实验二 经口急性毒性试验Acute Oral Toxicity Test

Dept. of Toxicology

School of Public Health

Xinjiang Medical University

目的要求

掌握实验动物的常用染毒途径和方法。

掌握半数致死浓度的测定方法和结果评定。

实习内容

试验动物的选择和性别鉴定。

试验动物的称重、编号以及随机分组方法。

急性毒性试验常用染毒途径和方法。

急性毒性反应的观察和 LD50计算。

实验材料 ( 一 ) 实验动物：健康成年小鼠或大鼠若干只。( 二 ) 器材 注射器 (O.25 ， 1 ， 2 ， 5ml) 、吸管 (0.1 ， 0.2 ，0.5 ， 1 ， 2 ， 10m1) 、容量瓶 (10 ， 25 ， 50ml 、烧杯 (10 ，25 ， 50ml) 、滴管、灌胃针 ( 大鼠、小鼠适用 ) 、电子天平( 感应量 1/10000g) 、动物体重秤、外科剪刀、镊子。( 三 ) 试剂 受试化学物为氟化钠 (NaF ，分析纯 ) ，苦味酸酒精饱和液或其它染色剂。

实验动物的选择 (提问 )

实验动物的性别鉴定

♀ ♂♀ ♂

小鼠（ Mouse ） 大鼠（ Rat ）

实验动物的称重 大、小鼠秤的感应量需在 0.1g 以下。同一组内、同性别动物体重差异应

小于平均体重的 10% 。不同组间同性别动物体重均值差异

应小于 5% 。急性毒性实验一般使用体重为 18-2

2g 的小鼠或 / 和 180-220g 大鼠。

实验动物编号的标记方法 颜料涂擦被毛编号法（常用于大小鼠）：

红色： 0.5% 中性红或品红溶液

黄色：黄色： 3-5%3-5% 苦味酸溶液（水苦味酸溶液（水））

80-90%80-90% 苦味酸酒精饱和溶液苦味酸酒精饱和溶液

咖啡色： 2% 硝酸银

黑色：煤焦油的酒精溶液

大小鼠标记方法（单色法 n<10 ）

单

色

法

大小鼠标记方法（单色法 n>10 ）

单色法标记原则：单色法编大于 10的号码时，我们规定顺时针旋转，后一位必需大于前一位数，例如：可以编， 12，13 ， 14……19 ，但不能编 10， 11 ， 20 ， 21 ， 22 ， 30 ， 31 ， 32 ， 33 ，等，以此类推。100 以内最大能编 89号。

大小鼠标记方法（双色法 n<10 ）

双

色

法

大小鼠标记方法（双色法 n>10 ）

红色表示十位数：

头部染红色为 10

左前

肢为 20 左

腰部为 30

黄色表示个位数。

其它标记方法

烙印编号法： 体内埋号编号法：

耳孔编号法：

挂牌编号法：

表 1 动物随机分组表

动物号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

随机数字 97 74 24 67 62 42 81 14 57 26 42 53 32 37 32

除 6 余数 1 2 0 1 2 0 3 2 3 2 0 5 2 1 2

分组 A B F A B F C B C B F E B A B

动物号 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

随机数字 27 7 36 7 51 24 51 79 89 73 16 76 62 27 66

除 6 余数 3 1 0 1 3 0 3 1 5 1 4 4 2 3 0

分组 C A F A C F C A E A D D B C F

实验动物的随机分组实验动物的随机分组

规定：

余数： 1 、 2 、 3 、 4 、 5 、 6 分别对应 A 、 B 、 C 、 D 、E 、 F 组

实验动物调配 按上法分组后， A 组有动物 7 只， B 组 7 只， C 组 6 只， D 组与 E 组各 2

只， F 组 6 只。为了使每组动物数均为 5 只，需要根据随机分配的原则再选

出 2 只 A 组和 1 只 C 组动物给 D 组。 B 组选出 2 只， F 组选出 1 只给 E 组。

组 别 鼠 号

A 1 4 14 17 19 23 25

B 2 5 8 10 13 15 28

C 7 9 16 20 22 29

D 26 27

E 12 24

F 3 6 11 18 21 30

表 2 初步分组结果

表 3 调配后 30 只动物随机分组组别 鼠号 组别 鼠号

A 1 14 17 19 23 D 4 9 25 26 27

B 5 8 10 13 15 E 2 6 12 24 28

C 7 16 20 22 29 F 3 11 18 21 30

具体方法如下：继续抄下随机数字分别除以 A 、 B 、 C 、 F 组的现有动物数，

即： 56/7(7 为 A 组现动物数 ) 整除，余数为 0 ，将 A 组第 7 只动物 (25 号 ) 调配

给 D 组；下一个： 50/6(6 为 A 组现有动物数 ) 余 2 ，将 A 组第 2 只动物 (4 号 )

调配给 D 组；接下来 26/6(6 为 C 组现有动物数 ) 余 2 ，将 C 组第 2 只动物 (9

号 ) 给 D 组。余类推，最后调整分组成表 3 所示。雌性动物也按上法分组，然后

将雌、雄动物合组进行试验。

实验动物染毒途径和方法（示教）实验动物染毒途径和方法（示教）常用的染毒途径：常用的染毒途径：

经口染毒经口染毒

经呼吸道染毒经呼吸道染毒

经皮染毒经皮染毒

注射途径染毒注射途径染毒

吸收速率：吸收速率：

静脉注射静脉注射 >> 吸入染毒吸入染毒 >>肌肉注射肌肉注射 >>腹腔注射腹腔注射 >>皮下皮下

注射注射 >> 经口染毒经口染毒 >>皮内注射皮内注射 >> 其他染毒途径如经皮等 其他染毒途径如经皮等

食道气管

By LASCO

面向自己,沿着门牙左边滑入

食道气管

By LASCO

面向自己,沿着门牙左边滑入

受试物的配制1 、受试化学物的量取

(1) 、称量法 --固体化学物

(2) 、吸量法 -- 液体化学物

2 、受试化学物的稀释

(1) 、等浓度稀释法

(2) 、等容量稀释法

KarberKarber 法或平均致死量法，是依据剂量对数与死亡率呈法或平均致死量法，是依据剂量对数与死亡率呈 SS

型曲线所包括的面积推导出死亡率为型曲线所包括的面积推导出死亡率为 50%50% 的剂量；的剂量；

此法简单，准确率高，但实验设计要求每个染毒组实验动此法简单，准确率高，但实验设计要求每个染毒组实验动

物数相同，各计量组距呈等比级数，死亡率呈常态分布，最物数相同，各计量组距呈等比级数，死亡率呈常态分布，最

低剂量组死亡率低剂量组死亡率 <20%<20% ，最高剂量组，最高剂量组 >80%>80% 。 。

寇氏法寇氏法

预实验预实验

目的是为了确定正式实验的剂量范围。目的是为了确定正式实验的剂量范围。

一般是采用少量动物一般是采用少量动物 (2~3(2~3 只为一组只为一组 )) ，拉大组距，逐，拉大组距，逐

渐缩小，找出受试物渐缩小，找出受试物 0%0% 和和 100%100% 死亡剂量。死亡剂量。

正式试验 经预试验求出受试化学物的致死剂量范围 ( 即死亡率 10

%-90% 的剂量范围 ) ，再以下式求出正式试验的剂量组距 (i) 值。

i— 表示相邻的两个剂量组，剂量对数之差或相邻两组剂量比值的对数值；

n— 为设计的剂量组数； 求得值后以最低剂量组的剂量值加上一个即是第二个剂量

组的对数剂量，依次推至最高剂量组，查各自反对数及得出各组剂量的真实值。

1-n

logLD10-logLD90i

啮齿类动物急性毒性中毒主要观察内容啮齿类动物急性毒性中毒主要观察内容（（ 11 ））

小鼠氟化钠经口急性毒性测量 小鼠氟化钠经口急性毒性测量

系统器官 观察及检查项目 中毒后一般表现

中枢神经系统及神经肌肉系统

植物神经系统

呼吸系统

行为动作对各种刺激的反应大脑及脊髓反射肌肉紧张力

瞳孔大小分泌

鼻孔呼吸性质和速率

改变姿态、叫声异常、不安、安静震颤、运动失调、麻痹、惊撅、强制性动作易兴奋、被动、缺乏知觉、知觉过敏减弱、缺乏强直、弛缓

扩大或缩小流泪、出汗

流鼻涕弛缓、困难、潮式呼吸

啮齿类动物急性毒性中毒主要观察内容啮齿类动物急性毒性中毒主要观察内容（（ 22 ））

系统器官 观察及检查项目 中毒后一般表现泌尿生殖系统

皮毛

眼睛

其他

阴户、乳腺阴茎会阴部

颜色、张力、完整性

眼硷眼球透明度

直肠或皮肤温度一般情况

肿胀脱垂、遗精污秽、有分泌物

皮肤充血、紫组、皮毛松弛、污秽

上睑下垂突出，充血，震颤混浊

降低、升高姿态不正常、消瘦

小鼠氟化钠经口急性毒性测量 小鼠氟化钠经口急性毒性测量

表表 4 4 急性毒性症状记录表急性毒性症状记录表受试物名称 :实验日期 :实验动物种系：

结构式：室 温：

组别 剂量 (mg/m3)

动物编号 性别 体重 (g) 症状出现时间 死亡时间

小鼠氟化钠经口急性毒性测量 小鼠氟化钠经口急性毒性测量

计算公式计算公式 ::

LDLD5050 的计算—寇氏法的计算—寇氏法 其中：其中： m : 1ogLDm : 1ogLD5050;;

Sm: Sm: 标准差标准差 ;;

Σp : Σp : 各组死亡率总和各组死亡率总和 ;;

p : p : 各组死亡率各组死亡率 ;;

q : 1q : 1 －－ pp

i i ：相邻两组对数值之差 ：相邻两组对数值之差 n n ： 每组动物数： 每组动物数 ;;

XXkk ：最大剂量的对数值 ：最大剂量的对数值

( 0.5)km X i p

mpq

S in

表 5 某化学物质小鼠经口染毒死亡情况

组别 剂量 动物数 死亡数 死亡率 存活率p.q

mg/kg 对数 （只） （只） （ p ） （ q ）1 15 1.1761 10 0 0 1 0

2 18 1.2561 10 2 0.2 0.8 0.16

3 21.7 1.3361 10 5 0.5 0.5 0.25

4 26.1 1.4161 10 7 0.7 0.3 0.21

5 31.3 1.4961 10 9 0.9 0.1 0.09

　 　 i=0.08 　 　 Σp=2.3 　 　

举例：举例： LDLD5050 的计算——寇氏法的计算——寇氏法

0213.010

09.021.025.016.008.0

3521.1)5.03.2(08.04961.1lg 50

mS

LD

lgLD50 及其 95% 可信限为 1.3521±1.96×0.0213＝ 1.3521±0.0417

lgLD50 及其 95% 可信区间范围为 22.50mg/kg(20.44~24.76mg/kg)

举例：举例： LDLD5050 的计算——寇氏法的计算——寇氏法

外源化学物急性毒性分级（外源化学物急性毒性分级（WHWHOO））

对人可能致死的估计量

毒性分级 大鼠一次经口LD50）（mg/kg）

6 只大鼠吸入4hr，死亡 2～4

只的浓度（ppm）

兔经皮

LD50(mg/kg) g/kg 总量（g/60kg）

剧毒 <1 <10 <5 <0.05 0.1

高毒 1～ 10～ 5～ 0.05～ 3

中毒 50～ 100～ 44～ 0.5～ 30

低毒 500～ 1000～ 350～ 5～ 250

微毒 5000～ 10000～ 2180～ >15 >1000

1mg/kg < 22.50mg/kg < 50mg/kg1mg/kg < 22.50mg/kg < 50mg/kg

该化合物大鼠急性经口毒性为高毒该化合物大鼠急性经口毒性为高毒

举例：举例： LDLD5050 的计算——寇氏法的计算——寇氏法

注意事项 灌胃染毒时要求动物保持空腹状态，因此染毒前应禁食

（不禁水） 6～ 10 小时。灌胃后至少 2～ 3 小时后才能喂食。油剂比水溶液要求限制喂食的时间更长些。

相同剂量的受试物，若以不同浓度给药，死亡情况会有所不同。常用的方法是将受试物体积固定，根据实验设计的剂量将受试物配制成不同浓度的溶液进行灌胃。

通常灌胃体积以体重的 1%～ 2% 计算，最多不超过 3% ，即每 100g 体重溜胃 l～ 2m1 ，最多不超过 3ml 。根据实际经验得出的各种实验动物灌胃量的极限是：小鼠 O.5～ 1ml ，大鼠 4～ 5m1 。