lipida kod bolesnika sa akutnim moždanim udarom

Zdrave osobe (n=40)

Bolesnici sa akutnim moždanim udarom (n=37)Inicijalno vreme 24h 48h 72h

P-SH/P (μmol/g prot) 7,07a 5,01 4,54 5,33 5,86(6,51–7,47) (3,82–5,13) (4,25–5,31) (4,83–6,56) (5,19–6,78)

% 100 70,8 64,2 75,4 82,9p 0,001 0,001 0,042 0,132Karbonilne grupe (μmol/g prot) 0,505 0,846 0,719 0,648 0,651

(0,44–0,57) (0,76–1,12) (0,61–0,91) (0,500–0,676) (0,550–0,730)% 100 167 142 128 129P 0,001 0,002 0,089 0,0788-Epi-PGF2α (ng/mg kreatinina) 0,60 1,91 1,39 1,64 0,93

(0,55–0,66) (1,51–2,78) (1,08–2,24) (1,27–2,39) (0,71–1,18)% 100 318 232 273 155P 0,001 0,001 0,001 0,008

a – vrednosti su izražene kao medijana i interval poverenja (95% IP); P-SH/P – proteinske tiol grupe; 8-epi-PGF2alfa – urinar-ni izoprostani; 0h – inicijalno vreme, pre primenjene trombolitičke terapije; 24h – 24 časa od primenjene trombolitičke terapije; 48h – 48 časova od primenjene trombolitičke terapije; 72h – 72 časa od primenjene trombolitičke terapije; %–procenat promene u odnosu na vrednosti u kontrolnoj grupi; p– statistička značajnost razlike u odnosu na vrednosti u kontrolnoj grupi

89



Grafikon 1.Koncentracija proteinskih tiol grupa u plazmi bo-lesnika sa akutnim moždanim udarom. Donja i gornja crta predstavljaju najnižu i najvišu vrednost, donja linija boksa predstavlja prvi kvartil (Q1), gornja linija boksa predstavlja treći kvartil (Q3), linija u samom boksu predstavlja medijanu. P-SH/P – proteinske tiol grupe; 0h – inicijalno vreme, pre pri-menjene trombolitičke terapije; 24h – 24 časa od primenjene trombolitičke terapije; 48h – 48 časova od primenjene trom-bolitičke terapije; 72h – 72 časa od primenjene trombolitičke terapije; ***–visoko statistički značajna razlika u odnosu na grupu kontrola; **–statistički značajna razlika u odnosu na grupu kontrola

Grafikon 2. Sadržaj karbonilnih grupa proteina u plazmi bo-lesnika sa akutnim moždanim udarom/ Donja i gornja crta predstavljaju najnižu i najvišu vrednost, donja linija boksa predstavlja prvi kvartil (Q1), gornja linija boksa predstavlja treći kvartil (Q3), linija u samom boksu predstavlja medijanu. 0h – inicijalno vreme, pre primenjene trombolitičke terapije; 24h – 24 časa od primenjene trombolitičke terapije; 48h – 48 časova od primenjene trombolitičke terapije; 72h – 72 časa od primenjene trombolitičke terapije; ***–visoko statistički značajna razlika u odnosu na grupu kontrola; **–statistički značajna razlika u odnosu na grupu kontrola

Pokazatelji oksidativnog oštećenja lipidaOksidativno oštećenje lipida, kod bolesnika sa akut-

nim moždanim udarom, praćeno je određivanjem koncentra-cije urinarnih izoprostana (8-Epi-PGF2α) u istim vremenskim intervalima. Iz rezultata prikazanih na Tabeli 1 i Grafikonu 3 vidi se da je koncentracija urinarnih izoprostana kod bolesni-ka sa akutnim moždanim udarom statistički značajno poveća-na u odnosu na grupu zdravih osoba (p=0,001), kako pre, tako i 24h i 48h nakon primene trombolitičke terapije (Grafikon 3). Značajno smanjenje koncentracije 8-Epi-PGF2α može se vi-deti tek nakon 72h od intravenske primene t-PA, mada su ove vrednosti i dalje značajno veće u odnosu na vrednosti izmere-ne u grupi kontrola (p=0,008). Rezultati koji ukazuju na 1,5–3 puta veće vrednosti urinarnih izoprostana kod bolesnika sa akutnim moždanim udarom u odnosu na kontrolnu grupu, ukazuju na visok stepen oksidativnog oštećenja lipida kod ovih bolesnika.

Grafikon 3. Koncentracija urinarnih izoprostana kod bo-lesnika sa akutnim moždanim udarom. Donja i gornja crta predstavljaju najnižu i najvišu vrednost, donja linija boksa predstavlja prvi kvartil (Q1), gornja linija boksa predstavlja treći kvartil (Q3), linija u samom boksu predstavlja medija-nu. 8-epi-PGF2alfa – urinarni izoprostani; 0h – inicijalno vreme, pre primenjene trombolitičke terapije; 24h – 24 časa od primenjene trombolitičke terapije; 48h – 48 časova od pri-menjene trombolitičke terapije; 72h – 72 časa od primenjene trombolitičke terapije; ***–visoko statistički značajna razlika u odnosu na grupu kontrola; **–statistički značajna razlika u odnosu na grupu kontrola

DiskusijaRezultati ovog istraživanja pokazali su da kod bolesni-

ka sa akutnim moždanim udarom nakon primene trombolitič-ke terapije dolazi do povećanog oksidativnog oštećenja prote-ina, na osnovu povećanog sadržaja karbonilnih grupa protei-na plazme i smanjene koncentracije proteinskih tiol grupa. Pored toga, pokazano je da su oksidativne modifikacije prote-ina, kod ovih bolesnika, praćene značajnim povećanjem uri-narne ekskrecije izoprostana, koji ukazuju na povećano oksi-dativno oštećenje molekula lipida.

Kao što je već pomenuto, oksidativni stres i pojačano stvaranje kiseoničnih slobodnih radikala uključeni su u veliki

90



broj neuroloških bolesti, uključujući i akutni moždani udar (4). Dosadašnji rezultati, dobijeni na eksperimentalnim živo-tinjama, pokazali su da kiseonični slobodni radikali koji se stvaraju u toku ishemije/reperfuzije mogu dovesti do oksida-tivnog oštećenja lipida, što je potvrđeno povećanom koncen-tracijom MDA (10). Međutim, nema jasnih podataka o posto-janju reperfuzionog oštećenja kod bolesnika sa moždanim udarom. Postojanje reperfuzionog oštećenja kod ovih bolesni-ka se ne negira, ali su rezultati dosadašnjih malobrojnih istra-živanja kontradiktorni. Naime, nekoliko studija je pokazao povećanje koncentracije pokazatelja procesa lipidne peroksi-dacije, kao što su malondialdehid, reaktanti sa tiobarbiturnom kiselinom ili lipidni hidroperoksidi kod bolesnika sa možda-nim udarom (26, 27). Sa druge strane, postoje i rezultati koji ukazuju na smanjeno prisustvo pokazatelja oksidativnog ošte-ćenja i aktivnost antioksidantnih enzima nakon moždanog udara (27, 28).

U ovom istraživanju je, po prvi put, pokazano poveća-nje sadržaja karbonilnih grupa proteina kod bolesnika sa mo-ždanim udarom nakon primene trombolitičke terapije. Pored toga, pokazano je i da je koncentracija proteinskih tiol grupa, koje su značajne zbog svoje antioksidantne uloge koju ostva-ruju zaustavljanjem lančanih reakcija slobodnih radikala (20), smanjena kod ovih bolesnika. Naši rezultati su u saglasnosti sa rezultatima Fukuyama i sar. (29), koji su na eksperimental-nom modelu ishemijskog/reperfuzionog oštećenja kod pacova pokazali povećanu koncentraciju nitrotirozina, pokazatelja nitrozativnog oštećenja proteina, u samoj zoni ishemije, sa dodatnim povećanjem u toku reperfuzije. Sa druge strane, re-zultati Domingueza i sar. (16) nisu pokazali vezu između ukupne koncentracije svih proizvoda uznapredovale oksidaci-je proteina i reperfuzionog oštećenja kod bolesnika sa možda-nim udarom.

Nezavisno od oksidativnog oštećenja proteina, perok-sidacija lipida jedna je od biološki najznačajnijih posledica povećane aktivnosti slobodnih radikala (30). Ako mu se ne suprotstavi efikasan lokalni antioksidantni sistem odbrane, peroksidativno oštećenje fosfolipida može dovesti do ozbilj-nog oštećenja ćelija. Visok stepen oksidativnog metabolizma, udružen sa slabom antioksidantnom odbranom i velikom ko-ličinom višestruko nezasićenih masnih kiselina, čini mozak izrazito osetljivim na dejstvo slobodnih radikala (18). Rezultati ovog istraživanja o povećanoj koncentraciji urinar-nih izoprostana kod bolesnika sa moždanim udarom, pre i nakon primene trombolitičke terapije, jasno ukazuju na visok stepen oksidativnog oštećenja lipida kod ovih bolesnika. U skladu sa našim rezultatima su i rezultati Domingeza i sar. (16) koji su pokazali povećanu koncentraciju MDA kod bole-snika sa moždanim udarom 24h nakon primene trombolitičke terapije. Pored rezultata o povećanoj koncentraciji MDA, po-stoje i rezultati o povećanoj koncentraciji reaktanta sa tiobar-biturnom kiselinom i lipidnih hidroperoksida kod bolesnika sa moždanim udarom (26, 27), mada se interpretacija ovih rezultata mora uzeti sa rezervom zbog ograničene primene pomenutih markera u in vivo uslovima.

Na osnovu rezultata dobijenih u ovom istraživanju mo-žemo zaključiti da postoje dokazi koji govore u prilog pretpo-stavci da u toku ishemije/reperfuzije tokom akutnog možda-nog udara dolazi do oksidativnog oštećenja proteina i lipida.

Ono što dalje treba da se razjasni jeste da li bi primena antiok-sidantne terapije kod ovih bolesnika imala uspeha i da li se pokazatelji oksidativnog stresa mogu koristiti u predviđanju kliničkog ishoda kod ovih bolesnika. Međutim, da bi smo od-govorili na ova pitanja, neophodno sprovođenje studija anti-oksidantnе intervencije, kao i izvođenje sistematičnih studija koje bi analizirale različite komponente antioksidantnih siste-ma zaštite, zajedno sa pokazateljima oksidativnog oštećenja proteina i lipida na značajno većem broju ispitanika.

Literatura1. Sies H. Oxidative stress: from basic research to clinical

application. American Journal of Medicine 1991; 91:31–38.

2. Halliwell B, Whiteman M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean? Br J Pharmacol 2004;142:231–255.

3. Halliwell B. Free radicals, antioxidants, and human dis-ease: curiosity, cause, or consequence? Lancet 1994; 344:721–724.

4. Beal MF. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases. BiochimBiophysActa 1998; 1366: 211–223.

5. Free radicals, other reactive species and disease. In Free Radicals in Biology and Medicine, Eds. Halliwell B and Gutteridge JMC, Oxford University Press, 2007, pp 617–783.

6. Ercegovac M, Jovic N, Simic T, Beslac-Bumbasirevic Lj, Sokic D, Djukic T, Savic-Radojevic A, Matic M, Mimic-Oka J, Pljesa-Ercegovac M. Byproducts of protein, lipid and DNA oxidative damage and antioxidant enzyme ac-tivities in seizure. Seizure, 2010; 19:205–210.

7. Caplan LR, Hon FK. Clinical diagnosis of patients with cerebrovascular disease. Prim Care 2004; 31:95–109.

8. C.L. Allen and U. Bayraktutan. Oxidative stress and its role in the pathogenesis of ischaemic stroke. World Stroke Organization International Journal of Stroke 2009;4: 461–470.

9. Schaller B, Graf R. Cerebral ischemia and reperfusion: the pathophysiologic concept as a basis for clinical therapy. J Cereb Blood Flow Metab 2004;24:351–371.

10. Yamato M, Egashira T, Utsumi H. Application of in vivo ESR spectroscopy to measurement of cerebrovascular ROS generation in stroke. Free RadicBiol Med. 2003;35:1619–1631.

11. Warash S. Latour LL. Evidence of reperfusion injury, ex-acerbated by thrombolytic therapy, in human focal isch-emia using a novel imaging biomarker of early blood-brain barrier disruption. Stoke 2004;35:2659–2661.

12. Kidwell CS, Latour L, Saver JL, Alger JR, Strakman S, Duckwiler G, Jahan R, Vinuela F, Kang DW, Warach S. Trombolytictoxicity:blood-brain barrier disruption in hu-man ischemic stroke. Cerebrovascular Dis 2008;25:338–343.

13. Cano CP, Bermudez VP, Atencio HE, Medina MT, Anilsa A, Souki A, Molina OM, Restrepo H, Vargas ME, Nunez M, Ambard M, Toledo A, Contreras F, Velasco M. Increased serum malondialdehyde and decreased nitric

91



oxide whithin 24 hours of thrombotic stroke onset. Am J Ther 2003;10:473–476.

14. Demirkaya S, Topcuoglu MA, Aydin A, Ulas UH, Isimer AI, Vural O. Malondialdehyde, glutathione peroxidase and superoxide dismutase in peripheral blood erythro-cytes of patients with acute cerebral ischemia. Eur J Neurol 2001;8:43–51.

15. Polidori MC, Cherubini A, Stahl W, Senin H, Sies H, Mecocci P. Plasma carotenoid and malondialdehyde levels in ischemic stroke patients: relationship to early outcome. Free Radic Res 2002;36:265–268.

16. Dominguez C, Delgado P, Vilches A, Martin-Gallan P, Ribo M, Santamarina E at all. Oxidative stress After Thrombolysis-Induced Reperfusion in Human Stroke. Stroke 2010; 41:653–660.

17. Sakano N, Takahashi N, Wang DH, Sauriasari R, Takemoto K, Kanbara S, Sato Y, Takogawa T, Takaki J and Ogino K. Plasma 3-nitrotyrosine, urinary 8-isopros-tane and 8-OHdG among healthy Japanese people. Free Radical Research 2009; 43:183–192.

18. Linseman AD. Targeting oxidative stress for neuroprotec-tion. Antioxidants and Redox Signaling 2009; 11:421–423.

19. Patsoukis N, Zervoudakis G, Georgiou CD, Angelatou F, Matsokis NA and Panagopoulos NT. Thiol redox state and lipid and protein oxidation in the mouse striatum after pentylenetetrazol-induced epileptic seizure. Epilepsia 2005; 46:1205–1211.

20. Davies KJA. Protein damage and degradation by oxigen free radicals. II Modification of amino acids. The Journal of Biological Chemistry 1987; 262:9902–9907.

21. National Institute of Neurological Disorders and Stroke rt-PA Stroke Study Group. Tissue plasminogen activator for acute ischemic stroke. N Engl J Med 1995; 333:1581–1587.

22. Jocelyn PC. Spectrophotometric assay of thiols. Methods in Enzymology 1987; 143:44–67.

23. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall TD. Protein measurement with the Folin phenol reagent. The Journal of Biological Chemistry 1951; 193:265–275.

24. Levine RL, Wiliams JA, Stadtman ER, Shacter E. Carbonyl assays for determination of oxidatively modified proteins. Methods in Enyzmology 1994; 233:346–357.

25. Husdan H and Rapoport A. Estimation of Creatinine by the Jaffe Reaction: A Comparison of Three Methods. Clinical Chemistry 1968; 14: 222–238.

26. Dringen R. Metabolism and function of glutathione in brain. Progress inNeurobiology 2000; 62: 649–671.

27. El Kossi MM, Zakhary MM. Oxidative stress in the con-text of acute cerebrovascular stroke. Stroke 2000;31:1889–1892.

28. Sharpe PC, Mulholland C, Tirnick T. Ascorbate and malo-ndialdehyde in stroke patients. Ir J Med. Sc. 1994;163:487–491.

29. Fukuyama N, Takizawa S, Ushida H, Hoshiai K, Shinohara Y, Nakazawa H. Peroxynitrite formation in focal cerebral ischemia-reperfusion in rats occurs predominantly in the peri-infarct region. J. Cereb Blood Flow Metab 1998;18:125–129.

30. Finkel T, Holbrook NJ. Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing. Nature 2000; 408:239–247.

92



SažetakUvod: Broj bolesnika na hroničnoj hemodijalizi

koji zahtevaju hirurške procedure na otvorenom srcu u značajnom je porastu proteklih godina. Prevalencija sr-čanih bolesti u ovoj populaciji veća je nego u opštoj po-pulaciji. Terminalna bubrežna insuficijencija je znača-jan faktor rizika za kardiohirurške intervencije izvođene uz asistenciju vantelesnog krvotoka.

Cilj rada: je da se prikažu perioperativni morbi-ditet i mortalitet bolesnika na hroničnom programu he-modijalize koji su podvrgnuti kardiohirurškim interven-cijama

Materijal i metode: Retrospektivnom analizom obuhvaćeni su bolesnici na hroničnom programu hemo-dijalize koji su podvrgnuti kardiohirurškim operacijama u periodu od 2009–2012 godine u Institutu za kardiova-skularne bolesti “Dedinje”. Praćene su preoperativne karakteristike bolesnika, intraoperativni parametri i postoperativne komplikacije.

Rezultati: Prosečna starost naše serije bolesnika je 61.7godina (između 33–77god.). Period preoperativ-nog lečenja na hemodijalizi prosečno je trajao 51 mesec (3–180 meseci). Kod 4 bolesnika (16.6%) izvedena je val-vularna hirurgija, kod 10 bolesnika (41.6%) aortokoro-narna bajpas hirurgija i kod 8 bolesnika (29.1%) kombi-novana koronarna revaskularizacija i valvularna hirur-gija. Kod 18 bolesnika (73%) zabeležena je bar jedna kardiološka komplikacija. Stanje niskog minutnog volu-mena i cirkulatorne insuficijencije zabeleženi su kod 14 bolesnika (58%) .

Zaključak: Perioperativni rizici povećanog mor-taliteta i morbiditeta bolesnika na hroničnoj hemodijali-zi veći je nego kod ostalih kardiohirurških bolesnika, ali nije zabranjujući, i dobri kandidati za kardiohiruške procedure mogu biti uspešno izabrani.

Ključne reči: hirurgija srca, hronična bubrežna insufi-cijencija, hemodijaliza.

AbstractIntroduction: The number of patients on chronic

hemodialysis who underwent open heart surgery has

been significantly increasing in recent years. The preva-lence of heart disease in this population is higher than in the general population. Terminal renal failure is a sig-nificant risk factor for heart surgery procedures per-formed on extracorporeal circulation.

Aim The Aim of the study was to present the peri-operative morbidity and mortality in patients on chroni-cal hemodialysis who underwent open heart surgery.

Material and metodes: The retrospective analysis of case histories of patients on chronic hemodialysis in-cluded those who underwent cardiac surgery in the pe-riod 2009–2012 years at the Institute for Cardiovascular Diseases Dedinje. We assessed the preoperative patient characteristics, intraoperative parameters and postop-erative complications.

Results: The mean age was 61.7 years (between 33–77 years). The average duration of hemodialysis was 51 months (3–180 months). Valve surgery was performed in four (16.6%), 11 patients (45.8%) underwent coronary artery bypass surgery while 8 patients (29.1%) had com-bined coronary and valve surgery. 18 patients (73%) had at least one cardiac complication. Low cardiac output and circulatory failure were registered in 14 patients (58%).

Conclusion: Perioperative mortality and morbid-ity in patients on chronic hemodialysis is higher than in cardiac surgery patients. Hemodialysis is not limiting and good candidates for heart surgery procedure can be successfully elected.

Key words: heart surgery, chronic kidney disease, he-modialysis.

UvodBroj bolesnika na hroničnoj hemodijalizi kojima je po-

trebna hirurška procedura na otvorenom srcu značajno je po-rastao proteklih godina. Prevalenca srčanih bolesti u ovoj po-pulaciji veća je nego u opštoj populaciji. Uzrok smrti kod više od polovine bolesnika u terminalnoj bubrežnoj insuficijenciji je koronarna bolest. Većina (90%) bolesnika prelazi u termi-nalnu fazu bubrežne bolesti kao posledica hronične bubrežne insuficijencuje (HBI).

PROCENA PERIOPERATIVNOG MORBIDITETA I MORTALITETA KARDIOHIRURŠKIH BOLESNIKA NA HRONIČNOM PROGRAMU

HEMODIJALIZE

Autor: Milan Milojević1

Mentor: Prof. dr Miomir Jović2

1 Medicinki fakultet, Univerzitet u Beogradu2 Institut za kardiovaskularne bolesti Dedinje, Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu

93



Terminalna bubrežna bolest (TBI) predstavlja stanje u kome postoji nepovratni gubitak endogene funkcije bubrega, do te mere da bolesnik postaje trajno zavistan od primene ve-štačkog bubrega (dijaliza) ili transplantacije da bi se izbegao nastanka uremije koja ugrožava život bolesnika. Uremija je klinički i labaratorijski sindrom koji utiče na disfunkciju svih organskih sistema kao posledica nelečene ili nedovoljno leče-ne akutne ili hronične bubrežne insuficijencije. Terapija he-modijalizom je u proteklih 50 godina produžila živote milio-nima ljudi sa TBI. Hemodijaliza je terapijski postupak ukla-njanja viška vode i produkata metabolizma, difuzijom koja se odvija u oba pravca-bidirekciono kroz semipermeabilnu membranu.

Kardiovaskularni i respiratorni sistem varijabilno od-govaraju na terapiju hemodijalizom. Popravljaju se arterijska hipertenzija, kongestivna srčana insuficijencija ili edem plu-ća, uremijska pluća, perikarditis, perzistiraju kardiomiopatije, ali nakon započinjanja lečenja hemodijalizom kod većine bo-lesnika obično dolazi do pojave ili pak značajnog pogoršanja arterioskleroze, hipotenzije, aritmija i kalcifikacija krvnih sudova (1). Kongestivna srčana insuficijencija udružena sa is-hemijskom koronarnom bolešću, teške kalcifikacije i promene na srčanim zalistcima, hipertrofija i disfunkcija leve komore, često su udružene sa terminalnom bubrežnom insuficijenci-jom (TBI) (1. 2) i značajno povećavaju rizik mortaliteta i mor-biditeta kod kardiohirurških procedura (3. 4).

Učinjeni su mnogi napori da se poboljša životni vek bolesnika, ali je hronična hemodijaliza ostala veoma važan nezavisni prediktivni faktor rizika mortaliteta i morbiditeta ovih bolesnika. Kandidati za hirurgiju srca moraju se birati veoma pažljivo, jer je ova vrsta hirurgije jedino opravdana u slučaju značajnog produženja i unapređenja kvaliteta života ovih bolesnika. Za vreme operacija na otvorenom srcu proble-mi ovih bolesnika dodatno su komplikovani korišćenjem van-telesnog krvotoka (balans vode i elektrolita, hemodilucija i poremećaji koagulacije) i zahtevaju optimalan pristup u cilju smanjenja perioperativnog rizika. Većina publikovanih studi-ja izveštava o značaju preoperativnog kliničkog statusa na perioperativni mortalitet i morbiditet ove kategorije bolesni-ka, ali se malo zna o prediktivnim faktorima dugogodišnjeg preživljavanja (1.3.4).

Cilj našeg ispitivanja je da se prikaže perioperativni morbiditet i mortalitet kardiohirurških bolesnika na progra-mu hronične hemodijalize.

Mater ija l i i metodeSprovedena je retrospektivna analiza istorija bolesti

bolesnika na hroničnom programu hemodijalize koji su pod-vrgnuti kardiohirurškim operacijama u periodu od 2009–2012 godine na Institutu za kardiovaskularne bolesti Dedinje. Uobičajni kriterijumi za početak lečenja dijalizom uključuju: uremijski sindrom, refraktornu acidozu i hiperkalijemiju, he-moragijsku dijatezu i klirens kreatinina manji od 10 ml/min na 1.73m².

Preoperativno svi bolesnici su podvrgnuti hemodijali-zi dan pre operacije i prvi postoperativni dan nakon hemodi-namske stabilizacije. Bolesnici su kao antibiotsku profilaksu preoperativno dobijali i.v cefuroksim i vankomicin po proto-kolu 45 minuta pre početka hiruškog reza, nakon čega su pra-

ćeni nivoi vankomicina u plazmi u postoperativnom toku. Hitne operacije definisane su kao one van rasporeda urađene u toku 24h od konzilijarne odluke. Svi bolesnici su dobijali premedikaciju morphina (0.1mg/kg/tt) i midazolama 5mg in-tramuskularno 45 minuta pre početka operacije. Za uvod u opštu endotrahealnu anesteziju korišćeni su midazolam (0.05–0.1mg/kg), etomidat i fentanil. Neuromišićni blok je us-postavljen davanjem rokuronijuma (0.6–1.2mg/kg/tt). Anestezija je održavana fentanilom, sevofluranom, midazola-mom (ev.diazepamom) i rokuronijumom. Doza heparina data pre započinjanja vantelesnog krvotoka iznosila je 4mg/kg u cilju uspostavljanja ACT-a (Activated Clotting Time) preko 480sekundi. Operacije na srcu su rađene uz pomoc mašine za vantelesni krvotok u umerenoj hipotermiji i perfuzionom pri-tisku većem od ≥ 50mmHg. Kod svih bolesnika primenjena je intraoperativna hemofiltracija tokom vantelesne cirkulacije. Srce je zaustavljano hladnim rastvorima anterogradne krvne kardioplegije (sa 40mmol/l kalijuma). Intraoperativni i posto-perativni monitoring obuhvatio je: 5 odvodni EKG-sistem, sondu za merenje telesne temperature, transezofagealnu eho-kardiografiju, SpO2 (pulsna oksimetrija), diureza, kapnogra-fija, kontinuirano merenje arterijskog, centralnog venskog i plućnog arterijskog pritiska. Intermitentno je kod bolesnika primenom termodilucionog Swan-Ganz katetera meren PCWP (wedge pressure), CI (cardiac index), SV (stroke volu-me), SVR (sistemska vaskularna rezistenca), PVR (plućna va-skularna rezistenca), ScVO2 (saturacija mešane venske krvi) i ostali pokazatelji rada srčane pumpe (RAP, PAS, PAD, PAM, RVEF, RVEDV, RWSVI, LWSVI, CCO, SVV idr.) Intraoperativno je svim bolesnicima primenjena antifibrinoli-tička terapija (TXA), a kod njih 13 (53%) i agregaciona terapi-ja (dezmopresinom (DDAVP)) u dozi od 20µcg. Vršeno je kontinuirano praćenje ScVO2 i intermitentno praćenje laktata i glikemije.

Kriterijumi za postavljanje dijagnoze srčane insufici-jencije definisani su kao potreba da se bolesniku obezbedi inotropna potpora adrenalinom, dobutaminom ( >5 mg/kg/tt) i/ili visokim dozama dopamina dužem od 24h i vrednost srča-nog indeksa < 2.0/l/min/m2.

Postoperativni infarkt je definisan kao porast kardio-specifičnih enzima (troponinaI i CKMB) 5 i više puta u toku 72h nakon operacije (5). Poremećaji srčanog ritma se definišu kao novonastala aritimija po tipu atrijalne fibrilacije (sa posle-dičnom ventrikularnom aritmijom po tipu absolute) ili ventri-kularna tahikardija koji su konvertovani medikamentozno (5). Cerebrovaskularni događaji su definisani kao izolovani neu-rološki deficit duži od 24h nakon operacije kliničkim pregle-dom i CT-om endokranijuma. Krvarenje je definisano kao potreba za revizijom hemostaze usled povećane drenaže ili tamponade srca. Respiratorna insuficijencija je definisana kao zahtev za mehaničkom ventilacijom dužom od 24h. Septični atak je dijagnostikovan na osnovu kriterijumima sepse (broj leukocita, telesna temperatura, broj respiracija, vrednost me-dijatora zapaljenja c-reaktivnog proteina (CRP), fibrinogena , prokalcitonina (PCT) i izolacija mikroorganizama hemokul-turom). Bolnički mortalitet je definisan kao svaka smrt koja je nastupila za vreme hospitalizacije. Evropski sistem za proce-nu kardio operativnog rizika (EuroSCORE + logistic

94



EuroSCORE) korišćen je za svakog bolesnika kao prediktor perioperativnog mortaliteta (6).

Rezultat iStudijom je obuhvaćeno 24 bolesnika. Demografski

podaci su prikazani u tabeli 1. Glavni preoperativni podaci o bolesnicima su prikazani u tabeli 2.

Tabela 1. Demografske karakteristike i faktori rizika za na-stanak KVS oboljenja

Varijable Broj bolesnika Procenat (%)PolMuškiŽenski

177

70.829.2

Starost 61.5± 17.5

Hipertenzija 20 83.5

Dijabetes melitus 7 29.2

Istorija pušenja 18 75.0

Hiperholesterolemija 12 50

Gojaznost 16 66.7

Pozitivni hereditet za KVS 13 54.2

Tabela 2. Pre-operativne kliničke karakteristike bolesnika

Varijable Broj bolesnika Procenat (%)CVI 6 25.0PAVB 8 33.4GIT-ulkus 3 12.5Fibrilacija pretkomora 11 45.8Ranija srčana slabost 9 37.5Predhodna PTCA 6 25.0NYHA klasifikacija III 11 45.8NYHA klasifikacija IV 5 20.8LVEF (%) ± SD 37.4 ± 23.6LVEF < 35% 11 45.8Hitne operacije 10 41.6Srednji Euroscore 8.04 ± 5.6EuroScore > 9 8 33.4Logistic EuroSCORE (%) 12.4 ± 9.2LP > 40mm 16 66.7LK(EDD) > 55mm 9 37.5LK(ESD)> 32mm 18 75.0CVI–cerebrovaskularni insult, PAVB -periferna vaskularna arterijska bolest, PTCA–perkutana transluminalna koronarna angioplastika, NYHA klasifikacija Njujorškog društva kardi-ologa, LVEF–ejakciona frakcija leve komore, Logistic EuroSCORE–evropski sistem za procenu operativnog rizika u hirurgiji srca, LP leva pretkomora, LK (EDD) end-dijastol-na dimenzija leve komore, LK (ESD) end-sistolna dimenzija leve komore

Kod 4 bolesnika (16.6%) urađena je operacija jedne ili više valvula, kod 11 bolesnika (45.8%) aortokoronarna bajpas hirurgija (ACB) i kod 8 bolesnika (29.1%) kombinovana ACB i valvularna hirurgija. Kod 3 bolesnika (8.3%) pored kardio-

hiruške intervencije (koronarne revaskularizacije) simultano je urađena karotidna endarterektomija everzionom metodom (EAT ACI) , a jednom bolesniku (4.1%) kombinovan ACB i valvularna procedura zajedno sa EAT ACI. Kod svih bolesni-ka je korišćena unutrašnja grudna arterija (LIMA) koja je anastomozirana sa LAD arterijom. Ukupno je implantirano 11 mehaničkih valvula (8 u aortnoj i 3 mitralnoj poziciji ). Urađene su 4 rekonstrukcije mitralne valvule Karpantijerovim prstenom i dve rekonstrukcije trikuspidne valvule po tipu De Vega. Prosečno vreme trajanja vantelesnog krvotoka (VTK) je 105.4 min. (min.35 i max. 311minuta) , a prosečno trajanje ishemisjkog srčanog aresta 70.1 min. (min. 19 i max. 216mi-nuta). Operativni detalji prikazani su u tabeli 3.

Tabela 3. Operativne procedure i perioperativni mortalitet

Procedura Broj bolesnika

Broj umrlih bolesnika

Izolovan ACB 11 -AVR 2 1MVP 1 -AVR + ACB 3 -AVR + ACB + EAT ACI 1 1MVR + ACB 1 -MVP + ACB 1 -ACB + EAT ACI 1 1AVR + MVR + ACB 1 -MVR + TVP 1 -AVR + MVR + TVP + ACB 1 -ACB aortokoronarni bajpas, AVR zamena aortne valvule, MVR zamena mitralne valvule, MVP–rekonstrikcija mitral-ne valvule, TVP–rekonstrukcija trikuspidne valvule, EAT ACI–endarterektomija zajedničke i unutrašnje karotidne arte-rije

Bolnički mortalitet je iznosio 3 bolesnika (12.5%). Uzrok smrti kod 2 bolesnika bila je refraktorna srčana insufi-cijencija sa multiorganskom disfunkcijom, dok je kod 1 bole-snika uzrok smrti bio septični šok sa posledičnom multior-ganskom insuficijencijom i postoperativnim cerebrovaskular-nim insultom. Značajan podatak, a koji može da prikaže ste-pen oštećenja koronarnih krvnih sudova kod ove grupe bole-snika je taj da je ova grupa bolesnika imala prosečno konzili-jarno indikovano za hiruršku revaskularizaciju 3.25 ± 1.75 koronarnih krvnih sudova, ali je svakom bolesniku u proseku urađeno samo 2.24 ± 0.72 distalnih anastomoza zbog težine promena i tehničkih nemogućnosti hirurga da izvede koro-narnu revaskularizaciju. Kod 18 bolesnika (73%) javila se bar jedna komplikacija. Kod 14 bolesnika (58.5%) neposredno postoperativno zbog sindroma niskog minutnog volumena bi-la je neophodna primena kontinuirane inotropne terapije. Ni kod jednog bolesnika nije bilo potrebe za primenu kontrapul-zacione intraaortalne balon pumpe (IABP).

Postoperativni poremećaji ritma (aritmija po tipu atri-jalne fibrilacije i ventrikularne tahikardije) dijagnostikovane su kod 13 bolesnika (54.1%). Kod svih bolesnika primenjena je medikamentozna konverzija amjadaronom (po protokolu) u sinusni ritam.

95



Kod 4 bolesnika (16.6%) je dijagnostikovan CVI, od kojih je 1 bolesnik operisan simultanom metodom sa endarte-rektomiom karotidne arterije (EAT ACI).

Ni kod jednog bolesnika nije postojala infekcija rane, a kod 5 bolesnika (20.8%) je postavljena dijagnoza urinarne in-fekcije (sedimentom urina i urinokulturom) i preduzeto je le-čenje po antibiogramu. Septični atak imalo je 4 bolesnika (16.6%), od kojih je jedan umro od posledica septičnog šoka i multioganske disfunkcije.

Prosečno vreme trajanja mehaničke ventilacije iznosi-lo je 30.8h. Prosečna zapremina postoperativne drenaže izno-sila je 1287 ml. Svim bolesnicima je zbog postoperativnog laboratorijski dijagnostikovanog niskog gram-hemoglobina bila neophodna transfuzija eritrocita, a svaki bolesnik je u proseku dobio 466 ml. resuspendovanih eritrocita. Potrebu za za nadoknadom faktora koagulacije je imalo 4 bolesnika (16.6%) koji su u proseku dobili 787 ml. zamrznute sveže pla-zme, a takođe, kod 4 bolesnika (16.6%) je zbog povišene za-preminene drenaže bilo neophodno uraditi reviziju hemosta-ze. Prosečno vreme lečenja u jedinici intenizvnog lečenja je 5.7 dana, a prosečno vreme trajanja hospitalizacije je u prose-ku iznosilo 16 dana.

DiskusijaTerminalna bubrežna insuficijencija je dobro poznat

faktor rizika u operacijama revaskularizacije miokarda. Ova grupa bolesnika ima vrlo visok perioperativni mortalitet (11.4–14.3%) [7]. Isto tako, za ove bolesnike je značajan i pe-rioperativni morbiditet, gde više od 50% bolesnika ima neku od postoperativnih komplikacija. Najčešće opisane komplika-cije su: produžena mehanička ventilacija, septikemija, cere-brovaskularne komplikacije i srčane komplikacije (low cardi-ac output sindrom i aritmije). Dugoročna prognoza posle izvr-šene revaskularizacije miokarda kod bolesnika sa terminal-nom bubrežnom insuficijencijom je još uvek loša (1-godišnji mortalitet je 23–47.1%) (7). Iz tog razloga potrebna je vrlo pažljiva preoperativna evaluacija i procena potencijalnog po-boljšanja funkcionalnog statusa bolesnika, olakšavanje simp-toma bolesti i poboljšanje preživljavanja da bi se smanjio, ina-če vrlo visok, operativni mortalitet i morbiditet. Pušenje je faktor visokog rizika kod ovih bolesnika, a u operativnoj teh-nici korišćenje unutrašnje grudne arterije kao grafta za reva-skularizaciju miokarda direktno utiče na smanjenje bolničkog mortaliteta (8).

Nedavno je objavljeno nekoliko studija koje su se bavi-le temom hronične dijalize u kardiohirurgiji (prikazane su u tabeli 4).

Bolnički mortalitet je kod ovih bolesnika između 0 i 36.7% (1,2,9–23). Naša iskustva su u skladu sa publikacijama kardiohirurških centara širom sveta (1,16,23), kao i sa najve-ćom multicentričnom studijom do sada urađenom (21) (tabela 4) i mortalitet u ovoj analizi iznosi 12.5%. Najveći stepen mortaliteta imaju bolesnici sa: nestabilnom anginom pectoris, stenozom glavnog stabla leve koronarne arterije (left main stenozom) i simultanom karotidnom endarterektomijom. Sa usavršavanjem tehnike hirurgije srca, u praksu se sve više uvodi primena krvne retrogradne i anterogradne kardioplegi-je zbog dokazanih efekata na bolju protekciju miokarda za

vreme ishemijskog srčanog aresta i smanjenja postoperativ-nog sindroma niskog udarnog volumena (LOS) [24].

Tabela 4. Perioperativnog mortaliteta bolesnika na hroničnoj hemodijalizi podvrgnutih hiruškoj Intervenciji

Broj bolesnikaLiteratura ACB VH

ACB +

VHO.H.

Mortalitet

N %

Horst et al. [1] 33 23 9 - 9/65 13.8Luciani et al. [8] 18 6 - - 7/24 29.0Jault et al. [9] 57 37 18 12 21/124 16.9Miyahara et al. [10] 14 4 - 2 1/20 5.0

Gultekin et al. [11] - 29 2 - 1/29 3.4

Krabatsch et al. [12] 71 - - - 4/71 5.6

Ariyoshi et al. [13] 35 - - - 2/35 5.7

Toole et al.[2] - 50 - - 5/50 1.0Boku et al.[14] 30 18 - 6 6/54 1.1Tugtekin et al. [15] 73 - - - 3/73 4.2

Kato et al. [16] - 27 - - 3/27 11.1Milani et al. [17] 51 - - - 0/51 0Liu et al. [18] 44 - - - 3/44 6.8Kogan et al. [19] 77 15 23 - 21/115 18.3Horai et al. [20] ° 37 - - - 1/37 2.7Bechtel et al. [21] ° 326 89 103 - 60/522 12.0Filsoufi et al. [22] 22 40 28 49 51/1 36.7Rahmanian et al. [23] 97 76 39 33 31/245 12.7

ACB–aortokoronarni bajpas, VH–vaskularna hirurgija, OH – ostala hirurgija, °Multicentrična studija

Sindrom low cardiac output koji je zabelezen kod 14 bolesnika (58%) postoperativno može biti objašnjen sa više aspekata: ranijom srčanom slabošću (45.8%), preoperativnom pripadnošću bolesnika visoko rizičnim grupama (III i IV (66.7% bolesnik)) prema klasifikaciji New York Heart Association (NYHA) i produženim trajanjem ishemijskog sr-čanog aresta i vantelesnog krvotoka (VTK) usled složenosti samih hirurških procedura. Multicentrična studija je pokazala da su preoperativna pripadnost III i IV NYHA klasi i prolon-giran ishemijski srčani arest vodeći faktori visokog rizika bolničkog mortaliteta [18].

U našoj seriji, reoperacija zbog krvarenja učinjena je kod 4 bolesnika (16.6%) što se razlikuje sa podacima dosada-šnjih istraživanja koja se kreću od 3.7–9.4% (1,2,8–23). Poremećaj funkcije trombocita, defekt koagulacionog sistema prouzrokovan uremijom i mehanički stres krvnih ćelija tokom VTK i hemodijalize su značajni kofaktori koji doprinose post-operativnom krvarenju kod ove grupe bolesnika. Pažljiva he-mostaza sa perioperativnom upotrebom antifibrinolitika mo-že smanjiti na minimum ovu postoperativnu komplikaciju, uz kontrolu koagulacionog sistema (tromboelastografijom (Rotem test) i funkcijom trombocita) i samim tim pravovre-menom nadoknadom faktora koagulacije kroz primenu kon-centrovanih preparata (koncentrat protrombinskog komplek-sa), zamrznute sveže plazme, krioprecipitata, trombocita i

96



kod najtežih slučajeva primenom rekombinantnog faktora VII (rVII).

Sklonost ka infekciji je zajednička karakteristika za sve bolesnike zbog smanjene hemotakse, limfopenije, sma-njenog ćelijski-posredovanog imuniteta, redukcije funkcije monocita, kao i primene steroidne terapije u slučajevima auto-imunih TBI. U ovoj studiji primećen je značajan porast uri-narnih i sistemskih infekcija koje su dobro reagovale na pri-menjenu antibiotsku terapiju.

Postoje kontroverze u izboru odgovarajuće proteze sr-čanih zalistaka za ovu grupu bolesnika. Postoje studije o ubr-zanoj degeneraciji bioloških proteza valvula usled poremećaja u metabolizmu minerala (pre svih kalcijuma i fosfata), ali sa druge strane visok nivo tromboembolija i krvarenja, cerebro-vaslularnih akcidenata, kao i paravalvularnog popuštanja su vrlo značajne komplikacije opisane kod mehaničkih proteza valvula, tako da još uvek ne postoji jasna preporuku kada je u pitanju izvor valvularnih proteza kod bolesnika na hroničnoj hemodijalizi (2). Herzog et al. (25), koristeći USRDS bazu po-dataka, uporedili su 2-godišnje preživljavanje posle implanta-cija mehaničkih i bioloških proteza nakon ispitivanja ishoda kod 5,858 bolesnika na hroničnom programu hemodijalize. Utvrdili su slično 2-godišnje preživljavanje kod obe ispitivane grupe bolesnika, a čekaju se rezultati 5-godišnjeg preživljava-nja. Njihova studija ukazuje da je životni vek među obe grupe bolesnika izrazito loš i da izbor proteze nema značajnog efek-ta na dugogodišnje preživljavanje ovih bolesnika. Međutim, u našem slučaju svim bolesnicima je ugrađena proteza meha-ničkog srčanog zalistka, a cerebrovaskularni događaj je doku-mentovan kao uzrok smrti kod jednog bolesnika i potvrđeni su rezultati studije dobijeni kod grupe 11 (tabela 4). Nova ge-neracija bioloških proteza koja je u završnoj fazi ispitivanja, mogla bi biti ocenjena kao adekvatna opcija za ovu visoko rizičnu grupu bolesnika, zbog njihove usporene degeneracije i izbegavanja doživotnog uzimanja antikoagulantne terapije i visokih rizika koju ona sobom nosi. U slučaju kada se bolesni-ku ugradi biološki srčani zalistak, nakon kratkog perioda upotrebe oralnih antikoagulantnih lekova, profilaksa trombo-ze uspešno se prevenira upotrebom aspirina, kao što je i pri-kazano u studiji (26).

Dugogodišnje preživljavanje bolesnika na hroničnoj hemodijalizi koji su podvrgnuti hirurgiji srca značajno je smanjeno, pozivajući se na nedavno objavljene publikacije. Bechtel i sar. (21) su objavili da je 5-godišnje preživljavanje 42%. Rahmanian i sar. (23) su objavili rezultate jednogodi-šnjeg, trogodišnijeg i 5-godišnjeg preživljavanja: 72.3%, 53.3% odnosno 39%.

Naša serija bolesnika predstavlja iskustvo referentnog centra za ovu grupu bolesnika u Srbiji, ali je i dalje relativno mali broj bolesnika koji pripadaju ovoj grupi i kreće se na godišnjem nivou 8–12 bolesnika (~0.5%). Ovo je retrospek-tivna i observaciona studija i samim tim zaključci imaju ogra-ničeni značaj. Nemamo podatke o bolesnima na hroničnoj hemodijalizi a koji su kardiohiruški konzilijarno odbijeni zbog neprihvatljivog operativnog rizika, kao i o bolesnicima koji su odbili hirušku intervenciju.

Perioperativni rizik bolesnika na hroničnoj hemodija-lizi veći je nego kod ostalih kardiohirurških bolesnika, ali ni-pošto nije zabrinjavajući, i dobri kandidati za kardiohiruške

procedure mogu biti uspešno izabrani. Izolovana hirurgija revaskularizacije miokarda daje dobre rane i kasne rezultate. Svakako, ovoj grupi bolesnika potrebna je rigorozna postope-rativna kontrola, antiagregaciona terapija i terapija statinima, s obzirom na dobro poznatu i više puta dokazanu njihovu ulo-gu u smanjenju progresije arterioskleroze i hronične inflama-cije, a istovremeno su značajna podrška dugoročnijoj prohod-nosti i funkcionalnosti graftova (27). Bolesnici kojima su ugrađene proteze srčanih zalistaka treba češće da budu pod-vrgnuti kardiološkim i ehokardiografskim kontrolama radi blagovremenog uočavanja pretrpljenih promena na valvula-ma, graftovima i sprečavanja uvoda u srčanu dekompenzaci-ju. U ovoj postavci, neophodna je bliska saradnja nefrologa, kardiologa, anesteziologa i hirurga jer dobri rezultati lečenja mogu biti postignuti samo timskim radom i pravovremenim upućivanjem na operaciju.

Literatura1. Horst M, Mehlhorn U , Hoerstrup SP, Suedkamp M de

Vivie ER. Cardiac surgery in patients with end-stage renal disease:10-year experience. Ann Thorac Surg 2000; 69:96–101

2. Toole JM,Stroud MR Kratz JM Crumbley AJ Crawford FA Jr,Ikonomidis JS. Valve surgery in renal dialysis pa-tients. J Heart Valve Dis. 2006; 15:453–458.

3. Cooper WA, O’Brien SM, Thourani VH, Guyton RA, BridgesCR,Szczech LA, Peterson R, Peterson ED Impact of renal dysfunction on outcomes of coronary artery by-pass surgery. Results from the Society of Thoracic Surgeons national adult cardiac database. Circulation. 2006; 113:1063–1070.

4. Witczak B, Hartmann A, Svennevig JL. Multiple risk as-sessment of cardiovascular surgery in chronic renal failure patients. Ann Thorac Surg. 2005; 79:1297–130

5. Thygesen K, Alpert JS,Whitw HD, on behalf of the Joint ESC/ACCF/AHA/WHF Task Force for the Redefinition of Myocardial Infarction. Universal definition of myocardial infarction. Circulation. 2007; 116:2634–2653

6. Nashef SA, Roques F, Michel P,Gauducheau E, Lemeshow S , Salamon R European system for cardiac operative risk Evaluation (EuroSCORE). Eur J Cardiothorac Surg. 1999; 16:9–13

7. Nešković V, Milojević P, Dimković N. Kombinacija opšte anestezije i visoke epiduralne torakalne analgezije u re-vaskularizaciji miokarda na kucajućem srcu u bolesnika na hemodijalizi. ACI prikaz slučaja. 2003; 139–141

8. Kogan A, Medalion B, Kornowski R,Raanani E, Sharoni E, Stamler A, Sahar G, Snir E,Porat E. Cardiac surgery in patients on chronic hemodialysis: short and long-term sur-vival Thorac Cardiovasc Surg. 2008 56:123–127

9. Luciani N, Nasso G, D’Alessandro C, Testa F,Glieca F,Gaudino M, Possati G (2002) Gliinterventi cardiochirur-gici nei pazienti in dialisi cronica: risultati a breve e lungo termine. Ital Heart J Suppl 2002; 7: 746–752.

10. Jault F, Rama A, Bonnet N, Reagan M, Nectoux M, Petitclerc T, Pavie A, Gandjbakhch I Cardiac surgery in patients receiving long-term hemodialysis. Short- and long-term results. J Cardiovasc Surg. 2003: 44:725–730

97



11. Miyahara K, Maeda M, Sakurai H, Nakayama M,Murayama H,Hesagawa H. Cardiovascular surgery in patients on chronic dialysis: effect of intraoperative hemo-dialysis.Interact Cardiovasc Thorac Surg. 2004; 3:148–153

12. Gultekin B, Ozkan S, Uguz E, Atalay H, Akay T, Arslan A,Sezgin A, Ozdemir N, Tasdelen A, Aslamaci S Valve Replacemant surgery in patients with end-stage renal disease:Long-term results. Artif Organs. 2005; 29:972–975

13. Krabatsch T, Yeter R, Hetzer R. Coronary surgery in Patients requiring chronic hemodialysis.Kidney Blood Press Res 2005; 28:270–274

14. Ariyoshi T, Eishi K, Yamachika S, Hazama S, Takai H, Odate T,Matsukuma S. Peroperative and mid-term results of cor-onary bypass surgery in patients undergoing chron-ic dialysis. Ann Thorac Cardiovasc Surg. 2006; 12:257–264

15. Boku N, Masuda M, Eto M, Nishida T, Morita S, Tominaga R. Risk evaluation an midte outcome of cardiac surgery In patients on dialysis. Asian Cardiovaqs Thorac Ann 2007; 15:19–23

16. Tugtekin S, Kappert U, Jarny K, Knaut M, Cichon R, Alexiou K,Matschake K. Coronary surgery in dialysis-dependentpatients with end-stage renal failure with and without extractor-poreal circulation. Thorac Cardiovasc Surg 2007; 55:84–88

17. Kato W, Tajima K, Teresawa S, Tanaka K, Usui A, Ueda Y. Results of isolated valve replacement in hemodialysis Patients. Asian Cardiovasc Thorac Ann 2007; 15:386–391

18. Milani R, Brofman PR,Souza JA,Barboza L,Guimaraes MR,Varela AM,Ravgnellli MR,Silva FM OPCAB in pa-tients on hemodyalisis. Rev Bras Cir Cardiovasc 2007; 22:104–108

19. Liu JF,Lin CH, Chua CH, Chiang SS, Hung HF, Lu MJ, Hung CR Outcome of off-pump coronary artery bypass in renal dialysis patient. Thorac Cardiovasc Surg 2008; 56:412–417

20. Horai T, Fukui T,Tabata M, Takanashi S. Early and mid-term results of off-pump coronary artery bypass grafting in patients with end stage renal disease: surgical outcomes after achievement of complete revascularization. Interact CardiovascThorac Surg 2008; 7:218–221

21. Bechtel JFM, Detter C, Fischlein T, Krabatsch T, Osswald BR, Riess FC,Scholz F,Schonburg M, Stamm C, Sievers HH, Bartels C. Cardiac surgery in patients on dialysis: de-creased 30-day mortality,unchanged overall survival. Ann Thorac Surg 2008; 85:147–153

22. Filsoufi F, Rahmanian PB, Castillo JG,Silvay G, Carpentier A, Adams DH (2008) Predictors and early and late out-comes of Dialysis-dependent patients in contemporary cardiac surgery. J Cardiothorac Vasc Anesth. 2008; 22:522–529.

23. Rahmanian PB,Adams DH,Castello JG,Vassalotti J, Filsoufi F Dependent patients: single-center experience with 245 conescu-tive patients. J Thorac Cardiovasc Surg 2008; 135:915–922

24. Nicolini F, Beghi C, Muscari C, Agostinelli A, Budillon Am, Spaggiari I, Gherli T. Myocardial protection in car-diac surgery: current options and future challenges. Eur J Cardio-Thoracic Surg 2003; 24:986 992

25. Herzog C, Ma J, Collins A. Long-term survival in the United States with prosehetic heart valves: should ACC/AHA practice guidelines be modified? Circulation 2002; 105:1336–1341

26. Gherli T,Colli A, Fragnito C,Nicolini F,Borrello B,Saccani S, D’Amico R,Beghi C. Comparing warfarin with aspirin after biological aortic valve replacement. A prospective study. Circulation 2004; 110:496–50

27. Oka H,Ikeda S,Koga S,Miyahara Y,Kohno S. Atorva-statin induces associated reductions in platelet P-selectin,oxi-dized low-density lipoprotein,and interleu-kin-6 in patients with coronary artery diseases. Heart Vessels 2008; 23:249–256

98



Sažetak:Uvod: Metabolički sindrom predstavlja važan

faktor rizika za oboljevanje od kardiovaskularnih bole-sti i diabetesa tip 2, dok je oporavak srčane frekvence nakon testa fizičkog opterećenja vrlo važan pokazatelj rizika za nastanak kardiovaskularnih bolesti i mortalite-ta uopšte. Predstavlja vrlo važan neinvazivni dijagno-stički marker.

Cilj: Cilj ovog rada je da se ispita povezanost iz-među prisustva metaboličkog sindroma kao faktora rizi-ka za nastanak kardiovaskularnih oboljenja i oporavka srčane frekvence nakon testa fizičkog opterećenja kao važnog prognostičkog parametra.

Materijal i metode: U ovu studiju je uključen 61 konsekutivni bolesnik, kojem je urađen test fizičkim op-terećenjem (stres-ehokardiografski test po Bruce proto-kolu). Pre testa, od svakog bolesnika intervjuom i uvi-dom u medicinsku dokumentaciju dobijeni su opšti po-daci, podaci o faktorima rizika i njihovoj terapiji, a za-tim im je izmeren obim struka, krvni pritisak i srčana frekvenca. Po završetku testa ponovo je meren krvni pritisak, a srčana frekvenca u prvom minutu odmora automatski je snimana. Rezultati: U isptivanoj popula-ciji 70,5% ispitanika imalo je metabolički sindrom, pri čemu su najzastupljeniji kriterijumi bili hipertenzija (83,6%) i obim struka – centralna gojaznost (73,77%). Rezultati stres-ehokardiografskog testa su bili pozitivni kod 36,1% ispitanika, dok je spor oporavak srčane fre-kvence (≤18) bio zabeležen kod 21.3% ispitanika. Ispitanici sa metaboličkim sindromom imali su sporiji oporavak srčane frekvence u odnosu na ispitanike bez metaboličkog sindroma, ali bez statističke značajnosti.

Zaključak: Rezultati ove studije pokazali su da metabolički sindrom nema uticaja na oporavak srčane frekvence nakon testa fizičkog opterećenja, ali da je go-jaznost (izražena kao obim struka), kao jedan od kriteri-juma metaboličkog sindroma, nezavisan prediktor opo-ravka srčane frekvence.

Ključne reči: metabolički sindrom, oporavak srčane fre-kvence, kardiovaskularne bolesti, gojaznost.

Abstract:Introduction: Metabolic syndrome is a very im-

portant risk factor for cardiovascular diseases and dia-betes type 2, while heart rate recovery after treadmill test is a very important prognostic marker of cardiovas-cular morbidity and all-cause mortality and it repre-sents a very usefull non-invasive diagnostic procedure.

The Aim: The Aim of this study was to examine whether there is a correlation between metabolic syn-drome as a risk factor for cardiovascular diseases and heart rate recovery as a very important prognostic fac-tor.

Material and methods: Our research included 61 consecutive patients who underwent treadmill test (stress-echocardiography by Bruce protocol). Before the test, by interview and examination of medical records from each patient were obtained: general information, information about the risk factors and their therapy and then we measured their waist circumference, blood pres-sure and heart rate. Upon completion of the test we mea-sured again blood pressure and heart rate in the first minute of rest.

Results: In the population that was studied, 70.5% had metabolic syndrome whereas the most common cri-teria were hypertension (83.6%) and waist circumfer-ence (73.77%). The results of stress-echocardiography were positive in 36.1% of patients, while the slow heart rate recovery (≤18) was noted in 21.3% of patients. Patients with metabolic syndrome had slower heart rate recovery as compared to the patients without metabolic syndrome but without statistical significance.

Conclusion: The results of this study showed that metabolic syndrome has no effect on heart rate recovery after treadmill test, but that obesity (measured as waist circumference), as one of the criteria of the metabolic syndrome, is an independent predictor of heart rate re-covery.

Keywords: metabolic syndrome, heart rate recovery, cardiovascular diseases, obesity.

POVEZANOST METABOLIČKOG SINDROMA SA OPORAVKOM SRČANE FREKVENCE NAKON TESTA FIZIČKOG OPTEREĆENJA

Autori: Nikola Bošković1, Dragoljub Blagojević1

Mentor: Doc. dr Jelena Stepanović2

1Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu2Klinika za kardiologiju, Klinički centar Srbije, Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu

99



UvodMetabolički sidnrom predstavlja skup faktora rizika za

pojavu dijabetesa tipa 2 i kardiovaskualrnih bolesti. Iako je povezanost nekih od ovih faktora rizika poznata već 80 godi-na, metabolički sidrom kao kombinacija insulinske rezistenci-je, hiperglikimemije, hipertenzije, niskih vrednosti HDL-holesterola i visokih vrednosti triglicerida prvi put se poja-vljuje 1998. godine u radu Reaven-a i saradnika (1). Prva for-malna definicija metaboličkog sindroma predložena je iste godine od strane grupe eksperata za dijabetes, Svetske zdrav-stvene organizacije (World Health Organization-WHO), pre-ma kojoj metabolički sindrom predstavlja kombinaciju insu-linske rezistencije i još dva faktora rizika od sledećih: goja-znost, hipertenzija, visoke vrednosti triglicerida, niske vred-nosti HDL-holesterola i mikroalbuminurije. National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel III (NCEP-ATP III) 2001. godine predlaže novu definiciju prema kojoj kriterijumi za dijagnozu metaboličkog sidroma predsta-vlja postojanje najmanje 3 od sledećih 5 faktora rizika: abdo-minalna gojaznost (koja dobro korelira sa insulinskom rezi-stencijom) tj. obim struka >102 cm kod muškaraca, >88 cm kod žena, vrednosti trigicerida > 1,7mmol/l ili terapija fibrati-ma, HDL holesterol <1.0 mmol/l kod muškaraca, <1, 3 mmo-la/L kod žena, vrednosti arterijskog krvnog pritiska (TA) ≥130/85 mmHg ili hipertenzija na terapiji i vrednosti glikemi-je >5,6mmom/L ili djiabetes melitus na terapiji . Najnovija i široko prihvaćena definicija predložena je 2009. godine od strane International Diabetes Federation (IDF) i American Heart Association/National Heart, Lung, and Blood Institute (AHA/NHLBI) prema kojoj je najvažniji kriterijum za dija-gnozu metaboličkog sindroma centralni tip gojaznosti odno-sno obim struka kod muškaraca ≥94 cm, a kod žena ≥80 cm, dok su ostali kriterijumi identični onima koje je predložila ATP III (2). Kako metabolički sidrom predsavlja kombinaciju nekoliko poremećaja, identifikovano je više patafizioloških mehanizama koji su u osnovi ovog sindroma i to: insulinska rezistencija koja se najčesće pominje kao glavni patofiziološki mehanizam, visceralna gojaznost, aterogena dislipidemija i endotelna disfunkcija. Danas se procenjuje da 20 -25 % svet-ske odrasle populacije ima metabolički sindrom i da su te oso-be u dva puta većem riziku od kardiovaskularne smrti i tri puta većem riziku da obolele od infarkta srca ili moždanog udara u odnosu na osobe koje nemaju metabolički sindrom i da su u višestruko većem riziku da obole od dijabetesa tip 2 (3).

Oporavak srčane frekvence predstavlja razliku između maksimalne srčane frekvence dostignute tokom testa i srčane frekvence u periodu odmora, najčešće prvom minutu. Porast srčane frekvence tokom testa opterećenja nastaje kao kombi-nacija smanjene aktvinosti parasimpatikusa i povećane aktiv-nosti simpatikusa, dok se pad srčane frekvence odmah posle testa pripisuje reaktivaciji parasimpatikusa. Spor oporavak srčane frekvence se definiše kao pad srčane frekvence ≤ 12 otkucaja u prvom minutu odmora kod protokola koji koriste “cool down” fazu ili ≤ 18 otkucaja u minuti za protokole koji prekidaju opterećenje odjednom, bez „cool down“ faze. „Cool down“ period po definiciji traje 2 minuta pri brzini od 1.5 mph i pri nagibu od 2.5 stepeni (4). Spor oporavak srčane frekven-ce usko je povezan sa hroničnom srčanom insuficijencijom,

metaboličkim sindromom, hipertenzijom, dijabetesom tip 2, aterosklerozom i insulinskom rezistencijom. Štaviše, veliki broj studija sa hiljadama ispitanika je pokazao da je oporavak srčane frekvence važan pokazatelj rizika od umiranja uopšte, tako da je ispitivanje oporavka srčane frekvence veoma važan i koristan neinvazivni dijagnostički marker (5).

Cilj ovog rada je da se ispita povezanost između prisu-stva metaboličkog sindroma kao faktora rizika za nastanak kardiovaskularnih oboljenja i oporavka srčane frekvence na-kon testa fizičkog opterećenja kao važnog prognostičkog mar-kera.

Mater ija l i metodeOva studija predstvalja opservaciono-kliničko ispiti-

vanje koje je sprovedeno u Kabinetu za ergometriju Klinike za kardiologiju Kliničkog centra Srbije. Ispitivanjem je obu-hvaćen 61 konsekutivni bolesnik (43 muškog pola, 18 ženskog pola) koji je bio podvrgnut testu fizičkog opterećenja (stres-e-hokardiografski test). Iz ispitivanja su isključeni bolesnici ko-ji nisu imali potrebne ili skorašnje (unutar tri meseca) biohe-mijske laboratorijske analize (n=15).

Pre testa, od svakog bolesnika intervjuom i uvidom u medicinsku dokumentaciju dobijeni su opšti podaci (starost, telesna visina, telesna težina), podaci o faktorima rizika (pu-šenje, dijabetes, hipertenzija, hiperlipoproteinemija i postoja-nje kardiovaskularnog oboljenja kod bližih srodnika), o posto-janju nekog oblika ishemijske bolesti srca (angina pektoris, infarkt miokarda), medikamentnoj terapiji, kao i podaci o prethodnim revaskularizacijama miokarda (perkutana koro-narna intervencija, by-pass operacija). Svim bolesnicima pre testa je izmeren krvni pritisak, srčana frekvenca i obim stru-ka. Obim struka je meren na sredini rastojanja od donjeg re-barnog luka do ilijačnog grebena. Krvni pritisak je meren ži-vinim manometrom.

Submaksimalni, simptomima ograničeni stres-ehokar-diografski test po Bruce protokolu urađen je kod svakog ispi-tanika. Na kraju svakog stepena opterećenja mereni su arterij-ski krvni pritisak i srčana frekvenca. Kriterijumi za prekida-nje testa bili su: pojava anginoznih tegoba, zamor, dostizanje submaksimalne frekvence, pojava ST depresije veće od 2 mm i pojava hipertenzivne reakcije (krvni pritisak veći od 240/130 mmHg). Po završetku testa, svim ispitanicima određivana je srčana frekvenca nakon isteka prvog minuta odmora. Prema protokolu stres-ehokardiografskog testa, ehokaradiografski pregled u levom dekubitalnom položaju je urađen svima pre i posle. Test je definisan kao pozitivan za postojanje inducibilne ishemije miokarda ukoliko je na EHO posle testa dolazilo do pogoršanja segmentne kinetike leve komore.

Kao kriterijumi za dijagnozu metaboličkog sindroma korišćene su preporuke od International Diabetes Federation (IDF) i American Heart Association/National Heart, Lung, and Blood Institute (AHA/NHLBI), prema kojima je za dija-gnozu metabičkog sindroma neophodno prisustvo 3 od slede-ćih 5 parametara : obim struka ≥ 94 cm kod muškaraca, ≥ 80 cm kod žena, vrednosti trigicerida > 1,7mmol/l ili terapija fi-bratima, HDL holesterol <1.0 mmol/l kod muškaraca, <1, 3 mmola/L kod žena, vrednosti arterijskog krvnog pritiska (TA) ≥130/85 mmHg ili hipertenzija na terapiji i vrednosti gli-kemije >5,6mmol/L ili diabests melitus na terapiji (2).

100



Oporavak srčane frekvence definisan je kao razlika iz-među maksimalne srčane frekvence dostignute tokom testa i srčane frekvence u prvom, odnosno, trećem minutu odmora. Kao spor oporavak srčane frekvence, uzet je oporavak srčane frekvence koji je ≤ 18 nakon prvog minuta odmora.

Numeričke vrednosti obeležja posmatranja prikazane su kao aritmetička sredina ± standardna devijacija. Za testira-nje značajnosti razlike numeričkih obeležja korišćen je dvo-smerni t-test za nezavisne uzorke. Za testiranje povezanosti oporavka srčane frekvence i numeričkih varijabli korišćena je univarijabilna linearna regresija. Parametri koji su bili stati-stički značajni univarijabilni prediktori oporavka srčane fre-kvence dalje su testirani u multivarijabilnoj linearnoj regresi-ji. Kao statistički značajni uzimani su oni testovi gde je vero-vatnoća nulte hipoteze (p-vredost) bila manja od 0,05. U obra-di podataka korišćen je statistički softverski paket SPSS 17.0.

Rezultat iIspitivana populacija obuhvatala je 61 bolesnika (43

muškog pola), prosečne starosti 58 ± 10 godina. Osnovne de-mografske i kliničke karakteristike ispitivane populacije pri-kazane su u tabeli (Tabela 1).

Tabela 1. Demografske i kliničke karakterisitke ispitivane populacije (n=61)

Varijabla Vrednost

PolMuški 43 (70,5%)Ženski 18 (29,5%)

Starost 58 ± 10Pušenje 40 (65,6%)Dijabetes 12 (19,7%)Hipertenzija 46 (75,4%)Hiperlipoproteinemija 42 (68,9%)Hereditet 29 (47,5%)

Obim struka (cm)Muškarci 99,37 ± 9,73Žene 87,22 ± 14,2

Sistolni arterijski pritisak (mmHg) 129,84 ± 11Dijastolni arterijski pritisak (mmHg) 82,5 ± 8,7Vrednosti triglicerida (mmol/l) 1,9 ± 1,2Vrednosti HDL-holesterola (mmol/l)

Muškarci 1,08 ± 0,26Žene 1,13 ± 0,22

Vrednosti glikemije (mmol/l) 6,5 ± 2,52Angina pectoris 25 (41%)Prethodni infarct 25 (41%)PCI* 26 (42,6%)By-pass 5 (8,2%)BMI* 26,63 ± 2,85PCI – perkutana koronarna intervencija, BMI – indeks telesne mase (Body Mass Index)

Ispitanici su bili opterećeni faktorima rizika za nasta-nak kardiovaskularnih oboljenja, pri čemu su skoro polovina ispitanika bili pušači, imali hipertenziju i/ili imali hiperlipo-proteinemiju. Medikamentna terapija ispitanika prikazana je u Tabeli 2. Najzastupljeniji lekovi koje su ispitanici koristili bili su β-blokatori (73,3%) i aspirin (73,3%).

Tabela 2. Terapija ispitivane populacije (n=61)

Klasa leka Vrednostβ blokatori 44 (73,3%)Blokatori Ca2+ kanala 13 (21,7%)Aspirin 44 (73,3%)Klopidogrel 19 (31,7%)Statini 35 (58,3%)ACE inhibitori 32 (53,3%)Tiazidni diuretici, diuretici Henleove petlje 13 (21,7%)Organski nitrati 23 (38,3%)

U ispitivanoj populaciji, 43 (70,5%) bolesnika imalo je metabolički sindrom (tj. bar tri od pet kriterijuma), dok samo jedan ispitanik (1,6%) nije imao nijedan od kriterijuma iz de-finicije metaboličkog sindroma. (Grafikon 1.).

Grafikon 1. Procenat ispitivanih pacijenata kod kojih je de-tektovano postojanje određenog broja kriterijuma metabolič-kog sindroma

Grafikon 2. Procenat zastupljenosti kriterijuma metabolič-kog sindroma u ispitivanoj populaciji

101



Tabela 3. Rezultati stres-ehokardiografskog testa

Varijabla Vrednost

SMFdostignuta 29 (47,5%)nije dostignuta 32 (52,5%)

Stepen kad je prekinut test

1 6 (9,8%)2 20 (32,8%)3 25 (41%)4 8 (13,1%)5 2 (3,3%)

Izazvana ishemijada 22 (36,1%)ne 31 (50,8%)inklokluzivan test 8 (13,1%)

Srčana frekvencamaksimalna dostignuta 132 ± 221. minut odmora 104 ± 193. minut odmora 84 ± 15

SMF – submaksimalna srčana frekvenca

Grafikon 3. Korelacija metaboličkog sindroma i oporavka sr-čane frekvence nakon testa fizičkog opterećenja (p=0,78)

Grafikon 4. Korelacija između veličine obima struka i opo-ravka srčane frekvence nakon testa fizičkog opterećenja

0

5

10

15

20

25

30

35

40

Metaboličkisindrom

Hipertenzija Izazvanaishemija

Opo

rava

k srča

ne fr

ekve

nce

u pr

vom

min

utu

odm

ora

(br.

otku

caja

)

Da

Ne

Inklokluzivan test

* ** p<0,05

Grafikon 5. Uticaj metaboličkog sindroma, hipertenzije i izazvane ishemije na oporavak srčane frekvence nakon testa fizičkog opterećenjaNajzastupljeniji bili su ispitanici sa tri, odnosno dva kriterijuma. Pojedinačno gledano, najviše ispi-tanika je imalo hipertenziju (83,6%), a odmah zatim povećan obim struka–centralna gojaznost (73,77%.). Ostali kriterijumi bili su zastupljeni kod manje od polovine ispitivane populacije ( Grafikon 2.).

Rezultati stres-ehokardiografskog testa su prikazani u Tabeli 3. Najveći broj ispitanika je dostigao treći (n=25, 41%), odnosno, drugi stepen opterećenja (n=20, 32,8%). Test je bio pozitivan za postojanje ishemije miokarda kod 22 (36,1%) is-pitanika dok je kod 8 (13,1%) test bio inklokluzivan-nedija-gnostički. Oporavak srčane frekvence u prvom minutu odmo-ra ≤ 18 zabeležen je kod 13 (21.3%) ispitanika.

Statistička analiza podataka pokazala je da nema stati-stički značajne povezanosti između metaboličkog sindroma i oporavka srčane frekvence u prvom minutu odmora nakon stres-ehokardiografskog testa (t=0,281, df=59 , p=0,780) (Grafikon 3.).

Sa druge strane, obim struka i hipertenzija bili su po-vezani sa oporavkom srčane frekvence : bolesnici sa većim obimom struka imali su sporiji oporavak srčane frekvence (b=-0,373, p=0,003) (Grafikon 4.), kao i bolesnici sa arterij-skom hipertenzijom (t=-1,930, df=34,6, p=0,026) (Grafikon 5).

U multiploj linearnoj regresiji jedini nezavisan predik-tor oporavka srčane frekvence bio je obim struka (b=-0,337, p=0,010), dok hipertenzija nije bila značajna (b=-4,7, p=0,199).

Takođe, bolesnici sa pozitivnim stres-ehokardiograf-skim testom imali su sporiji oporavak srčane frekvence (b=3,062, df=51, p=0,004) (Grafikon 5.).

DiskusijaMetabolički sindrom se sastoji od nekoliko kriterjuma,

od kojih su neki već dugo vremena dokazani kao važni fakto-ri rizika za oboljevanje od kardiovaskularnih bolesti. Metabolički sindrom je od samog početka bio dosta kontro-verzan i sve do današnjih dana se stalno vode debate da li

102



metabolički sindrom uopšte može biti definisan kao poseban klinički entitet koji nosi veći rizik za oboljevanje od kardiova-skularnih bolesti nego prost zbor pojedinačni faktora rizika. Po poslednjoj Međunarodnoj klasifikaciji bolesti metabolički sindrom se ne nalazi kao dijagnoza. Takođe, nije jasno ni da li se u osnovi pojedinačnih komponentni metaboličkog sindro-ma nalazi zajednički uzročni faktor rizika kao što je insulin-ska rezistencija, ili su i ovi faktori međusobno nezavisni (6). Ispitivana populacija je u visokom procentu imala metabolič-ki sindrom (70,5%), što je znatno više u odnosu na neke od publikacija koje su ispitivale povezanost metaboličkog sindro-ma i oporavka srčane frekvence nakon testa fizičkog optere-ćenja (6,7).

Sa druge strane, oporavak srčane frekvence u brojnim studijama dokazan je kao važan prognostički parametar za oboljevanje i smrtnost od kardiovaskularnih bolesti (5,8). U našem radu nismo pronašli povezanost između metaboličkog sindroma i oporavka srčane frekvence nakon testa fizičkog opterećenja, što nije u skladu sa studijama koje su ispitivale njihov odnos (7,9,10). Naime, populacije u ovim studijama bi-le su homogene, dok je naša studijska populacija bila hetero-gena, opterećena kardiovaskularnim bolestima uz terapiju koja može modifikovati oporavak srčane frekvence. Međutim, naša studija imala je nekoliko ograničenja. Kao prvo, naša studija je obuhvatila mali broj pacijeneta, od kojih je samo 12 imalo dijagnostikovan dijabetes koji mnogi istraživači ističu kao glavni kriterijum metaboličkog sindroma. Kao drugo, skoro svi pacijenti obuhvaćeni studijom bili su na terapiji ra-zličitih poremećaja koji su kriterijumi metaboličkog sindro-ma. I kao treće, većina ispitanika (n=31) imala je prethodnu revaskularizaciju, neki su imali infarkt miokarda, anginu pektoris, ishemiju miokarda, te se njihov uticaj na oporavak srčane frekvence ne može isključiti.

Analizirajući povezanost pojedinačnih kriterijuma metaboličkog sindroma sa oporavkom srčane frekvence našli smo značajnu povezanost veličine obima struka i hipertenzije sa sporim oporavkom srčane frekvence. U multiploj regresio-noj analizi uticaja veličine obima struka i hipertenzije na opo-ravak srčane frekvence kao nezavisnih parametara pokazalo se da je veličina obima struka povezana sa sporim oporavkom srčane frekvence, ali ne i hipertenzija. To je u skladu sa rezul-tatima drugih studija (6), koje su pokazale da je gojaznost glavni faktor metaboličkog sindroma i da su ostali kriterijumi povezani sa metaboličkim sindromom preko gojaznosti. Ovi rezultati navode na zaključak da se sa povećanom fizičkom aktivnošću i smanjenjem gojaznosti smanjuje i rizik za obo-ljevanje od kardiovaskularnih bolesti, što može imati pozitiv-ne zdravstvene, socioekonomske posledice. Ovo je posebno naglašeno, s obzirom na to da gojaznost ima epidemijske raz-mere u 21. veku. Svetska zdravstvena organizacija procenjuje da preko milijardu ljudi u svetu ima prekomernu telesnu teži-nu, a da je od tog broja preko 300 miliona klinički gojazno.

Prema istraživanjima Instituta za zaštitu zdravlja Srbije “Dr Milan Jovanović-Batut” u Srbiji je 37,2% populacije preko-merno uhranjeno a 18,3% klinički gojazno.

Naše ispitivanje na malom broju bolesnika pokazuje da metabolički sindrom nema uticaja na oporavak srčane fre-kvence nakon testa fizičkog opterećenja, ali da je gojaznost (izražena kao obim struka), kao jedan od kriterijuma metabo-ličkog sindroma, nezavisan prediktor oporavka srčane fre-kvence. Ovi rezultati ukazuju da od svih komponenti metabo-ličkog sindroma na gojaznost treba obratiti posebnu pažnju, jer se radi o potencijalno promenljivom faktoru rizika, što ukazuje na značaj optimalne telesne mase, čime se još jednom ističe značaj edukacije i prevencije u zdravstvenom radu.

Literatura:1. Reaven GM. Banting Lecture 1988: Role of insulin resis-

tance in human disease. Diabetes. 1988;37:1595–1607.2. Alberti KG, Zimmet P, Shaw J; IDF Epidemiology Task

Force Consesus Group. The metabolic syndrome: a new worldwide definition. Lancet 2005; 366:1059 – 1062.

3. Kim, J. A., Montagnani, M., Koh, K. K. and Quon, M. J. Reciprocal relationships between insulin resistance and endothelial dysfunction: molecular and pathophysiologi-cal mechanisms. Circulation 2006; 113: 1888–1904.

4. Vivekanathan, D. P., Blackstone, et al. “Heart rate recov-ery after exercise is predictor of mortality, independent of the angiographic severity of coronary disease.” J Am Coll Cardiol 2003; 42(5):831–838

5. Cole CR, Foody JM, Blackstone EH, Lauer MS. Heart rate recovery after submaximal exercise testing as a predictor of mortality in a cardiovascular healthy cohort. Ann. Intern. Med. 2000;132(7):552 – 555.

6. Anderson PJ, Critchley JA, Chan JC, Cockram CS, Lee ZS, Thomas GN, Chan JC. Factor analysis of the meta-bolic syndrome: obesity vs insulin resistance as the central abnormality. Int J Obesity. 2001;25:1782–1788.

7. Rogowski Ori, Arie Steinvil, Cohen Michael et al. Elevating resting heart rate is associated with the meta-bolic syndrome. Cardiovascular diabetology 2009; 8:55 doi:10,2009

8. Jae SY, Carnethon MR, Heffernan KS, Choi YH, Lee MK, Park WH, Fernhall B. Slow heart rate recovery after exer-cise is associated with carotid atherosclerosis. Atherosclerosis 2008;196(1):256 – 261.

9. Deniz F, Katircibasi MT, Pamukcu B, Binici S, Sanisoglu SY. Association of metabolic syndrome with impaired heart rate recovery and low exercise capacity in young male subjects. Clin. Endocrinol. 2007;66(2):218 – 223.

10. Kullo IJ, Hensrud DD, Allison TG. Relation of low cardio-respiratory fitness to the metabolic syndrome in middle-aged men. Am J Cardiol. 2002;90:795–797

103



Sažetak:Uvod: Među najčešćim tegobama koje bolesnike

dovode neurologu nalaze se vertigo i gubitak ravnoteže. Uzroci vertiga su brojni a diferencijalna dijagnoza širo-ka. Veliki broj osoba se zbog akutno nastalog vertiga hospitalizuje na neurološkim odeljenjima, ali se samo kod malog broja dijagnostikuje neurološka bolest kao uzrok.

Cilj: Analizirati kliničke osobine i rezultate dija-gnostičkih ispitivanja i etiologiju koja je dovela do akut-nog vertiga koji je rezultovao prijemom na Kliniku za neurologiju KCS.

Materijal i metoda: Kod 31 konsekutivnog bole-snika primljenih kao hitan slučaj na Kliniku za neurolo-giju KCS u periodu od 01.01.2011. do 01.01.2012. godine izvršena je analiza demografskih osobina, vaskularnih faktora rizika, kliničke prezentacije i nalaza dopunskih analiza. Klinički parametri obolelih su upoređeni sa 30 zdravih ispitanika.

Rezultati: Kod 26 (80,9%) bolesnika končana ne-urološka dijagnoza na otpustu bila je periferni vertigo (PV), kod 4 (12,9%) centralni vertigo (CV), a kod jedne osobe (3,2%) radilo se o anksioznom poremećaju sa su-bjektivnim doživljajem vertiga. Od ukupnog broja dija-gnostikovanih bolesnika sa PV, 76,9% je imalo neuroni-tis vestibularnog nerva, 9,7% benigni paroksizmalni vertigo, 7,7% druge uzroke PV, dok je kod jednog obole-log (3,8%) dijagnostikovan Coganov sindrom. Od ukup-nog broja bolesnika sa CV, troje je imalo dijagnozu ver-tebrobazilarne insuficijencije, a jedan dijagnozu demije-linizacionog oboljenja.

Zaključak: U našoj grupi ispitanika koji su pri-mljeni sa akutnim vertiginoznim sindromom kao hitan slučaj na Kliniku za neurologiju, u najvećem broju slu-čajeva nije detektovana neurološka osnova poremećaja. Najveći broj bolesnika zahtevao je ispitivanje i lečenje od strane specijaliste otorinolaringologije.

Ključne reči: Vrtoglavica, Benigni paroksizmalni pozi-cioni vertigo, Vestibularni neuronitis, Coganov sindrom.

Abstract:Introduction: Vertigo and balance loss are the

most common symptoms that bring patients to the neu-

rologist. The causes of vertigo are numerous and differ-ential diagnosis is wide. Many patients with acute ver-tigo are hospitalized at neurological wards, although neurological causes of vertigo are found in only a small number of patients.

The aim: To analyze the clinical features and re-sults of diagnostic tests and etiology leading to acute vertigo that resulted in admission to the Department of Neurology, Clinical Centre of Serbia.

Materials and Methods: In 31 consecutive pa-tients hospitalized at the Clinic of Neurology in period January 2011–January 2012, we analyzed demographic data, vascular risk factors, clinical presentation and re-sults of ancillary tests. Clinical data were compared be-tween patients and 30 healthy controls.

Results: In 26 (80.9%) patients, the final diagnosis on discharge was peripheral vertigo (PV), in 4 (12.9%) central vertigo (CV), and in one case (3.2%) anxiety dis-order with subjective experience of vertigo was detected. Of all patients diagnosed with PV, 76.9% had vestibular neuronitis, 9.7% benign paroxysmal vertigo, 7.7% other causes of PV and 3.8% Cogan’s syndrome. Of all pa-tients with CV, three had a diagnosis of vertebrobasilar insufficiency, and one patient had demyelinating dis-ease.

Conclusion: In our group of patients admitted to the Clinic of Neurology with acute vertigo as an emer-gency, no neurological basis of the disorder was detect-ed. A large majority of patients met indications for eval-uation and treatment by an otorhinolaryngology spe-cialist.

Key words: Vertigo, Cogan, BPPV, Vestibular neuroni-tis.

UvodVertigo i gubitak ravnoteže su među najčešćim tegoba-

ma koje bolesnike dovode lekaru neurologu. Uzroci vertiga su brojni a diferencijalna dijagnoza široka. Veliki broj osoba se zbog akutno nastalog vertiga hospitalizuje na neurološkim odeljenjima, ali se samo kod malog broja dijagnostikuje neu-rološka bolest kao uzrok.

Vertigo je osnovni simptom oštećenja vestibularnog dela VIII kranijalnog nerva (n. vestibulocochlearis) i njegovih

AKUTNI VERTIGINOZNI SINDROM KAO INDIKACIJA ZA PRIJEM NA NEUROLOŠKO ODELJENJE

Autori: Marko Benčić1, Milenko Bogdanović1, Vuk Aleksić1

Mentor: Asist. dr Aleksandra Pavlović2

1Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu2Klinika za neurologiju KCS, Medicinski fakultet, Univerziteta u Beogradu

104



veza (1). To je subjektivni osećaj okretanja spoljnjeg sveta ili osećaj okretanja sopstvenog tela i zapravo predstavlja haluci-naciju pokreta (2).

Akutni napad vertiga često može biti praćen vegetativ-nim (bledilo, znojenje, promene pulsa, muka, povraćanje) i drugim propratnim znacima kao što su nistagmus, devijacija pogleda, diplopije i retko gubitak svesti (2). Kod pojedinih bo-lesnika opisane smetnje se mogu javiti i bez ispoljavanja „pra-vog vertiga“. U zavisnosti od lokalizacije oštećenih struktura razlikujemo periferni i centralni vertigo (3).

Periferni vertigo (PV) je posledica oštećenja perifer-nog neurona. PV može nastati usled oštećenja labirinta ili oštećenja vestibularnog nerva. Ukoliko je lezija lokalizovana u pontocerebelarnom uglu mogu se javiti i udruženi znaci oštećenja V i VII kranijalnog nerva.

Kao posebni oblici PV izdvajaju se benigni paroksi-zmalni pozicioni vertigo (BPPV), kod koga vrtoglavice nasta-ju usled promene položaja glave i vestibularni neuronitis (VN), koji ima dramatičan početak, ali ima povoljan tok i po-vlači se u potpunosti (4). Pretpostavlja se da je uzrok VN za-paljenske etiologije jer se često javlja nakon infekcije gornjeg respiratornog trakta.

Centralni vertigo (CV) nastaje usled oštećenja central-nog neurona. Težak i protrahovan vertigo može nastati usled infarkta, demijelizacionih procesa ili tumorskih infiltracija moždanog stabla, zatim kao deo kliničke slike akutnog ošte-ćenja malog mozga, ponekad u sklopu epileptičkog napada poreklom iz temporalnog režnja, u sklopu migrenskog ataka ali i kod anksioznih osoba (5).

Cilj našeg rada bio je da analiziramo kliničke osobine i rezultate dijagnostičkih ispitivanja, kao i etiologiju koja je dovela do akutnog vertiginoznog sindroma koji je rezultovao prijemom na Kliniku za neurologiju KCS.

Mater ija l i metodeU studiju su uključeni bolesnici koji su u periodu od

01.01.2011. do 01.01.2012. godine primljeni preko neurološke ambulante Urgentnog centra KCS radi hospitalnog lečenja na Klinici za Neurologiju KCS, a pod dijagnozom akutnog verti-ginoznog sindroma. Kao kontrolna grupa uključeni su podaci za 30 osoba bez neuroloških smetnji, odgovarajućeg pola i uz-rasta.

Kod svih bolesnika koji su primljeni na Kliniku ura-đen je, detaljan neurološki pregled, pregled otorinolaringolo-ga, zatim pomoćne dijagnostičke metode: auditivni evocirani potencijali, magnetna rezonanca (MR) ili kompjuterizovana tomografija mozga, transkranijalni dopler i dopler karotidnih arterija.

Kod bolesnika koji su uključeni u studiju analizirani su osnovni demografski podaci, podaci o dužini trajanja smetnji i dužini bolničkog lečenja, podaci o vaskularnim faktorima rizika i specifične tegobe vezane za vertiginozni sindrom.

Statistička AnalizaU radu je korišćena osnovna deskriptivna statistika.

Statistička analiza obuhvatala je analizu varijanse za nekonti-nuirane promenljive i χ2 odnosno Fišerov test za kontinuirane promenljive. P-vrednost <0.05 je smatrana statistički značaj-nom.

Rezultat iU studiju je uključen 31 bolesnik sa akutnim vertigom

za koje su postojali svi relevantni podaci, a kao kontrola grupa 30 zdravih ispitanika, odgovarajućeg pola i uzrasta. Kod 26 (80,9%) bolesnika konačana neurološka dijagnoza na otpustu je bila PV, kod 4 (12,9%) CV, a kod jednog (3,2%) se radilo o anksioznom poremećaju sa subjektivnim doživljajem vertiga. Bolesnici sa akutnim vertigom su ukupno hospitalizovani 411 dana, što je 1,3% u odnosu na ukupan broj bolničkih dana na Klinici za neurologiju u istom periodu (31 968). U toku istog perioda na Klinici za neurologiju hospitalno je lečeno ukupno 2286 bolesnika, što znači da su bolesnici sa akutnim vertigom činili 1.36% svih bolesnika.

U Tabeli 1 prikazani su osnovni demografski podaci i vaskularni faktori rizika za bolesnike sa akutnim vertigom i kontrolnu grupu ispitanika. Nije postojala statistički značajna razlika između grupa za ove parametre.

Tabela 1. Demografski podaci i vaskularni faktori rizika u obe grupe (grupa bolesnih i zdravih ispitanika)

Grupa/varijable Sa vertigom Kontrolna grupa P

Broj bolesnika n 31 30Muški pol n ( %) 9 (29%) 10 (33,3%) 0.920Godine života x±SD 47.4 ± 15.8 47.7 ± 11.0 0.921B.B.D.x±SDRaspon

13±8.62–41

NP

Hipertenzija n (%) 12 (38,7%) 10 (33,3%) 0.863Dijebetes melitus n (%) 2 (6,45%) 1 (3,3%) 0.999Hiperlipidemija n (%) 9 (29%) 10 (33,3%) 0.786Aritmija, bilo koji tip, n (%) 0 0 0.999Koronarna bolest, n (%) 1 (3,2%) 0 0.492Pušenje, n (%) 3 (9,67%) 4 (13,3%) 0.707B.B.D. – broj bolesničkih danač NP – neprimenjivo, p- vred-nost

U inicijalnoj kliničkoj slici na prijemu, dominantna smetnja kod naših bolesnika bila je okretanje predmeta iz okoline, koja je registrovana kod 67,7% (21/31) osoba. Subjektivni osećaj propadanja i sopstvenog okretanja u pro-storu imalo je 61,3% (19/31) bolesnika, a isto toliko žalilo se na pogoršanje ili pojavu vrtoglavice poziciono, prilikom po-meranja glave 61,3% (19/31). Dužina trajanja vertiginoznih smetnji nije se razlikovala između bolesnika sa PV (7,5±10,2 dana) i CV (2,8±1,5 dana) (p=0,290). Mučninu bez povraćanja navodi 41,9% (13/31) pacijenata, dok se povraćanje kao simp-tom prijavilo kod 51,6% naših pacijenata (16/31). Nestabilan hod registrovan je kod 14 (45,2%) bolesnika. Tinitus je imalo 3 (9,7%) bolesnika, a glavobolju 6 (19,4%) bolesnika. Bolesnici ca PV i CV se nisu međusobno razlikovali u učestalosti pojave ni za jedan od navedenih parametara (p>0.1) osim pojave ne-stabilnosti hoda, koja je bila prisutna kod svih bolesnika sa CV a samo kod 10 (38.5%) bolesnika sa PV (p=0.037).

Pozitivan neurološki nalaz u smislu lezija kortikospi-nalnog puta imalo je dvoje bolesnika: jednog bolesnika sa sli-kom vertebrobazilarne insuficijencije i kod jedne bolesnice sa demijelinizacionom bolešću centralnog nervnog sistema. Od dopunskih nalaza, MR mozga je bio koristan u jednom slučaju

105



CV, ultrazvučni pregled je pokazao krucijalan nalaz u dru-gom slučaju CV. Konačne dijagnoze na otpustu sa Klinike za neurologiju prikazane su u Grafikonu 1 i objašnjene u daljem tekstu.

Grafikon 1. Spektar neuroloških dijagnoza, NV – Neuronitis nervi vestibularis; CV – Centralni vertigo; BPPV – Benigni poroksizmalni pozicioni vertigo; Alia – Vertigo peripherica alia

Od ukupnog broja dijagnostikovanih bolesnika sa PV, njih 20 (76,9%) je imalo NV, njih 2 (7,7%) BPPV, dva bolesni-ka dijagnozu „Vertigo peripherica alia“ – drugi uzroci vertiga perifernog porekla (7,7%), 1 (3,8%) vertigo posttraumatica i 1 (3,8%) bolesnik Coganov sindrom (Grafikon 1).

Od ukupnog broja obolelih sa CV (Grafikon 1), njih 3 (75%) je imalo dijagnozu vertebrobazilarne insuficijencije ili tranzitornog ishemijskog ataka u vertebrobazilarnom slivu, a 1 (25%) dijagnozu klinički izolovanog sindroma (CIS), odno-sno demijelinizacione bolesti. Ni kod jednog bolesnika nije postavljena dijagnoza migrenskog vertiga niti Menierove bo-lesti.

Slaganje između dijagnoza postavljenih od strane spe-cijaliste neurologije i otorinolaringologije postojalo je kod svih bolesnika, osim kod dvoje gde ORL lekar nije dao za-ključno mišljenje već je naložio dalje praćenje bolesnika. Ovo dvoje bolesnika primljeno je na hospitalno lečenje zbog izra-ženih vegetativnih smetnji u vidu mučnine i povraćanja i nji-hov oporavak do prestanka smetnji i vertikalizacije trajao je više dana (9 ,odnosno, 12 dana), i ovo je razlog zašto su lekari na prijemu u Urgentnom centru postavili indikaciju za hospi-talizaciju na Neurološkoj klinici.

Kod jednog bolesnika sa PV, muškarca starog 20 godi-na, postavljena je dijagnoza Coganovog sindroma. Bolesnik je lečen zbog recidivantnih tegoba u vidu vrtoglavice, nestabil-nosti u hodu, tinitusa i oslabljenog sluha. Imunoserološkim analizama potvrđeno je postojanje ANA antitela. ORL pre-gledom pokazano je da se radi o bilateralnom oštećenju čula sluha i ravnoteže. MR mozga je bila uredna. U daljem toku bolesnik je imao još jednu epizodu oftalmoloških smetnji, sa-

da sa jasnom kliničkom slikom akutnog konjuktivitisa tipič-nog za ovaj sindrom (Slika 1).

Slika 1. Bolesnik sa Cogan-ovim sindromom, foto-špalt, karakterističan intersticijalni keratitis. Ljubaznošću Ass. Dr Marije Božić, Klinika za oftalmologiju KCS

Kod jednog bolesnika, muškarca starog 48 godina sa dugogodišnjom hipertenzijom, a sa smetnjama u vidu vrtogla-vice, mučnine i krize svesti, na osnovu ultrazvučnog i angio-grafskog pregleda dijagnostikovan je Subclavian steal sin-drom levo (Slika 2).

Slika 2. Subklavija steal syndrom: ekstrakranijalni pregled arterije vertebralis sa karakterističnim Dopler signalom

Bolesnica stara 37 godina sa uputnom dijagnozom ver-tiga primljena je na Neurološku kliniku KCS, sa simptomima vrtoglavice, otežanog govora i nestabilnosti pri hodu. Iako su ovo bile prve smetnje koje je ikada imala, na osnovu kliničke slike i daljih dijagnostičkih ispitivanja zaključeno je da se kod bolesnice radi o mogućem prvom ataku demijelizacione bole-sti. Pregled mozga i cervikalne kičme MR metodom ukazali

106



su na postojanje tipičnih demijelinizacionih lezija, a u likvoru su detektovane oligoklonalne IgG trake.

DiskusijaRezultati naše analize pokazuju da je najveći broj bo-

lesnika koji je primljen na Neurološku kliniku sa slikom akut-nog vertiga, zapravo imao konačnu otorinolaringološku dija-gnozu, odnosno sprovedena ispitivanja nisu dokazala neuro-lošku osnovu smetnji. Ukupno, ovi bolesnici sa PV su proveli 321 (78,1%) od ukupno 411 dana na bolničkom lečenju svih bolesnika sa uputnom dijagnozom akutnog vertiga na neuro-loškom odeljenju, a da je zapravo bio indikovan prijem na ORL odeljenje.

U svim slučajevima PV, neurolog i ORL specijalista su se složili kod dijagnoze osim u dva slučaja, gde nije postavlje-na definitivna ORL dijagnoza.

Konačne neurološke dijagnoze CV bile su veoma raz-nolike i potvrđuju širok spektar diferencijalne dijagnoze ver-tiga uopšte. U studiji koju su radili Dickerson i Post (6), ko-načna dijagnoza akutnog vertiga nije dobijena u 20% slučaje-va. Ovi autori navode široku diferencijalnu dijagnozu i teško-će postavljanja krajnje dijagnoze. Takođe, i studija Holmsa i Padghama (7) kaže da čak u 40–80% slučajeva etiologija i mehanizam nastanka vertiga ostaju nerazjašnjeni. Poseban problem predstavlja široka diferencijalna dijagnoza vertigino-znog sindroma. Vrtoglavicu mogu da daju i razna ne-neurolo-ška stanja, kao što su teška anemija, neki lekovi, infekcije re-spiratornih puteva, ortostatska hipotenzija i drugo.

Od ukupnog broja bolesnika, kod samo jednog bole-snika nije dijagnostikovano ni neurološko niti ORL oboljenje koje se ispoljavaju kliničkom slikom vertiga, već je otpusna dijagnoza bila anksiozni poremećaj sa subjektivnim doživlja-jem vertiga. Pojava vertiginoznih smetnji kod bolesnika sa neurotskim poremećajima je opisana i predstavlja jednu od diferencijalno-dijagnostičkih mogućnosti (8).

Prema podacima studije Karasa i saradnika, PV se di-jagnostikuje u 75% slučajeva akutnog vertiga, a CV u 25% slučajeva (9). Naši rezultati su u skladu sa ovim podacima.

Za postavljanje dijagnoze od krucijalnog značaja je do-bro uzeta anamneza i fizikalni ,odnosno, neurološki pregled i neuroimidžing nalazi, dok izvestan, mada manji značaj imaju analize krvi kao pomoćne dijagnostičke metode koja su se u jednoj studiji pokazale efikasnim u samo 0,6% od 4538 anal-ziranih slučajeva (6). U našoj studiji analize krvi su ,takođe, bile dijagnostički postupak koji nije bio od značaja sem kod Coganovog sindroma, gde je ,međutim, od još većeg značaja bio oftalmološki pregled. Neuroimidžing metode (CT i MR) mozga bili su uredni kod svih osim kod bolesnice sa CV koja je imala znake demijelinizacione bolesti centralnog nervnog sistema. Ultrazvučni pregledi bili su uredni kod svih osim

kod bolesnika kod koga je pokazana slika vertebrobazilarne insuficijencije usled sindroma subklavijalne krađe. To znači da je klinički utisak neurologa da se radi o PV bio potvrđen u svim slučajevima, jer ni jedan od dopunskih pregleda nije ukazao na patologiju centralnog nervnog sistema.

Među drugim čestim uzrocima vertiginoznog sindro-ma treba razmatrati migrenski vertigo, koji se prema studiji Karatasa javlja u 25% slučajeva bolesnika sa akutnim verti-gom (9). Takođe, Meniereova bolest se javlja kod 5% osoba starijih od 70 godina (9). U našoj studiji, verovatno usled ma-log broja bolesnika, što je glavni limitirajući faktor ove studi-je, nije registrovan ni jedan pacijent sa ovim dijagnozama.

U Koganovom sindromu, koji je veoma retka bolest, prema studiji Antoniosa i Silimana (10), vertigo se javlja u 80%, a poremećaj sluha u 100% slučajeva uz recidivantni ke-ratitis. Podatak da je i u našoj grupi bolesnika registrovan je-dan ovakav slučaj, govori u prilog tome da se, iako redak, i ovaj sindrom mora razmatrati u diferencijalnoj dijagnozi. Značaj pravovremene dijagnoze leži i u tome što adekvatna terapija dovodi do znatnog poboljšanja simptoma i toka bole-sti.

U zaključku, kod najvećeg broja bolesnika sa akutnim vertiginoznim sindromom koji su primljeni kao hitan slučaj na Kliniku za neurologiju, radilo se o slici vertiginoznog sin-droma koja nije imala neurološku osnovu.

Literatura1. Kostić VS, et al. Neurologija za studente medicine.

Beograd: Medicinski fakultet Univerzitet u Beogradu; 2007.

2. Radojičić BM. Klinička Neurologija. Beograd: Medicina danas; 1983.

3. Neuhauser HK, Lempert T. Expert Vertigo: epidemiologic aspects. Opin Pharmacother 2009; 10:1537–1548.

4. Kim JS, Lee H. Inner ear dysfunction due to vertebrobasi-lar ischemic stroke.Semin Neurol 2009; 29:528–533.

5. Karatas M. Central vertigo and dizziness: epidemiology, differential diagnosis, and common causes. J Gen Intern Med 2008; 23:2087–2094.

6. Dickerson LM, Post RE. Dizzines: A Diagnostic Approach. Am Fam Physician 2010; 82:361–368.

7. Holmes S, Padgham ND. A review of the burden of verti-go. Otolaryngol Clin North Am 2011; 44:473–496.

8. Kutz JW Jr. The dizzy patient. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg 2010; 18:431–435.

9. Karatas M. Vascular Vertigo: epidemiology and clinical syndroms. Neurologist 2011; 17:1–10.

10. Antonis N, Silliman S. Cogan syndrome: An analysis of reported neurological manifestations. Neurologist 2012; 18:55–63.

107Izdanje 63│Broj 1–2│Decembar 2012│

Poseban članakMedicinski podmladak

„Kako je slatko videti ljudski život oplemenjen pronalascima!“Vergilije (iz šestog pevanja Eneide)

Šećerna bolest (dijabetes melitus) svakih deset se-kundi odnese jedan život, a dve osobe u svetu obole od ove bolesti. Dijabetes je oboljenje evolutivnog toka, velike učesta-losti, zbog čega se u savremenoj literaturi označava kao pan-demijski problem morbiditeta i mortaliteta. Definiše se kao stanje hronične hiperglikemije, nastale usled apsolutnog ili relativnog nedostatka insulina, koje dovodi do poremećaja metabolizma ugljenih hidrata, masti i belančevina, a kao jed-nu od dominantnih posledica ima razvoj hroničnih angiopat-skih komplikacija u vidu mikroangiopatije i ateroskleroze (1, 2).

Dijabetes i bolesti srca uzročnici su više od 60% smrt-nih slučajeva u svetu. Preko 35 miliona ljudi u Evropi boluje od dijabetesa, a procenjuje se da će do 2030. godine 43 milio-na ljudi oboleti od ove bolesti. U Srbiji više od 630000 ljudi ima dijabetes, a čak polovina od tog broja ne zna da je bole-sno. Prema aktuelnim podacima Internacionalne federacije za dijabetes (International diabetes federation–IDF), od dijabe-tesa boluje više od 285 miliona ljudi širom sveta, a očekuje se da taj broj u narednih 15 godina poraste na 380 miliona (3). Svake godine broj obolelih od dijabetesa tip 1 (insulin zavisni dijabetes) poraste za tri procenta. Ovaj tip dijabetesa pogađa decu u najranijem uzrastu. Javlja se naglo, često i kod zdravih i vitkih ljudi. Iako još uvek nema prevencije i spada u grupu hroničnih autoimunskih bolesti, stručnjaci u samom startu sa-vetuju insulinsku terapiju. Najčešća forma dijabetesa je tip 2 (insulin nezavisni dijabetes), jer devetoro od deset ljudi ima upravo ovaj tip dijabetesa (4–6). Dijabetes tip 2 je progresivna bolest, koja sve više pogađa mlade i osobe između 35. i 64. godine. Karakteriše se dugim asimptomatskim predijabete-snim stanjem, koje može da traje godinama. Za njegov nasta-nak su, pored starenja populacije, uglavnom odgovorni ishra-na, način života i nasleđe. Povećana prevalenca dijabetesa kod radno aktivnog stanovništva, zbog dugotrajnog toka bolesti i propratnih komplikacija, višestruko povećava troškove leče-nja (7, 8).

Šećerna bolest u preinsu l inskoj er iPre otkrića insulina dijabetes melitus značio je smrtnu

presudu za milione obolelih (9). Ova bolest je poznata više od 3.500 godina. Prvi put je opisana u drevnom Egiptu kao bolest kod koje se javlja velika potreba za vodom i često i obilno mokrenje (10). Reč dijabetes je kovanica grčkog porekla (dia = kroz i betes = ići, proći, izdržati, podneti), dok je mellitus latinska reč za med ili slatko. U drugom veku grčki lekar Aretus (Aretaeus) iz Kapadokije dao je klasičan opis šećer-ne bolesti. Celzus (Celsus) i Galen takođe su spominjali ovu

bolest (11–13). Pre dva milenijuma indijski lekari Čarak (Charak) i Susruta (Sushruta) zapazili su da se muve i drugi insekti skupljaju na uzorcima urina dijabetičara, kao posledi-ca njihovog slatkog ukusa. Slično tome, čuveni persijski lekar Avicena (Avicenna) u Bagdadu pre jednog milenijuma pisao je o šećernoj bolesti, naglašavajući pri tom slatki ukus urina (12). Avicena je, pored toga, svrstao dijabetičare u dve grupe (mlađi, mršavi pacijenti i starije, gojazne obolele osobe) (11–13). Više od dve hiljade godina verovalo se da je dijabetes bolest koja primarno pogađa bubrege i bešiku. Ovakvo stano-vište osnaženo je 1776. godine, kada je Metju Dobson (Matthew Dobson) dokazao prisustvo povećane koncentraci-je šećera u krvi dijabetičara (14). Međutim, izvor glukoze u urinu nije bio poznat. S tim u vezi, 1857. godine Klod Bernar (Claude Bernard) opisao je glikogen kao produkt metaboli-zma glukoze u jetri i predložio koncept prema kome je izme-njen metabolizam glukoze uzrok šećerne bolesti (15). Student medicine Pol Langerhans (Paul Langerhans) je 1869. godine prvi opisao ostrvca u pankreasu koja sadrže ćelije koje luče insulin (Langerhansova ostrvca), ne shvatajući, tom prilikom, njihov značaj (16, 17). U toku opsade Pariza 1870. godine, za vreme Francusko-Pruskog rata, niskokalorijska dijeta uticala je na smanjenje prevalence dijabetesa kod odraslih osoba kod kojih je u zrelom dobu otpočela bolest. Francuski lekar Lansero (Lancereaux) je na osnovu svojih kliničkih zapaža-nja 1887. godine pretpostavio da unutrašnja sekrecija pankre-asa može biti umešana u nastanak i razvoj dijabetesa. Njegova pretpostavka je potvrđena 1889. godine kada su nemački is-traživači Jozef fon Mering (Josef von Mehring) i Oskar Minkovski (Oscar Minkowski) u Univerzitetu u Strazburu izvršili uklanjanje pankreasa psima, i na taj način izazvali ek-sperimentalni dijabetes, koji je praćen izrazitom glikozurijom (18). Tako je istraživanje eksperimentalnog dijabetesa u prve dve decenije prošlog veka dodatno povećalo interesovanje na-učnika za ovu bolest. U tom periodu Džon Maklaud (John James Richard Macleod), kanadski fiziolog škotskog pore-kla, u Univerzitetu u Klivlendu, a zatim u Univerzitetu u Torontu, bavio se mehanizmima koji dovode do glikozurije (19–22). Njegova teorija da interna sekrecija pankreasa uglav-nom pogađa jetru, proistekla je iz prethodno publikovanih podataka, prema kojima podvezivanje artetije koja prenosi krv do jetre (a. hepaticae) može da spreči hiperglikemiju na-kon pankreatektomije. Istraživanja Džona Maklauda doprine-la su razumevanju regulacije metabolizma glukoze u jetri i rasvetljavanju funkcije glikogenaze u ovom organu. Uz to, Maklaud je na psima kojima je uklonjen pankreas ispitivao da li interna sekrecija pankreasa ima uticaj na metabolizam glu-

PRIČA O INSULINU–90 GODINA OD OTKRIĆA KOJE JE PROMENILO SVET

Doc. dr Danijela Vučević1, Prof. dr Tatjana Radosavljević1

1Institut za patološku fiziologiju ‘’Ljubodrag-Buba Mihailović’’, Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu, Srbija

108

Medicinski podmladakPoseban članak


koze u mišićima (22). Istovremeno, preduzeta su brojna istra-živanja sa ciljem da se izoluje pankreasni hormon. Tako je Skot (Scott) u okviru svog istraživačkog projekta u Kolumbija univerzitetu, 1912. godine publikovao rezultate svog istraži-vanja, po kojima ekstrakt pankreasa može da smanji glikozu-riju kod pasa kojima je izvršena pankreatektomija (23). Skotov eksperimentalni metod se zasnivao na podvezivanju pankrea-snih izvodnih kanala. Ova ligacija dovodila je do atrofije žle-zda i produkcije digestivnih enzima, koji su, zatim, po Skotovom mišljenju bili odgovorni za destrukciju interne se-krecije i toksične reakcije pankreasnih ekstrakata. Međutim, Skot je nakon svog eksperimenta u kome injekcija ekstrakta pankreasa mačkama povećava šećer u krvi napustio ovu vrstu istraživanja (24). Nasuprot tome, Karlson (Carlson) i Ginzburg (Ginsburg) objavili su da infuzija krvi zdravih pa-sa kod depankreatizovanih pasa dovodi do primetnog smanje-nja hiperglikemije i glikozurije, čak i kada zapremina prime-njene infuzije iznosi 1/10 od ukupne zapremine krvi (25). Sledeći veliki napredak u istraživanju eksperimentalnog dija-betesa predstavljaju studije koje je na psima sa parcijalnom pankreatektomijom vršio Frederik Alen (Frederick Allen), američki renomirani dijabetolog tog vremena. Njegovi ekspe-rimenti su se odnosili ne efekte groznice, infekcije, hladnoće i intoksikacije (26, 27). Na samom početku prošlog veka, Alen je zapazio da dotadašnji animalni eksperimentalni model še-ćerne bolesti baziran na totalnoj pankreatektomiji dovodi do ketoacidoze i uginuća životinje u toku 24 do 48 časova. On je poboljšao ovaj model uvođenjem delimične pankreatektomi-je, koja je sprečavala ubrzani egzitus pasa. Tom prilikom, Alen je utvrdio da niskokalorijska dijeta ovim psima značajno produžava život. Shodno tome, ovakav način ishrane, baziran na gladovanju i označen kao Alenova dijeta, je primenjen u kliničkoj praksi. Takav vid ishrane je dijabetičarima produža-vao život nekada i godinama pre neizbežnog kraja zbog gla-dovanja, ketoacidoze ili infekcije, pa je rad na dobijanju preči-šćenog ekstrakta nastavljen. U isto vreme, vršeni su i pokuša-ji lečenja dijabetičara neprerađenim (sirovim) ekstraktom pankreasa. Nažalost, pacijenti su usled toksičnog delovanja ekstrakta razvijali sterilne abscese na mestu njegove aplikaci-je, koji su bili praćeni groznicom i hipoglikemijom. U tom

smislu, slična iskustva imao je i doktor Georg Cojlzer (Georg Zeulzer), koji je u Berlinu radio na projektu prečišćavanja pankreasnog ekstrakta, sve do izbijanja Prvog svetskog rata 1914. godine. S druge strane, Nikolae Paulesku (Nicolae Paulescu) je pokazao da aktivni princip ekstrakta pankreasa eksperimentalnih životinja, koga je označio imenom pankre-atin, može ne samo da snizi koncentraciju glukoze u krvi, već i da poveća sadržaj glikogena u jetri. Međutim, njegovi ekspe-rimenti grubo su završeni kada je Bukurešt okupiran 1916. godine. U avgustu 1921. godine, Paulesku je objavio rezultate svog rada na francuskom jeziku, tako da su neki istraživači ove naučne oblasti ostali uskraćeni za pravovremeno sagleda-vanje značaja Pauleskove studije (28).

Otk r iće insu l inaOtkriće insulina predstavlja jedno od najvećih medi-

cinskih dostignuća svih vremena. Frederik Grant Banting (Frederick Grant Banting), kanadski hirurg i fiziolog, sma-trao je da Langerhansova ostrvca stvaraju hormon koji kon-troliše nivo glukoze u krvi.

Slika 2. Frederick Banting (desno) I Charles Best (levo) u kancelariji, 1924 (48)

Shvatio je, takođe, da bi adekvatno izdvojen hormon mogao da se koristi kao lek protiv dijabetesa (9). On je 1919. godine, radeći kao predavač u Univerzitetu Zapadni Ontario pročitao publikaciju doktora Mozesa Barona (Moses Barron), koji je opisao kalkulozu pankreasnog izvodnog ka-nala sa posledičnom atrofijom egzokrinog dela pankreasa. To je dalo ideju Bantingu da osmisli eksperimentalni metod, pre-ma kome podvezivanje pankreasnog izvodnog kanala izaziva destrukciju dela pankreasa koji produkuje digestivne enzime, pri čemu Langerhansova ostrvca ostaju intaktna. Banting je bio uveren da ukoliko tom prilikom dobije ekstrakt pankreasa bez digestivnih enzima, takav ekstrakt bi mogao da ukloni glikozuriju bez toksičnih neželjenih dejstava. Banting je izlo-žio svoju ideju profesoru Vilsonu (Wilson) sa kojim je radio. Pošto od svog matičnog univerziteta nije dobio odobrenje za svoje eksperimente, Banting je zahvaljujući zalaganju profe-sora Vilsona otišao kod profesora Maklauda, dekana Univerziteta u Torontu, koji je u naučnim krugovima bio po-znat i priznat istraživač metabolizma ugljenih hidrata.

Slika 1. John James Richard Macleod, kanadski fiziolog (50)



Profesor Maklaud najpre nije bio impresioniran Bantingovim istraživačkim planom. Međutim, posle ponovnog razmatranja celokupnog eksperimentalnog protokola, u maju 1921. godine dao je dozvolu Bantingu da koristi univerzitetsku laboratoriju za istraživanje, i omogućio svom saradniku Čarlsu Herbertu Bestu (Charles Herbert Best) da se odmah nakon završetka studija pridruži Bantingu (29). Banting i Best su prvom psu podvezali izvodni pankreasni kanal, i nakon razvoja atrofije pankreasa, pankreas izvadili, samleli i filtrirali, da bi, potom, njegov ekstrakt ubrizgali drugom psu kome je prethodno izvr-šena pankreatektomija. Ubrizgani ekstrakt je ispoljavao hipo-glikemijsko delovanje, uz istovremeni razvoj sterilnih absce-sa i opštih toksičnih reakcija. Banting i Best su nastavili sa eksperimentima sve do zime. U tom periodu su koristili i ek-strakte goveđeg pankreasa, koje su dobijali iz klanica. Krajem 1921. godine počeli su da koriste alkohol u postupku ekstraho-vanja aktivne komponente pankreasnog ekstrakta. Profesor Maklaud je tim povodom predložio da se u istraživanje uklju-či stručnjak za ekstrahovanje tkiva, profesor Džejms Kolip (James Bertram Collip), iz Univerziteta u Edmontonu. Profesor Kolip je napravio nekoliko modifikacija pankrea-snog ekstrakta, koristeći za testiranje zdrave zečeve. Rezultati istraživačkog tima iz Toronta prezentovani su u formi sažetka u okviru 34. godišnjeg okupljanja Društva američkih fiziolo-ga u decembru 1921. godine (30). Rad na ekstraktu pankreasa nastavljen je u Torontu. Početkom 1922. godine Kolip je saop-štio Bantingu da ima rešenje za dobijanje delotvornog aktiv-nog netoksičnog ekstrakta. Mardžori (Marjorie), laboratorij-ski pas, bio je prvo živo biće koje je nakon dobijanja ekstrakta označenog kao isletin preživelo bez toksičnih sporednih efe-kata, pri čemu je šećer u krvi značajno pao. O svom otkriću obavestili su profesora Maklauda, koji je za izdvojeni hormon isletin predložio naziv insulin (31). U toku 1922. godine obja-vljena su dva članka o efektima insulina na zdrave zečeve i zečeve sa hiperglikemijom (32, 33). Tim iz Toronta je 1922. godine na godišnjem okupljanju Društva američkih fiziologa prezentovao rezultate svojih daljih istraživanja efekata insuli-na, koji su, potom, objavljeni u celini (34–37). Rezultati su impresionirali doktora Eliota Džozlina (Elliott Joslin), osni-

vača čuvene Joslin klinike, kao i doktora Klouza (Clowes), direktora Eli Lili farmaceutske kompanije (Eli Lilly US drug company) koji je ponudio podršku svoje kompanije u daljim istraživanjima. Na povratku u Toronto, Banting je dobio do-zvolu profesora Maklauda da primene insulin kod ljudi. Tako je četrnaestogodišnji dečak Leonard Tompson (Leonard Thompson), koji je hospitalizovan zbog dijabetesne kome, do-bio 7.5 mL insulina u svaki glutealni predeo, pri čemu je došlo do očekivanog hipoglikemijskog dejstva, ali uz ozbiljnu tok-sičnu reakciju i sterilne abscese na mestima ubrizgavanja.

Slika 4. Leonard Thompson – prvi bolesnik koji je primio insulin (49)

Kada je dečak ponovo primljen u bolnicu u stanju sko-ro fatalne hiperglikemije, injekcija insulina je ovoga puta dala evidentne pozitivne rezultate bez neželjenih dejstava (28, 38). Banting i Best, mesec dana kasnije, objavili su svoj prvi rad o tome u februaru 1922. godine (28). Vesti o njihovom istraživa-nju ubrzo su se raširile i formalno su objavljene svetu u maju 1922. godine na Medicinskoj konferenciji u Vašingtonu. Iste godine Banting piše doktorsku disertaciju zasnovanu na svom istraživanju i postaje doktor medicinskih nauka (39). Za otkri-će insulina Banting je 1923. godine dobio Nobelovu nagradu za fiziologiju i medicinu zajedno sa Maklaudom. Smatrajući da je Nobelov komitet trebalo da nagradi čitav istraživački tim, Bating je polovinu svog iznosa ustupio Bestu, dok je Maklaud svoju polovinu novca dao Kolipu (31). Osnovana je i Bantingova fondacija za medicinska istraživanja s kapitalom od milion dolara, a prvu donaciju od 10.000 dolara je darovao sam Banting (jedan deo njegove Nobelove nagrade). Iz sred-stava ove fondacije otvoren je 1930. godine Bantingov institut (40).

Da umetnost često ide u korak s naukom potvrđuje i Branislav Nušić, koji je 15. aprila 1922. godine, dakle, u godi-ni otkrića insulina, u Politici objavio priču Šećerna bolest, ne propuštajući, pri tom, da se kao britki satiričar, na sebi svoj-stven način, osvrne na aktuelne pojave u našem društvu.

Proi z vodnja insu l inaFarmaceutska kuća Eli Lili 1923. godine počinje indu-

strijsku proizvodnju insulina iz pankreasa svinja, i ubrzo je insulin korišćen u mnogim delovima sveta (28). Kada je reč o Evropi, Avgustus Krog (Augustus Krogh), čuveni danski fi-ziolog, obratio se vlasniku danske fabrike lekova Leo phar-Slika 3. James Bertram Collip izolovao aktivni netoksični

ekstrakt označen kao isletin (51)

110

Medicinski podmladakPoseban članak


maceuticals, Avgustusu Krongštedu (Augustus Krongstedt) u vezi sa proizvodnjom insulina u Danskoj. U tom cilju, Krongšted je iskoristio pomoć mladog istraživača medicine Hansa Kristijana Hagedorna (Hans Christian Hagedorn). Njegovom zaslugom patent za proizvodnju goveđeg insulina dat je Kolipu i Bestu, koji su ga odneli na Univerzitet u Toronto, gde je patent odobren. Uskoro je Leo pharmaceuti-cals otpočeo sa proizvodnjom insulina u Danskoj, koja je ka-snije dovela do osnivanja Novo Nordiska ( Novo Nordisc) (41).

Hans Kristijan Hagedorn je 1946. godine počeo da snabdeva tržište lekova novim oblikom insulina sa dugotraj-nim dejstvom. Naime, kada je insulin izolovan prvi put, ispo-ljavao je svoje dejstvo u relativno dugačkom vremenskom periodu. Međutim, sa procesom prečišćavanja, dužina njego-vog delovanja je postajala sve kraća i kraća. Shodno tome, učinjen je napor da se pronađe pogodan protein koji bi mogao da produži dejstvo preparata insulina bez alergijskih manife-stacija. Takav protein je protamin, molekulske težine 4 kDa, nađen u ribljoj semenoj tečnosti. Kada se on kombinuje sa goveđim insulinom i malom količinom cinka, formiraju se dugački kristali koji sporo disosuju, dajući insulin sa osmoča-sovnim dejstvom poznatim pod nazivom NPH (Neutral pro-tamine hagedorn). Ista organizacija je 1956. godine, predvo-đena Šlihtkrulom (Schlichtkrull) i Molerom (Moller), proi-zvela Lente insulin, tj. insulin sa dodatkom cinka. Lente insu-lin stvara kristale u vidu kockastih blokova, koji dodatno produžavaju vreme dejstva preparata na dvanaest časova. Međutim, kockasti kristalni blokovi se postrojavaju u regular-ne grupe, uzrokujući otežan transport leka do ciljnih tkiva (43–45).

Insulin je zaslužan za još jednu Nobelovu nagradu, ka-da je 1958. godine britanski hemičar Frederik Senger (Frederick Sanger) odredio njegovu strukturu. Štaviše, insu-lin je bio prvi protein kome je određena sekvenca aminokise-lina. Senger je pokazao da insulinski preparati raznih vrsta sisara imaju slične, ali ne i identične molekulske strukture. Njegovi radovi su postavili hemijsku osnovu za proučavanje specifičnosti proteina po vrstama i bacili novu svetlost na pro-blem evolucije živih bića (31).

Slika 5. Frederick Sanger, prvi odredio strukturu insulina (50)

Šezdesete i sedamdesete godine prošlog veka predsta-vljale su uvod u dobijanje prečiščenog monokomponentnog insulina, kao i prelaz sa goveđeg na svinjski insulin, koji se razlikuje od humanog insulina za jednu do tri aminokiseline. Osamdesetih godina prošlog veka humani insulin proizveden je korišćenjem tehnologije rekombinacije dezoksiribonukle-inske kiseline (DNK), korišćenjem bakterije E.coli ili pekar-skog kvasca (Saccharomyces cerevisiae) (4).

Inovacija relativno novijeg datuma je sintetski insulin, nastao substitucijom raznih aminokiselina u proteinskim lan-cima, rezultujući preparatima insulina različite dužine dej-stva. U poslednje vreme u cilju postizanja veoma oštrih i za-htevnih vrednosti koncentracije glukoze u krvi, primenjuje se insulinska pumpa. Ona predstavlja poseban aparat kojim se može vrlo precizno i dugotrajno optimalno dozirati insulin. Insulinska pumpa se sastoji od kompjuterskog sistema i rezer-voara insulina. Pacijent je na sebi nosi spolja, najčešće za po-jasom. Primenjuje se kod pacijenata kod kojih je nemoguće drugačije postići terapijski uspeh, a naročito je raširena njena primena kod trudnica i osoba sa visokim rizikom za nastanak komplikacija (8).

Insulin je prvi protein za koji je dokazano da ima hor-monsko delovanje, prvi protein koji je kristaliziran, prvi pro-tein kojem je određena struktura, prvi protein koji je sinteti-san hemijskim tehnikama, prvi protein za koji je ustanovljeno da nastaje iz većeg molekulskog prekursora i prvi protein pri-premljen tehnologijom rekombinacije DNK za komercijalnu upotrebu. Međutim, uprkos ovoj impresivnoj listi “prvoga”, još uvek nije u potpunosti proučena uloga insulina u metabo-ličkim procesima u organizmu. Stoga, čitavu armiju istraži-vača i lekare dijabetologe kao svojevrsni izazov i dalje ”negde nešto neverovatno čeka da bude otkriveno.”

Literatura1. Manojlović D i sar. Interna medicina. Savremena admini-

stracija, Beograd, 2000.2. Masharani U. Diabetes mellitus and hypoglycemia. In:

McPhee SJ, Papadakis MA, eds. Current medical diagno-sis and treatment. Mc Graw Hill, New York, 2011, pp. 1140–88.

3. International Diabetes Federation. IDF diabetes atlas. Brussels: International Diabetes Federation; 2009.

4. Juvenile Diabetes Foundation http://www.jdf.org.index.html

5. Skyler JS. Type 1 Diabetes Trial Net Study Group. Update on worldwide efforts to prevent type 1 diabetes. Ann N Y Acad Sci 2008;1150:190–6.

6. Screening for type 2 diabetes mellitus in adults: US pre-ventive services task force recommendation statement. Ann Intern Med 2008;148(11):846–54.

7. Schwarz PEH, Li J. The finnish diabetes risk score is as-sociated with insulin resistance and progression towards type 2 diabetes. J Clin Endocrinol Metab 2009;94:920–6.

8. American Diabetes Association. Standards of medical care in diabetes. Diabetes Care. 2011;34:11–61.

9. Balkin Dž. Velika otkrića: Sto naučnika koji su promenili svet. Beograd: Laguna; 2010.



10. Goldfine ID, Youngren JF. Contributions of the American Journal of Physiology to the discovery of insulin. Am J Physiol Endocrinol Metab 1998;274:E207-E9.

11. Bandelin FJ. Insulin and Diabetes. Our modern medicines: Their origin and impact. Hankinson ND: Woodline pub-lishers, 1986, pp. 89–98.

12. Major RH. A history of medicine. Oxford, UK: Blackwell Scientific, Oxford, UK, 1954, vol. I, pp. 74–91.

13. Schneider T. Diabetes through the ages: a salute to insulin. S Afr Med J 1972;46:1394–1400.

14. Dobson M. Nature of the urine in diabetes. Med Obs Inqu 1776;(5):298–310.

15. Bernard C. De suc pancreatique et son role dans phe-nomenes de las digestion. C R Soc Biol 1857;1:99–101.

16. Langerhans P. Beitrage zur Mikroskopischen Anatomie de Bauchspeicheldrusse. Berlin, 1869.

17. Murray I. The search for insulin. Scott Med J 1969;14:286–93.

18. Von Mering J, Minkowski O. Nach pancreas extirpation. Arch Exp Pathol Pharmakol 1890;26:371–81.

19. Macleod JJR. Studies in experimental glycosuria. The cause of the hyperglycaemia produced by asphyxia. Am J Physiol 1909;23:278–302.

20. Macleod JJR, Pearce RG. Studies in experimental glycos-uria. The distribution of glycogenolytic ferment in the animal body, especially of the dog. Am J Physiol 1910;25:255–91.

21. Macleod JJR, Pearce RG. Studies in experimental glycos-uria. The amount of glycogenase in the liver and in the blood issuing from it, as affected by stimulation of the great splanchnic nerve. Am J Physiol 1911;28:403–21.

22. Macleod JJR, Pearce RG. The sugar consumption in nor-mal and diabetic (depancreated) dogs after evisceration. Am J Physiol 1913;32:184–99.

23. Scott EL. On the influence of intravenous injections of an extract of the pancreas on experimental pancreatic diabe-tes. Am J Physiol 1912;29:306–10.

24. Scott EL. The relation of pancreatic extract to the sugar of the blood. Proc Soc Exp Biol Med 1913;10:101–3.

25. Carlson AJ, Ginsburg H. The influence of blood transfu-sion on the hyperglycemia and glycosuria of pancreatic diabetes in the dog. Am J Physiol 1915;36:280–93.

26. Allen FM. The internal pancreatic function in relation to body mass and metabolism. The influence of fever and in-toxication. Am J Physiol 1920;54:375–81.

27. Allen FM. The internal pancreatic function in relation to body mass and metabolism. The influence of cold. Am J Physiol 1921;54:425–38.

28. Alberti G. Lessons from the history of insulin. Diabetes Voice 2001;46(4):33–4.

29. Shampo MA, Kyle RA, John JR. Macleod–Nobel Prize for discovery of insulin. Mayo Clin Proc 2006;81(8):1006.

30. Banting FG, Best CH, Macleod JJR. The internal secre-tion of the pancreas (Abstract). Am J Physiol 1922;59:479.

31. Pavlović B, Pavlović V. Leksikon Nobelovaca. Naučna el-ita 20. veka. Beograd: Prosveta; 2007.

32. Banting FG, Best CH, Macleod JJR, Noble EC. The effect of pancreatic extract (insulin) on normal rabbits. Am J Physiol 1922;62:162–76.

33. Banting FG, Best CH, Macleod JJR, Noble EC. The ef-fects of insulin on experimental hyperglycemia in rabbits. Am J Physiol 1922;62:559–80.

34. McCormick NA, Macleod JJR, O’Brien K, Noble EC. Experiments on the mechanism of action of insulin. Am J Physiol 1923;63:389–90.

35. Best CH, Macleod JJR. Some chemical reactions of insu-lin. Am J Physiol 1923;63:390–1.

36. Banting FG, Best CH, Doffin GM, Gilchrist JA. Quantitative parallelism of effect of insulin in man, dog and rabbit (abstract). Am J Physiol 1923;63:391.

37. Collip JB. Delayed manifestation of the physiological ef-fects of insulin following the administration of certain pancreatic extracts. Am J Physiol 1923;63:391–2.

38. Banting and Best biography. File://E:\banting-biogra-phy-20477.htm

39. Shampo MA, Kyle RA. Frederick Banting–Nobel Laureate for discovery of insulin. Mayo Clin Proc 2005;80(5):576.

40. Šercer A, Grmek MD i suradnici. Medicinska enciklope-dija. Jugoslavenski leksikografski zavod, Zagreb, 1967.

41. Herrington GM. The discovery of insulin. Alabama Med 1995;64:6–12.

42. Bliss M. Banting: A biography. University of Toronto Press, Toronto, 1984.

43. Bliss M. The discovery of insulin. The University of Chicago Press, Chicago, 1982.

44. Bliss M. The Danish Connection. Unpublished lecture de-livered at the steno centre for diabetes, Copenhagen, 1996.

45. Brange J. Galenics of insulin. Springer-Verlag, Berlin, 1987.

46. Medvei VC. The history of clinical endocrinology. The parthenon publishing group, Carnforth, 1992.

47. The discovery of insulin: Banting, Best, Collip, Macleod. On line history resource centre http://www.discoveryofin-sulin.com

48. http://en.wikipedia.org/wiki/File:C._H._Best_and_F._G._Banting_ca._1924.png#filelinks

49. http://loretoscience.files.wordpress.com/2012/01/thomp-son.jpg

50. http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laure-ates/1958/sanger.htm

51. http://www.folio.ualberta.ca/article.cfm?v=74754&i=73957&a=8


Medicinski podmladak

UPUTSTVO AUTOR IM A

Me di cin ski pod mla dak je na uč no-struč ni ča so pis stu de na ta Me di cin skog fa kul te ta Uni ver zi te ta u Be o gra-du. Pr vi broj ča so pi sa pu bli ko van je 1949. go di ne, što ga či ni jed nim od naj sta ri jih stu dent skih ča so pi sa na Bal ka-nu. Go di šnje se ob ja vlju ju naj ma nje dva bro ja. Po po tre bi, štam pa ju se i su ple men ti po je di nim bro je vi ma. Mo guć nost ob ja vlji va nja ra do va po sto ji za sve za in te re so va ne stu den-te sa svih uni ver zi te ta, ka ko do ma ćih ta ko i stra nih. Ča so-pis ima svoj Izdavački sa vet i od go vo ran je Ko mi si ji za na-uč no-is tra ži vač ki rad Me di cin skog fa kul te ta u Be o gra du.

Cilj Me di cin skog pod mlat ka je da za in te re su je i pod stak ne stu den te me di ci ne za na uč no-is tra ži vač ki rad, da ih in for mi še o naj no vi jim do stig nu ći ma u obla sti bio-me di cin skih na u ka i olak ša pri pre ma nje is pi ta.

Uslo vi ko ji mo ra ju bi ti is pu nje ni:Me di cin ski pod mla dak ob ja vlju je ra do ve ko ji ra ni je ni-

su pu bli ko va ni i za dr ža va pra vo od re đi va nja re do sle da nji ho-vog štam pa nja. Re do sled ko jim se ra do vi ob ja vlju ju ne od ra-ža va vred nost ra da. Pri mlje ni ra do vi se ne vra ća ju. Uz rad, na po seb nom pa pi ru for ma ta A4 tre ba do sta vi ti:

1. Propratno pismo autora2. Izjavu mentora, da rad nije do sada (delimično ili u ce-

losti) publikovan ili prihvaćen za publikovanje u nekom drugom časopisu.

3. Dve odštampane anonimne kopije rada 4. Kompletan materijal u elektronskoj formi poslati na

e-mail adresu: [email protected]

Pri pre ma ru ko pi sa:Rad tre ba da bu de pi san u pro gra mu Word for Windows

(ver zi ja 7.0 ili no vi ja), na be lom pa pi ru for ma ta A4, sa dvo-stru kim pro re dom (do u ble spa cing) i mar gi na ma od 2,5 cm (gor nja, do nja, le va i de sna). Font tre ba da bu de Ti mes New Ro man, ve li či na slo va 12 pt, kod ni ras po red CP 1250 (Ser bian La tin). Ni je do zvo lje na upo tre ba ita lic i bold slo va.

Ra do ve sla ti u tri ano nim ne ko pi je (bez ime na auto ra, ko a u to ra i men to ra), od štam pa ni na la ser skom štam pa ču (La-ser Jet) ili kva li tet nom InkJect štam pa ču. Uz ru ko pis do sta vi-ti kom ple tan ma te ri jal i u elektronskoj formi.

Pri spe li ra do vi pod le žu re cen zi ji. Za re cen zi ra nje ra-do va Ured ni štvo ča so pi sa an ga žu je kom pe tent ne re cen zen te (ko ji su ano nim ni). Even tu al ne su ge sti je ured ni ka i re cen ze-na ta do sta vlja ju se auto ru ra di ko rek ci je. Ko ri go va ni ma te ri jal mo ra se do sta vi ti re dak ci ji ča so pi sa u ro ku od se dam da na od da na pri je ma zah te va za ko ri go va nje.

De lo vi ra da:Rad mo ra sa dr ža ti sle de će de lo ve: na slov nu stra nu, ab-

strakt sa ključ nim re či ma i tekst. Obim ra da ne sme da pre đe 10 stra ni ca (od no sno 36000 slov nih me sta).

Na slov na stra na sa dr ži: na slov ra da ko ji mo ra bi ti kra-tak (ne vi še od 15 re či), ja san, in for ma ti van; pu na ime na i pre zi me na auto ra i men to ra; naj vi ša na uč na i struč na zva nja auto ra i men to ra. Na vo di se i pun na ziv usta no ve u ko joj je rad re a li zo van, kao i me sto u ko me se ona na la zi.

Sa že tak (ab strakt) se ku ca na dru goj stra ni ci i sa dr ži naj vi še 250 re či. Sa že tak tre ba da sa dr ži cilj ra da, bit ne ele-men te me to do lo gi je, kon ci zno iz ne te re zul ta te sa de ta lji ma iz

ko jih pro iz i la zi za klju čak. Ispod sa žet ka na ve sti 3–5 ključ ni re či. Sa že tak se pi še na srp skom i en gle skom je zi ku.

Tekst - či ne sle de ći de lo vi: uvod, ma te ri jal i me to de, re zul ta ti, di sku si ja (IMRaD) i li te ra tu ra. Za klju čak mo že da bu de u vi du po seb nog po gla vlja ili se iz no si u po sled njem pa-su su di sku si je.• Uvod - sa dr ži li te ra tur ne po dat ke o pro ble mu ko ji se u ra-

du ob ra đu je. Pre gled po zna tih či nje ni ca ne sme da bu de pre dug ali mo ra ja sno da oprav da za što je pred u ze to is tra-ži va nje ko je se ra dom pred sta vlja. Ta ko đe se na vo de osnov ne hi po te ze i cilj ra da.

• Ma te ri jal i me to de - de talj no i pre ci zno opi sa ti spro ve de no po sma tra nje ili eks pe ri ment. Na ve sti broj, sta ro snu dob, pol i dru ge ka rak te ri sti ke is pi ta ni ka, uko li ko se ra di o hu-ma noj po pu la ci ji. Uko li ko se ra di o eks pe ri men tal nim ži-vo ti nja ma, na ve sti vr stu, broj, sta rost, pol i dru ge ka rak te-ri sti ke ko ri šće nih ži vo ti nja. Na ve sti ime na me to da ko je su upo tre blja va ne u to ku ra da kao i ta čan na ziv apa ra ta (mo-del, pro iz vo đač). Kod na vo đe nja ime na le ko va, ko ri sti ti ge ne rič ki na ziv, a u za gra di na ve sti re gi stro va no ime le ka. Po red na zi va le ka na ve sti i do zu i na čin apli ka ci je (i.m, i.v, per os itd.). Opi sa ti sta ti stič ke me to de ko ri šće ne to kom ob-ra de re zul ta ta. Ko ri sti ti mer ne je di ni ce SI si ste ma.

• Re zul ta ti - pred sta vi ti ih lo gič nim re do sle dom u tek stu, ta-be la ma i ilu stra ci ja ma. Sva ki od pri lo ga mo ra sa dr ža ti od-go va ra ju će tek stu al no ob ja šnje nje, ali ne po na vlja ti u tek-stu sve po dat ke pri ka za ne u ta be la ma ili u ilu stra ci ja ma. Ob u hva ti ti i re zi mi ra ti sa mo zna čaj ne na la ze.

• Di sku si ja - sa či nje na je od ana li ze do bi je nih re zul ta ta u po re đe nju sa već ob ja vlje nim, po zna tim re zul ta ti ma. Izbe-ga va ti tvrd nje i za ključ ke ko je re zul ta ti u pot pu no sti ne po dr ža va ju.

• Li te ra tu ra - re fe ren ce tre ba nu me ri sa ti re do sle dom ko jim su pr vi put na ve de ne u tek stu. Iden ti fi ko va ti re fe ren ce u tek stu, ta be le i le gen de arap skim bro je vi ma u za gra da ma. Izbe ga va ti ko ri šće nje ab strak ta kao re fe ren ce. Re fe ren ce na vo di ti po uzo ru na na vo đe nje li te ra tu re u „Srp skom ar-hi vu“ kao što je pri ka za no pred sto je ćim pri me ri ma:

• Čla nak iz ča so pi sa: Na e ser MA, Ale xan der MP, Helm-Esta bro oks N. Ap ha sia

with pre do mi nantly sub cor ti cal le sion si tes. De scrip tion of three cap su lar / pu ta mi nal ap ha sia syndro mes. Arch Ne u-rol 1982; 39:2–14.

(na ve sti ime na svih auto ra. Uko li ko je u ra du na ve de no vi še od šest auto ra, na ve sti ime pr vog i dru gog auto ra i „i sa rad ni ci“ ili et al.).

• Mo no gra fi ja: Blu me WT, Ka i ba ra M. Atlas of adult elec tro-en cep ha lo-

graphy. New York: Ra ven Press, 1994.• Po gla vlje knji ge: Ma isch B, Ri stic AD, Funck R. Di la ted car di omyopat hi es

and con ge sti ve he art fa i lu re. In: Sin gal PK, Di xon IMC, Kir shen ba um LA, Dhal la NS, edi tors. Car di ac Re mo de-ling and Fa i lu re. Bo ston-Dor drecht-Lon don: Kluwer Aca-de mic Pu blis hers; 2003. p.35–65.

• Knji ga: Se fe ro vic PM, Spo dick DH, Ma isch B, edi tors, Mak si mo-

vic R, Ri stic AD, asoc. Edi tors. Pe ri car di o logy: Con tem-


Medicinski podmladak

po rary An swers to Con ti nu ing Chal len ges. Be o grad: Na u-ka; 2000.

Spi sak pri lo ga sva ki pri log se sta vlja na po se ban list nu me ri san u gor njem le vom uglu sa: Pri log I, Pri log II... Ispod sva kog pri lo ga tre ba na pi sa ti tek stu al no ob ja šnje nje pri lo ga.

Sr da čan po zdrav bu du ćim sa rad ni ci ma!

Ured ni štvo ča so pi sa.

e-mail: me di cin ski pod mla [email protected]


Medicinski podmladakMedical Youth

I NSTRUCTIONS FOR AUTHORSMedical Youth is a scientific-professional journal of

the students of Medical Faculty, University of Belgrade. The first issue of the journal was published in 1949, mak-ing it one of the oldest student journals in the Balkans. At least two issues are being published annually. Supplements to some issues are also printed as needed. The option to publish papers is available to all interested students from all universities, both national and international. The jour-nal also has the Advisory Board, under the auspices of the Council for Reserach of the Medical Faculty in Belgrade.

The goal of the Medical Youth is to raise interest and motivate medical students to do research, to inform them on the latest accomplishments in the field of biomed-ical sciences and facilitate preparation for exams.

Conditions to be fulfilled:Medical Youth publishes papers which were not pu-

blished previously and reserves the right to establish the order of printing. The order in which the papers are printed does not reflect the value of a paper. Prepared papers are not being re-turned to authors. The paper should be supplemented with a separate A4 sheet with the following:

1. The cover letter2. Statement from the supervisor that the paper was not

previously (partially or fully) published or accepted for publishing in another journal.

3. Two anonymous printed copies of the paper (without name of authors, supervisor)

4. Electronic version of the paper, delivered in person or by e-mail: [email protected]

Preparation of manuscript:Papers, in Serbian language, are to be written using

Word for Windows (version 7.0 or later), printed on white A4 paper, with double line spacing and 2.5 cm margins (top, bot-tom, left, right). Font is Times New Roman, font size 12 pt., code page CP 1250 (Serbian Latin). For papers written in English, rules are equal except for the code page which is 1252 (English (United States)). The use of italic and bold is not permitted.

Papers are to be sent in three anonymous copies (wit-hout names of authors, co-authors and supervisor), printed on laser jet or quality ink jet printer. The manuscript is to be sup-plemented with full material in electronic format (virus free).

The submitted papers are subject to review. The Editorial Board of the journal hires competent reviewers (who remain anonymous) for review of papers. Possible suggestions of editors and reviewers are forwarded to the author for cor-rection. Corrected material is to be delivered to the Editorial Board of the journal seven days upon receiving the request for correction.

Sections of the paper:The paper must contain the following segments: the

front page, abstract with keywords and text. Volume of the paper must not exceed 10 pages (36,000 characters).

The front page contains the headline which must be short (not more than 15 words), clear, informative; full first and last names of authors and supervisors, the highest scienti-fic and professional titles of the authors and supervisors. The

full name and domicile of the institution where the paper has been produced is also noted.

The abstract is to be typed on the second page, conta-ining not more than 250 words. The abstract should contain the objective of the paper, important elements of methodolo-gy, concisely presented results with details serving as the ba-sis for the conclusion. Below the abstract, list 3 – 5 keywords. The abstract is written both in Serbian and English.

The text consists of the following parts: Introduction, Material and methods, Results, Discussion (IMRaD) and References. Conclusions may be given in the form of a sepa-rate chapter or presented in the final paragraph of the Discussion.· Introduction – contains data from literature on issue

presented in the paper. Overview of familiar facts must not be too long and must clearly justify the reasons for the research presented in the paper. Basic hypotheses and aim of the paper are also presented.

· Material and methods – elaborate in detail and with pre-cision observation or experiments performed. List num-ber, age, gender and other characteristics of subjects, if the subject is human population. If experiments are per-formed on animals, list species, number, age, gender and other characteristics of animals used. List names of methods to be used in research and the exact name of an appliance (model, manufacturer). When listing names of medications, use generic name and registered name in brackets and note application method (i. m, i. v, p. o…). Describe statistical methods used for results processing. Use SI measurement units.

· Results – are to be presented in logical order in the text, tables and illustrations. Each of the annexes must contain appropriate textual elaboration, but without repeated en-tire content of tables and illustrations in the text. Cover and overview significant findings only.

· Discussion – consists of the analysis of results obtained against previously published, known results. Avoid claims and conclusions not fully supported by the results.

· References – should be numbered according to the first appearance in the text. Identify references in the text, ta-bles and legends with Arabian numbers in brackets. Avoid using abstracts as references. List references according to the listing in the “Serbian Archives of Medicine”, as noted in the following examples:

· Article from the journal: Naeser MA, Alexan der MP, Helm Estabrooks N. Aphasia

with predominantly subcortical lesion sites. Description of three capsular / putaminal aphasia syndromes. Arch Neurol 1982; 39:2–14.

(List names of all authors. If the paper lists more than six authors, include the first author and designation “with as-sociates” or et al).

· Monograph Blume WT, Kaibara M. Atlas of adult electro encephalog-

raphy. New York: Raven Press, 1994.· Book chapter: Maisch B, Ri stic AD, Funck R. Dilated cardiomyopathies

and congestive heart failure. In: Singal PK, Dixon IMC, Kirshen baum LA, Dhalla NS, editors. Cardiac Remodeling


Medicinski podmladakMedical Youth

and Failure. Boston Dordrecht London: Kluwer Academic Publishers; 2003. p. 35–65.

· Book Seferovic PM, Spodick DH, Maisch B, editors, Maksimovic

R, Ristic AD, asoc. Editors. Pericardiology: Contemporary Answers to Continuing Challenges. Beograd: Nauka; 2000.

List of annexes – Each annex is placed on a separate sheet designated with “Annex I”, “Annex II”, etc, in the top left corner. Textual explanation is to be written under every annex.

Kindest regards to all future contributors!

Editorial Board of the Journal

e-mail: [email protected]

We inform all students that the option to submit ma-nuscript is available throughout the year. For the upcoming issue, submission deadline is going to be announced afte-rwards. Students who are interested in publishing papers, for further information can contact us by e-mail [email protected].

Scientific – professional journal

Medical Youth

CIP - Каталогизација у публикацијиНародна библиотека Србије, Београд

61(497.11)

MEDICINSKI podmladak = Medical youth :naučni časopis studenta Medicinskog fakultetaUniverziteta u Beogradu / glavni i odgovorniurednik Miloš Branković. - God. 1, br. 1(1949)-. - Beograd : Medicinski fakultet,Univerzitet u Beogradu, 1949- (Beograd :BeoSing). - 24 cm

Godišnje.ISSN 0369-1527 = Medicinski podmladakCOBISS.SR-ID 94773004

Documents

Волуме 63, број 1-2