คมอ

บทปฏบตการ แบคทเรยวทยาและกณวทยาทางการแพทย

(MTH-231)

หลกสตรเทคนคการแพทย ส านกวชาสหเวชศาสตรและสาธารณสขศาสตร

มหาวทยาลยวลยลกษณ

แบคทเรยวทยาและกณวทยาทางการแพทย (MTH-231)

ส านกวชาสหเวชศาสตรและสาธารณสขศาสตร มหาวทยาลยวลยลกษณ

ค าน า

คมอปฏบตการแบคทเรยวทยาและกณวทยาทางการแพทยจดทาขนสาหรบนกศกษาสาขาเทคนค -

การแพทย สานกวชาสหเวชศาสตรและสาธารณสาธารณสขศาสตร มหาวทยาลยวลยลกษณ เพอใชประกอบการเรยนการสอนในรายวชาแบคทเรยวทยาและกณวทยาทางการแพทย (MTH-231)

คมอปฏบตการแบคทเรยวทยาและกณวทยาทางการแพทยจะแบงออกเปน 2 สวน โดยสวนท 1 จะเปนบทปฏบตการทวไปทเกยวของกบจลชววทยา และในสวนท 2 จะเปนบทปฏบตการทเนนเกยวกบแบคทเรยทางการแพทย รวมถงวธการทใชในการแยกวนจฉยเชอ ซงรายละเอยดของบทปฏบตการครอบคลมเนอหาเกยวกบกลมแบคทเรยทมความสาคญทางการแพทยทงแบคทเรยแกรมบวกและแบคทเรยแกรมลบ รวมทงเชอรา เพอใหนกศกษามทกษะพนฐานในการแยกวนจฉยกลมแบคทเรยและเชอราสาเหตของโรคได

การผลตคมอปฏบตการแบคทเรยวทยาและกณวทยาทางการแพทย เสรจสมบรณลงไดดวยการรวบรวมเนอหาและดดแปลงมาจากขอมลออนไลน ซงผเรยบเรยงขอขอบขอบพระคณเปนอยางสงไว ณ ทนดวย ทไดใชขอมลจากแหลงดงกลาวมาเรยบเรยงประกอบเนอหาจนสาเรจเปนเอกสารเลมนขนมา

มณฑล เลศคณาวนชกล

สารบญ

ปฏบตการท หนา เทคนคทางจลชววทยา i สณฐานวทยาและโครงสรางของแบคทเรย x การยอมสแบคทเรย xi

สวนท 1 1. Basic Apparatus and Common technique in Microbiological Laboratory ................................ 1 2. Microscopic examination of bacterial cells............................................................................... 9 3. Microscopic measurement of microorganisms and motility test ............................................... 12 4. Media preparation ..................................................................................................................... 16 5. Cultivation of Microorganisms from the environment .............................................................. 22 6. Gram’s Stainning ...................................................................................................................... 26 7. Sterilization and Disinfection ................................................................................................... 30 8. Antibiotic Susceptibility test..................................................................................................... 34 9. Gram positive cocci, Gram negative cocci and Gram positive bacilli ....................................... 39 10. Enterobacterianceae .................................................................................................................. 43 11. Non-fermenter,Vibrionanceae and Gram negative coccobacilli ............................................... 46 12. Identification of unknown bacteria ........................................................................................... 60 13. Anaerobes and Spirochete ........................................................................................................ 67 14. Acid Fast Bacteria .................................................................................................................... 73 15. Mycology ................................................................................................................................. 77

สวนท 2 1. AEROBIC GRAM POSITIVE COCCI FAMILY MICROCOCCACEAE. .................................................................................. 1 2. AEROBIC GRAM POSITIVE COCCI FAMILY STREPTOCOCCACEAE ................................................................................ 3 3 . การศกษาคณสมบตของ Gram Positive Cocci ......................................................................... 5 4 . AEROBIC GRAM NEGATIVE COCCI ................................................................................. 15 5 . AEROBIC GRAM POSITIVE BACILLI ............................................................................... 17

สารบญ (ตอ) ปฏบตการท หนา

6 . AEROBIC GRAM POSITIVE BACILLI ELEK’S TEST ................................................................................................................ 7. การศกษาคณสมบตของ Gram Positive Bacilli ......................................................................... .... 17 8. FAMILY ENTEROBACTERIACEAE ................................................................................... .... 17 9. FAMILY ENTEROBACTERIACEAE 2 ................................................................................ .... 17 10. FAMILY ENTEROBACTERIACEAE 3 ................................................................................. .... 17 11. FAMILY ENTEROBACTERIACEAE 4 ...................................................................................... 17 12. FAMILY VIBRIONACEAE AND GENUS CAMPYLOBACTER ........................................ .... 17 13. FAMILY PSEUDOMONACEAE AND NONFERMENTATIVE GRAM NEGATIVE BACILLI .................................................................................................... 17 14. GRAM NEGATIVE COCCOBACILLARY FACULTATIVE BACTERIA .......................... .... 17 15. MYCOBACTERIUM............................................................................................................... .... 17 16. ANAEROBE ........................................................................................................................... .... 53 ภาคผนวก .................................................................................................................................. ..... 91 การเพาะเลยงแบคทเรย เทคนคในการศกษาแบคทเรย ลกษณะการเจรญของแบคทเรยในอาหารเลยงเชอ การทดสอบทางชวเคมเพอตรวจวนจฉยแบคทเรย

รายวชาแบคทเรยวทยาและกณวทยาทางการแพทย

รหสวชา MTH-231 ชอวชา (ภาษาไทย) แบคทเรยวทยาและกณวทยาทางการแพทย ชอวชา (ภาษาองกฤษ) Medical Bacteriology and Mycology หนวยวชา (ภาคทฤษฎ) (ภาคปฏบต)

1.5 หนวย (4-6-24) (ภาคทฤษฎ 4 ชวโมงตอสปดาห ) (ภาคปฏบต 6 ชวโมงตอสปดาห)

หลกสตรเทคนคการแพทย สานกวชาสหเวชศาสตรและสาธารณสขศาสตร มหาวทยาลยวลยลกษณ ค าอธบายรายวชา ภาคปฏบตเกยวกบการเพาะเลยงและการแยกเชอแบคทเรยใหไดสายพนธทบรสทธ การศกษารปรางลกษณะ การศกษาคณสมบตทางชวเคม รวมทงการศกษาคณสมบตอนๆ เพอใชในการว นจฉยชนดของแบคทเรยทมความสาคญทางการแพทย การตรวจวนจฉยเชอราและไวรสทกอโรคในคนทมความสาคญและ /หรอพบไดบอยในประเทศไทย ตลอดจนการแกไขปญหาทางหองปฏบตการ วตถประสงค

1. เพอใหนกศกษาสามารถสงเกตลกษณะทาง macroscopic และ microscopic ของแบคทเรยและราแตล ะ ก ล มได

2. เพอใหนกศกษาสามารถแยกชนดของกลมแบคทเรยโดยใชชดทดสอบทางชวเคมไดอยางเหมาะสม 3. เพอใหนกศกษาเกดทกษะในการแยกวนจฉยแบคทเรยและรา

ขอแนะน าและขอทตองปฏบต 1. อานคมอปฏบตการใหเขาใจทกครงกอนทาการทดลอง 2. อานผลและบนทกผลการทดลองทกครง 3. ขณะทาการทดลอง หามนาสงของอนๆ ทไมเกยวของกบการทดลอง มาวางไวบนโตะปฏบตการ 4. ลางมอดวยนายาลางมอ และ 70% แอลกอฮอล ทจดเตรยมไวใหกอนและหลงปฏบตการ 5. ถาเกดอบตเหตหรอทาเชอหก หรอทาภาชนะทมเชอตกแตก และใหนกศกษาเท 70% แอลกอฮอลทบบรเวณ

เชอ 10 นาท ใชกระดาษ tissue เชดแลวทงในถาดใสเชอใหนกศกษารายงานตออาจารยทนท 6. ตองฝกการทาใหปราศจากเชอ (aseptic technique) จนใหเกดความชานาญเนองจากการปนเปอนจากจลนทรย

อนจะทาใหผลการทดลองผดพลาด 7. หามทง สงของทปนเปอนดวยเชอจลนทรยลงในถงขยะ ใหใสในภาชนะรองรบทอยบนโตะปฏบตการ 8. ไมกน ดม หรอนอนในหองปฏบตการ 9. อานคมอปฏบตการใหเขาใจทกครงกอนทาการทดลอง 10. อานผลและบนทกผลการทดลองทกครง 11. ขณะทาการทดลอง หามนาสงของอนๆ ทไมเกยวของกบการทดลอง มาวางไวบนโตะปฏบตการ 12. หามวางเขมหรอหวงเขยเชอบนพนโตะปฏบตการ ควรจดภาชนะสาหรบใสหรอวางอปกรณดงกลาว 13. ใหทงอปกรณทปนเปอนเชอทกชนดในภาชนะทมนายาฆาเชอ 14. ปรบระดบเปลวไฟจากตะเกยงใหพอด อยาใหเปลวออนหรอแรงจนเกนไป กรณทใชตะเกยงบนเสนตอง

พยายามปรบใหเปลวไฟเปนสนาเงนอยาใหมสเหลอง และพยายามปรบเปลวใหตาทสดเทาทจะทาได และเมอเลกใชตะเกยงแลงจะตองดบไฟทนท ถาใชแกสจะตองปดวาลวแกสทถงดวย

15. ควรเขยเชอในบรเวณทไมมลมพด ถาลมสงบจะดมาก 16. หามใชปากหรอลน อม เลย วตถตางๆ เชน ปากกา ไมบรรทด บหร ฯลฯ และหามดมหรอรบประทานอาหาร

หรอสงใดๆ ในหองปฏบตการโดยเดดขาด และหลกเลยงการกระทาใดๆ ซงอาจทาใหเกดการตดเชอเขาสรางกายได

อปกรณทจ าเปนในหองปฏบตการจลชววทยา 1. สไลด (slide)

เปนแผนแกวใสผวเรยบรปรางเปนสเหลยมผนผาขนาด 2.5 x 7.5 ซม. หนาประมาณ 0.2 ซม. ใชสาหรบเปนทรองรบตวอยางทจะศกษาดวยกลองจลทรรศน นอกจานยงมสไลดทมหลมตรงกลาง (hollow slide or concave slide) ใชดการเคลอนท (motility) ของจลนทรย 2. ปเปต (graduated pipette)

เปนหลอดแกวปลายเปดทงสองดานมขดบอกปรมาตรอยทขางหลอดมหลายขนาด เชน 1 มล. 2 มล. 5 มล. 10 มล. เวลาใชตองเลอกขนาดใหเหมาะสมกบปรมาตรของของเหลวทตองการ เชน ตองการของเหลว 0.5 มล. ควรใช ปเปต 1 มล. ไมควรใชปเปต 5 มล.

ใหสงเกตดวาเลขบอกปรมาตรตาเรมจากปลายบนหรอปลายลาง ปเปตทเลขตาสดอยขางลางตองสงเกตดวยวารวมปรมาตรตรงบรเวณปลายปเปตหรอไม ถารวมตองมการเปาสารละลายออกใหหมด มฉะนนปรมาตรจะไมถกตอง จะทราบวารวมหรอไมโดยดทปลายบน ถามเครองหมายเปนลกษณะวงแหวน ตองเปาสารละลายออกใหหมดหรอจางาย ๆ วา

มวงแหวน ตองเปา ไมมวงแหวน ไมตองเปา

สาหรบปเปตทใชในปฏบตการจลชววทยาทปลายจะมสาลอดไว เพอปองกนการปนเปอน (contamianation) 3. หลอดเพาะเชอ (culture tube)

โดยทวไปจะใชหลอดทดลองในการใสอาหารสาหรบเลยงเชอหรอทดสอบสมบตทางชวเคม โดยเฉพาะอยางยงถาอาหารเลยงเชอเปนของเหลว ปดปากดวยจกสาล ฝาโลหะ ฝาพลาสตก จกยาง หรอฝาเกลยว (screw cap) กได การปดดวยจกสาลมขอดในดานกาซผานเชาออกไดสะดวก แตมขอเสยคอถาไมตองการใหกาซผานเขาออกจะกนไมได ถาเปนฝาเกลยวสามารถปรบไดตามตองการและเมอใสอาหารเลยงเชอทปราศจากเชอไวจะเกบไดนานกวานอกจากหลอดและขวดทกลาวมาแลวยงมหลอดขนาดเลกมาก ปกตขนาดยาว 25-30 มม. กวาง 5-6 มม. ปลายดานหนงตนเรยกวา Durham’s tube ใชสาหรบดกกาซทแบคทเรยผลตขนจากสารบางอยาง โดยควาไวในสารละลายทใชทดสอบสมบตทางชวเคม 4. จานเพาะเชอ (petri dish หรอ plate)

เปนจาน 2 ใบประกบกน ใบหนงใหญกวาเพอใหครอบอกใบได มหลายขนาดทใชทว ๆ ไป เสนผาศนยกลาง 10 ซม. ปกตทาดวยแกว ใชแลวลางนาไปฆาเชอใชตอไปได และมการผลตจานเพาะเชอดวย polystyrene ในลกษณะทปราศจากเชอบรรจอยในถง polythene ใชแลวจะทงเลย จานเพาะเชอใชสาหรบใสอาหารเลยงเชอ ปรมาตรอาหารทจะบรรจลงในแตละจานราว 15 มล. ถานอยไปจะทาใหอาหารแหง และสญเสยสมบตเมอใสในตเลยงเชอ (incubator) 5. หวงถายเชอและเขม (inoculating loop and needle)

เปนอปกรณทจาเปนในการถายเชอจลนทรยจากภาชนะหนงไปใสในภาชนะหนงทาดวยลวดตวนาความรอนทด เชน nichrome หรอ platinum มดามจบหมดวยฉนวนลกษณะของ loop ตรงปลายเสนลวดจะขดเปนวงกลม

เสนผาศนยกลางประมาณ 1-2 มม. สวน needle เปนปลายตรง ถาเปน needle ทใชเขยเชอรา เรยกวา teasing needle ทสวนปลายยาวประมาณ 1 ซม. งอเปนมมฉาก ในการใชจะตองเผา (flame) ใหลวดรอนแดง และปลอยใหเยน (10-15 วนาท) กอนสมผสเชอ 6. Glass spreader

เปนแทงแกวทงอสวนปลายเปนรปสามเหลยม ใชเกลย liquid culture บนผววนซงอยในจานเพาะเชอ 7. Cotton swab

เปนสาลพนปลายไม ใสหลอดแลวฆาเชอไว มกใชในในการปายเชอ (swab) จากทตาง ๆ แลวนามาเพาะเชอ 8. เครองฆาเชอ (sterilizer)

ใชในการกาจดสงมชวตทกชนดออกจากอาหารเลยงเชอ ตลอดจนเครองมอและอปกรณตาง ๆ วธการทาลายหรอกาจดจลนทรย และสงมชวตอน ๆ เรยกวา sterilization ซงมหลายแบบ แตอปกรณทใช

ควรเลอกใหเหมาะสมกบชนดของงาน 8.1 Autoclave เปนการฆาเชอโดยใชความรอนผสมกบความดน โดยใชความรอนท 121oซ และควมม

ดน 15 ปอนด/ตร.นว นาน 15 นาท นยมใชกบเครองมอผาตดและอาหารเลยงเชอ 8.2 Hot air oven ตอบมอณหภมสงทปรบได ปรกตใช 180o ซ นาน 3 ชวโมง ใชกบเครองแกวชนด

ตาง ๆ 8.3 Millipore filter แผนกรองมขนาดร (pore) เลกมากจนกระทงแบคทเรยไมสามารถผานไปได

ดงนนสารทผานการกรองจะปราศจากเชอแบคทเรย ใชกรองสารททนความรอนไมได เชน โปรตน plasma serum ฯลฯ

9. ตบมเชอ (incubator) เปนตควบคมอณหภมใหสมาเสมอ สาหรบใหเชอจลนทรยเตบโต ในบรเวณทมอณหภมตามตองการ โดย

ทว ๆ ไปมกตงใหอณหภมคงท 35o ซ ตบมเชอทวๆ ไปมกใชไฟฟาและปรบอณหภมไดแตในสภาพทสงกวาอณหภมในบรเวณนน ปรบใหตากวาไมได แตมตบมเชอทมทงเครองใหความรอนและทาใหเยนแบบตเยน เรยกวา high and low temperature incubator อณหภมประมาณ 0-60o ซ แบบนสามารถปรบใหอณหภมตากวาอณหภมหองได 10. ตเยนใชส าหรบเกบอาหารเลยงเชอ

สารตางทตองเกบไวในทเยนหรออาจจะตองถงเยนจนแขง (freezer) เชน ยาปฏชวนะ (antibiotics) serum plasma เลอด นอกจากนการเกบเชอจลนทรยไวนานๆ (stock culture) เกบไวในทเยนจะเกบไวไดนานกวา 11. น ายาลางแกว Dichromate-sulphuric acid cleaning solution ละลาย sodium (or potassium) dichromate 63 กรมกบนา 35 มลลลตร อนใหละลายทาใหเยนแลวผสมดวย H2SO4 เขมขน (technical grade reagent) 1 ลตร ใชในการลางสไลดและปเปตโดยแชไวนานพอสมควรแลวนาไปลางนาใหสะอาดโดยอยาใหมอสมผสกบนายาลางแกว

ค าอธบายศพททางจลชววทยา agar aseptic technique autoclave broth coliform colony contaminant contaminate contamination culture disinfectant Durham tube Gram’s stain hot air oven incubation incubator inoculum loop media minimal inhibition concentration (MIC) mixed culture motile motility

วนเลยงเชอ เทคนคทางจลชววทยาททาใหปราศจากเชอ หมอนงฆาเชอภายใตความดนท 15 ปอนด/ตารางนวในอณหภม 121o ซ ระยะเวลา 15 นาท อาหารเลยงเชอทเปนของเหลว แบคทเรยกลมกรมลบแทงสน ๆ ทอยในทางเดนอาหาร สวนลาไส หมกนาตาล แลค โตส เชน Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes นคม หรอกลมแบคทเรย เรมจาก 1 ตวแบงตวดวยวธทวคณ (binary fission) คอจาก 1 เปน 2 เชอทปนเปอน ทาใหปนเปอนเชอทไมตองการ การทาใหปนเปอนเชอทไมตองการเพาะเลยง เชอทตองการเลยง สารเคมยบยงการเจรญเตบโตของเชอโรค หลอดดกแกส มกใชใสในหลอดทดลองทบรรจพวกนาตาลตาง ๆ เพอดปฏกรยาทางชวเคมหลงเลยงเชอวาจากขบวนการหมกเชอสามารถผลตแกสหรอไม ชดยอมสกรม ซงเปนการยอมพนฐานในการศกษาสญฐานวทยาของแบคทเรย ประกอบดวยส crystal violet กรมไอโอดน สารลางส เชน 95% แอลกอฮอล หรอ acetone ตอบฆาเชอ ใชความรอนสงประมาณ 160-200oซ ระยะเวลานานประมาณ 1 ชวโมงครง ถง 2 ชวโมง การเพาะเชอ แบคทเรยโดยทวไปขนในอณหภม 35oซ ระยะเวลา 24 ชวโมง จะผลตนคมทชดเจน ตเพาะเลยงเชอ เพาะเลยงเชอ ลวดเขยเชอปลายวนเปนวน เสนผาศนยกลางประมาณ 0.01 มม. อาหารเลยงเชอ อาจเปนอาหารเหลวหรออาหารแขง ทมวนเปนองคประกอบ คาความเขมขนตาสดของสารเคมทสามารถยบยงการเจรญเตบโตของเชอได เชอผสม มเชอตงแต 2 ชนด ขนไปอยรวมกน เคลอนทได การเคลอนท

ค าอธบายศพททางจลชววทยา (ตอ) mycelium needle non-motlile normal saline pour plate pure culture resistant semisolid agar sensitive slant smear spread stab sterile sterilization streak swab

ขยมรา เกดจากสายราหลายๆ สาย (hyphae) มารวมกน เขมเขยเชอ เปนแทงลวดยาวแหลม โดยทวไปใชลงเชอในอาหารเหลว หรอลงในลกษณะแทง (stab) หรอใชเขยเชอราซงมสาย ไมเคลอนท นาเกลอ 0.85% โซเดยมคลอไรด ใชเปนสารละลายในการตรวจสอบทางชวเคม การเพาะเลยงเชอ โดยนาเชอผสมกบวนทหลอมไว ณ อณหภม 45oซ ถง 55o ซ แลวเทลงในจานทฆาเชอแลว ทงใหแขงตวประมาณ 15 นาท จงนาไปใสในตอบเลยงเชอ เชอบรสทธเพยง 1 ชนด ทนทาน วนแลวเชอทประกอบดวยวนแค 0.5% ทาใหมลกษณะกงแขง กงเหลว ใชในการตรวจสอบทางชวเคมบางอยาง เชน การตรวจการเคลอนทของแบคทเรย ไวตอสงแวดลอมชนดนน เชน ไวตอยาปฏชวนะ อาหารเลยงเชอประกอบดวยวน เทในหลอดทดลองใหมพนหนาลาดเอยง เพอทจะไดมพนทในการเพาะเลยงมากขน เกลยเชอ กระจายเชอใหสมาเสมอดวยวธการใชไมสาลทฆาเชอแลว (sterile cotton swab) หรอแทงแกวสามเหลยม (glass spreader) ลนไฟทงใหเยน แลวกวาดเชอบนวนเลยงเชอ ใช needle เขยเชอแลวแทงลงในอาหารตรงๆ ฆาเชอแลว ขบวนการทาใหปราศจากเชอ ซงทาไดหลายวธ เชน การใชความรอนชน การใชความรอนแหง รงส หรอสารเคมบางชนด ฯลฯ กระจายเชอโดยวธลากลวดเขยเชอทมเชอไปบนผวหนาของอาหารเลยงเชอเพอใหไดนคมอสระ ไมพนสาลทใชเกบสงตรวจสอบทางจลชววทยา หรอใชปายเชอ

i

เทคนคทางจลชววทยา Techniques in Microbiology

บทน า ในธรรมชาต จลนทรยจะอยรวมกนเปนกลมปะปนกน (mixture) แตในหองปฏบตการ เราสามารถแยกจลนทรยเหลานออกเปนแตละชนดได หรอเรยกวา pure culture ซงเหมาะทจะนามาศกษาลกษณะรปราง และสมบตทางชวเคมของแบคทเรย เมอนาจลนทรยไปเพาะบนอาหารเลยงเชอ จลนทรยจะเตบโตเปน colony หนง colony อาจเกดจากเซลลเดยวหรอสปอรเดยว เมอมการเตบโตเซลลทกเซลลใน colony หนงจะมลกษณะเหมอนกนทกประการ หรอมแตเชอบรสทธ (pure culture) เมอยาย colony ไปเลยงในอาหารใหม โดยใชเทคนคการถายเชอแบบ aseptic technique กจะเกดเปน colony ใหมซงมแตเชอบรสทธเทานน ก. การถายเชอใสอาหาร nutrient agar slant โดยใช loop (รปท 1)

1. จบ loop ดวยมอขวา (ถนดขวา) ลนไฟ (flame) จนลวด loop รอนแดง แลวปลอยใหเยนประมาณ 10-15 วนาท (หมายเลข 3)

2. ใชมอซายจบหลอดเชอ E.coli และหลอดอาหาร NA slant ใชนวกอยนวนางและองมอขวาเปดจกหลอดทงสอง และจบจกหลอดไวตลอดเวลาทถายเชอ โดยไมวางจกหลอดบนโตะ (หมายเลข 4)

3. ลนปากหลอดดวยการผานเปลวไฟ 2-3 วนาท สอด loop ลงในหลอดเชอแตะเชอ นา loop ออกมาใสหลอดอาหาร NA slant โดยลาก loop (streak) ลงบนผวหนาอาหารเปนรปฟนปลา นา loop ออกจากหลอด (หมายเลข 5, 6 และ 7)

4. ลนปากหลอดอกครง กอนเปดจกหลอด (หมายเลข 8) 5. ลน loop ทใชแลวดวยเปลวไฟจนรอนแดง เพอทาลายเชอทเหลออย (หมายเลข 9) 6. นาหลอดอาหาร NA slant incubate ท 35-37oซ 18-24 ชวโมง 7. ตรวจผลโดยสงเกตแนวการเตบโตของเชอ ตามแนวทลากไว บนทกผล

หมายเหต สาหรบผทยงไดชานาญการถายเชอควรจบหลอดครงละหลอด แทนการจบพรอมกนทงสองหลอด ข. การถายเชอใสหลอดอาหาร semisolid โดยใช needle (รปท 2) วธการทาทาเชนเดยวกบขอ ก. แตใช needle แทน loop และถายเชอโดยการแทงลงไปในอาหารตรงๆ (stab) แทนการ streak สาหรบวธการนใชในการทดสอบการเคลอนทของแบคทเรย (motility test) ค. การถายเชอในหลอดอาหารเหลว NB โดยใช pipette

1. เปดกระบอกใส pipette ลนปากกระบอกดวยการผานเปลวไฟ 2-3 วนาท 2. ดง pipette ออกจากกระบอก ใหจบ pipette เฉพาะดานไมมตวเลขบอกปรมาตร สาหรบดานมตวเลขหาม

จบและอยาใหแตะตองกบสงอนๆ 3. จบ pipette ไวในมอทถนด (การถอ pipette คลายกบการจบดนสอโดยใชนวหวแมมอและนวชจบทตว

pipette โดยมนวกลางรองรบ)

ii

4. ใชมออกขางจบหลอดเชอใชนวกอยหรอองมอดานถนด (ซงจบ pipette อย) เปดจกหลอด ลนปากหลอดดวยการผานเปลวไฟ 2-3 นาท วางหลอดลงใน rack ใส pipette ลงในหลอดเชอ (มอดานทถนดจะมจก หลอดอยเทานน)

5. ใชมออกขางหยบลกยางสแดงทชวยในการดดของเหลวขนมาแลว บบใหลกยางแฟบลง สอดปลายลกยางทมหลอดพลาสตกปลายแหลมลงทดานบนของ pipette ปลอยใหลกยางพองตว ของเหลวจะถกดดขนมาใน pipette (ระวงอยาใหของเหลวขนมาชนสาลทอดไวดานบน) ดงลกยางออกใชนวชของมอทถนดกดลงดานบนของ pipette เพอกนไมใชของเหลวไหลออก ปรบปรมาตรของเหลวใหได 0.1 ml. โดยใชนวชเปนตวควบคม

6. ดง pipette ขนจากหลอดเชอ ใชมออกขางจบหลอดเชอขนจาก rack ลนไฟทปากหลอดแลวปดดวยจกซงอยในองมอดานทจบ pipette วางหลอดเชอลงใน rack

7. ใชมอจบหลอดอาหารเหลว NB ขนมาแทน เปดจกและลนปากหลอด ใสเชอทดดไวลงไป (ใหปลาย pipette แตะอยดานขางเหนอระดบของ NB) เอา pipette ออกลนปากหลอดอกครง ปดจกวางหลอดไวทเดม

8. pipette ทใชแลวใสลงในโถแช pipette ซงบรรจนายาฆาเชออย 9. ลนปากกระบอก pipette ดวยการผานเปลวไฟ ปดกระบอกวางไวเชนเดม 10. นาหลอดอาหาร NB ทใสเชอแลว ไป incubate ทอณหภม 35oซ 18-24 ชวโมง 11. ตรวจผลโดยดความขนของอาหาร ถาเชอเตบโตอาหารจะขน

หมายเหต อาจารยผควบคมจะสาธตการใชลกยางประกอบ pipette ชวยในการดดสาร

iii

รปท 1 การถายเชอจาก broth ใส agar slant

iv

รปท 2 แสดงการทดลองการเคลอนทของแบคทเรยใน semisolid media (motility test)

การแยกเชอใหบรสทธ 1. วธ Streak plate (รปท 3 และ 4)

1. นา loop ลนไฟจนรอนแดง ทงใหเยน แตะเชอ mixed aulture โดย aseptic technique 2. ถอ loop ทมเชอ ไวในมอทถนด ใชอกมอเปดฝา plate ออกใช loop streak เชอลงบนผวหนาอาหารเบาๆ โดย

ลากเปน 4 แถว บรเวณ A (รปท 3) หรอลากเปนฟนปลา (รปท 4) 3. นา loop ลนไฟจนรอนแดง เพอฆาเชอทเหลอ ทงใหเยน ใช loop ลากตอแนวจาทลากไวครงแรก ไปยง

บรเวณ B อก 4 แนว 4. นา loop ลนไฟจนรอนแดง ทงใหเยน ลากแนวตอจากบรเวณ B ไปยงบรเวณ C อก 4 แนว และทาเชนเดมไป

ยงบรเวณ D 5. ลน loop ใหรอนแดงกอนเกบ 6. นาจานอาหารดงกลาว incubate ทอณหภม 35-37oซ โดยควาจานเปนเวลา 18-24 ชวโมง 7. ตรวจผลโดยสงเกตวา mixed culture แยกเปน colony เดยวๆ หรอไมและถาแยกสงเกตดวา colony ทไดม 2

แบบ แตกตางกนอยางไร บนทกผล หมายเหต ขณะ streak อาจวาง plate ไวบนโตะหรอจบมอไวในมอแลวแตถนด

v

รปท 3 ขนตอนการแยกเชอแบคทเรยใหบรสทธโดยการลากแบบ 16 streaks รปท 4 ขนตอนการแยกแบคทเรยใหบรสทธโดยการ streak plate แบบฟนปลา

vi

2. วธ Pour plate (ดรป 5 ประกอบ) 1. ทา serial dilution ของเชอ mixed culture โดยทา dilution ใหได 10-4, 10-5, 10-6 โดยใชเกลอเปนสารทาเจอ

จาง (diluent) การทาเจอจางเปนชด (serial dilution) ทาดงน 1.1 เรยง tube ลงใน rack และ label 1 ถง 6 1.2 ใช sterile pipette ขนาด 5 ml. ดดนาเกลอใสลงใน sterile หลอดละ 4.5 มล. 1.3 ใช sterile ขนาด 1 มล. ดดเชอจาก mixed culture ขนมา 0.5 มล. ใสลงใน tube ท 1 ดดขนลง 2-3 ครง

เพอใหเชอผสมเขากบนาเกลอ และดดสารละลายจากหลอดท 1 ปรมาตร 0.5 มล. ใสในหลอดท 2 1.4 ใช sterile pipette อนใหม ขนาด 1 มล. ดดขนลง 2-3 และดดสารละลายจากหลอดท 2 ปรมาตร

0.5 มล. ใสในหลอดท 3 1.5 ทาเชนเดยวกนจนถงหลอดท 6 กจะได serial dilution ทมความเขมขน 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, และ

10-6 ตามลาดบ 2. เขยนชอกลม ระดบความเขมขน 10-4, 10-5 และ 10-6 ทฝาดานลางของ sterile petridish ระดบความเขมขน

ละ 1 จาน 3. ใช sterile pipette ขนาด 1 มล. ดดสารละลายในขอ 1.5 ทระดบความเขมขน 10-6, 10-5 และ 10-4 ตามลาดบ

ใสใน sterile petridish จานละ 1 มล. (ดรป 3.6 ประกอบ) หรอจะใสลงในอาหารเลยงเชอแขงทยงหลอมเหลว (melted agar) เลยกไดโดยดดจากความเขมขนตามายงความเขมขนสง

4. เท melted agar (ซงบรรจอยในหลอด แชในอางนาควบคมอณหภม (water bath) อณหภมประมาณ 50o

ซ) ลงใน petridish ทมเชอ (จากขอ 3) หมนจานอาหารเลยงเชอ (petridish) ไปมา แลวปลอยให agar แขงกอน นาไป incubate ในต incubator ท 35oซ 18-24 ชวโมง การอานผล นบจานวนจลนทรยในจานทอยในชวง 30-300 colonies แลวคานวณจานวน colony ตอ 1 ml. เชน สมมตวาจานทระดบความเขมขน 10-5 อานได 85 CFU (colony forming unit) ดงนนจานวนเชอตอ 1 ml. คานวณไดดงน ทระดบความเขมขน 10-5 ปรมาตร 1 มล. นบได 85 CFU ทระดบความเขมขน undilute ปรมาตร 1 มล. จะมเชอ 85 x 105 CFU = 8.5x106CFU ดงนนจานวนเชอเรมตน= 8.5x106 CFU/ml

vii

รปท 5 เทคนคการ pour plate

viii

3. วธ Spread plate (ดรป 7 ประกอบ) 1. เขยนชอกลมระดบความเขมขน 10-4, 10-5 และ 10-6 ทฝาดานลางของ nutrient agar ทก plate 2. ใช sterile pipette ขนาด 1 มล. ดด serial dilution ของ mixed culture (ซงไดเตรยมไวเรยบรอยแลวในการ

ทดลองท 2.2) ปรมาตร 0.1 มล. ทระดบความเขมขน 10-4, 10-5 และ 10-6 โดยใช sterile pipette 1 อน ดดเชอทความเขมขน 10-6, 10-5 และ 10-4 ตามลาดบโดยไมตองเปลยนปเปต

3. จม spreader ลงใน beaker ซงมแอลกอฮอลบรรจอย ยกขนมารอใหแอลกอฮอลไหลลงไปใน beaker จนเกอบหมดแลวเผาไฟรอจนเยนใช spreader กวาดไปบน nutrient agar ทม solution ของ mixed culture อย โดยกวาดใหทวผววน นาไป incubate ในต incubator ท 35oซ 18-24 ชวโมง

รปท 6 การถายของเหลวลงใน plate โดยใช pipette

ix

รปท 7 ขนตอนการ spread plate

x

สณฐานวทยาและโครงสรางของแบคทเรย (Morphology and Structure of Bacteria)

บทน า การศกษาทางกลองจลทรรศนเปนขนแรกในการชเอกลกษณ (identify) แบคทเรย ซงสามารถแบงเปนกลมใหญๆ ตามการตดสกรมเปนแบคทเรยกรมบวก (gram-positive bacteria) และแบคทเรยกรมลบ (gram-negative bacteria) ลกษณะทางสณฐานวทยา ไดแก รปราง (shape) วา กลม (coccus/cocci) แทง (bacillus/bacilli) หรอเกลยว (spirilli) และการเรยงตวของเซลล (cell arrangement) รวมถงการมโครงสรางทเฉพาะตว เชน เอนโดสปอร (endospore), แสเซลล (flagella), ปลอกหม (capsule) และเมดสภายในเซลล (intracellular granules) ขนตอนในการเตรยมเชอแบคทเรย (bacterial smear) กอนการยอมส (รปท 1)

1. แบงแผนแกว (slide) ดวยดนสอเขยนแกว เขยนชอแบคทเรยกากบในแตละชอง 2. ใชเทคนคทลดการปนเปอนจลนทรย (aseptic technique) โดยใชหวงถายเชอ (loop) ถายเชอจาก

อาหารเลยงเชอทเปนของเหลว (broth) 3-4 loop หยดบนสไลดทสะอาด ถาใชจลนทรยจาก agar ใหนามาผสมกบนาหรอนาเกลอ 1 หยด ใชหวงเขย (spread) เชอใหแผเปนแผนฟลมบางๆ (เสนผาศนยกลางประมาณ 2 ซม.) โดยวน loop ไปทางเดยวกน

3. ทงไวใหแหงในอากาศ (air dry) 4. ทาใหเชอตดแนน (fixation) บนแผนแกวโดยผานสไลด ใหรอยคราบเชอ (smear) อยดานบน เหนอ

เปลวไฟของตะเกยงผานไปมา 4-5 ครง 5. ใหวางสไลดบนแทงเหลกทพาดบนอางนา หยดสทใชใหทวมแผนคราบเชอ เมอครบเวลาใหรนสท

เหลอออก ลางสดวยนากอก วางไวใหแหง นาไปศกษาดวยกลองจลทรรศน แผนกระจก 6. เตรยมเองทดเสรจแลว ใหแชในนายาฆาเชอ (disinfectant) ทอยในขวดบนชนประจาโตะ

A B C

รปท 1 ขนตอนการเตรยมเชอแบคทเรย (bacterial smear) สาหรบยอมส

A.แบงแผนแกวและเขยนชอแบคทเรยกากบ (label slide) B.smear เชอแบคทเรยและทงไวใหแหง (air dry) C.ผานเชอเหนอเปลวไฟ (heat-fix)

xi

การยอมสแบคทเรย แบคทเรยประกอบดวย สวนประกอบดวยของเซลล (protoplasmic matter) ทใสไมมสจดประสงคของการยอมสกเพอใหแบคทเรยตดส ทาใหเหนไดงายในการศกษารปราง ขนาดและลกษณะของเซลล รวมถงสวนประกอบตาง ๆ และชวยในการจาแนกใหเหนความแตกตางระหวางเซลลทมลกษณะคลายคลงกน 1. การยอมสชนดเดยวกน (simple staining)

1.1 การยอมตวเซลล (positive staining) ส (dye, stain) ทใชยอมเปน acidic, cationic stain โดยมสวนแสดงสเปนประจบวก จะจบกบผนงเซลลของจลนทรยดานนอกทเปนประจลบ (negatively charged anion) ตวอยางชนดน เชน methylene blue, crystal violet, safranin

1.2 การยอมพนเบองหลง (negative staining) สทใชเปนพวก basic, anionic, stain โดยมสวนแสดงสเปนประจลบ จะผลกกบประจลบทผวดานนอกของแบคทเรยมผลใหพนเบองหลง (background) มส ในขณะทตวเซลลไมตดส ตวอยางเชน India ink

2. การยอมสเหลายสเพอจ าแนกเชอ (differential staining) ทสาคญ ไดแก

2.1 Gram staining เปนการยอมสขนพนฐาน และสาคญในการศกษาแบคทเรย การยอมวธนจะแบงแบคทเรยออกเปน 2 กลม คอ แบคทเรยกรมบวก จะตดสมวงของ crystal violet และแบคทเรยกรมลบจะตดสแดง safranin หรอ carbol fuchsin

2.2 Acid-fast staining แบคทเรยใน genus Mycobacterium ยอมสกรมตดยาก ตองยอมส crystal violet นานถง 24 ชวโมง จงตดสกรมบวกเนองจากทผนงเซลล (cell wall) ประกอบดวยสารไขมนเปนจานวนมาก สวนสาคญไดแก กรดชอ mycolic acid เมอยอมดวย acid fast staining ซงเปนสารประกอบ (complex) ทมสแดงของ fuchsin mycolic acid จะไปทาปฏกรยากบ basic fuchsin ไดเปน fuchsin mycolate และเมอลางดวย decolourizer ซงเปนกรดเกลอกบแอลกอฮอล (acid alcohol) สจะไมหลดคณสมบตนเรยกวา acid fastness และเชอกลมนเรยกวา acid-fast bacilli (AFB) การยอม acid-fast ม 2 วธ คอ

1. Ziehl-Nelsen staining (hot method) 2. Kinyoun carbol fuchsin staining (cold method)

Gram staining (รปท 2 และ 3) 1. แบงแผนกระจกออกเปน 3 สวน 2. เตรยมเชอตามขนตอนทกลาวไวขางตน 3. วธยอมสกรม

3.1 หยด crystal violot ใหทวมรอยเชอ 30 วนาท แลวลางนา เทนาออกใหหมด 3.2 หยด Gram iodine 30 วนาท ลางนา

xii

3.3 ลางส (decolorize) ดวย 95% แอลกอฮอล โดยเอยงแผนกระจกไปมาประมาณ 5-10 วนาท ลางนา ระวงอยาลางสนานเกนไป เพราะจะทาใหสารประกอบเชงซอน crystal violet-iodine complex หลด

3.4 หยด safranin 15 วนาท ลางนา แลวซบใหแหงกอนดดวยกลองจลทรรศน การอานผล เซลลสมวงของ crystal violet=แบคทเรยกรมบวก เซลลตดสแดงของ safranin =แบคทเรยกรมลบ Acid-fast staining (Kinyoun’s)

1. หยดส carbol fuchsin บนสไลดใหทวมรอยเชอ ทงไวประมาณ 3-5 นาท ลางนา 2. ลางสดวย acid alcohol จนกระทงสจาง (ประมาณ 1 นาท) ลางนา 3. ยอมทบดวย methylene blue ประมาณ 30 วนาท ลางนา ทงไวใหแหง แลวนาไปสองดดวยกลอง

จลทรรศน การอานผล เซลลรปแทงตดสแดงของ carbol fuchsin =acid fast bacilli เซลลอน ๆ ตดสนาเงนของ methylene blue=non-acid fast bacilli

xiii

รปท 2 ขนตอนของ Gram staining A-I

xiv

รปท 3 แสดงขนตอนการตดสกรมบวกหรอกรมลบ

xv

สวนท 1

1

บทปฏบตการท 1 เครองมอหลกและเทคนคในการปฏบตงานดานจลชววทยา

บทน า

ในการเรยนวชาทางจลชววทยาสงทขาดไมไดคอ บทปฏบตการทมไวเพอใหนกศกษาไดรหลกการและฝกหดเทคนคพนฐานในการทาปฏบตการทางจลชววทยาอยางถกตอง เพราะงานทางจลชววทยาต องการความสะอาดและปลอดภยเปนอยางสง ดงนน การฝกเทคนคพนฐาน เชนการแยกเชอบรสทธ (isolation of pure culture)และการถายเชอ(culture transfer) นอกจากจะฝกใหนกศกษาไดแยกเชอและถายเชอเปนแลว ยงมวตถประสงคเพอใหนกศกษารจกการหลกเลยงไมใหเกดการปนเปอน(contamination) ของเชออนทไมตองจากสภาพแวดลอมทกาลงทาการทดลอง การทาปฏบตการทางจลชววทยาจงความจาเปนทตองใชอปกรณหรอเครองมอบางอยางทจาเพาะ เพอใชในการฆาเชอและการเลยงเชอ ดงนน นกศกษาจงตองทราบถงหลกปฏบตการทางจลชววทยา และวธการใชงานเครองพนฐานทางจลชววทยาอยางถกตองและเครงครด เพอความปลอดภยของตวนกศกษาเองและผอน การแยกเชอใหบรสทธเปนเทคนคพนฐานทางจลชววทยาทมความสาคญอยางมากเนองจากสงแวดลอมตางๆ เชน นา อากาศ พนหองเรยน หรอแมแตรางกายของคนกมเชอจลนทรอยหลายชนดทอาจปนเปอนในหลอดเพาะเชอได ดงนเวลาเกบสงสงตรวจจากผปวยกอาจมการปนเปอนของเชอจากรางกายดวย จงมความจาเปนทจะตองแยกเชอบรสทธทเปนสาเหตทาใหเกดโรค หลกการของการแยกเชอใหบรสทธบนอาหารเลยงเชอ(culture medium) คอ จะตองแยกเชอใหไดโคโลนเดยวๆ (single colony) จานวนมาก จากนนจงนาเชอทเปนโคโลนเดยวไปศกษารปรางลกษณะ และคณสมบตตางๆ เพอใหทราบวาเปนเชอชนดใด เทคนคทนยมใชในการแยกเชอบรสทธคอ วธcross streak plate ซงทาไดโดยใชหวงเขยเชอ (loop) แตะตวอยางหรอสงตรวจแลวลากหรอขด (streak)ลงบนจานเพาะเชอทมอาหารแขง (agar plate) อยใหไดแนวระนาบตดตอกน 4-5 วน หลงจากเสรจในระนาบแรกซงมเชอจลนทรอยหนาแนนทสด ใหนาหวงเขยเชอมาเผาไฟใหลวดทปลายรอยแดงฆาเชอทตดใหหมด จากนนจงขดเชอสวนของรอยลากในระนาบแรกออกมาเพยงหนงครงแลวลากเปนระนาบทสอง 4-5 เสนตดกนโดยรอยขดของเชอจะไมทบกบระนาบแรกอก หลกจากนกทาเชนเดยวกนกบระนาบทสองจนครบทวทงจานเพาะเชอซงมประมาณสระนาบ เมอไดเชอบรสทธแลวจะมการศกษาเชอตอไปในดานตางๆ ซงจะตองมการถายเชอจากอาหารเดมไปยงอาหารใหม หรอมการเพาะเชอลงในอาหารเพอการทดสอบและการวเคราะหตางๆ ดงนนการเรยนรเทคนคทถกตองในการถายเชอจงมความสาคญ เปนอยางยงซงตองอาศยหลกการของaseption technique เพอปองกนการปนเปอนของเชอชนดอนซงจะทาใหผลการทดลองผดพลาดได อปกรณพนฐานทใชในการถายเชอคอ หวงเขยเชอ เขมเขยเชอ (needle) และตะเกยบอลกอฮอลสาหรบใชฆาเชอโดยการเผา(incineration) การถายเชอจลนทรยพวกแบคทเรยและยสตจะใชหวงเขยเชอเปนสวยใหญ มบางครงทใชเขมเขยปลายตรง สวนเชอราทเปนเสนสาย (filamentous fungi) มกจะใชเขมเขยปลายงอ

2

วตถประสงค 1. เพอใหนกศกษารจกอปกรณและเครองมอตางๆ ทใชงานทางจลชววทยา รวมถงขอควรระวงและ

ความปลอดภยในการใชงาน 2. เพอใหนกศกษามทกษะในการแยกเชอบรสทธแบบ cross streak และการถายเชอทถกตอง ตลอดจน

เขาใจความสาคญของ aseption technique วสดอปกรณ (สาหรบสาธตอยางละ 1 ชด)

1. วดโอแนะนาการใชเครองมอทางจลชววทยา เชน autoclave, hot air oven, incubator, refrigertor, water bath และชดกรองแบคทเรย เปนตน

2. หวงเขยเชอ เขมเขยเชอปลายตรง และเขมเขยเชอปลายงอ 3. ตะเกยงอลกอฮอล 4. จานเพาะเชอ 5. หลอดเลยงเชอ หลดดกกาซ และสาล 6. ปเปตและกระบอก 7. กระจกสไลดและcover glass 8. Nutrient agar (NA) plate (ทง streak เชอแลว และอาหารเลยงเชอเปลา) 9. NA slant (ทงทปลกเชอแลว และอาหารเลยงเชอเปลา) 10. Nutrient broth (NB) (ทงทปลกเชอแลว และอาหารเลยงเชอเปลา) 11. Semisolid medium

วสดอปกรณ (สาหรบนกศกษาแตละกลม) 1. NA plate 2. NB

เชอจลนทรย 1. เชอแบคทเรยStaphylococcus aureus อาย 24 ชวโมง บนอาหาร NA slant 2. เชอผสม (mixed culture) ของแบคทเรย Staphylococcus aureus และ Serratia marcescensในอาหาร

NB 3. เชอ unknown บนอาหาร NA slant

วธทดลอง ตอนท 1 แนะน าการใชอปกรณและเครองมอทางจลชววทยา 1.1อธบายและสาธตหนาชนเรยนเกยวกบการใชหวงเขยเชอ เขมเขยเชอ ตะเกยงอลกอฮอล จานเพาะเชอ หลอดเลยง

เชอ หลอดดกกาซ ปเปต การพบจกสาล นายาฆาเชอ 1.2 แนะนาการใชเครองมอ autoclave, hot air oven, incubator, refrigerator, water bath และชดกรองแบคทเรย เปน

ตน

3

หวงเขยเชอและเขมเขยเชอ (Inoculating loop and needle) ทงสองชนดนเปนเครองมอสาหรบการถายเชอแบคทเรยจากภาชนะหนงไปใสในภาชนะหนง ทาดวยลวดทเป นตวนาความรอนทด เชน nichrome หรอ platinum มดามถอทเปนวสดทไมนาความรอน หวงเขยเชอมลกษณะเปนเสนลวดมปลายขดเปนวงกลมขนาดเสนผาศนยกลางประมาณ 4 มลลเมตร สวนเขมเขยเชอนนปลายเหยยดตรง เมอเวาลาจะใชเครองมอทงสองนจะตองทาใหปราศจากเชอโดยการเผาจนกระทงลวดรอนแดงและปลอยใหเยนกอนนามาใช

รปท 1.1 เขมเขยเชอปลายตรง(inoculating needle , a และ หวงเขยเชอ (inoculating loop, b)

ตะเกยงกาซ (Bunsen burner) เปนตะเกยงทใชกาซหงตมทาใหเกดเปลวไปสาหรบใชเผาฆาเชอทตดอยกบเครองมอบางอยาง เชน เขมเขยเชอ ,ปเปต,หลอดทดลอง,ปากคบ เปนเครองมอทใชกนมากในการถายเชอ ตะเกยงอลกอฮอล เปนตะเกยงแบบทใชอลกอฮอลเปนเชอเพลงเพอใหไดเปลวเพลงเพอใหไดเปลวไฟ ใชประโยชนเชนเยวกบตะเกยงกาซในกรณทหงอปฏบตการนนไมมกาซ เปลวไฟจากตะเกยงอลกอฮอลรอนนอยกวาตะเกยงกาซมาก จงตองใชเวลานานกวาในการเผาเพอใหปราศจากเชอ จานเพาะเชอ (Petri dish) มลกษณะคลายจานทรงกระบอกแบบตน 2 ใบ สวมประกบกนสนม โดยปกตทาดวยแกวหรอพลาสตคททนความรอน ใชสาหรบใสอาหารเลยงเชอชนดแขง (agar) ทาใหมบรเวณเนอทผว (surface area) กวางเหมาะในการแยกเชอแบคทเรยจากตวอยางสงตรวจโดยทวไป

รปท 1.2 จานเพาะเชอ

4

หลอดเลยงเชอ (Culture tube) หองปฏบตการจลชววทยาจาเปนตองใชหลอดทดลอง(test tube) ขนาดตางๆ จานวนมาเพอใชใสอาหารเลยงเชอจลนทร หลอดทดลองทใชมทงแบบปดดวยจกเกลยว(screw cap test tube) และแบบธรรมดาซงใชสาลอดเปนจกแลวแตประเภทของอาหารทจะใสในหลอดนนอาหารเลยงเชอทบรรจในหลอดทดลองมทงชนดทเปนอาหารแขงประเภทวน(agar) และอาหารเหลว(broth) เมอบรรจอาหารในหลอดทดลองแลวจะตองมจกปดปากหลอดไวเพอปองกนไมใเชอจลนทรยอนปนเปอน หลอดดกกาซ (Durham tube) เปนหลอดทดลองขนาดเลกประมาณ 5 x 50 มลลเมตร ใชควาลงในหลอดทดลองขนาดปกตทบรรจอาหารเลยงเชอทตองการทดสอบความสามรถในการใชนาตาลแลวใหกรดและกาซ CO2 กาซทเกดขนจะลอยขน จงทาใหกาซจานวนหนงดนไลทของเหลวและถกขงอยทกนหลอดดกกาซ

รปท 1.3 หลอดดกกาซ ปเปต (pipette) การถายทอดเชอในสภาพของเหวหรอสารละลายจานวนมากจากหลอดทดลอง จาเปนตองใชปเปต ในทางจลชววทยาปเปตทใชมกจะมปลายดานทสาหรบดดไวกรองเชอไมใหผานเขาปากและเพอปองกนเชอจากปากลงสอาหารเลยงเชอ สาหรบนกศกษาใหใชลกยางแดงในการดดปลอยสารละลายโดยใชปเปต หามใชปากเนองจา กนกศกษายงไมมความชานาญในการทาปฏบตการทางจลชววทยา ชดยอมส (Staining set) โดยปกตจะประกอบดวยขวดสตางๆ หลายชนดสาหนบการยอมสไลดแบบ Gram’s stain, Acid fast stain, หรอ Simple stain อนๆ โดยมากนยมใชขวดสชาเพอกนแสง เนองจากสารมเคมหลายชนดเปลยนสภาพไดงายเมอถกแสงสวาง เครองกรองแบคทเรย (Becteriological filter) เครองกรองแบคทเรยซงมแผนกรองแบคทเรย (membrane filter) ซงแผนกรองเหลานมรขนาดเลกมาก (0.22-0.45 m) จนกระทงแบคทเรยไมสามารถผานๆได (แตไวรสผานได) ฉะนนสารทผานการกรองแลวปราศจากแบคทเรยและสงมชวตอนๆ ทมขนาดใหญกวารของกระดาษกรอง

5

รปท 1.4 ชดกรองแบคทเรย ตบมเชอ เปนตอบทสามารถปรบอณหภมไดตามความตอง มประโยชนในการเพาะเลยงเชอแบคทเรย ซงสวนใหญเจรญไดดทอณหภม 37o c วธใชสะดวกเนองจากมหนาปดสาหรบหมนเลออณหภมไดตามทตองการ ภายในตอบจะมระบบปรบการไหลเวยนของอากาศทาใหอณหภมสามเสมอทวบรเวณตางๆ ภายในตอบ ตเยน (Refrigerator) ใชในการเกบอาหารเลยงเชอทยงไมตองการใช ตลอดจนสารเคมและนายาทจาเปนตองเกบรกษาในอณหภมตา เชน ยาปฏชวนะ, ซรม, พลาสมา, เลอดและอนๆ ในกรณทตองการเกบแบคทเรยไวเปนเวลานานๆ โดยไมตองการใหแงตวเพมจานวนมากอาจเกบไวในตเยนไดเชนเดยวกน(ยกเวนเชอบางชนดทตายไดงายในอณหภมตาๆ) อางน าควบคมอณหภม (Water bath) เปนอางนาทปรบอณหภมไดตามความตองการ สามารถใชบมเพาะเชอในกรณทเลยงเชอในอาหารเหลวหรอในหลอดทดลอง และใชในการเตรยมอาหารเลยงเชอ หรออนอาหารเลยงเชอใหมอณหภมเหมาะสมสาหรบการทดลอง หมอนงฆาเชอภายไตความดนไอน า(Autoclave) เปนเครองทใชในการฆาเชอจลนทรยทกชนด เปนวธทนยมใชกนมาก ซงสามารถฆาเชอไดโดยอาศยความรอนจากไอนาเดอดภายใตความดน ลกษณะของเครองเปนภาชนะโลหะรปสเหลยมหรอรปทรงกระบอกมฝาปด ทแขงแรง ภายในมชองวาง (chamber) สาหรบบรรจสงของทตองการฆาเชอในลกษณะเชนเดยวกบการนง ดานลางมชองวางสาหรบบรรจนา ซงเมอตมใหเดอดจะกลายเปนไออดแนนอยภายใน มอณหภมสงถง 121oc ภายใตความดน 15 ปอนด/ตารางนว ตามปกตถาวตถอยภายในสภาพนนาน 10-15 นาท จะปราศจากสงมชวตทกอยาง (sterile) เครองมอทใชกนมากในการเตรยมอาหารเลยงเชอ (media) และฆาเชอจากจานอาหาร, หลอดทดลอง ตลอดจนใชทาใหเครองมอใชปราศจากเชอจลนทรย ตอบความรอน(Hot air oven) เปนตอบฆาเชอโดยใชความรอนแหง(dry heat) ทอณหภมสงมาก เชน อณหภม 160c นาน 1-2 ชวโมง เครองแบบนเหมาะสาหรบการทาลายเชอจากวตถสงของททนความรอนไมเสอมสลายเมอสมผสกบความรอนสงโดยตรง เชนเ เครองแกวตางๆ เพอทาใหปราศจากเชอกอนทจานามาใชในการทดลองทางจลชววทยา

6

ตอนท 2 ฝกเทคนคการถายเชอและการแยกบรสทธ อาจารยสาธตหนาชนเรยนเกยวกบการถายเชอแบบ aseptic technique จากอาหารแขงไปยงอาหารวนเอยง และการถายเชอลงในอาหารเหลว รวมทงการแยกเชอบรสทธบนอาหารแขงดวยวธ cross streak

1. ถอหวงเขยเชอบรเวณเกอบปลายดามในลกษณะจบปากกา เผาหวงเขยเชอใหรอนแดงดวยเปลวไฟ โดยเรมจากลวดปลายหวงจนถงโคนหวงและเผาในลกษณะทหวงเขยเชอทามนประมาณ 60 องศากบเปลวไฟ ทงไวใหเยนสกคร

2. ใชมออกขางหบยบหลอดอาหารวนผวเอยงทมเชออยจากนนเปดจกหลอดโดยใชนวกอยและนวนางของมอทถอหวงเขยเชอ พรอมลนปากหลอดดวยเปลวไฟและใชหวงเขยเชอแตะเชอแบคทเรยมาพอประมาณ ลนปากหลอดดวยเปลวไฟและปดจกหลอด

3. นาหวงเขยเชอทมเชอตดอยถายลงบนอาหารวนผวเอยงหลอดใหมโดยลากเปนรอยหยกไปมาบนผวหนาอาหาร ถาเปนอาหารเหลวใหแกวงหวงเขยเชอไปมาในอาหารเพอใหเชอหลดจากปลายหวง

4. นาหวงเขยเชอออกพรอมลนๆไฟทปากหลอดและปดจก 5. ใชปากกาสาหรบ label เขยนชอเชอ วน เดอน ปทเขยเชอบนหลอดอาหารทปลกเชอ

ก. เผาลวดเขยเชอเพอฆาเชอใหลวดรอนแดงทงเสน ข. เปดจกหลอดพรอมกนทงสองหลอด

ค. ลนปากหลอดทง 2 หลอด ง. ถายเชอจากหลอดหนงไปยงอกหลอดหนง

จ. ลนไฟปากหลอดอกครงหลงเขยเชอช.ปดหลอดดวยสาลพรอมกน รปท 1.5 แสดงขนตอนการถายเชอแบบ aseptic technique

7

ซ. เผาลวดเขยเชออกครงหนงเพอฆาเชอ ฌ.เขยนชอเชอ วนททดลองทขางหลอด

รปท 1.5 แสดงขนตอนการถายเชอแบบ aseptic technique (ตอ) การแยกเชอบรสทธบนอาหารแขงดวยวธ cross streak

1. การใชหวงเขยเชอลนไฟจนรอนแดง ปลอยใหเยนแลวจมลงในเชอผสม นาหวงเขยเชอมาแตะทผววนในจานอาหรทขอบดานใดดานหนงของจานเพาะเชอ ลากหวงเขยเชอเบาๆ เปนระนาบ 4-5 เสนตดกน ปดฝาจานอาหารเลยงเชอ (การวางจานเพาะเชอควรใหอาหารอยดานบนเพอความสะดวก)

2. จากนนเปลยนทศทางการลากอก 2-3 โดยกอนทจะใชหวงเขยเชอขดเชอจากระนาบเกา มา streak เปนระนาบใหม ควรเผาไฟหวงเขยเชอใหรอนแดงกอนทกครงเพอกาจกเชอสวนเกนทตดอย ชวยทาใหโอกาสไดโคโลนเดยวๆ ของเชอบรสทธมากขน

รปท 1.6 การแยกเชอดวยวธ cross streak plate

3. เขยนชอเชอ วน เดอน ป ทเขยเชอและนาจานอาหารไปบอมท 37oc เปนเวลา 24 ชวโมง (โดยใหจาน

เพาะเชอดานทอาหารอยดานบน ) บนทกผลการทดลอง (ลกษณะ ขนาด และสของโคโลน) ตอนท 3 ใหนกศกษาฝกปฏบตเปนกลม ๆ โดยเชอ unkhown

3.1 การถายเชอ unkhon จากอาหาร NA slant (ใหนกศกษาบนทกหมายเลขของเชอ) ลงในหลอดอาหารเหลว NB แลวนาเชอไปบมท 37oc เปนเวลา 24 ชวโมง บนทกผลการทดลองโดยดวาเชอแบคทเรยทนกศกษาไดรบมการเจรญเตบโตแบบใด และเชอทมการเจรญแบบนเรยกวาอยางไร

8

รปท 1.7 ลกษณะการเจรญแบบตางๆ ของเชอในอาหารเหลว

3.2 การแยกเชอบรสทธบนอาหารNA plate นกศกษาจะไดรบหลอดทมเชอแบคทเรยสองชนดผสมกนอย เมอไดเชอมาแลวใหนกศกษาทาการแยกเชอบรสทธดวยวธ cross streak plate จากนนนาจานเพาะเชอไปบมเปนเวลา 24 ชวโมง โดยใหผาจานเพาะเชอทมอาหารควาอยดานบน (up side down) จากนนใหนสตบนทกวาผลการทดลองทไดเชอโคโลนเดยวทมลษณะตางกน 2 ชนดบนอาหารเลยงเชอหรอไมและมการปนเปอนจากเชอชนดอนดวยหรอไม

รปท 1.8 โคโลนของเชอทเจรญบนอาหารแขงหลงจากการท า cross streak plate

©©©©©©©©

9

บทปฏบตการท 2 การใชกลองจลทรรศนในการศกษาเซลลแบคทเรย

บทน า กลองจลทรรศน (microscope) เปนเครองมอทางวทยาศาสตรทมความสาคญมากสาหรบนกจลชววทยา เพราะจลนทรยทนามาศกษานนสวนใหญมขนาดเลกเกนกวาทตาคนเราจะมองเหนได โดยปกตแลวตาคนเราไมสามารถทจะแยกรายละเอยดสงของทมขนาดเลกเกนกวา 0.1 ม.ม. ออกจากกนได ดงนนจงตองใชกลองจลทรรศนชวยในการขยายภาพวตถ หรอเซลลจลนทรยใหมขนาดใหญขนพอทเรตนา (retina) ของคนสมารถจะรบภาพได กลองจลทรรศนทใชประจาในงานทางจลชววทยาเปนกลองชนด Bright-field แบบทเรยกวา Compound microscope เปนสวนใหญ เนองจากตวเลนททใชขยายภาพจะมสองสวนแยกกน คอ เลนสทอยใกลตา (ocular lens)ทอยในสวนของeyepiece และเลนสทอยใกลวตถ (objective lens) ซงอยในสวนของrevolving nosepiece โดยทวไปท ocular lens จะมตวเลขบอกกาลงขยายไวดวย เชน 10X หมายถง กาลงขยายของเลนสใกลตาเทากบ 10 เทา หรอบางกลองจะมกาลงขยายของ ocular lens เทากบ 15 เทา ซงแลวแตกลองจลทรรศนนนๆ สวนเลนสใกลวตถจะมกาลงขยายตงแต 4,10,40 และ 100 เทา การเลอกใชเลนสทกาลงขยายใดกขนอยกบขนาดของจลนทรยทตองการจะศกษา เชน จลนทรยพวก โปรโตซว สาหราย ยสต รา สามารถมองเหนไดอยางชดเจนทกาลงขยายของเลนสใกลวตถตงแต 10 เทาขนไป สวนการศกษาการเคลอนทของแบคทเรยเราสามารถสงเกตไดดวยกาลงขยายของเลนสใกลวตถ 40 เทา แตสวนใหญแลวการศกษาแบคทเรยภายใตกลองจลทรรศนจะใชกาลงขยายของเลนสใกลวตถท 100 เทา หรอทเรยกวา “ เลนสหวนามน ” (oil-immersion lens) ภาพทเรามองเหนจาก eyepiece จะมขนาดใหญเปนกเทาจากของจรงนนขนอยกบกาลงขยายของเลนสใกลวตถคณกบกาลงขยายของเลนสใกลตา โดยทวไปกลองจะมเลนทใกลวตถอย 3 ขนาด เลนสแตละขนาดจะมกาลงขยายแตกตางกน คอ low power (10X),high power (40X), และ 0il-immersion objective (100X) การเลอกใชเลนสใกลวตถแตละขนาด จะทาใหมระยะหางตวเลนทกบวตถ (working distance) แตกตางกน ดงตาราง

ชนดเลนสใกลวตถ กาลงขยาย Working distance(มม.) Low power 10 X 4-8 High power 40 X 0.2-0.6 Oil immersion 100 X 0.11-0.16 ถากาลงขยายของเลนสตาๆ เชน low power objective จะทาใหมคาระยะระหวางตวเลนสกบวตถมาก เราจงสามารถทจะปรบภาพโดยใชปมปรบภาพหยาบและปมรบภาพละเอยดได แตถาใชเลนสทมกาลงขยายสงๆ โดยเฉพาะอยางยง high power และ oil immersion lens จะทาใหมระยะระหวางวตถกบตวเลนสรอยมาก ดงนการปรบเปลยนกาลงขยายของเลนสใกลวตถหรอการปรบความคมชดของภาพ (โฟกส) จงตองทาดวยความระมดระวงอยางยงโดยเฉพาะเมอใชเลนสใกลวตถทกาลงขยาย 40X และ100X จะใชไดเฉพาะปมปรบภาพละเอยดเทานน

10

หามหมนปมปรบภาพหยาบเลอนขนอยางเดดขาด เพอปองกนการกระแทกของเลนสกบกระจกสไลด ซงจะทาใหเลนสของกลองทมราคาแพงเสยหายได นอกจากนการใชเลนสใกลวตถทกาลงขยาย 100X จะตองหยด immersion oil ลงบนกระจกสไลดบรเวณทมแสงผานอยางชาๆ ถาปรบโฟกสแลวมองไมเหน ใหเลอน mechanical stage ลงมากอน จากนนใหซบนามนทกระจกสไลดออกใหหมด แลวจงเรมตนตรวจหาตวอยางใหมทเลนสใกลวตถกาลงขยาย 10X ระวงอยาใหเลนสใกลวตถก าลงขยายอนเปอน immersion oil โดยเดดขาด หากพบใหรบเชดเลนสนนๆ ดวยกระดาษเชดเลนสใหสะอาดโดยทนท การศกษาเซลสแบคทเรยภายใตกลองจลทรรศนสวนมากศกษาเกยวกบการตดสแกรมของเซลส (Gram’s staining) สณฐานวยาของเซลล (cell morphology ) การเคลอนท (motility) และโครงสรางของเซลลบางชนด เชน แฟลกจลลา (flagella) เอนโดสปอร (endospore) แคปซล (capsule) เมตาโครมาตกแกรนล (metachromatic granules) ในบทปฏบตการนนกศกษาจะไดศกษาเกยวกบสณฐานวทยา และโครงสรางบางชนดของเซลลแบคทเรย การศกษาสณฐานวทยาของเซลลแบคทเรยจะศกษาในดานตางๆ ดงน

1. รปรางของเซลล (cell shape) ซงงแบคทเรยมรปรางหรอรปทรงอย 3 แบบหลกๆ คอรปทรงกลม(spherical shape หรอ coccus) รปทอน (rod shape หรอ bacillus) และ รปเกลยว (spiral shape หรอ spirillum)

2. ขนาดของเซลล (cell size) จะแตกตางกนไปตามชนดของแบคทเรยและระยะการเจรญโดยทวไปแลวขนาดของแซลสแบคทเรยสวนใหญจะอยในชวง 1-10 ไมโคเมตร

3. การเรยงตวของเซลล (cell arrangement) เกดขนเนองจากระนาบของการแบงเซลสซงแบคทเรยบางชนดมการแบงเซลสในระนาบเดยว เชน แบคทเรยทเซลลเรยงตวตอกนเปนสาย(chain) หรอเซลลอยเปนคๆ แบคทเรยบางชนดมการแบงเซลลใน 2 ระนาบ ไดแก แบคทเรยทเซลลเรยงเกาะในระนาบเดยวกนทง 4 เซลล (tetrad) และแบคทเรยทมการแบงเซลลในทง 3 ระนาบ เชน แบคทเรยทเซลลเรยงกนเปนทรงลกบาศก (sarcina) หรอทเรยงเกาะกนเหมอนพวงองน (grape-like cluster) การเรยงตวของเซลสแบคทเรยบางชนดสามารถบอกกลมของเชอแบคทเรยได ซงมกจะเปนเชอทเพงแยกไดจากสงสงตรวจใหมๆ โดยจะชวยใหเราวนจฉยไดงายขน

เนองจากเซลลแบคทเรยมขนาดเลกมากคอนขางใส ดงนนการศกษาโครงสรางของเซลสแบคทเรยโดยทวไปจะตองอาศยการยอมสทโครงสรางนนๆ การศกษาโครงสรางของเซลสแบคทเรยมสวนชวยในการวนจฉยเชอแบคทเรยไดเชนกน โคงงสรางทนนมศกษาสวนใหญ ไดแก แฟลกจลลา เอนโดสปอร แคปซล และอาหารสะสมภายในเซลล เชน พวกไกลโคเจน หรอ เมตาโครมาตกแกรนล เปนตน วตถประสงค

1. เพอใหนกศกษารจกสวนประกบตางๆ ของกลองจลทรรศน และการใชงานอยางถกวธ รวมถงขอควรระวง

2. เพอใหนกศกษาไดศกษาสณฐานวยาและโครงสรางบางชนดของเซลลแบคทเรย

11

วสดอปกรณ 1. กลองจลทรรศน 2. แผนสไสดทมเซลลแบคทเรยแบบตางๆ เชน การยอมสแกรม การยอมแฟลกเจลลา การยอมแคปซล

การยอมเอนโดสปอร เปนตน เชอจลนทรย

1. แบคทเรยทนามาใชในการศกษาทางสณฐานวทยาไดแก Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginisa และ Bacillus subtilis โดยนาไปยอมสแกรม

2. แบคทเรยทนามาศกษาโครงสรางบางชนดของเซลล ไดแก - Proteus sp. หรอ Pseudomonas sp. ใชศกษาประเภทของแฟลกเจลลา - B. subtilis หรอ Clostridium sp.ใชศกษาลกษณะของเอนโดสปอร - Klebsiella sp. ใชศกษาลกษณะของแคปซล - Corynebacterium sp. ใชศกษาอาหารสะสมทเรยกวา เมตาโครมาตก แกรนล

วธการทดลอง ตอนท 1 ศกษาองคประกอบของกลองจลทรรศน

1.1 สาธตหนาชนเรยนเกยวกบสวนประกอบอขงกลองจลทรรศน แลการใชกลองจลทรรศนอยางถกวธ 1.2 ใหนกศกษาบนทกสวนประกอบตางๆ ของกลองจลทรรศนลงในผลการทดลอง

ตอนท 2 ศกษาเซลลแบคทเรยภายใตกลองจลทรรศน ใหนกศกษาศกษาสณฐานวทยาและโครงสรางบางชนดของเซลลแบคทเรย จากการตงกลองสาธต หรอแผนภาพประกอบ พรอมทงวาดภาพทเหนภายใตกลองและช (label)สวนตางๆ ทนกศกษาเหน

2.1 สณฐานวทยาของเซลลแบคทเรย - รปรางของเซลล และการตดสยอม - การเรยงตวของเซลล 2.2 โครงสรางบางชนดของเซลลแบคทเรย - endospore - capsule - flagella - metachormatic granules

©©©©©©©©

12

บทปฏบตการท 3 การวดขนาดและการตรวจสอบการเคลอนทของเซลลจลนทรย

บทน า การศกษาแบคทเรยภายใตกลองจลทรรศนนนสามารถบอกถงรปราง ขนาด การเรยงตวของเซลลกลการเคลอ นทของจลนทรยได ในบทปฏบตการนนกศกษาจะไดศกษาเกยวกบวธการวดขนาดและการตรวสบการเคลอนทของเซลส?จลนทรยโดยเฉพาะแบคทเรย แตเนองจากเซลลแบคทเรยสวนใหญมขนาดเลก ไมมสและโปรงใส ดงนนจงทาใหการมองเหนเซลสแบคทเรยเปนไปไดคอนขางลาบากถาไมมการปรบความเขมแสงทดพอ วธทชวยทาใหเรามองเหนเซลลแบคทเรยไดชดเจนยงขน คอการยอมสซงเปนการเพม contrast กนระหวางตวเซลลกบฉากหลงทเปนพนสไสด ถาแบงวธการยอมสตามการตดสของเซลลแลว สามารถแบงออกไดเปน 2 วธ คอ

1. positive stain เปนการยอมทตวเซลลตดสของ chromophore แตฉากหลงไมตดส เชน การยอมสเซลลแบคทเรยดวยวธ simple stain หรอ Gram’s stain เปนตน

2. Negative stain เปนการยอมทตวเซลลไมตดสแตฉากหลงตดส ไดแก การยอมสแบคทเรยทเซลลตดสไดคอนขางยาก โดยเฉพาะพวก spirilli เชน spirochetes หรอการยอมเพอดแคปซล เปนตน

การยอมสเพอใชวดขนาดเซลลแบคทเรยควรเลอกใชวธททาใหขนาด และรปรางของเซลลคลาดเคลอนจากความเปนจรงนอยทสด ซงวธดงกลาวคอการยอมสแบบ negative stain เปนวธการยอมทเซลลแบคทเรยไมสมผสกบสารเคมรนแรง เชน การลางสออกดวยแอลกอฮอล หรอ acetone นอกจากนยงไมตองผานความรอนเพอใช fix เซลลเหมอนกบการยอมสแบบ positive stain ดงนนจงทาใหขนาด และรปรางของเซลลแบคทเรยมขนาดใกลเคยงกบความจรงมากทสด วธการยอมสแบบนจงนยมนามาใชในการวดขนาดของเซลลแบคทเรย โดยทวไปขนาดของเซลลแบคทเรยมหนวยเปน ไมโครเมตร (m) ซงมคาเทากบ 10-6 เมตร แบคทเรยแตละชนดกมความแตกตางกนไปทงในดานขนาดและรปรางของเซลส เชน แบคทเรยรปทรงกลม (cocci) จะวดขนาดโดยใชเสนผาศนยกลาง แตถาเปนแบคทเรยรปทอน(bacilli) จะวดขนาดของเซลลทงดานกวางและดานยาว โดยทวไปดานกวางของเซลสแบคทเรยไมแตกตางกนมากนกแตจะแตกตางกนทความยาวของเซลส อปกรณทใชใ นการวดขนาดของเซลลจลนทรยเรยกวา ocular micrometer มลกษณะเปนแผนกระจกวงกลมบรเวณตรงกลางมสเกลทขดเปนชอง แตละชองจะมขนาดเทากน แตไมทราบความกวางของแตละชองวาเปนเทาใด และ ocular micrometer นจะอยในกระบอกของเลนส (eyepiece)

รปท 3-1 ลกษณะของ ocular micrometer ทใสไวในบรเวณกระบอกของเลนสตา (ภาพซาย๗ และสเกลทแบงเปนชองๆ บน ocular micrometer (ภาพขวา)

13

กอนทจะวดขนาดเซลลของแบคทเรยจะตองทาการหาคาความกวางของชองใน ocular micrometer เสยกอนโดยเทยบกบstage micrometer ททราบคาแนนอนแลว stage micrometer มลกษณะเปนแผนสไลดทหนากวาปกต ตรงกลางจะมสเกลทขดเปนชองเลกๆ แตละชองจะมขนาดเทาๆ กน คอ 10m หรอ 0.01mm (รปท 3-2) วธการหาคาความกวางของชองใน ocular micrometer โดยเทยบกบstage micrometer ททราบความกวางแลวนน เราเรยกวธนวา Calibration เมอคานวณคาความกวางของocular micrometer แตละชองทกาลงขยายนนๆ ไดแลว จงนาแผนสไลดทมเซลลแบคทเรยทยอมสแบบ negative stain มาวดขนาดของเซลลทกาลงขยายของเลนสใกลวตถ 100X

รปท 3-2 ลกษณะของstage micrometer ทอยบนแทงวางสไลด (ภาพซาย) และสเกลทแบงเปนชองๆ บน stage micrometer ททราบคาแนนอน (ภาพขวา)

การเคลอนทของจลนทรยเปนลกษณะหนงทสาคญทใชในการจาแนกชนดของจลนทรยโดยเฉพาะอยา งยงแบคทเรย การตรวจสอบการเคลอนทของจลนทรยโดยทวไปนยมทากนใน 3 วธ คอการทา Wet mount การทาเทคนคหยดแขวน (Hanging drop slide) และการทดสอบการเคลอนทในหลอดทดสอบ ในบทปฏบตการนจะเปนการตรวจสอบกาารเคลอนทของแบคทเรยโดยใชเทคนคหยดแขวน ขอสาคญในการตรวจดเชอดวยวธนกคอจะตองเลอนโฟกสชาๆ โดยใชกาลงขยายของเลนสใกลวตถตาๆ กอน แลวคอยๆ เพอกาลงขยาย และระวงอยาใหเลนสกระทบกบกระจก cover glass เพราะจะทาใหแตกไดงาย ขอสาคญในการทาคอตองระวงในเรองของความเขมแสง เพราะถาใหแสงสวางมากเกนไปจะทาใหมองไมเหนเซลลจลนทรย ดงนนจงตองปรบความเขมหรอความสวางของแสงใหพอเหมาะกบกาลงขยายของเลนสใกลวตถ ซงสวนมากจะใหความสวางของแสงในปรมาณนอยๆ หรอตาๆ สด วตถประสงค 1.เพอใหนกศกษารจกเทคนคการวดขนาดของเซลสจลนทรยและวธตรวจสอบการเคลอนท 2.เพอใหนกศกษาแยกความแตกตางระหวางขนาดของ prokaryotic cell และ eukaryotic cell ได รวมทงเซลลทมการเคลอนทโดยใชแฟลกเจลลา และเซลลทไมเคลอนท วสดอปกรณ (สาหรบการวดขนาดเซลล)

1. แผนสไลดหลม และกระจกปดสไลด 2. กลองจลทรรศน 3. เชอแบคทเรยทใช คอ Staphylococcus aureus และ Pseudomonas aeruginosa ทเลยงในอาหารเหลว

อาย 24 ชวโมง 4. เชอแบคทเรย unknown ทเลยงในอาหารเหลว กลมละ 1 หลอด

14

วธการทดลอง ตอนท 1 การวดขนาดเซลลจลนทรย

1. ใหนกศกษาแตละกลมเลอกยอมแบคทเรยและยสตอยางละ 1 ชนดผสมกนบนกระจากสไลดแบบ negative stain โดยมอาจารยสาธตใหดหนาชนเรยนกอนนกศกษาลงมอปฏบตจรง

2. ใหนกศกษาหาความกวางอขงชองใน ocular micrometer ทกาลงขยายของเลนสใกลวตถ 10X และ 40X หลกจากนนจงนาเซลลจลนทรยทยอมไวในขอท 1 ไปวดขนาดดวย ocular micrometer แลวเปรยบเทยบขนาดของเซลลจลนทรยแตละชนด

วธหาความกวางของชองบน ocular micrometer

1. ใส ocular micrometer ทบรเวณกระบอกของเลนสตาขางใดขางหนงของกลอง 2. นา stage micrometer มาวางบนแทนวางสไลดโดยใหขดของสเกลอยบรเวณตรงกลางไฟทสองขนมา

จากดานลาง 3. มองดทเลนสตาจะเหนภาพภายในกลองมสเกลของ ocular micrometer และ stage micrometer ให

หมน eyepiece หรอเลอน stage ใหสเกลทงสองอนมเสนซอนทบกบพอดทปลายดานหนง จากนนใชสายตามองไปทปลายอกดานหนงเพอดวามสเกลของ ocular micrometer และ stage micrometer ซอนทบกนอกทบรเวณใด ดงรปท 3-3 แลวนบจานวนชองของ ocular micrometer และ stage micrometer ในชวงทสเกลทงสองซอนทบกนพอด

รปท 3-3 การซอนทบกนของสเกล ocular micrometer และ stage micrometer

4. เลอน stage micrometer ไปบรเวณอนเพอสมนบจานวนชองของ ocular micrometer และ stage micrometerทซอนทบกนพอด ทาอยางนใหได 5 ครง เพอหาคาเฉลย

5. คานวณหาคาความกวางของชอง ocular micrometer ทกาลงขยาย 10X และ 40X โดยเทยงเคยงจากความกวางของ 1 ชอง stage micrometer = 0.01mm = 10 m

6. เมอทา calibration เสรจแลว ใหนา stage micrometer ออกมาจากแทนวางสไลดแลงจงนาแผนสไลดทยอมสเซลสจลนทรยใสเขาไปแทน จากนนใช ocular micrometer วดขนาดเซลลแบคทเรย และเซลลยสตเพอเปรยบเทยบขนาดระหวางจลนทรยทงสองชนด

15

ตอนท 2 การตรวจสอบการเคลอนทของเซลลแบคทเรย 1. ใหนกศกษาดการสาธตวธการตรวจสอบการเคลอนทของจลนทรยทง 2 ชนดดวยวธ Hanging drop

method จากอาจารยทควบคมการปฏบตการ 2. ใหนกศกษาแตละกลมทา hanging drop ของแบคทเรย Staphylococcus aureus และ Pseudomonas

aeruginosa ในอาหารเหลวบนกระจกปดสไลดแตละแผน แลวตรวจสอบการเคลอนทของเซลสแบคทเรยดวยกลองจลทรรศนวาเซลสมการเคลอนท (motile) โดยใชแฟลกเจลลา หรอเซลลไมเคลอนท (non-motile) แตมลกษณะสนอยกบทแบบทเรยกวา Brownian movement

3. ใหนกศกษาแตละกลมทา hanginf drop ของเชอแบคทเรย unknow แลวตรวจสอบดวาเชอทนกศกษาไดรบมการเคลอนทหรอไม

©©©©©©©©

16

บทปฏบตการท 4 การเตรยมอาหารเลยงเชอ

การศกษารปรางโครงสรางหรอคณสมบตตางๆของจลนทรยนน จะศกษาจากตวอยางของจรงจากธรรมชาตแตเพยงอยางเดยวนบวายงมไมเพยงพอ จงจาเปนจะตองนาจลนทรยมาเลยงและขยายพนธเพมจานวนในอาหารเลยงเชอใหมปรมาณมากพอทจะใชศกษาเพอสงเกตลกษณะตางๆเพมมากขน อาหารซงใชเลยงจลนทรยนน อาจมลกษณะทางกายภาพหลายลกษณะ เชน

- Solid media (agar) คอ อาหารเลยงเชอทมการเตมวนลงไป ตามปกตจะเตม 15 กรมตอลตรอาหาร ในการเลยงเชอจลนทรย solid media จะอยในจานแกว (petri dish) หรออยในหลอดทดสอบซงมผวหนาเอยงเรยก slant หรอ slope อาหารในหลอดทดสอบทผวหนาไมเอยงเรยก deep tube เพอใชเลยงจลนทรยทตองการออกซเจนในการเจรญเพยงเลกนอย

- Semisolid media คอ อาหารเลยงเชอจลนทรยทเตมวนลงไปปรมาณตากวา solid media คอ ประมาณ 0.5% หรอนอยกวา

- Liquid media (Broth) คอ อาหารเลยงเชอจลนทรยทไมไดเตมวนลงไป ดงนนอาหารจงเปนของเหลว เชน Nutrient broth เปนตน อาหารเลยงเชอนนสามารถแบงตามสวนประกอบทางเคมไดเปน 2 พวกคอ

1. Natural or chemically non-defined media เปนอาหารเลยงเชอทเราไมรสวนประกอบทางเคมทแนนอน เชน อาหารเลยงเชอทไดจากธรรมชาต

เชน มนฝรง หรออาหารทประกอบดวย peptone, yeast extract, meat infusion, serum, beef eatract หรอ casein hydrolysate

2. Synthetic or Artificial or Chemically define media เปนอาหารเลยงเชอทรสวนประกอบทางเคมทแนนอนวาประกอบดวยสารอะไรอยางละเทาใดสามารถจะ

เตรยมไดเหมอนกนทกครงซงมทงชนดทเปน inorganic salt ตางๆ และชนด organic synthetic media เชน รวาอาหารแตละชนดประกอบดวย amino acid อะไรบาง อยางละเทาใด เปนตน

นกจลชววทยาจะสามารถใชอาหารทเหมาะสมตอการใชงานได เราสามารถแบงประเภทของอาหารตามวตถประสงคของการใชงานไดดงน Enrichment media

เปนอาหารเลยงเชอทไดเตมสารอาหารบางอยางพเศษนอกเหนอไปจากธาตอาหารท จลนทรยทวไปใช ทงนเพอใหจลนทรยทเราตองการเลยงเจรญไดดยงขน เชน การเตม blood serum วตามน หรอเตมสารสกดทไดจากเนอเยอพชหรอเนอเยอสตวลงไปใน nutrient broth หรอ nutrient agar อาหารชนดนใชสาหรบเลยงจลนทรยพวก fastidious heterotroph เชน พวก pathogen ตางๆ

17

Selective media อาหารทมการเตมสารเคมบางตวลงใน nutrient agar เพอยบยงการเจรญของแบคทเรยบางกลม โดยทสารนจะไมยบยงเชอกลมทเราตองการจะเพาะเลยง ตวอยางเชน crystal violet ทความเขมขนบางชวงจะชวยยบยงการเจรญของแบคทเรยแกรมบวก โดยไมมผลตอแบคทเรยแกรมลบ ในทานองเดยวกน ในอาหารเลยงเชอทมสารคารบอนเปนนาตาล maltose จะสามารถคดเลอกแบคทเรยทใชนาตาล maltose ใหสามารถเจรญได โดยใชหลกทวาจะคดเลอกเชอทสามารถใชสารประกอบอนทรยทแปลกออกไปไดอยางงายๆ โดยการเตมสารเหลานลงในอาหารเลยงเชอแทนสารประกอบคารบอนอยางอน Differential media คออาหารทเตมสารเคมตวอนลงไปซงอาจจะมผลตอชนดของเชอทจะเจรญ หรอการเปลยนแปลงลกษณะไปหลงจาก inoculate เชอและ incubate เชอไว ตวอยางเชน เชอผสมของแบคทเรย inoculate ลงใน blood-agar medium แบคทเรยบางพวกอาจจะสลายเมดเลอดแดง สวนแบคทเรยอนๆไมมความสามารถน สงเกตไดจาก clear zone รวมทงโคโลนจะแสดงถง hemolysis ทาใหสามารถแบงแบคทเรยเปนพวก hemolytic หรอ nonhemolytic bacteria จากการเจรญบนอาหารเดยวกน ดงนน blood agar medium เปนทงอาหาร enrich และ differential medium Assay medium คออาหารทมสวนประกอบทใชในการตรวจสอบหาวตามนตางๆ amino acid ตางๆ และ anitibiotics Media for enumeration of bacteria คออาหารทมความจาเพาะเจาะจงเพอใชสาหรบตรวจสอบหาปรมาณของแบคทเรยในวตถอยางใดอยางหนง เชน นมหรอนานนควรจะตองมสวนประกอบเปนสารทมความจาเพาะของเชอรวมอยดวย Media for characterization คออาหารทสามารถใชจาแนกบอกถงชนดของจลนทรย ทสามารถจะเจรญไดหรอสรางสารบางอยางททาใหอาหารเปลยนแปลงไป ทาใหสงเกตเหนความแตกตางได Maintenance media คออาหารทใชเกบรกษาเชอและลกษณะทางกายภาพของเชอนน จะตองเปนสารอาหารทแตกตางจากอาหารสตรทเหมาะสมตอการเจรญของเชอ เพราะอาหารทเหมาะสมตอการเจรญของเชอนนอาจทาใหเชอเจรญไดดและตายเรวขน ตวอยางเชน นาตาลกลโคสทเปนสวนประกอบในอาหารเลยงเชอจะทาใหเชอเจรญไดดขนแ ละสรางกรด รวมทง metabolite อยางอน ดงนนสตรอาหารทใชสาหรบเกบรกษาเชอมกจะไมเตมนาตาลกลโคส หรอเตมในปรมาณตาๆ จงเหนไดวาอาหารเลยงเชอจลนทรยมหลายชนด ในการทจะเลอกใชอาหารชนดใดนนขนอยกบวตถประสงคและความเหมาะสม โดยทวไปแลว คณสมบตทสาคญของอาหารเลยงเชอทกชนดควรมคณสมบตดงนคอ

1. มธาตอาหารทเหมาะสมกบการเจรญของเชอจลนทรยและมความเขมขนเหมาะสม 2. มความเปนกรดเปนดาง (pH) ทเหมาะสมกบจลนทรยแตละชนด 3. ไมมสารพษ 4. ไมมสงมชวตใดๆ ปนเปอนอยในอาหารนน

18

การเตรยมอาหารเลยงเชอจลนทรยอาจใชอาหารสาเรจรปซงมองคประกอบชนดตางๆผสมอยเรยบรอยแลว หรอชงสารแตละชนดทเปนองคประกอบของอาหารชนดนน เมอชงอาหารเรยบรอยแลวใหละลายในนากลนปรมาตรทตองการเตรยม อาหารทจะเตรยมชงกกรมใหอานจากฉลากขางขวดเมอละลายอาหารในนากลนแลวคนใหเขากน ตมจนละลาย ปรบ pH ดวยเครองหรอใชกระดาษวด pH กได แลวจงถายลงในหลอดทดสอบหรอขวด ปดจก แลวนาไปทาลายเชอจลนทรยในหมอนงความดน (autoclave) ตอไป โดยใชความรอน 121C เปนเวลา 15 นาท อาหารเลยงเชอจลนทรย Solid media ทอยใน petri dish ตองเตรยมลงในขวดหรอภาชนะกอน แลวจงนาไปฆาเชอจลนทรย ภายหลงผานการฆาเชอจลนทรยแลว จงคอยนามาเทลงใน petri dish (ซงผานการอบฆาเชอดวยความรอนแหงใน hot air oven 180C 2 ชม.ดวยวธปลอดเชอ (aseptic technique) อาหารเลยงเชอทเปน slant นนอาหารจะถกบรรจลงใน test tube หรอภาชนะ แลวนาเขาเครอง autoclave เพอทาลายจลนทรยทมอยในอาหาร เมอนาออกจากเครอง autoclave แลวใหนา rack ทม test tube เหลานนมาวางเอยงบนทอนไม จนกระทงอาหารเยนกจะเกด slant ขน ถาตองการเตรยม deep agar คออาหารเลยงเชอจลนทรยทไมมผวหนาเอยง (slant) กไมตองเอยง rack ขณะทงใหอาหารเยน อาหารเลยงเชอจลนทรยทเปน broth ใหบรรจลงใน test tube หรอใน flask หรอในขวด (ขนกบวตถประสงค) ไดเลย แลวนาเขาเครอง autoclave เพอทาลายเชอจลนทรย อาหารเลยงเชอจลนทรยบางชนดมองคประกอบของสารบางตวในอาหารทสลายตวไดงายเมอผานความรอน ใหแยกสารประกอบทสลายตวไดงาย เตรยมแยกตางหาก สวนองคประกอบอนๆ ใหชงแลวละลายนา ตม ปรบ pH แลวนาเขาเครอง autoclave เพอทาลายเชอจลนทรยในอาหารสวนน เมออาหารสวนนนาออกจาก autoclave ทงใหเยนแลว จงคอยเตมอาหารอกสวนลงไปดวยวธปลอดเชอจลนทรย โดยอาหารสวนทไ มสามารถผานความรอนตองนาไปกรองดวยเครองกรองดวยวธปลอดเชอ เครองกรองนจะมแผนกรองทมรขนาด 0.45 ไมครอน จงทาใหเชอจลนทรยตดอยบนกระดาษกรอง อาหารทผานแผนกรองไปจะปราศจากเชอจลนทรย วตถประสงค เพอศกษาเทคนคและวธการเตรยมอาหารเลยงเชอ อปกรณ

1. สวนประกอบตางๆของอาหาร Nutrient broth (NB) Nutrient agar (NA) 2. เครองชง กระดาษไขรองชง ชอนตกสาร (spatula) 3. ภาชนะเตรยมอาหาร แทงแกว กระดาษวด pH 4. เครองแกว เชน หลอดทดสอบ บกเกอร ฟลาสก ขวดบรรจอาหาร

5. สาล กระดาษ ยางรดของ การทดลองท 1 การเตรยมอาหาร Nutrient broth (NB) เตรยม nutrient broth 50 มล. โดย Nutrient broth มสตรของอาหารดงน

beef extract 3 กรม peptone 5 กรม นากลน 1000 มล.

19

1. ใหคานวณดวาถาตองการเตรยมอาหาร nutrient broth 50 มล. ตองใชสารแตละอยางกกรมแลวจงชงสารตามทคานวณได

2. ละลายสวนประกอบตางๆ ในนากลน 50 มล. คนดวยแทงแกวคนสาร ใหสวนประกอบอาหารละลายเขากนไดด หรอวางบนเตาเพอใหสารอาหารละลายเรวขน อาหารประเภท broth ละลายงายจงไมตองตมนาน การตมตองการใหสารทกตวละลาย

3. วดความเปนกรดหรอดางของอาหารดวยกระดาษวด pH หรอเครอง pH meter กรณทมความเปนกรดมากเกนไป ปรบดวย NaOH 0.1 N ถาเปนดางมากเกนไปใหปรบ pH ดวย HCl 0.1 N จนได pH 7.0 + 0.2

4. บรรจอาหาร NB ลงในหลอดทดสอบ 5. ปนสาลปดปากหลอดทดสอบ (ตองฝกวธปนจกสาลจนกระทงไดจกสาลทดคอ จกสาลตองยาวพอควร เมอเปด

จกสาลแลว จกสาลจะยงคงรปอยไมกระจายตวออก) วาง test tube ใน rack คลมจกสาลดวยกระดาษ เพอปองกนไมใหจกสาลเปยก จะทาใหจกสาลขนรางาย

6. เมอเตรยมอาหารเสรจแลว ใหนาไปฆาเชอจลนทรยในหมอ autoclave ทอณหภม 121C นาน 15 นาท (ตามวธการในบทปฏบตการท 2)

การทดลองท 2 การเตรยมอาหาร Nutrient agar (NA) การเตรยม nutrient agar 300 มล. โดย nutrient agar มสตรเหมอน nutrient broth ตางกนทเตม agar

beef extract 3 กรม peptone 5 กรม agar 15 กรม นากลน 1000 มล.

1. ใหคานวณดวาถาตองการเตรยมอาหาร NA 300 มล. ตองใชสารแตละอยางกกรม ชงสารตามทตองการ 2. ละลายสวนประกอบตางๆ ในนากลน 300 มล. โดยใหละลายวนกอนแลวจงใสสวนประกอบอนๆคนใหละลาย

แลวตมจนกระทงสวนประกอบตางๆ ละลายเปนเนอเดยวกน การสงเกตดวาละลายหมดหรอไมใหสงเกตดจากการเอาแทงแกวจมลงไป ถามเมดๆเกาะตดแทงแกวขนมาแสดงวาละลายไมหมด ถาละลายหมด media จะใส ไมมเมดวนเกาะตามภาชนะหรอแทงแกว การเตรยมอาหารทม agar ถาละลาย agar ไมหมด จะมผลทาให อาหารบางหลอด หรอบาง plate ไมแขงตว และมบางหลอด หรอบาง plate แขงเกนไป

3. ปรบ pH 7.0 + 0.2 เชนเดยวกบ NB 4. ตวงอาหาร 100 มล. บรรจลงในขวด อก 200 มล. ใสใน test tube โดยนาออก 2 หลอดแยกออกใส rack

ตางหากเพอทา deep tube นอกนนใส rack เดยวกน เพอทา slant 5. ปนสาลใสปากขวดและหลอดใสอาหาร 6. เมอเตรยมอาหารเสรจแลว ใหนาไปฆาเชอจลนทรยในหมอ autoclave ทอณหภม 121ซ. นาน 15 นาท (ตาม

วธการในบทปฏบตการท 2) 7. ใหนา NB และ NA เกบไวอยางละ 1 หลอด ไมตองเอาเขาเครอง autoclave 8. เมอเตรยมอาหารเรยบรอยแลว ทาความสะอาดภาชนะและเครองมอตางๆทใชในการเตรยมอาหาร

20

ภายหลงจากทนาหลอดและขวดอาหารออกจาก autoclave แลว นา rack ของ test tube ทม NA อย และตองการเตรยมเปน slant วางเอยงบนทอนไม (ขณะยงรอนอย) แลวทงไวจนกระทงเยนและแขงตว จะได slant rack ทจะเตรยม deep agar ไมตองวางเอยง สวนขวดอาหารถาตองการเทลงใน petri dish ใหแชขวดอาหารในอางนาควบคมอณหภม (water bath) ซงมอณหภม 50-55ซ. รอจนกระทงอาหารเยนลงประมาณ 50ซ. (รอนในระดบทมอจบได ระวงอยาใหเยนเกนไปวนจะแขงตวเปนหยอมๆ) ใหเทลงใน petri dish (ทผานการฆาเชอจลนทรยแลว) ดวยวธปลอดเชอจลนทรย ทงไวจนกระทงเยนและแขงจงคอยเกบ อาหารใน petri dish ทเตรยมเสรจใหมๆ ผวหนาอาหารอาจจะมไอนาเกาะอย จงยงไมสามารถนามาใชงานได ตองนา petri dish มาอบในตอบอณหภม 37ซ. คางคน โดยควาจานลงเพอใหผวหนาแหงและตรวจสอบดวาอาหารมการปนเปอนเชอจลนทรยหรอไม จงจะสามารถนามาใชงานได หามอบนานเกนไปจะทาใหอาหารแหงเชอจลนทรยจะไมเจรญ ถายงไมตองการเทอาหารลงใน petri dish กเกบอาหารไวในขวดจนกระทงตองการใช จงนาขวดอาหารมาตมในนาเดอดใหวนละลายจนหมด แชขวดอาหารในอางนาควบคมอณหภม 50-55ซ. จนกระทงอาหารมอณหภมประมาณ 50ซ. จงคอยเทลงใน petri dish และทาใหผวหนาแหงตอไป

อาหารทผานการฆาเชอจลนทรยแลว จะเกบไดนานเปนเดอนหรอหลายเดอนขนกบชนดของอาหาร แตตองไมเกบนานเกนไป เนองจากอาหารทเกบนานเกนไปจะแหง ทาใหจลนทรยไมสามารถเจรญได การตรวจผลการทดลอง 1. เปรยบเทยบลกษณะของอาหารทฆาเชอและทไมไดฆาเชอ เมอเกบไวเปนเวลา 1–7 วน โดยดความขน การเกด

ตะกอน หรอเกดฝาบางๆ ทผวหนา 2. เปรยบเทยบปรมาณและชนดของจลนทรยในอาหาร NB ทฆาเชอและไมไดฆาเชอโดยการยอมสแกรม สองด

ดวยกลองจลทรรศนกาลงขยาย 1000 เทา แลววาดภาพทเหนจากกลองลงในรายงาน ค าถาม 1. จงใหเหตผลวาทาไมจงใชวนผสมอาหาร และวนคออะไร 2. แบคทเรยสวนใหญเจรญไดดท pH เทาใด 3. จงใหความหมายของชนดอาหารเลยงเชอตอไปน : enrichment media, selective media, differential media 4. ความดนและความรอนชนมผลในการฆาเชอจลนทรยอยางไร 5. อาหาร NB จะเหมาะสมกบการเลยงเชอแบคทเรยไดทกชนดหรอไม อยางไร

21

ตารางท 4.1 Characteristic of Several Complex Materials as Ingredients of media

Raw material Characteristic Nutritional Value

Beef extract An aqueous extract of lean beef tissue concentrated to a paste

Contain the water-soluble substance of animal tissue which include carbohydrates, organic nitrogen compound, water-soluble vitamins, and salts

Peptone The product resulting from the digestion of protein-aqueous materials e.g. meat casein, and gelatin; digestion of the protein material accomplished with acids or enzyme; many different peptones(depending upon the protein used and the method of digestion) are available for use in bacteriological media ; peptone differ in their ability to support growth of bacteria

Principle source of organic nitrogen; may also contain some vitamins and some carbohydrate; depending upon the kind of proteinaceous material digested

Agar A complex carbohydrate obtained from certain marine algae; Processed to remove extraneous substances

Used as a solidification agent for media; agar dissolved in aqueous solutions and become solid gels when the temperature is reduced below 45C; agar not considered to be a source of nutrient to the bacteria

Yeast extract An aqueous extract of yeast cells commercially available as a powder

A very rich source of the B vitamins ; also contains organic nitrogen and carbon compound

©©©©©©©©

22

บทปฏบตการท 5 การศกษาจลนทรยทอยในสงแวดลอม

บทน า จลนทรยเปนสงมชวตทพบอยทวไปในธรรมชาต มความหลากหลายสง ทงนเนองจากจลนทรยสามารถใชสารประกอบในธรรมชาตไดหลายชนด เชน สารอนทรย สารอนนทรย แกส รวมทงสารประกอบทมค ารบอนอะตอมเดยว เชน carbon monoxide, methane และ methanol เปนแหลงอเลคตรอนในการสรางATP ของ จลนทรย และเปนแหลงคารบอนสาหรบการสงเคราะหโครงสรางของเซลล นอกจากนจลนทรยบางชนดสามารถเจรญในสภาพแวดลอมทวกฤต เชน อณหภมสง ภายใตความดน ความเปนกรดดาง ความแหงแลง จลนทรยสามารถตดไปกบฝน ปลวไปกบลม ฟงกระจายไปได ฉะนนในอากาศ ตามสวนตางๆ ของสงมชวต ไมวาคน สตว และพช จะมจลนทรยหลายชนดอาศยอยดวยกนเปน normal flora วาจะพบจลนทรยไดทวไปในธรรมชาตแต จลนทรยมขนาดเลก เซลลอยกระจดกระจาย จงเปนการยากทจะตรวจนบจานวนและชนดของจลนทรยจากแหลงธรรมชาตนน ดงนนควรเปดโอกาสใหจลนทรยเจรญเพมจานวนในอาหารและสภาพแวดลอมทเหมาะสม เซลลของจลนทรยจะเจรญเพมประมาณจนกลายเปนโคโลน (colony) ทาใหสะดวกในการตรวจวเคราะห วตถประสงค

1. เพอใหนกศกษารจกลกษณะของจลนทรยกลมตางๆ ทเจรญบนอาหารเลยงเชอ และลกษณะภายใตกลองจลทรรศน

2. เพอใหนกศกษารจกเทคนคการทา dilution และ spread plate วสดอปกรณ

1. จานอาหารทมโคโลนของ Bacteria, Actinomyces, Mold, Yeast ตวอยางละ 1 plate 2. อาหารเลยงเชอ Nutrient (NA) 3. ไมพนสาลทปราศจากเชอ (cotton swab) 4. แทงแกวปลายงอ 5. แอลกอฮอล 95% 6. ปากคบ 7. นากลนปราศจากเชอ 90 มล. ในขวดรปชมพขนาด 250 มล. 8. นากลนปราศจากเชอ 9 มล. บรรจในหลอดทดลอง 9. จานเพาะเชอปราศจากเชอ 10. ปเปตปราศจากเชอขนาด 1 มล. 11. ตวอยาง ดน นา

23

วธทดลอง 1. บนทกลกษณะโคโลนรวมทงลกษณะของเซลสจลนทรยภายใตกลองจลทรรศน ลงในรางานบท

ปฏบตการ 2. การตรวจจลนทรยในอากาศ

2.1 นาจานอาหารเลยงเชอ nutrient agar มาเปดฝาทงไว 30 นาท แลวปดฝาตามเดม 2.2 ทาเครองหมายทดานใตจานอาหารเลยงเชอวา อากาศ 2.3 นาจานอาหารเลยงเชอไปบมทอณหภมหอง

3. การตรวจจลนทรยบนรางกาย 3.1 ใชไมพนสาลนากลนฆาเชอ แตะขางหลอดใหนาไหลออกจากสาล 3.2 ใชไมพนสาลเชดตามรางกายสวนใดสวนหนง 3.3 นาไปปายบนผวอาหารในจานอาหารเลยงเชอใหทว นาไปบมทอณหภมหอง

4. การตรวจนบจลนทรยในตวอยางนาโดยวธ spread plate 4.1 ใชปเปตดดตวอยางนา 0.1 มล.ใสลงในจานอาหาร NA 2 plate 4.2 ใชแทงแกวปลายงอจมแอลกอฮอล ผานเหลวไฟ เพอฆาเชอทแทงแกวเกลยใหนากระจายทว

ผวหนาอาหาร ทงไวสกคร ใหผวหนาอาหารแหง 4.3 นาไปบมทอณหภมหอง รอใหเชอเจรญ แลวนามานบจานวน ดงภาพท 4-2

5. การตรวจนบจลนทรยในตวอยางดนโดยวธ spread plate 5.1 ชงตวอยางดน 10 กรม ใสในขวดรปชมพทมนากลนฆาเชอแลว 90 มล. เขยาใหเขากนด

เขยาใหเขากน ตงทงไวสกคร เพอใหดนตะกอน ดงนน ตวอยางดนจะถกเจอจางลง 10 เทา คดเปนความเจอจาง 10-1

5.2 ใชปเปตขนาด 1 มล. ดดของเหลวออกไป 1 มล. ใสในหลอดทดลองทมนากลน 9 มล. ผสมใหเขากนด ดงนนดนตวอยางจะถกทาใหเจอจางลงอก 10 เทา เปน 1:100 หรอ 10-2

5.3 ใชปเปต 1 มล. อนใหมดดเชอจากขวดในขอ 5.2 ออกมา 10 มล. ใสในหลอดทดลองทมนากลน 9 มล. อกหลอดหนง ผสมใหเขากนด ดงนนนาตวอยางจะถกทาใหเจอจางลงอก 10 เทา เปน 1:1000 หรอ 10-3

5.4 ทาการเจอจางเชนนตอไปเรอยจนถง 10-5 ดงภาพ 4-1 5.5 ดดนาจากหลอดทมความเจอจาง 10-4, 10-5 ใสในจานอาหาร nutrient agar จานละ 0.1

มล. 2 จานตอความเจอจาง 5.6 ใชแทงแกวรปตวแอลจมแอลกอฮอล 95% เผาไฟ เพอฆาเชอทแทงแกวเกลยใหนากระจาย

ทวผวหนาอาหาร ทงไวสกครใหผวหนาอาหารแหง 5.7 นาไปบมทอณหภมหอง รอใหเชอเจรญ แลวนามานบจานวน ดงภาพท 7-2

6. เกบโคโลนทแตกตางกน 2 ชนด บนอาหารแขงเพอใชในบทปฏบตการท 5

24

7. การนบจานวนจลนทรย 7.1 นาจานอาหารทมเชอเจรญอยมานบจานวนโดย เวลานบจะตองใหปากกาทาเครองหมายลง

บนจานอาหารตรงตาแหนงโคโลนทนบแลว เพอปองกนการนบซา 7.2 เลอกจานอาหารทมจานวนโคโลนอยระหวาง 30-300 โคโลน มาคานวณหาจานวน จลนทรย

ตอตวอยางนา 1 มล. หอ ตวอยางดน 1 กรม 7.3 การคานวณ

จานวนแบคทเรย (ตอ 1 มล.) = จานวนโคโลนบนจานอาหาร / ความเจอจางของตวอยางทนามาทดสอบ สงทตองค านงถงคอ

จลนทรยทไมสามารถเจรญในอาหารเลยงเชอ เราไมสามารถตรวจนบได ซงไดแก ไวรส และแบคทเรยทเพาะยากบางชนด

จานวนโคโลนทความเจอจางสงควรนอยกวาจานวนโคโลนทความเจอจางตาถดลงมาประมาณ 10 เทา ถาคลาดเคลอนไปมาก แสดงวามความผดพลาดเกดขน อาจเนองมากจากการเจอจางไมด หรอ เชอผสมกบวนอาหารไมด

ภาพท 5-1 ขนตอนการท าการเจอจาง

25

ภาพท 5-2 ขนตอนการพอรเพลท และสเปรดเพลท

©©©©©©©©

26

บทปฏบตการท 6 การยอมสแบคทเรยดวยวธ Gram’ staining

บทน า การยอมสแบบแกรมจดเปนการยอมสแบบแตกตางทมความสาคญในการชวยแบงแบคทเรยออกเปน 2 กลมใหญ ตามคณสมบตของการตดสยอม คอ แบคทเรยแกรมบวก (gram-positive bacteria) และแบคทเรยลบ(gram – negative bactiria) ซงในกระบวนการยอมสแบบแกรมจะใชสยอม 2 ชนด คอ สยอมแรก (primary stain) ซงไดแกสครสตลไวโอเลต (crystal violet) และสยอมทสอง (counterstain หรอ secondary stain) คอสซาฟรานน-โอ (safranin-o)นอกจากนยงมสารอนรวมดวยในกระบวนการยอม เชน สารละลายไอโอดน หรอ Gram’s iodine ทมคณสมบตเปน mordant กลาวคอชวยใหสครสตลไวโอเลตตดกบเซลลของแบคทเรยบวกแนนขน และไมถกลางออกเมอลางดวยแอลกอฮอร 95 เปอรเซน หรอ อาซโตนแอลกอฮอร (acetone alcohot) สาหรบขนตอนโดยสรปของการยอมสแบบแกรม และลกษณะการตดสของแบคทเรยแกรมบวก และแบคทเรยลบ แสดงในตารางท 2-1 ตารางท 6-1 ขนตอนการยอมสแบบแกรม และลกษณะการตดสของแบคทเรยแกรมบวก และแบคทเรยแกรมลบ

ขนตอน สยอมและ สารเคมทใช

เวลา (วนาท)

การตดส

แบคทเรย แกรมบวก

แบคทเรย แกรมลบ

1 (primary stain)

2 (mordant)

3 (decolorization)

4 (counterstain)

ครสตลไวโอเลต

Gram’s iodine

เอธานอล 95% หรอ อาซโตนแอลกอฮอล

ซาฟรานน-โอ

60

60

15-20

60

มวง

มวง

มวง

มวง

มวง

มวง

ไมตดส

แดง

การตดสยอมทแตกตางกนของแบคทเรยแกรมบวก และแบคทเรยแกรมลบ มสาเหตจากโครงสรางและองคประกอบทางเคมของผนงเซลลทแตกตางกนของแบคทเรยทง 2 กลม (ภาพท 5-1) กลาวคอผนงเซลลแบคทเรยแกรมบวกมชนของเปปตโดไกลแคนทหนาและมกรดเทโซอก (teichoic acid) เปนองคประกอบซงสามารถจบกบสารประกอบเชงซอน crystal violet-iodine complex ทเกดจากการทาปฏกรยาระหวางครสตลไวโอเลต และ Gram’s iodine ไดด จงไมถกลางออกไปในขนตอนการลางส (decolorization) และเมอยอมทบสซาฟรานน-โอ เซลลแบคทเรยแกรมบวกจงยงคงตดสมวงของครสตลไวโอเลต สวนแบคทเรยแกรมลบซงมผนงเซลลทประกอบดวย

27

สารจาพวกไขมนเปนสวนมากประกอบกบมชนเปปตโดไกลแคนทบาง สจงถกลางออกไปไดงายในขนตอนของการลางส และเมอยอมทบดวยสซาฟรานน-โอ เซลลของแบคทเรยแกรมลบจงตดสแดงของซาฟรานน-โอ

ภาพท 6-1 โครงสรางและองคประกอบทางเคมของผนงเซลลของแบคทเรยแกรมบวกและแบคทเรยแกรมลบ

นอกจากนการตดสยอมแบบแกรมของแบคทเรยยงมผลมาจากปจจยอนอกหลายประการ เชน อายของเชอแบคทเรยทนามายอมส ปรมาณเซลลแบคทเรยบนรอยเกลยเชอบนสไลดระยะเวลาในการลางส ปรมาณความรอนทใชในขนตอนตรง ตลอดจนสารเคมทใชในกระบวนการยอมนนควรใชสารเคมทเตรยมใหม วตถประสงค

1. เพอใหนกศกษาไดฝกเทคนคการยอมสเซลลแบคทเรยดวยวธ Gram’s staining 2. เพอใหนกศกษาทราบถงความแตกตางระหวางแบคทเรยแกรมบวกและแกรมลบ 3. เพอใหนกศกษาไดศกษารปรางเซลลและลกษณะการเรยงตวของเซลลแบคทเรย

วสดอปกรณ 1. หวงเขยเชอ 2. สไลด ลวดรองสไลด 3. ตะเกยงแอลกอฮอล 4. ชดยอมสแบบแกรม เชน สครสตลไวโอเลต สารละลายไอโอดน แอลลกอฮอล 95% และสซาฟรานน-โอ 5. กลองจลทรรศนชนด brightfield microscope 6. immersion oil 7. กระดาษเชดเลนส

เชอจลนทรย

1. เชอแบคทเรย Escherichia coli อาย 18 – 21 ชวโมง 2. เชอแบคทเรย Staphylococcus aureus อาย 18 – 24 ชวโมง 3. เชอ Unknown 4. เชอจลนทรยทไดจากการทดลองท 4

28

วธทดลอง 1.การเตรยมการกอนการยอมส

การเตรยมสไลด ทาการลางสไลดใหสะอาดปราศจากไขมนโดยใชนวจมนาใหเปยกแตะผงซกฟอกแลวถไปมบนสไลดใหทว ทงไวพอหมาด ๆ จงใชกระดาษชาระเชดคราบผงซกฟอกใหเกลยง หรออาจใชนาปร ะปาลางคราบผงซกฟอกออกพรอมเชดสไลดดวยผาสะอาดหรอกระดาษชาระทงไวสกคร กอนนาไปทาการเกลยเชอ 2.การเกลยเชอ (smear) (รปท 5-1) โดยทวไปม 2 วธ คอ

2.1 การเกลยเชอจากเชอทเพาะเลยงไวบนอาหารวนผวเอยง (slant agar culture) ทาโดยใชหวงเขยเชอแตะนาประปามาประมาณ 2-3 หวง จากนนใชหวงเขยเชอทเผาไฟและทงไวใหเยนซกคร แตะเชอทเจรญบนอาหารวนผวเอยงมาเพยงเลกนอย แตะลงบนหยอดนา และเกลยเชอใหกระจายเปนวงเลก ๆ ทงใหรอยเกลยแหงเองในอากาศ (air dry) รอยเกลยเชอทดตองบางและมเชอแผกระจายอยางสมาเสมอ

2.2 การเกลยเชอจากเชอทเพราะเลยงไวในอาหารเหลว (broth culture) วธนจะทาการเตรยมเกลยเชอโดยไมตองใชหยดนาประปา เพราะเชอแบคทเรยเจรญอยในอาหารเหลว เพยงแตจานวนเชอหนาแนนนอยกวากรณเชอทเจรญบนอาหารวนผวเอยง ดงนนการเตรยมเกลยเชอจงตองใชเชอทเจรญในอาหารเหลวหลายหวง ซงทาโดยใชหวงเขยเชอเผาไฟ ทงไวใหเยนสกคร จมเชอมา 2-3 หวง จากนนเกลยเชอใหกระจายเปนวงเลก ๆ แลวทงไวใหรอยเกลยแหงในอากาศ

ใหนกศกษาเตรยมรอยเกลยเชอแบคทเรยทแจกใหลงบนสไลดแผนเดยวกน ดงน เชอ E.coli, S. aureus และเชอผสมทงสองชนด เมอรอยเกลยเชอแหงแลวนาไปตรง โดยผานเปลวไฟประมาณ 2-3 ครงกอนทาการยอมส 3.การยอมส

3.1 หยดสครสตนไวโอเลต ใหทวมรอยเกลยเชอ ทงไวนาน 1 นาท จากนนเทสสวนเกนทงไปลางดวยนาประปาเบา ๆ ซบดวยกระดาษชาระ (ในขนตอนนอาจใชสารละลายไอโอดนชะเบา ๆ แทนการลางดวยนาประปา และไมตองซบดวยกระดาษชาระ)

3.2 หยดสารละลายไอโอดนใหทวมรอยเกลยเชอ ทงไวนาน 1 นาท จากนนเทสารละลายไอโอดนสวนเกนทงไป

3.3 ชะดวยแอลกอฮอล 95% หรออาวโตนแอลกอฮอล นาน 15-20 นาท จากนนลางดวยนาประปาเบา ๆ ทนท ซบดวยกระดาษชาระ

3.4 ยอมทบดวยสซาฟรานน-โอ ใหทวมรอยเกลยเชอ ทงไวนาน 1 นาท เทสซาฟรานน-โอ สวนเกนทง ลางดวยนาประปาเบา ๆ ซบใหแหงดวยกระดาษชาระ

3.5 นาไปตรวจดการตดสแกรม รปราง การจดเรยงตวของเซลลภายใตกลองจลทรรศนกาลงขยาย 400 และ 1,000 เทา บนทกผลพรอมวาดภาพประกอบ

3.6 ใหนกศกษานาเชอ Unknown 2 เชอและเชอทไดจากการทดลองท 4 มายอมสแกรม พรอมทงบนทกผลการตดสแกรม และรปรางของเชอแบคทเรย ภายใตกลองจลทรรศน

29

ภาพท 6-1(a-f) การเตรยมรอยเกลยเชอแบคทเรยกอนนาไปยอมส ; (a) เขยเชอแบคทเรยมาพอประมาณนามาแตะลงบนหยดนาทเตรยมไวบนสไลด (b) เกลยใหหยดนาทมเชอ แบคทเรยกระจายเปนฟลมบางๆ (c) นาหยดเชอแบคทเรยมาประมาณ 2-3 หวง (d) เกลยใหหยดเชอแบคทเรยกระจายเปนฟลมบาง ๆ (e) ทงไวใหเยน (air dry) (f) ตรงรอยเกลยเชอดวยความรอน (heat-fix)

©©©©©©©©

30

บทปฏบตการท 7 Sterilization and Disinfection

บทน า

การกาจดและการยบยงการเจรญของจลนทรยมอยดวยกนหลายวธ เชน วธทางกายภาพ (physical method) ไดแก การใชความรอน (heat treatment) การกรอง (filtration) การฉายรงส (radiation) หรอวธการทางเคม (chemical method) ไดแก การใชสารเคมบางชนดทมคณสมบตในการทาลายจลนทรย โดยไปทาใหเยอหมเซลลเกดรรว หรอไปทาใหโปรตนและกรดนวคลอกของจลนทรยเสยสภาพไป

การใชความรอนในการควบคมการเจรญของจลนทรยเปนวธทใชกนแพรหลาย และมหลายวธ เชน การตม การนง การอบในตอบอณหภมสง (hot air oven) การทา pasteurization การนงภายใตความดนไอนา (autoclaving) โดยความรอนจะทาใหโปรตนและองคประกอบในเซลเสยสภาพไป อณหภมทใชในการทาลายจลนทรยแตละชนดจะตางกนไปขนชนดของจลนทรยกบชวงอณหภมทเหมาะสมในการเจรญของเชอ จลนทรยหลายชนดมความทนตอความรอนไดแตกตางกนไป ดงนนจงมการกาหนดตวบงชตาง ๆ เพอใชเปรยบเทยบความทนทานตอความรอนของจลนทรยดงน Thermal death point (TDP) หมายถง อณหภมตาสดทสามารถทาลายจลนทรยในของเหลวไดภายใน 10 นาท Thermal death time (TDT) หมายถง ชวงเวลาทสนทสดทสามารถทาลายแบคทเรยในของเหลวไดทงหมดในอณหภมทกาหนด

รงสอลตราไวโอเลต (UV) มผลตอโครงสรางของเซลลทดดซบรงสนไวไดด เชน DNA, RNA โปรตนและสารอนทรยอน ๆ ในจานวนโครงสรางทดดซบรงสอลตราไลโอเลตไวน พบวา ผลทเก ดขนกบ DNA จะมความสาคญตอเซลลมากทสด เพราะ DNA เปนสารพนธกรรม จงควบคมกลไกการดาเนนชวตของเซลล การตายของจลนทรยเกดขนเนองจาก DNA ไมสามารถจาลองตวเองได หรอ gene ทควบคมหนาทสาคญของเซลลผดปกต (mutation) ประสทธภาพการใชรงส UV มขอจากด โดยขนกบความแรงของรงสและเชอตองสมผสกบรงสโดยตรง วตถประสงค

1. เพอศกษากรรมวธในการควบคมจลนทรยทเปนวธทางกายภาพและเคม 2. เพอศกษาปจจยทอาจมผลกระทบตอวธการทใชในการควบคมจลนทรย 3. เพอใหนกศกษาสามารถทดสอบเพอเปรยบเทยบประสทธภาพในการฆาแบคทเรยของนายาฆาเชอ

ตอนท 1 การหาคา thermal death point วสดอปกรณ

1. หลอดทดลอง 2. อาหารเลยงเชอ Nutrient agar (NA) 3. ไมพนสาลทปราศจากเชอ (cotton swab) 4. อางนาควบคมอณหภม 5. หวงเขยเชอ 6. ตะเกยงแอลกอฮอล

31

เชอจลนทรย 1. Bacillus subtilisเลยงใน nutrient broth 48-72 ชวโมง 2. Escherichia coliเลยงใน nutrient broth 24 ชวโมง วธทดลอง

1. นา nutrient broth ทเลยงเชอ Bacillus subtilis มา 48-72 ชวโมง จานวน 5 หลอด และ nutrient broth ทเลยงเชอ Escherichia coli มา 24 ชวโมง จานวน 5 หลอด

หลอดท 1 ของเชอทง 2 ชนด ใชเปนหลอดควบคม หลอดท 2 ของเชอทง 2 ชนด นาไปแชในอางนารอน 50ซ. นาน 10 นาท หลอดท 3 ของเชอทง 2 ชนด นาไปแชในอางนารอน 62.5ซ. นาน 10 นาท หลอดท 4 ของเชอทง 2 ชนด นาไปแชในอางนารอน 75ซ. นาน 10 นาท หลอดท 5 ของเชอทง 2 ชนด นาไปตมในนาเดอด 100ซ. นาน 10 นาท

2. นาอาหารเลยงเชอ nutrient agar มา 2 จาน แลวแบงออกเปน 6 สวนเทา ๆ กน และแตละสวนเขยนทกนจานอาหารวา C (control), U (uninoculate), 50, 62.5, 75 และ 100 พรอมกบเขยน B (B. subtilis), E (E. coli) ลง plate ท 1, 2 ตามลาดบ

1. นาเชอจากหลอดท 1 ถง 5 ของเชอทง 2 ชนด มา streak บนอาหารแตละสวนโดยใช sterile loop

สาหรบสวนทเขยนวา “U” ไมตอง streak เชอใด ๆ 2. นาจานอาหารทงสองไปบมในตบมเชอ อณหภม 37C นาน 18-24 ชวโมง 3. ตรวจดโคโลนของเชอบนอาหารแตละสวน สงเกตการเจรญและไมเจรญของเชอบนอาหารแตละ

สวน อานคา thermal death point รายงานผลการทดลองในตารางบนทกผลการทดลอง ตอนท 2 การท าลายจลนทรยโดยใชแสงอลตราไวโอเลต วสดอปกรณ

1. หวงเขยเชอ 2. ตะเกยงแอลกอฮอล 3. จานอาหารบรรจ nutrient agar

C U B

50

75 100

62.5

C U E

50

75 100

62.5

32

เชอจลนทรย 1. Bacillus subtilisเลยงใน nutrient broth 48-72 ชวโมง 2. Serratia marcescensเลยงใน nutrient broth 24 ชวโมง

วธทดลอง 1. นา sterile loop มาจมเชอ แลวนามา streak ใหเปนเสนตรง 2 เสนบนผวหนาอาหารวน ดงรป 2. ปดฝาแลวขดเสนแบงครงกนจานอาหาร เขยนวา UV และ non UV 3. นาจานอาหารมาวางไวใตหลอดอลตราไวโอเลต โดยเปดฝาเฉพาะดานทเขยนวา UV 4. เปดสวตซใหแสงอลตราไวโอเลตถกเชอนาน 10 นาท 5. นาจานอาหารไปบมในตบมเชอ อณหภม 37C นาน 18-24 ชวโมง 6. ตรวจดโคโลนของเชอบนจานอาหารทง 2 สวน รายงานผลการทดลองวามการเจรญของเชอหรอไม

หากมการเจรญปรมาณการเจรญมากนอยเพยงใด ตอนท 3 การท าลายจลนทรยโดยใชสารเคม เชอจลนทรย

1. Bacillus subtilisเลยงใน nutrient broth 48-72 ชวโมง 2. Escherichia coliเลยงใน nutrient broth 24 ชวโมง

อาหารเลยงเชอ Nutrient agar plate2 plates

สารเคม 1. 70% Alcohol ; A 2. 3% Hydrogen peroxide ; H 3. Mercurochrome ; M 4. 0.5% Phenol ; P 5. Tincture iodine ; T

Serratia marcescens

Bacillus subtilis

Non UV UV

33

วธทดลอง 1. แบงจานอาหารออกเปน 6 สวนเทา ๆ กน และแตละสวนเขยนวา C (control), A, H, M, P และ T

พรอมกบเขยน B (B. subtilis), E (E. coli) ลง plate ท 1, 2 ตามลาดบ 2. นา sterile swab มาจมเชอพอหมาด ๆ นามาปายบนผวหนาอาหารใหเชอกระจายทวกน 3. นาแผน disc ทปราศจากเชอ ชบสารเคมแตละชนด นามาวางบนผวหนาอาหารตามทเขยนไว ยกเวน

สวนทเขยนวา C ดงรป

4. นาจานอาหารไปบมในตบมเชอ อณหภม 37ซ. นาน 18-24 ชวโมง 5. ตรวจดและวด inhibition zone ทเกดจากเชอแตละชนด แลวบนทกผลในตารางบนทกผลการทดลอง

©©©©©©©©

C A H B

P T

M

C A

E H

P T

M

34

บทปฏบตการท 8 Antibiotic susceptibility test

บทน า

เชอมความไวตอยาตานจลชพตางกน และความไวของเชอกสามารถเปลยนแปลงไปเมอเชออยในสภาวะทแตกตางไปจากเดม สามารถประเมนความไวของเชอไดโดยวธหลก ๆ 2 วธ คอ disc diffusion method และ tube dilution method

Disc diffusion method วธการนจะนาเชอทตองการจะทดสอบมาปายบนผวหนาของอาหารวนและนาแผนกระดาษกรองทตดไวเปนวงกลมซงมตวยาชนดตาง ๆ อย (antibiotic disc) มาวางบนผวหนาของอาหารวน หลงจากนาไปบมในตเพาะเชอ ตวยาจะคอย ๆ ซมจาก disc แผนเปนรศมโดยรอบจากทมความเขมขนสงไปทมความเขมขนตา ตวยาทมประสทธภาพจะยบยงการเจรญของเชอและพบวงใสรอบแผนยา (zone of inhibition) ใหวดเสนผาศนยกลางแลวนาไปเทยบกบมาตรฐานของยานน ๆ กจะทราบวาเชอไวตอยา (susceptible) ไวปานกลาง (intermediate susceptible) หรอดอตอยา (resistance)

Tube dilution method วธการนใชหลกการของการเจอจางสารตานจลชพ (antibiotic) ในอาหารเหลวใหมความเขมขนแตละหลอดลดลงไปครงหนงเรอย ๆ (two fold dilution) แลวนาเชอทตองการทดสอบเตมลงไปในจานวนจากดทกหลอด หลงจากนาไปเพาะเลยงสามารถหาคาความเขมขนของยาตาสดทยบยงการเจรญของเชอซงเรยกวา Minimum Inhibitory Concentration (MIC) โดยอานผลจากหลอดทไมมเชอเจรญ โดยจะเปนหลอดทใสไมขนและมความเขมขนของยาตาสด และถาทาการถายเชอจากหลอดทไมพบวามเชอเจรญไปเพาะเลยงตอบนอาหารวนจะสามารถหาคาความเขมขนของยาตาสดทไมพบการเจรญของเชอบนอาหารวนซงเรยกวา Minimum Bactericidal Concentration (MBC) วตถประสงค

1. เพอใหนกศกษาสามารถอธบายและใหคาจากดความตอไปนได : disc diffusion method, tube dilution method, MIC, MBC

2. เพอใหนกศกษาสามารถแปลผลการทดสอบความไวของเชอตอยาโดยวธ disc diffusion method และ tube dilution method ได ตอนท 1 การทดสอบความไวของเชอตอยาโดยวธ disc diffusion method (Kirby-bauer method) วสดอปกรณ

1. อาหารเลยงเชอ Mueller-Hinton agar 1 plate 2. ไมสาลพนปราศจากเชอ (swab) 3. Antibiotic Disc 4. ตะเกยงอลกอฮอล, forcep

35

เชอแบคทเรย Staphylococcus aureus หรอ Escherichia coli กระจายตวใน Tryptic Soy Broth จนมความขนเทากบ

McFarland No. 0.5 (จะมเชออยประมาณ 1.5 x 108 CFU/ml) วธการทดลอง 1. ใชไมพนสาลจมเชอปายถ ๆ ใหทวผวหนา Mueller-Hinton Agar รวมทงขอบของอาหาร วางจานใหแหงเปน

เวลา 10-15 นาท 2. นาแผนยา (antibiotic disc) ไปวางบนผวหนาของอาหารและกดเบา ๆ โดยใชคมทปราศจากเชอโดยวางแผนยา

ใหหางกนประมาณ 3 เซนตเมตร และหางจากขอบจานอาหารประมาณ 1.5 เซนตเมตร นาจานอาหารไปเกบในเพาะเชอเปนเวลา 16-18 ชวโมง (รป 8.1)

3. การศกษาใหสงเกตด inhibition zone ทเกดขนและวดเสนผาศนยกลางนาไปเทยบกบตาราง มาตรฐาน (ตารางท 8.1)

รปท 8.1 แสดงการวาง antibiotic disc

antibiotic disc

36

ตารางท 8.1คามาตรฐานในการแปลผล Inhibition zone จากการทา antibiotic susceptibility test

Disk symbol

Chemotherapeutic Agent Disk Content

Diameter of zones of inhibition (mm) Resistant Intermediate Susceptible

Am Ampicillin, when testing gram

negative microorganisms and enterococci

10 g 13 or less 14-16 >17

AM Ampicillin, when testing Staphylococci and penicillin G susceptibel microorganisms

10 g 28 or less - >29

B Bacitracin 10 units 8 or less 9-12 13 or more C Chloramphenicol 30 g 12 or less 13-17 18 or more

CL Colistin 10 g 8 or less 9-10 11 or more E Erythromycin 15 g 13 or less 14-17 18 or more

GM Gentamicin 10 g 12 or less - 13 or more K Kanamycin 30 g 13 or less 14-17 18 or more

ME Methicillin 5 g 9 or less 10-13 14 or more N Neomycin 30 g 12 or less 13-16 17 or more

NB Novobiocin 30 g 17 or less 18-21 22 or more P Penicillin G, when testing

staphylococci 10 units 8 or less 9-12 13 or more

37

ตอนท 2 การทดสอบความไวของเชอตอยาโดยวธ tube dilution method (broth dilution method) วสดอปกรณ

1. อาหารเลยงเชอ Trypticase soy broth (TSB) 10 มลลลตร 2. ampicillin solution (100 g/ml) 3. Sterile tube 10 หลอด, Sterile pipette, ลกยาง, ตะเกยงอลกอฮอล

เชอแบคทเรย Escherichia coli หรอ Staphylococcus aureus กระจายตวใน Tryptic Soy Broth จนมความขนเทากบ

McFarland No. 0.5 วธทดลอง (ตาราง 8.2)

1. นาหลอดแกวปราศจากเชอมา 10 หลอดเขยนหมายเลข 1-10 แลวดด TSB ใสหลอดท 2-10 หลอดละ 0.5 มลลลตร

2. ดด ampicillin solution (100 g/ml) ใสหลอดท 1 และ 2 หลอดละ 0.5 มลลลตร 3. ผสมยาและอาหารในหลอดท 2 ใหเขากนแลวดสารละลายจากหลอดท 2 0.5 มลลลตร ไปใสใน

หลอดท 3 และในหลอดท 3 ใหทาเชนเดยวกบหลอดท 2 โดยผสมใหเขากนแลวดดสารละลายไปใสในหลอดท 4 ทาเชนนไปเรอย ๆ จนถงหลอดท 9 ใหดดสารละลายยาทงไป 0.5 มลลลตร

4. ดดเชอทเพาะเลยงในอาหารเหลว (broth culture) ทปรบจากความขนจนเทากบ McFarland No. 0.5 .ใสลงไปในหลอดท 1-10 ทก ๆ หลอด หลอดละ 0.5 มลลลตร แลวนาหลอดทดลองทงหมดไปบมในตเพาะเชอ 37C เปนเวลา 16-18 ชวโมง

5. อานผลคา MIC ของยาตอเชอซงเปนความเขมขนของยาตาสดทยบยงการเจรญของเชอในอาหารเหลว

38

ตารางท 8.2 แสดงการทา tube dilution method

Tube number

TSB (ml) Ampicillin solution Diluted broth culture

Final ampicillin concentration

(gml-1) 1 - 0.5 ml. From working solution 0.5 50 2 0.5 0.5 ml. From working solution 0.5 25 3 0.5 0.5 ml. From tube No. 2 0.5 12.5 4 0.5 0.5 ml. From tube No. 3 0.5 6.25 5 0.5 0.5 ml. From tube No. 4 0.5 3.125 6 0.5 0.5 ml. From tube No. 5 0.5 1.562 7 0.5 0.5 ml. From tube No. 6 0.5 0.781 8 0.5 0.5 ml. From tube No. 7 0.5 0.39 9 0.5 0.5 ml. From tube No. 8 0.5 0.195

10 0.5 - 0.5 0

©©©©©©©©

39

บทปฏบตการท 9 Gram-positive cocci, Gram-negative cocci and Gram-positive bacilli

บทนา

แบคทเรยกอโรคในกลม Gram positive cocci ไดแก Genus Staphylococci, Sreptococci, Enterococci ซงจดเปนเชอประจาถน (normal flora) ทพบไดทวไปในรางกาย คณสมบตทวไปคอรปรางกลม ยอมตดสกรมบวก และมความสามารถในการสลายเมดเลอดแดง (hemolysis) บนอาหาร blood agar ทแตกตางกนดงน

- alpha-hemolysis มการสลายเมดเลอดแดงบน blood agar เพยงบางสวน เหนเปนสเขยวรอบ ๆ โคโลนของเชอ

- bata-hemolysis มการสลายเมดเลอดแดงบน blood agar อยางสมบรณ เหนเปนวงใส ๆ รอบ โคโลนของเชอ

- gamma-hemolysis ไมพบการสลายเมดเลอดแดงบน blood agar คณสมบตทางเคมทส าคญทใชทดสอบและแยกความแตกตางของเชอในกลม Gram-positive cocci

- Catalase test ใชแยกเชอในกลม Staphylococci และ Sreptococci เนองจากเชอ Staphylococci สามารถสรางเอนไซม catalase ซงมคณสมบตในการเปลยนไฮโดรเจนเปอรออกไซม (H2O2) ใหเปนนาและออกซเจนดงสมการ

2H2O2 2H2O + 2 O2

- Coagulase test ใชแยกเชอ S. aureus ออกจาก Staphylococci อน ๆ S. aureus เปนเชอกอโรคในคน

เพยงชนดเดยวทสามารถสรางเอนไซม coagulase ซงเปนเอนไซมทมคณสมบตเปลยน fibrinogen เปน fibrin ทาใหเลอดแขงตว การทดสอบสามารถทาไดทง slide coagulase test และ tube coagulase test

- Bacitracin susceptibility test ใชพสจนเชอ group A streptococcus ซงเปนเชอทไวตอสาร bacitracin ใชแยกความแตกตางระหวาง group A streptococcus กบ beta-hemolytic streptococci อน ๆ

- Optochin susceptibility test ใชพสจนเชอ Streptococus pneumoniae (pneumococci) เนองจากสาร optochin สามารถยบยงเชอ pneumococci แตไมยบยง alpha-hemolytic streptococci อน ๆ สวนแบคทเรยกอโรคทสาคญในกลม Gram negative cocci คอ N. gonorrheae และ N. meningitidis เชอในกลมนจะใหผลบวกในการทา oxidase test และสามารถอาศยคณสมบตในการใชนาตาล (sugar fermentation) เพอวนจฉยและแยกเชอในระดบ species ได

- Oxidase test อาศยคณสมบตในการสรางเอนไซม cytochrome oxidase ของแบคทเรยสามารถทดสอบการสราง cytochrome oxidase ของเชอไดโดยการใช oxidase paper strip มาแตะบนโคโลนของเชอ ถากระดาษเปลยนเปนสมวงเขมภายใน 10 วนาท แสดงวาใหผลเปนบวก

40

วตถประสงค 1. เพอใหนกศกษาสามารถอธบายรปราง คณลกษณะ และคณสมบตของเชอแบคทเรยทกอใหเกดโรค

ในกลมตอไปนได Staphylococci, Sreptococci, Enterococci, Pneumococci, Neisseria, Corynebacteria และ Badillus

2. สามารถแยกความแตกตางของเชอเหลานไดโดยอาศยคณสมบตทางชวเคมทสาคญของเชอแตละกลม หรอแตละชนด

ตอนท 1 การศกษาคณสมบตบางประการของเชอในกลม Gram-positive cocci วสดอปกรณ

1. Blood agar plate (BA) 2. Manitol salt agar (MSA) 3. 3% Hydrogen peroxide 4. Plasma 5. นากลนปราศจากเชอ 6. ชดยอมสกรมและสไลด

เชอแบคทเรย Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Streptococcus pyogenes Enterococcus faecalis

วธทดลอง 1. การยอมส

ศกษาการตดสยอม รปราง และการเรยงตวของเชอทง 4 ชนด โดยการยอมแบบ Gram staining บนทกผลการทดลองในตาราง

2. Catalase test ใช sterile loop แตะเชอ S. aureus, S. epidermidis และ S. pyogenes มาปายบนสไลด แลวหยด 3% Hydrogen peroxide ลงไปบนเชอ สงเกตการเกดฟองกาซ บนทกผลในตาราง

3. Coagulase test 3.1 หยดนากลนลงบนสไลด 1 หยด แลวใช sterile loop แตะเชอ S. aureus แลวนาไปทาใหกระจาย

ตวในหยดนากลนจนเปนเนอเดยวกน เหนเปนลกษณะ suspension 3.2 ทาเชนเดยวกบขอ 3.1 แตใชเชอ S. epidermidis แทน S. aureus 3.3 หยด plasma 1 หยด ลงบน suspension ของเชอ ผสมใหเขากนเปนเวลาประมาณ 5 วนาท สงเกต

การเกาะกลม (clumping) ของเชอ บนทกผลตาราง

41

4. ความแตกตางทางคณสมบตทางชวเคมของ S. aureus และ S. epidermidis โดยใช sterile loop แตเชอทตองการทดสอบมา streak บนอาหาร manitol salt agar โดยแบงพนทในจานอาหารออกเปนสองสวนเทา ๆ กน นาไปบมท 37C เปนเวลา 24 ชวโมง สงเกตการเจรญของเชอ และการเปลยนสของอาหาร เทยบกบแผนภาพทตงแสดง

5. ศกษาการเจรญของเชอ Enterococcus sp. โดยใช sterile loop แตะเชอทตองการทดสอบมา streak บนอาหาร Bile-esculin agar นาไปบมท 37C เปนเวลา 24 ชวโมง สงเกตการเจรญของเชอ และการเปลยนสของอาหาร เทยบกบแผนภาพทตงแสดง

การสาธต

1. การสลายเมดเลอดแดง (hemolysis) ของเชอในกลม Gram-positive cocci ใหศกษาลกษณะโคโลน ส ขนาด (เสนผาศนยกลางเปนมลลเมตร) และการสลายเมดเลอดแดง (, หรอ ) ของเชอ Gram-positive cocci บนอาหาร BA จากแผนภาพทตงแสดงแลวบนทกผลลงในตาราง

2. การวนจฉบเชอ S. pyogenes หลกการ S. pyogenes หรอ group A streptococci เปนเชอใน Genus Sterptococcus ทยอยสลายเมดเลอดแดงอยางสมบรณ ( -hemolysis) และไวตอ bacitracin ดงนนเราจงสามารถใชการทดสอบความไวของเชอตอ bacitracin (bacitracin susceptibility test) เพอพสจนเชอในเบองตน และเพอแยกความแตกตางระหวาง S. pyogenes กบ -hemolytic streptococci ชนดอนได Bacitracin susceptibility test ใช sterile loop แตะเชอทตองการมา streak ถ ๆ บน BA plate แลวนา bacitracin dise มาวางบนบรเวณท streak เชอไว บมเชอท 37C เปนเวลา 18-24 ชวโมง ถาม clear zone เกดขนรอบแผน dise แสดงวาใหผลเปนบวก ใหศกษาขนตอนการทาและการแปลผลจาแผนภาพทตงแสดง

3. การวจจฉยเชอ S. pheumoniae หรอ pneumococci หลกการ สาร optochin สามารถยบยงการเจรญของเชอ Pneumococci ซงเปนเชอใน Genus Sterptococcus ทสามารถยอยสลายเมดเลอดแดงไดเพยงบางสวน ( - hemolysis) การทา optochin susceptibility test จงชวยการวนจฉบเชอ Pneumococci ไดในเบองตน และชวยในการแยกเชอชนดนออกจากเชอ -Sterptococci กลมอน ๆ Optochin susceptibility test ใช sterile loop แตะเชอทตองการมา streak ถ ๆ บน BA plate แลวนา optochin dise มาวางบนบรเวณท streak เชอไว บมเชอท 37C เปนเวลา 18-24 ชวโมง ถาม clear zone เกดขนรอบแผน dise แสดงวาใหผลเปนบวก ใหศกษาขนตอนการทาและการแปลผลจากแผนภาพทตงแสดง

42

ตอนน 2 การศกษาคณสมบตบางประการของเชอในกลม Gram-negative cocci วธศกษา

1. ใหศกษาลกษณะโคโลน รปราง การเรยงตว และการตดสยอมของเชอ N. gonorrheae และ N. meningitidis จากสไลดและแผนภาพทตงแสดง

2. ใหศกษาลกษณะโคโลน รปราง การเรยงตว และการตดสยอมของเช อ N. gonorrheae และ N. meningitidis จากสไลดและแผนภาพทตงแสดง

ตอนท 3 การศกษาคณสมบตบางประการของเชอในกลม Gram-positive bacilli วสดอปกรณ

1. ชดยอมสกรมและสไลด 2. NA slant ของเชอ Bacillus sp. 3. สไลดถาวรของเชอ C. diphtheriae, B. cereus, B. anthracis

วธทดลอง

1. ศกษารปราง การเรยงตว และการตดสยอมของเชอ Bacillus sp. ทไดจากการยอมโดยวธ Gram staning

2. ศกษารปราง การเรยงตว และการตดสยอมของเชอจากสไลดถาวร และแผนภาพทตงแสดง 3. ศกษาลกษณะโคโลนของเชอ C. diphtheriae, B. cereus, B. anthracis จากแผนภาพทตงแสดง

©©©©©©©©

43

บทปฏบตการท 10 Enterobacteriaceae

บทน า

การทดสอบทางชวเคมทใชจาแนกเชอในกลม Enterobacteriaceae มดงน 1. Indole production เปนการตรวจสอบความสามารถของเชอในการใชกรดอะมโน tryptophan โดย

อาหารทใชคอ SIM medium โดยถาเชอสามารถใช tryptophan ได จะให indole ออก มาซงสามารถตรวจสอบไดโดยการหยด Kovac’s reagent กจะเหนเปนวงแหวนสแดงทอยผวหนาของอาหาร

2. Motility and H2S โดยใชอาหาร SIM medium ซงเปนอาหารประเภทกงแขงกงเหลวทใชในการทดสอบความสามารถในการเคลอนท นอกจากนยงใชในการตรวจสอบความสามารถในการผลต H2S โดย H2S ทเกดขนจะรวมตวกบ metallic ion ในอาหารไดเปน sulfide ททาใหอาหารมสคลาลง

3. Urease test เปนการทดสอบความสามารถของเชอในการสลายยเรยใหเปนแอมโมเนยและคารบอนไดออกไซด โดยอาหารทใชทดสอบจะมยเรยเปนสวนประกอบและม phenol red เปนอนด-เคเตอร ถาเชอสามารถสลายยเรยได อาหารจะเปลยนเปนสชมพ

4. Citrate test เปนการทดสอบความสามารถของเชอในการใช citrate เปนแหลงคารบอนโดยอาหารทใชทดสอบจะม citrate เปนองคประกอบและม bromothymol blue เปนอนดเคเตอร ถาเชอทนามาทดสอบสามารถใช citrate ไดจะเปนสของอาหารจากเขยวเปนฟา

5. การเจรญของแบคทเรยบน MacConkey agar MacConkey agar เปนอาหารเลยงเชอทใชสาหรบทดสอบ Lactose และ non-lactose fermentor ของแบคทเรยในแฟมล Enterobacteriaceae ได โดยในอาหารนจะมนาตาลแลคโตสเปนองคประกอบ ถาเชอทนามาทดสอบสามารถใชนาตาลแลคโตสได โคโลนจะเปนสชมพ ถาไมสามารถใชนาตาลแลคโตส โคโลยจะไมมส

6. TSI tests (Triple Sugar Iron) เปนความสามารถในการทดสอบการใชนาตาลของเชอ TSI agar เปนอาหารทมนาตาล 3 ชนดเปนสวนประกอบ คอ กลโคส 0.1%, แลคโตส 1%, และซโครส 1% โดยม phenol red เปนอนดเคเตอร แสดงการเกดกรดจากการใชนาตาลซงตองอานผลใน 18-24 ช.ม. โดยอานผลดงน

6.1 เชอ ferment นาตาลกลโคสไดอยางเดยว อานผลเปน K/A พบสวนลางของอาหาร (butt) เปนสเหลอง (Acid) และบรเวณ slant เปนสแดง (alkaline) เกดจากมการใชนาตาลกลโคสใหกรดออกมาทาให phenol red เปลยนสจากแดงเปนเหลอง สวนบรเวณ slant เปนบรเวณทมเชออยมากเชอจะใชกลโคสจนหมดอยางรวดเรว และไมสามารถใชนาตาลชนดอนไดจงหนไปใชโปรตนแทนไดผลตผลสดทายเปนดาง (alkaline) สของ indicator จงเปลยนกลบมาเปนสแดง

44

6.2 เชอ ferment นาตาลไดมากกวา 1 ชนด อานผลเปน A/A จะเหนทง slant และสวนลางของอาหาร (butt) เปนสเหลอง (Acid) โดยครงแรกเชอจะใชนาตาลกลโคสกอนและในสวน slant เมอกลโคสหมด เชอจะหนไปใชนาตาลชนดอนแทนแลวใหกรดออกมาตลอดเวลาทาให phenol red ยงคงเปนสเหลองอย

6.3 เชอไมสามารถ ferment นาตาลทง 3 ชนดได แตจะใชโปรตนในอาหารแทนทาใหอาหารมฤทธเปนดางจงเกดสแดงตลอดหลอดอาหารอานผลเปน K/K หรอ K/N

นอกจากนยงอานผลการเกด H2S ซงในอาหารจะม Ferrous ammonium sulfate อยถาม H2S เกดขน H2S จะทาปฏกรยากบ Ferrous sulfate ได FeS เหนเปนตะกอนสดาและอานผลการเกดกาซซงจะมการดนอาหารใหยกขนหรอแตกตางออกได ตาราง 10.1 สรปการแปลผล TSI tests

สอาหาร เกด gas เกด H2S การแปลผล

slant button เหลอง เหลอง - - A/A- เหลอง เหลอง + - A/AG- เหลอง เหลอง - + A/A+ เหลอง เหลอง + + A/AG+ แดง เหลอง - - K/A- แดง เหลอง + - K/AG- แดง เหลอง - + K/A+ แดง เหลอง + + K/AG+ แดง แดง - - K/K-

วตถประสงค

1. เพอใหนกศกษาสามารถอธบายรปรางลกษณะของเชอในกลม Enterobacteriaceae ได 2. เพอใหนกศกษาสามารถวนจฉยเชอในกลม Enterobacteriaceae โดยใชคณสมบตทางชวเคม

ตอนท 1 ลกษณะรปรางและการเรยงตวของแบคทเรยในกลม Enterobacteriaceae วสดอปกรณ

1. อปกรณการยอมสแกรม 2. หวงเขยเชอ, ตะเกยงอลกอฮอล, แผนกระจกสไลด 3. กลองจลทรรศน

45

เชอแบคทเรย

Escherichia coliบนอาหารวนเอยงอาย 24 ชวโมง Salmonella sp.บนอาหารวนเอยง อาย 24 ชวโมง Shigella sp.บนอาหารวนเอยง อาย 24 ชวโมง

วธทดลอง ยอมสกรมเพอศกษารปรางลกษณะ และการเรยงตวของเชอในกลม Enterobacteriaceae

ตอนท 2 การทดสอบคณสมบตทางชวเคมของแบคทเรยในกลม Enterobacteriaceae วสดอปกรณ

1. TSI slant2. Citrate slant 3. SIM medium4. MacConkey agar 5. Urea medium6. เขมเขยเชอและหวงเขยเชอ 7. Kovac’s reagent

เชอแบคทเรย Escherichia coliบนอาหารวนเอยง อาย 24 ชวโมง Salmonella sp.บนอาหารวนเอยง อาย 24 ชวโมง Shigella sp.บนอาหารวนเอยง อาย 24 ชวโมง Enterobacter sp.บนอาหารวนเอยง อาย 24 ชวโมง Proteus sp.บนอาหารวนเอยง อาย 24 ชวโมง

วธทดลอง 1. TSI test : ใชเขมเขยเชอทฆาเชอแลว เขยเชอแตละชนดไป streak บน slant และ stab จนถงกนหลอด 2. Citrate test และ urease test : ใชหวงเขยเชอทฆาเชอแลว เขยเชอแตละชนดไป streak บนอาหารวน

เอยง 3. Indole production, motility test และ H2S production : ใชเขมเขยเชอทฆาเชอแลว เขยเชอแตละชนด

ไป stab ลงไปในอาหารตรง ๆ ประมาณ ¾ ของอาหาร 4. Lactose fermenter : ใชหวงเขยเชอทฆาเชอแลว เขยเชอแตละชนดไป streak บนจานอาหาร

MacConkey agar 5. นาจานอาหารและหลอดทดลองทงหมดไปบมท 37C, 24 ชวโมง บนทกผลการทดลองในตาราง สาหรบการทดสอบ Indole production ใหหยด Kovac’s reagent ลงไปบนผวหนาของอาหาร SIM

medium ผลบวกจะใหวงแหวนสแดงเกดขนบรเวณผวหนาของอาหาร

©©©©©©©©

46

บทปฏบตการท 11 Nonfermenter, Vibrionaceae and Gram negative coccobacilli

บทน า

นอกจากแบคทเรยในแฟมล Enterobacteriaceae แลวยงมแบคทเรยแกรมลบรปแทงอกหลายจนสทพบไดทวไปในสงแวดลอมและเปนสาเหตของโรคตดเชอหลายชนด ทสาคญไดแก แบคทเรยในกลม nonfermenter โดยเฉพาะอยางยง Pseudomonas aeruginosa เนองจากเชอนกอใหเกดโรคในคนและตานทานตอยาตานจลชพหลายชนด ดงนนการแยกความแตกตางระหวาง Enterobacteriaceae Vibrionaceae และ nonfermenter จงมความสาคญมาก ซงสามารถทาไดโดยดลกษณะของโคโลน การผลตเอนไซม oxidase การสลายเมดเลอดแดง และการ ferment นาตาล

สวนการแยกความแตกตางของเชอพวก Vibrio spp. ทาไดโดยจากการเพาะเลยงบน differential media ไดแก TCBS (Thiosulfate Citrate Bile Salt sugar) โดยในอาหารนจะมนาตาลซโครสเปนองคประกอบ ถาเชอทนามาทดสอบสามารถใชนาตาลซโครสโคโลนจะเปนสเหลอง ถาไมสามารถใชนาตาลซโครส โคโลนจะมสเขยว วตถประสงค

1. เพอใหนกศกษาสามารถอธบายรปรางลกษณะของเชอในกลม Nonfermenter ได 2. เพอใหนกศกษาสามารถแยกความแตกตางระหวาง Nonfermenter และ Enterobacteriaceae ได 3. เพอใหนกศกษาสามารถแยกความแตกตางระหวาง Vibrio cholerae และ V. parahaemolyticus ได 4. เพอใหนกศกษาสามารถอธบายรปราง ลกษณะของแบคทเรยในกลม Gram negative coccobacilli ได

47

Nonfermentative Gram Negative Bacilli

เชอทสาคญ, พบบอย และ ควรรจก 1. Pseudomonas aeruginosa

2. Burkholderia pseudomallei ( Pseudomonas pseudomallei ) 3. Burkholderia cepacia ( Pseudomonas cepacia )

4. Acinetobacter baumannii

ตาราง 11-1 ลกษณะ colony บน Blood agar และ Mac Conkey agar

เชอ BA Mac

P. aeruginosa สเขยว , hemolysis กลนผลไม สใส , นาตาลใส กลนผลไม

B. pseudomallei เหยวยน กลนดน สชมพ , เหยวยน กลนดน

B. cepacia นนเยมคลายเนย สชมพ

A. baumannii สขาว สชมพ ( peach )

ตาราง 11-2 ลกษณะพเศษบน TSI

เชอ ลกษณะบน TSI

P. aeruginosa B. pseudomallei B. cepacia A. buamannii

metallic sheen บนผว slant colony เหยวยน yellow pigment ไมมลกษณะพเศษ

การทดสอบทางชวเคม (Biochemical test) 1. Oxidase test oxidase Oxidase reagent violet color (1% tetramethyl-paraphenylenediamine dihydrochloride ) กระดาษกรองชบนายา ( paper strip ) ทาใหแหง ตดเปนชนเลกๆ

48

วธทดสอบ ใช plastic loop หรอใช ไมจมฟน ( หามใช loop เหลก จะเกด false positive ได) เขย colony ของเชอทจะทดสอบ ปายบนกระดาษกรองชบนายา

ถา + ve จะใหสมวงเขม ( ภายใน 10 วนาท ) ถา - ve ไมเกดส P. aeruginosa B. pseudomallei Oxidase + ve B. cepacia A. baumannii Oxidase - ve 2. Nitrate test NO3 NO2 GAS Nitrate Nitrite Solution ทใชทดสอบ จะทาปฏกรยากบ Nitrite ใหสแดง Solution ทใชทดสอบไดแก Sol. A 0.5% alpha () nathylamine และ

Sol.B 0.8% sulfanilic acid ใน 5 N Acetic acid

ดงนน ถาเตม solution แลว เปลยนเปนสแดง = + ve NO3 NO2 ถาไมเปลยนส NO3 NO2 = - ve จรง หรอ NO3 NO2 GAS = + ve ตองเตม Zn dust ลงไป เพอดวาม NO3 ( Nitrate เหลออย หรอเปลยนเปน gas หมดแลว) Zn dust ถาม NO3 เหลออย NO2 ( ทาปฏกรยากบ slution ทเตมไปแลว ใหสแดง ) reduce Zn dust ถาไมม NO3 เหลออย NO2 ไมมส ( ถกเปลยนเปน gas หมดแลว ) reduce ดงนน ถาเตม Zn dust แลว ใหสแดง = - ve ไมใหส = + ve

49

P. aeruginosa Nitrate + ve B. pseudomallei + ve B. cepacia + / - A. baumannii - ve 3. Urea ( white , yellow agar slant ) urease Urea Ammonia ( alkaline ) ไมมส pink 4. Citrate ( green agar slant ) Growth on Citrate blue No growth ( green ) blue 5. OF media ( Oxidative – Fermentative test ) ทดสอบการยอยสลายนาตาลของแบคทเรย โดยผานขบวนการใช oxygen ( oxidation ) หรอ ไมใช oxygen ( Fermentation ) media ทใชทดสอบคอ OF media

OF media ประกอบดวย

Peptone นาตาล 1 ชนด ( เชน glucose ) bromthymol blue ( Indicator )

วธทดสอบ Stab bacteria ลงใน OF media 2 tubes เท paraffin ลงปดทบ OF media 1 tubes เพอใหเปนภาวะไร oxygen สวน tube ทไมใส paraffin จะสมผสกบอากาศ เปนภาวะทม oxygen incubate tubes ทง 2 ท 37 c 18 – 24 ชม.

50

อานผล Fermentation ( F ) : เกดสเหลองทง 2 tubes เรยกเชอนวา Fermenter Oxidation ( O ) : เกดสเหลองเฉพาะ tubes ทสมผสกบอากาศ ( ไมใส paraffin ) เรยกเชอนวา Oxidizer หรอ Nonfermenter Non oxidizer : สเดม ( เขยว ) หรอ สนาเงนทง 2 tubes เนองจากเชอไมใชนาตาล ( Nonsaccharolytic ) ตวอยางเชอ Fermenter = Enterobacteriaceae Nonfermenter ( Oxidizer ) = Pseudomonas Burkhoderia Acinetobacter Nonoxidizer = Moraxella เขยว เหลอง เหลอง เขยว เหลอง เขยว OF media Fermenter Oxidizer Nonoxidizer (Nonsaccharolytic) การยอม Flagella Flagella มลกษณะเปนเสนยาว 3 – 10 ไมโครเมตร ใชในการเคลอนทของแบคทเรย การยอมดลกษณะของ flagella จะชวยในการแยกชนดของเชอกลม Nonfermenters การตรวจหา Flagella : สามารถทาไดดวยการ stab เชอลงใน semisolid agar ( 0.3% agar ) เพอดการแผขยายของเชอจากรอย stab การยอมส Flagella : จะชวยใหเหนและบอกลกษณะชนดของ Flagella ได การยอมสจะใช Tanic เปน mordant solution ชวย fix flagella และยอมทบดวย Crystal violet

51

การเตรยมเชอเพอยอม Flagella : เพาะเชอลงใน motility media ( SIM ) ดวยวธ stab เลยง 37 c 18-24 hr วธการยอม Flagella 1. หยด sterile NSS ( normal saline ) หรอ นากลน บน slide

2. เขยเชอจาก motility media โดยใช needle แตะรอบๆผวอาหารเลยงเชอ 3. แตะเชอทเขยลงบนหยด NSS หรอนากลน เบาๆ 4. ใช cover slip ปด หยดสยอมทมมของ cover slip ตงทงไว 5 นาท ( ใหสซมเขาไปตด flagella

และใหสไมไหลไปมา ) 5. ดดวยกลองจลทรรศน หว oil ( 100X ) ดรปราง จานวน flagella ทพบ

การอานผล Monotrichous flagella พบ flagella 1 เสน Peritrichous flagella พบ flagella รอบๆ ตว Polytrichous flagella พบ flagella มากกวา 1 เสน No flagella ไมพบ flagella P. aeroginosa B. pseudomallei

B. cepacia Acinetobacter buamannii

52

FAMILY VIBRIONACEAE AND GENUS CAMPYLOBACTER

Vibrio, Aeromonas, Plesiomonas

Basic identification media 1. TSI (Triple sugar Iron agar)

สวนประกอบสาคญ Glucose acid K/A, Red slant/yellow butt Lactose G+L, G+S Sucrose G+L+S acid A/A,Yellow slant/yellow butt Ferrous sulfate +H2S Black iron sulfate (Iron salt) Phenol red indicator Acid (A) = Yellow Alkaline (K) = Red

2. Urea (White agar slant) urea urease Ammonia (Alkaline) ไมมส สชมพ

3. Citrate (Green; agar slant)

Growth on citrate Blue No growth (Green)

4. MIL (LIM) (Violet ; semisolid)

Test for : Motility Indole Indole + = Red LDA+ = Red Lysine decarboxylase (LDC) LDA- = Violet Lysine deaminase (LDA) LDC + = Violet LDC - = Yellow

53

Additional media 1. TCBS : Selective media for Vibrios Growth (Green media)

Inhibit growth of Enterobacteriaceae Aeromonas No growth Plesiomonas

Colonial appearance of Vibrios on TCBS

Yellow Green

V. cholerae V. parahaemolyticus V. fluvialis V. mimicus V. alginolyticus V. hollisae V. vulnificus

2. Salt Tolerance test : Growth in NaCl (%)

0% V. cholerae, V. mimicus 8% V. parahaemolyticus, V. alginolyticus

3. AD, LD, OD (Decarboxylase test) : Amino acid, Glucose, Indicater : Bromcresol purple Ornithine Amino acid Lysine Decarboxylase +Ferment Arginine Amine (Alkaline) Glucose acid ภาวะไรออกซเจน (purple) (Yellow) (Parrafin oil) (Purple)

Amino acid Decarboxylase

Vibrios Aeromonas Plesiomonas

OD v - + LD v v + AD v + +

v = vary - = negative ( yellow)+ = positive (violet)

54

Additional test Oxidase test oxidase

Oxidase reagent violet color (1% tetra-methyl-para-phenylenediamine dihydrochloride)

กระดาษกรองชบนายา (paper strip) ทาใหแหง ตดเปนชนเลกๆ เกบไดนาน วธทดสอบ ใช plastic loop หรอไม (หามใช loop เหลก จะเกด false positive ได) เขย colony ของเชอทจะทดสอบ ปายบนกระดาษกรองชบนายา

Positive = ใหสมวงเขม Negative = ไมเกดส

Vibrios Aeromonas Oxidase = positive (+) Plesiomonas Enterobacteriaceae Oxidase = negative (-)

Key ทชวยในการแยกชนด Vibrios, Aeromonas, Plesiomonas

Test Vibrio Aeromonas Plesiomonas

TCBS + (Growth)

Green/Yellow - (No growth) - (No growth)

TSI A/A K/A K/A OD v - (yellow) + (violet) LD v v + (violet) AD v + (violet) + (violet)

Oxidase + + +

Vibrio cholerae

V. cholerae ขนไดดบนอาหารเลยงเชอทใชในงาน routine laboratory growth is enhanced by additional of 1% NaCl (ขนไดดเมอเตม 1% NaCl ลงในอาหาร) V. cholerae tolerate 3% NaCl (ขนไดใน broth ทม 3% NaCl ) Oxidase positive

55

Indole positive Lysine posotive Ornithine positive 1. Gram stain

Gram stain from alkaline peptone water culture Gram negative bacilli : comma -shaped

2. TCBS (Thiosulfate Citrate Bile salts Sucrose medium) ให Coloniesสเหลองเนองจากใชนาตาล sucrose เชอชนดอนๆสวนใหญไมขนบน TCBS หรอขนไดแตให colonies เลกฝอย

3. Alkaline peptone water ใชเปน Transport media และ enrichment broth สาหรบ feces หรอ rectal swab เมอสงสย

V.cholerae 4. Agglutination test ตรวจด serogroup ของ V. cholerae วาเปน O1 หรอไม ดวยวธ agglutination วธทา 1. หยด O1 antisera 1 หยดลงบน slide Negative Positive2. เขยเชอ V. cholerae ลง ผสมใหเขากน 3. ตรวจด การเกดตะกอน ถาเปน O1จะใหตะกอน ภายใน 30-60 วนาท

5. V. cholerae biotype V. cholerae O1 แบงเปน 2 biotypes 1. Classical 2. El Tor ปจจบนพบวา Cholerae เกดจาก El Tor biotypes เปนสวนใหญ ใช 50 IU Polymixin แยก Classical= Susceptible (S) El Tor= Resistant (R) V(oges)P(roskuer) test Classical= VP negative (-) El Tor= VP positive (+)

56

Vibrio parahaemolyticus

1. TCBS green colonies (non sucrose fermenting colonies) V. parahaemolyticus is a cause of food poisioning associated with shellfish and other seafood.

2. Salt tolerance test : NaCl 0%, 8%, 10% ตองใช NaCl ชวยในการเพาะเลยง can tolerate 8% NaCl (สามารถขนไดใน broth ทม 8% NaCl) oxidase positive Indole positive Lysine positive Ornithine positive Aeromonas hydrophila บน Blood agar ให Beta-hemolysis colonies oxidase positive Plesiomonas shigelloides

OD positive LD positive

AD positive Oxidase positive

Campylobacter : cause diarrhea, enterocolitis 1. Gram stain : Gram negative rod กลองจลทรรศน : curved, comma- shaped, s- shaped and gull-winged : รปรางเกดจาก two cells remaining attached after division 2. Identification Campylobacter jejuni ขนไดดท 420c (จะไมขนท 250c) microaerophilic (5-10% CO2) CAMPY blood agar = selective media (เตมยา Vancomycin, Polymixin) ใช isolate Campylobacter spp. from mixed flora.

57

oxidase positive Nitrate positive Urease negative Nalidixic acid = susceptible (S) Cephalothin= resistant (R) Helicobacter pylori : cause peptic ulcer, gastritis Urease positive gastric biopsy specimen urease positive

ตอนท 1 การแยกความแตกตางระหวาง Nonfermentative gram negative bacilli จาก Enterobacteriaceae และ Vibrionaceae วสดอปกรณ 1. Blood agar 1 plate2. O-F glucose broth 3. Oxidase reagent4. Mineral oil + dropper 5. TSI slant เชอแบคทเรย

Pseudomonas aeruginosa บนอาหารวนเอยง อาย 24 ชวโมง Escherichia coliบนอาหารวนเอยง อาย 24 ชวโมง V. choleraeบนอาหารวนเอยง อาย 24 ชวโมง

วธทดลอง

1. สงเกตลกษณะการสรางสารสโดยการเพาะเชอ Ps. Aeruginosa V. cholerae และ E. Coli ในหลอดอาหาร

2. ทดสอบความสามารถในการผลต oxidase โดยใชกระดาษกรองทฆาเชอแลวชบ oxidase reagent ใหชม วางบนสไลด จากนนใชหวงเขยเชอเขยเชอทงสามชนด นามาปายบรเวณกระดาษกรอง ถาเชอสามารถสรางเอนไซม oxidase ได จะเปลยนเปนสมวงภายใน 10 วนาท

3. เพอเชอ E. coli และ Ps. Aeruginosa ใน O-F medium 2 หลอดโดยการ “stab” หวงเขยเชอลงไปทบรเวณกนหลอด และเตม mineral oil ลงไปทผวหนาอาหารของหลอดหนง

58

4. ทดสอบความสามารถในการใชนาตาลของ E. coli และ Ps. aeruginosa โดยการเพาะเชอลงไปทกนหลอดและผวอาหารของ TSI slant

5. ทดสอบการสลายเมดเลอดแดงโดยการ streak เชอ E. coli และ Ps. aeruginosa บน Blood agar 6. นาจานอาหารและหลอดทดลองในขอ 3-5 ไปบมท 37C, 24-48 ชวโมง สงเกตผลทเกดขน บนทกผล

การทดลอง ตอนท 2 คณสมบตบางประการของเชอในกลม Vibrio spp. วสดอปกรณ

Loop TCBS plate

เชอแบคทเรย V. parahaemolyticus V. cholerae

วธทดลอง ศกษาดลกษณะรปรางลกษณะและโคโลนของเชอ โดยการ streak ลงบนอาหาร TCBS

ตอนท 3 การทดสอบแบคทเรยในกลม Haemophilus spp. การสาธต

ศกษาความตองการใช X และ V factor ของเชอ H. influenzae และ H. parainfluenzae โดยวธ Disc method และ Satellite test จากแผนภาพทตงแสดงไว

©©©©©©©©

59

บทปฏบตการท 12 Identification of unknown bacteria

บทน า

การพสจนเชอ unknown เปนสงสาคญในการศกษาจลชววทยาโดยการศกษาครงนนกศกษาจะไดนาความรเกยวกบการยอมส (strining methods) การแยกเชอ (isolation techniques) อาหารเลยงเชอ (culture media) วธการทางชวเคม (biochemical test) และรปรางลกษณะและคณสมบตของเชอแบคทเรยแตละตวนามาใชในการศกษาเพอวนจฉยแยกเชอแบคทเรย ตอนท 1 Gram positive bacteria unknown เชอแบคทเรย

นกศกษาแตละกลมจะได Gram positive bacteria unknown บน blood agar ซงอาจเปนเชอใดกไดตอไปน 1. Stahyhlococcus aureus 2. Staphyhlococcus epidermidis 3. Streptococcus group A 4. Streptococcus group B 5. Pneumococci 6. Enterococci 7. Streptococcus group D (non Enterococci)

อาหารเลยงเชอ

1. Blood agar plate 2. Plasma 3. Bile esculin medium 4. PR mannitol

สารเคม

1. Bacitracin disc 2. Optochin disc 3. 3% hydrogen peroxide

60

วธทดลอง 1. บนทกเลขทของ unknown ในใบรายงานผล 2. รายงานลกษณะโคโลนของ unknown บนอาหาร blood agar ทงขนาดรปแบบของโคโลน ส การเกด

hemolysis 3. นาเชอทไดไปยอมสแกรมและตรวจดดวยกลองจลทรรศนกาลงขยาย 1000 เทา 4. นาเชอทไดมาทดสอบ catalase test แลวนาไปเพาะเลยงบนอาหารตามลกษณะโคโลนและการเกด

ทดสอบ catalase test ดงน Catalase ลกษณะโคโลนบน blood agar Gram’s stain อาหารทใช

ผลบวก ทบแสง, สขาว

Gram positive Cocci in cluster

PR mannitol plasma

ผลลบ

ใส, ให - hemolysis Gram positive

Diplococci Blood agar plate

Optochin disc

ใส, ให - hemolysis Gram positive Cocci in chain

Blood agar plate Bacitracin disc

ใส, ให - hemolysis Gram positive Cocci in chain

Bile esculin 7.5% Nacl

การเพาะเลยงเชอใน Biochemical media

1. PR mennitol ใช sterile needle เขยเชอมา stab ลงอาหารจนถงกอนหลอด ถาเชอสามารถใชนาตาล mannitol อาหารจะเปลยนจากสสมเปนสเหลองทงหลอดภายใน 18-24 ชวโมง

2. Tube coagulase ใช sterile loop เขยเชอมา 2-3 โคโลนมา suspend ในพลาสมาแลวนาไปเพาะเลยงท 35-37C ถาเชอสามารถสรางเอนไซม coagulase ได จะเกดการแขงตวจบเปนกอนของพลาสมาภายในเวลา 4-24 ชวโมง

3. Optochin susceptibility test ใช sterile loop เขยเชอมา streak ถ ๆ บนอาหาร blood agar แลวนา optochin disc มาวางตรงกลาง หลงจากเพาะเลยงไว 18-24 ชวโมง ถาเกด inhibition zone แสดงวาใหผลบวก

4. Bacitracin susceptibility test ใช sterile loop เขยเชอมา streak ถ ๆ บนอาหาร blood agar แลวนา Bacitracin disc มาวางตรงกลาง หลงจากเพาะเลยงไว 18-24 ชวโมง ถาเกด inhibition zone แสดงวาใหผลบวก

5. Bile esculin medium ใช sterile loop เขยเชอมา streak บนผวหนา slant ถาเชอสามารถทนตอ Bile salt ไดกจะมการเจรญและสามารถยอยสลาย esculin เกดสารประกอบเชงซอนสนาตาลดา

หลงจากทบมเชอเปนเวลา 18-24 ชวโมง ใหอานและแปลผลตามไดอะแกรม 1, 2 รายงานผลและเขยน schematic แสดงการวนจฉยเชอ unknown ทได

61

ตอนท 2 Gram negative bacteria unknown เชอแบคทเรย นกศกษาแตละคนจะได Gram negative bacteria unknown บน MacConkey ซงอาจเปนเชอใดกไดตอไปน

1. E. coli 2. Shigella sp. 3. Samonella sp. 4. Klebsiella pneumoniae 5. Pseudomonas auruginosa 6. Proteus sp. 7. Enterobacter sp. 8. V. cholerae

อาหารเลยงเชอ 1. Urea medium 2. SIM medium 3. Citrate medium 4. TSI medium

สารเคม

1. Kovacs’ reagent 2. Oxidase reagent

วธทาการทดลอง

1. บนทกเลขทของ unknown ในใบรายงานผล 2. รายงานลกษณะโคโลนของ unknown บนอาหาร MacConkey agar ทงขนาดรปแบบของโคโลน 3. นาเชอทไดไปยอมสแกรมและตรวจดดวยกลองจลทรรศนกาลงขยาย 1000 เทา 4. ทดสอบ oxidase test แลวทาการเพาะเลยงใน Biochemical media ตอไปน

4.1 Urea medium ให streak บนผวหนาอาหารวนเอยงนาไปเพาะเลยงเปนเวลา 18-24 ชวโมง ผลบวกจะเกดการเปลยนสของอาหารเปนสชมพ

4.2 SIM medium ใช needle stab เชอลงไป นาไปเพาะเลยงเปนเวลา 24-48 ชวโมง สงเกตการสราง H2S จากการเกดตะกอนสดา การเคลอนท (motility) จากการเจรญของเชอออกจากบรเวณท stab และการเกด indole จากการเปลยนสแดง เมอเตม Kovacs’ reagent

4.3 Citrate medium ให streak บนผวหนาอาหารวนเอยงนาไปเพาะเลยงเปนเวลา 18-24 ชวโมง ผลบวกจะเกดการเปลยนสของอาหารจากเขยว เปนฟา

4.4 TSI medium ให streak บนผวหนาอาหารวนเอยงแลวใชเขมเขยเชอ stab เชอลงไป นาไปเพาะเลยงเปนเวลา 24-48 ชวโมง อาหารวนเอยง

หลงจากบมเชอ 24-48 ชวโมง อาหารวนเอยง ใหอานและแปลผลตามตาราง 12.1 และไดอะแกรม 1, 3 และตารางท 12.1 รายงานผลและเขยน schematic แสดงการวนจฉยเชอ unknown ทได

62

Schematic 1

Gram stain

Gram positive Gram negative

cocci Rods Fermentative, rods - Enterobacter - Escherichia

non fermentative, rods

- Pseudomonas catalase – -Streptococcus

catalase + -Staphylococcus

Anaerobic - Clostridium

Aerobic - Bacillus

63

chematic 2

Gram positive

Catalase positive catalase negative

Coagulase+,mannitol+ - S. aureus

Coagulase-, mannitol- - S. epidermidis

- hemolysis -hemolysis -hemolysis

Optochin Bacitracin 7.5% NaCl

+ S pneumoniae

- S treptococci

+

Streptococcus (gr. A)

- Streptococci (not gr. A)

+

-Enterococci

- non enterococci

64

Schematic 3

Gram negative bacilli

oxidase + oxidase -

A/A K/A+ K/A-

E.coli Klebsiella

Enterobacter Citrobacter

TSI TSI

A/A- K/N-

pyocyanin+

V. cholerae Ps. aeruginosa

Salmonella Proteus

Salmonella typhi Shingella Proteus

Select key test: Indole production, Citrate test, Urease test, Motility, Lactose fermentation

65

ตาราง 12.1 คณสมบตทางชวเคมของแบคทเรยกรมลบในแฟมล Enterobacteriaceae บางชนด

เชอ/การทดสอบ Oxidase Indole Urea Citrate Motility การเกด

H2S TSI reaction

E. coli - + - - + - A/AG- Shigella spp. - - - - - K/A- Salmonella

most serotype - - - + + + K/A+

Salmonella typhi - - - - + + K/A+

Proteus spp. - +

rapid + K/A+

Enterobacter spp. - - - or late

+ + - A/AG-

K. pneumonia - - + + - - A/AG-

©©©©©©©©

66

บทปฏบตการท 13 Anaerobes and Spirochetes

บทน า

Anearobes เชอทกอใหเกดโรคในคนสวนมากจะเจรญไดดในทมออกซเจน แตมเชอบางชนดทไมตองการออกซเจน

ในการเจรญเตบโต เชอพวกนไมสามารถเจรญหรอเจรญไดไมดในทมออกซเจน เรยกเชอกลมนวา แอนแอโรบส (anaerobes) ดงนนตวอยางทตองการตรวจหาเชอในกลมนจะตองทาในภาวะไรออกซเจนและควรทาการตรวจทนทเนองจากเชอจะตายไดเมออยในทมออกซเจน

การเพาะเลยงเชอสามารถทาไดหลายวธดงน เชน เพาะในตทอากาศภายในตถกไลออกและแทนทดวยกาซเฉอย (Anerobic incubator) เพาะใน anaerobic jar ซงทฝาจะมทางสาหรบดดอากาศออกและมทางสาหรบใสกาซเขาไป หรอเปนแบบทไมตองดดอากาศออก ภายในมซองบรรจสารเคมทกอใหเกดกาซไฮโดรเจนและคารบอนไดออกไซด กาซไฮโดรเจนจะทาปฏกรยากบออกซเจน เพาะเลยงในจานเลยงเชอชนดพเศษ (Brewer’s anaerobic petri dish) เพลทชนดนมขอบของฝาจะแนบพอดอยบนพนหนาของอาหาร ทาใหพนผวของอาหารบรเวณสวนกลางของจานถกปดสนท จะมอากาศหลงเหลออยเปนชนบาง ๆ หนาประมาณ 1 มม. ออกซเจนในอากาศสวนนจะถกดดซบโดย sodium thioglycollate ในอาหาร นอกจากนยงอาจทาการเพาะเลยงดวยเทคนคการเลยงเชอ (culture technique) เชน – Agar deep culture ใชอาหารแขงบรรจในหลอดแกวสง 8-10 ซม. หลอมแลวทาใหเยนลงสอณหภม 45 ซ. เพาะเชอแลวทาใหอาหารเยนทนทโดยใชนาเยนไหลผาน นาเขาตเพาะเชอ เชอแอนแอโรบสจะเจรญทกนหลอด

- Cooked meat medium เปนอาหารเหลวทใสเนอบดจากหวใจววหรอจากสวนอน ๆ ทไมมไขมนไวทกนหลอดแกวใหสงประมาณ 2 นว สวนอาหารเหลวควรใสใหทวมเนอบดประมาณ 1 นว เนอเยอจะทาหนาทเปน reducing agent และเปนอาหารของแบคทเรยดวย เมอเพาะเชอแลวนาเขาบมใน anaerobic jar หรอใช petrolatum ทผานการฆาเชอแลวปดทบสวนบนของอาหารใหมความหนาประมาณ ¼ นว แลวนาเขาบมในตเพาะเชอ เชอ Anaerobes ทพบบอยและควรรจก

1. Bacteroides 2. Clostridium 3. Propionibacterium

Gram stain : Bacteroides gram negative rod , coccobacilli , bacilli , อาจพบ pleomorphic ( หลายรปราง แทงสน และ แทงยาว ) Clostridium gram positive rod ขนาดใหญ ม spore คลาย Bacillus ยกเวน C. perfringens จะไมพบ spore spore ของเชอ อาจอยใน cell เรยก endospore

67

อยนอก cell เรยก exospore spore จะตดส Gram เฉพาะตรงขอบรอบนอก เหนเปนชมพ จางๆ ตรงกลางไมตดส Propionibacterium gram positive rod รปรางคลายพวก Diphtheroides Growth appearance ทส าคญ บน Blood agar : Clostridium perfringens ให hemolysis และอาจพบลกษณะ double zone of hemolysis ซงเปนลกษณะเฉพาะของเชอน ใน Thioglycollate broth : Clostridium จะใหเกดฟอง Media ทจ าเปน ส าหรบ Anaerobes 1. Thioglycollate broth ใชเลยง Anaerobes แตเชอ aerobes และ microaerophilic สามารถขนไดเชนกน ใน media จะม Resazurin เปน indicator ทบอกภาวะวาม oxygen ลงไปใน media มากนอยหรอไม โดยดจากสของ Resazurin ( สชมพ ) Resazurin + oxygen ชมพ

ถาสชมพ อยระดบบนทผวของ broth แสดงวาขางลางตอจากสชมพ เปน anaerobic condition ใช culture Anaerobe ได

ถาสชมพอยลงมาลกมาก แสดงวาอากาศเขามาอยใน broth เปนจานวนมาก ไมเหมาะในการเพาะ Anaerobes ตองขจดอากาศทละลายอยใน broth โดยการนาไปตมไลอากาศออก รอใหเยน จะเหนสชมพกลบขนไปอยทผว broth จงนามาเพอใชเพาะเลยง Anaerobes ตอไปได

68

2. Cooked meat media หรอ chopped meat media เปน broth ทม ชนเนออยเปนเมด เหมาะในการเพาะเลยง Anaerobes เชอทง anaerobes และ aerobes สามารถขนไดใน cooked meat และสามารถเกบรกษาเชอไวไดนาน Anaerobic condition

Gas Pak System : ประกอบดวย 1. Anaerobic jar 2. ซองบรรจสารเคมททาใหเกดภาวะไร oxygen ม 2 ชนด ชนดเตมนา และตองใช catalyst ชนดไมตองเตมนา และ ไมตองใช catalyst

3. Indicator เพอ check ภาวะภายใน jar วา เปน aerobe หรอไม ซองบรรจสารเคม ( Disposable H2 + CO2 generator envelope ) สารเคม H2 + CO2 2H2 + O2 2H2O (เกดภาวะไร oxygen) Indicator : เปนแผนกระดาษจมส Methylene blue (MB) ในภาวะทม oxygen จะใหสนาเงน (blue) ถาไมม oxygen จะเปลยนเปนสขาว Indicator (MB) + O2 blue O2 MB white (ภาวะ anaerobe) Anaerobic jar ซองสารเคม catalyst indicator

Anaerobes

69

1. ปฏบต : ยอม Gram และ รายงานผล 2. ดสาธตตงแสดง

ตวอยางเชอ Anaerobes ยอม Gram

culture plates ของ Anaerobes

Thioglycollate broth

Cooked meat broth

Gas Pak System

Spirochetes เชอ spirochete บางชนด เชน Treponema และ Borrelia เปน normal flora ในปากคนและบางชนดอาจเหน

ดวยการยอม simple stain เชอพวกนไมเปนเชอกอโรครนแรง แตทาใหเกดฟนผและเกด periodontal disease (การอกเสบและถกทาลายของเนอเยอรอบฟน) วตถประสงค

เพอใหนกศกษาสามารถอธบายรปรางลกษณะและวธการเพาะเลยงเชอ Anaerobes ได เพอศกษารปรางลกษณะของเชอในกลม spirochete

ตอนท 1 การเพาะเลยงเชอ Anaerobe วสดอปกรณ

1. อาหารเลยงเชอ Thioglycolate broth (ทตมไลออกซเจนแลว) 2. Sterile pasteur pipette 3. Blood agar plate 4. ชดยอมส Gram

เชอแบคทเรย Clostridium spp. ใน Cook meat medium Escherichia coli ใน Nutrient broth Pseudomonas aeruginosa ใน Nutrient broth

70

วธทดลอง 1. ใช Sterile pasteur pipette ดดเชอ Clostridium spp. จาก broth culture นามาหยดบนสไลดทสะอาด 1

หยด โดยอยาใหปลายปเปตแตะกบสไลดแลวนาไปหยดทกนหลอดของ Thioglycolate broth 4-5 หยด นาไปบมท 37C เปนเวลา 18-24 ชม.

2. นาสไลดมา smear ทงใหแหง fix โดยผานเปลวไฟแลวนาไปยอมสกรม ศกษาดรปรางลกษณะของเชอ Clostridium spp.

3. เปรยบเทยบการเจรญของเชอ 3 กลมคอ E. coli, Clostridium spp. และ Ps. aeruginosa โดยการ Streak เชอทง 3 บน blood agar ดงรปและนาไปบมท 37C เปนเวลา 18-24 ชม. ใน anaerobic jar สงเกตการเจรญ

ตอนท 2 การตรวจหา Oral spirochetes วสดอปกรณ

1. ไมจมฟนปราศจากเชอ 2. สไลด 3. สยอม crystal violet หรอ methylene blue

วธทดลอง

1. ใชไมจมฟนเขยตรงซอกฟนแลวนามา smear ในหยดนาบน slide ทงใหแหง 2. heat fix แลวนาไปยอมดวย สยอม crytal violet หรอ methylene blue เปนเวลา 2-3 นาท 3. นาไปสองดดวยกลองจลทรรศนแลวบนทกผล

การสาธต

ศกษาลกษณะของ spirochete จากแผนสไลดถาวรทตงแสดงไว

©©©©©©©©

71

บทปฏบตการท 14 Acid fast bacteria

บทน า

แบคทเรยในกลมมยโคแบคทเรยมโครงสรางผนงเซลลพเศษทมไขมนในปรมาณสง และมกรด mycollic เปนสวนประกอบ กรด mycolic นทาใหแบคทเรยนมคณสมบต acid-fastness แมวาจะ mycobacteria จะจดเปนแบคทเรยแกรมบวกแตการยอมสโดยวธแกรมใหผลไมด เนองจากสไมสามารถเขาผนงเซลล แตจะยอมไดโดยใชวธของ Ziehl-Neelsen (ใชความรอนชวยใหสตดด) หรอ Kinyoun (ไมใชความรอน) เชอทตดสแลวไมสามารถลางออกไดงายดวย acid alcohol ทาใหสามารถจาแนกแบคทเรยกลมนเปนพวกทนกรด (Acid-fast bacteria) วตถประสงค

1. นกศกษาเขาใจหลกการยอมสทนกรด 2. นกศกษาสามารถยอมสทนกรดได โดยสามารถใชการยอมสทนกรดในการแยกประเภทของ

แบคทเรยเปน acid-fast และ non acid-fast วสดอปกรณ

1. Ziehl-Neelsen carbolfuchsin stain 2. Kinyoun’s carbolfunchsin stain 3. Acid-alcohol solution 4. Loeffler’s Alkaline methylene bule stain 5. สไลดถาวรแสดงการยอมส acid-fast ของเชอ M. tuberculosis

เชอแบคทเรย 1. เชอ S. aureus ในอาหารเหลว 2. เชอในกลม Mycobacterium สายพนธทไมกอโรค (non-pathogenic) ในอาหารเหลว

วธทดลอง กลมท 1 ใชวธ Ziehl-Neelsen method

1. เตรยมสไลดสะอาดจานวน 3 แผน 2. เตรยม smear ของเชอจานวน 3 แผน คอ แผนแรกเปนสเมยรของเชอ S. aureus แผนทสองเปนสเมยร

ของเชอ Mycobacteria sp. และแผนทสามเปนสเมยรของเชอผสม S. aureus และ Mycobacterium sp. ใน smear เดยว

3. ทงใหรอย smear แหงดวยอากาศ แลวตรง smear ดวยความรอน 4. หยดส Ziehl-Neelsen carbolfuchsin ใหทวมรอย smear 5. ทาใหรอนจนเกดไอแตไมเดอด โดยนาไปองไฟจากตะเกยงหรอจากไอนารอนจากบกเกอรตงไฟ เปน

เวลา 5 นาท ถาสแหงใหหยดสเพม

72

6. รนสออก ชะเบา ๆ ดวยนาประปา 7. ลางสออกดวย acid-alcohol โดยหยด acid-alcohol decolorizer ใหทวมรอยสเมยร นาน 2 นาท 8. ลางดวยนาประปา (5 วนาท) 9. ยอมทบดวยส methylene blue ทงไว 1-2 นาท รนสทเหลอออก ลางดวยนาประปา (30 วนาท) 10. ซบนาใหแหง หลงจาก smear แหงแลวนาไปดดวยกลองจลทรรศนโดยใชเลนสนามน 11. บนทกรปรางและสของแบคทเรยใหใกลเคยงกบทเหนจากกลอง 12. วางสไลด 3 แผนทยอมและตรวจดแลวใหอาจารยประจาโตะตรวจ 13. ศกษาเชอ M. tuberculosis จากสไลดทเตรยมไว

กลมท 2 ใช Kinyoun method

1. เตรยมสไลดสะอาดจานวน 3 แผน 2. เตรยม smear ของเชอจานวน 3 แผน คอ แผนแรกเปนสเมยรของเชอ S. aureus แผนทสองเปน สเมยร

ของเชอ Mycobacteria sp. และแผนทสามเปนสเมยรของเชอผสม S. aureus และ Mycobacterium sp. ใน smear เดยวกน

3. ทงใหรอย smear แหงในอากาศ แลว fix smear ดวยความรอน 4. หยด Kinyoun’s carbolfuchsin stain ใหทวมรอย smear ทงไว 2 นาท 5. ลางสออกดวย acid-alcohol 3 นาท อาจทาโดยหยด acid-alcohol ทละหยดจนเหนวาแผนสไลดมสตด

เลกนอย อาจใชเวลาประมาณ 10-30 วนาท ขนตอนตองระวงการลางสออกมากเกนไป 6. ลางดวยนาประปา (5 วนาท) 7. ยอมทบดวยส methylene blue ทงไว 1-2 นาท รนสทเหลอออก ลางดวยนาประปา (30 วนาท) 8. ซบนาใหแหง หลงจาก smear แหงแลว นาไปดดวยกลองจลทรรศนโดยใชเลนสนามน (x100) โดยไม

จาเปนตองปดดวย coverslip 9. บนทกรปรางและสของแบคทเรยใหใกลเคยงกบทเหนจากกลอง 10. วางสไลด 3 แผนทยอมและตรวจดแลวใหอาจารยประจาโตะตรวจ 11. ศกษาเชอ M. tuberculosis จากสไลดทเตรยมไว

หมายเหต

1. ขนตอน decolorization อยาทานอยเกน เพราะแบคทเรยชนดทนกรดแทจรง สจะตดแนนยากทจะชะออก

2. อยาทา smear หนาจะทาให decolorize ไดไมด 3. สยอมทบ (counterstain) มากเกนไปอาจปดบงเชอ acid-fast bacilli 4. Mycobacteria ชนดเจรญเรวอาจยอมตดสนอยหรอไมไดเลย การยอมดวย Ziehl-Neelsen method อาจ

ใหผลดกวา Kinyoun’s method สาหรบเชอ weak acid-fast

73

การสาธต ลกษณะ และการตดสของ Mycobacterium spp. ศกษารปราง ลกษณะและการตดสของ Mycobacterium spp. จากสไลดถาวร และแผนภาพทตงไว การตรวจ slide ทยอมสดวยกลองจลทรรศน

หลกสากลของการตรวจ slide ขนาด 1 x 2 cm. ตองตรวจใหได 100 - 300 field โดยตรวจดอยางนอย 3 แถวตามแนวนอนของ smear โดยเรมตนแถวแรกจากกงกลาง slide ซายมอสดของพนทยอมสเคลอนไปทางขวาจนสด แลววกขนขางบน เคลอนกลบมาทางซายสด วกกลบลงมาดานลางแลวเครองไปทางขวาจนสด จะไดระยะทาง 6 cm. 300 field การรายงานผล

แบบรายงานผล

ปรมาณ AFB รายงาน

0 No acid fast bacilli found 1 - 2/300 field Rare 1 - 9/300 field 1+ 1 - 9/10 field 2+

1 - 9/ field 3+ >9/ field 4+

1.การตรวจหาเชอโดยการเพาะเลยงเชอ (culture) โดยวธการเพาะเลยง

การเพาะเลยงวณโรคจาเปนอยางยงทจะตองกาจดเชอแบคทเรยอน ๆ ทปนเปอนมากบสงสงตรวจกอน เรยกวาการ Decontamination มกจะใชกบสงสงตรวจทเปนเสมหะและหนอง แตถาเปนสงสงตรวจทมาจาก sterile site เชน CSF กสามารถเพาะลงบนอาหารเลยงเชอไดโดยตรง อาหารเลยงเชอทนยมใชกนมากคอ Lowenstein - Jensen medium (L-J) ซงมไขเปสวนประกอบทสาคญ incubate ท 35oซ. นาน 8 สปดาห และนามาอานออกผลทกสปดาห จนกระทงเปน colony ลกษณะแหง ขรขระ ขนาด 2 - 3 mm. คลายดอกกะหลา (cauliflower) เรยกลกษณะแบบนวา Eugonic type แตถา colony มลกษณะกลม แบน เรยบ ขนาด 1 - 2 mm. จะเรยกวา Dysgonic type ซงจะเปนลกษณะเชออนๆ ทไมใช M. tuberculosis

จดเรมตน

74

การวนจฉยเชอในกลม Aerobic actinomycetes อาหารเพาะเลยงเชอทเปน primary isolation ของเชอในกลม Aerobic actinomycetes ไดแก Sabouraud dextrose agar (SDA) และ blood โดย incubate ท 25 และ 37oซ.เปนเวลานาน 2 - 4 สปดาห ตรวจดการเจรญ นาโคโลนทเพาะขนได มาทาการทดสอบคณสมบตการตดส acid fast c และ คณสมบตทางสรรวทยา ลกษณะโคโลน Nocardia บน Sabouraud dextrose agar คลายขผง ผวหนาเรยบมรอยยน เปนรอง สของโคโลนทวไปเปนสสม นอกจากนมสเหลอง ชมพ นาตาล บางครงมลกษณะคลายผงชอลกปกคลมทผวหนา การยอม Modified acid fast หลกการ

การยอม Modified acid fast เปนการยอมเชอกลม Aerobic actinomycetes ไดแก Nocardia, Actinomadura และ Streptomyces เนองจากเชอ Nocardia เมอยอมดวยวธ acid fast สจะถกลางออกดวย acid alcohol ทาใหตดสไมชดเจน จงตอง modified โดยเปลยนจาก acid alcohol เปน 1% Sulfuric acid เปนตวลางซงไมทาใหสหลด เชอจะตดสแดงของ carbol fuchsin แตไมเขมเทากบ Mycobacterium และการตดสอาจจะไมทวครบทกเซลล ซงเรยกการตดสแบบนวา partially acid fast วธการยอมส Modified acid fast

1. หยด carbol fuchsin จนทวม smear ทงไว 3 - 5 นาท ลางนา 2. 1%Sulfuric acid จนรอย smear เปนสชมพออน 3. หยอด methylene blue ทงไว 1 นาท ลางนา 4. รอจน slide แหง ดดวยกลองจลทรรศ โดยใช oil immersion objective 100x จะเหนลกษณะของ

เชอทเปนกงกานเปนสายตดสแดงบนพนสนาเงน ตารางการแยกเชอ Aerobic actinomycetes

Organisms Modified Acid fast

Decomposition

Caseine Tyrosine Xanthine

Streptomyces - + + + S. somaliensis - + + - Actinomadura madurae or A. pelleteri - + +/- - Rhodococcus spp. + - +/- - N. asteroides + - - - N. brasiliensis + + + - N. otitidiscaviarum + - - +

75

บทปฏบตการท 15 การศกษารปรางลกษณะของเชอรา

บทน า

เชอราเปนจลนทรยอกชนดหนงทสามารถพบไดทวไปในสงแวดลอมตาง ๆ รวมทงมนษย สตวและพช ซงมบทบาททงทาใหเกดประโยชนและโทษตาง ๆ โดยเฉพาะอยางยงบทบาททเกยวของกบทางการแพทยแลว สวนใหญจะเกยวของกบการดารงชวตของมนษย ตวอยางเชน เชอรา Pemicillium sp. ทใชในการผลตยาปฏชวนะเพนนซลน (penicillin) ทเปนประโยชนตอการรกษาโรค หรอเชอ Candida albicans ซงเปนยสตททาใหเกดโรค Candidosis ทสามารถเปนไดทกสวนของรางกาย นอกจานยงมเชอราในกลมของ Dermatophytes ทกอโรคผวหนงตาง ๆ เชน กลาก เกลอน เปนตน

ดงนนการแยกและการจดจาแนกชนดเชอราทางการแพทย จงมความสาคญตอการวนจฉยและการรกษาโรคอยางมาก ซงในการแยกและการจดจาแนกชนดเชอราจะตองใชอาหารเลยงเชอชนดพเศษ ใชเวลาเพาะเลยงนาน เนองจากเชอราเจรญเตบโตชา การศกษาชนดเชอราจะดความแตกตางทางดานสและผวหนาของโคโลน ลกษณะของเสนใย ชนดของสปอรและการสรางสปอร เปนหลกสาคญ นอกจานอาจใชการทดสอบทางชวเคมตาง ๆ เชน การใชนาตาล ความตองการกรดอะมโนและวตามน เปนตน เพอใชประกอบในการจดจาแนกเชอราชนดนน ๆ

วตถประสงค

1. เพอใหนกศกษาไดเรยนรวธการพนฐานตาง ๆ ทใชในการศกษาเชอรา 2. เพอใหนกศกษาไดรจก รปราง ลกษณะตาง ๆ ของเชอราบางชนด

วสดอปกรณ

1. เชอราตวอยาง ไดแก Aspergillus sp., Penicillium sp., Rhizopus sp., Fusarium sp. Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae ทเจรญบนอาหารเลยงเชอ

2. เขมเขยเชอปลายงอ (needle) และหวงถายเชอ (Loop) 3. สไลดและกระจกปดสไลด 4. สยอม Lactophenol cotton blue, 10% KOH, 0.5 ml Serum tube 5. นายาทาเลบหรอ balsum 6. อาหารเลยงเชอ Sabouraud dextose agar (SDA), Potato dextose agar (PDA), Cornmeal agar (CMA),

Rice-Tween agar 7. ชดทา Slide culture 8. ตะเกยงแอลอฮอล 9. ปากคบ (forceps)

76

วธทดลอง ตอนท 1 การศกษาเชอราและยสตตวอยางแบบ Macroscopic study

ทาการศกษาเชอราและยสตตวอยาง โดยดความแตกตางทางดานสของโคโลน ผวหนาโคโลน (ไดแก Cottony = ปยคลายปยสาล หรอปยฝาย, Floccose = ปยเหมอนขนสตว, Fluffy = ลกษณะคลายขนสตว, Glabrous = เรยบเหมอนผนง, Downy = เหมอนขนออน หรอไรขน, Powder = คลายผงแปง, Velvety = คลายพรม หรอกามะหย) และการสราง pigment (ถาสราง pigment ทละลายนาได อาหารเลยงเชอจะเปลยนสไป) และบนทกผลการทดลองเปรยบเทยบกบตารางการจาแนกเชอรา ดงแสดงในตารางท 15.1 ตารางท 15.1 การจดจ าแนกเชอราบางชนด

77

Laboratory Diagnosis of Fungal infection การตรวจเชอราทางหองปฏบตการ

การเกบตวอยางตรวจ (Collection of specimens) เชอราพบไดทวไปในสงแวดลอม สวนใหญไมทาใหเกดโรคแตถาปนเปอนมาในสงสงตรวจจะทาใหโอกาสแยกเชอกอโรคไดนอยลง เนองจากเชอปนเปอนเจรญไดเรว จงตองรวธการเกบทถกตอง กรณทเปนโรคเกดจากเชอราฉวยโอกาส (opportunistic fungi) จงเปนเชอราทพบทวไปในธรรมชาต จาเปนตองสงตวอยางซา เพอใหแนใจวาเชอนนเปนตนเหตของโรคจรง 1. โรคเชอราทผวหนง (Superficial and Cutaneous mycoses)

ขยผวหนง (skin scrap) ผม ขน เลบ เยอบ ผวหนง เกบโดยการขด skin scraping ตองเลอกบรเวณทจะขดกลากเปนวงขอบนนแดงมสะเกด ใช 70%

alcohol เชดใหสะอาด ใชใบมดสะอาดขดตรงบรเวณขอบ ใสใน slide หรอภาชนะทสะอาด เสนผม หรอ ขน เลอกผมหรอขนทเปราะหกงาย ถอนมาใสภาชนะสะอาด หรออาจใช wood’s lamp

(ความยาวคลน 366 nm) ชวยสองหาดเสนผมทเรองแสง ถอนสงมาตรวจ เลบ ตดเลบ หรอ ขดเลบ สงมาตรวจ เยอบ ใชสาลพนปลายไม (swab) ทปราศจากเชอ ปายตรงรอยโรค เชนปายจากชองคลอด กรณทสงสย

Vaginal Candidosis (Vaginal swab) เยอบในชองปาก (Oral thrush) ใช swab ปายสงมา มกใส swab มาใน Transport media เพอปองกนไมใหแหง

ตวอยางเมอเกบไดแลว ควรสงหองปฏบตการทนท ถาสงสยวาตดเชอ Dermatophytes ถาสงไมไดทนท ใหเกบตวอยางไวทอณหภมหอง หามใสตเยน เพราะพวก Dermatophytes จะตายงายถาถกความเยน 2. โรคเชอราทชนใตผวหนงและอวยวะภายใน

(Subcutaneous & Systemic mycoses) หนอง Pus เจาะจากรอยโรคใตผวหนง เกบใสภาชนะทปราศจากเชอ ปดฝา สงมาหองปฏบตการโดยเรว เสมหะ ควรเปนเสมหะในตอนเชาหลงจากบวนปากแลว เกบใสภาชนะปากกวางทสะอาดมฝาปด ควรสง

ตรวจทนท เสมหะทเกบขามคนไมเหมาะทจะนามาหาเชอราทกอโรค เนองจากม bacteria ปนเปอนอยเจรญไดรวดเรว ทาใหตรวจไมพบราทเปนสาเหตของโรค นอกจากน Candida แบงตวไดรวดเรว และเจรญไดในเสมหะ ถาทงไวนานจะเพมปรมาณมากขน ทาใหแปลผลผด

ปสสาวะ เกบ Midstream urine เกบปสสาวะชวงกลาง หรอกรณทใสสายสวนเกบเปน Cath urine ใสในภาชนะปากกวางปราศจากเชอ มฝาปด สงตรวจทนท ถาสงไมไดตองใสตเยน เพอกน bacteria ทปนเปอนมาเจรญเตบโต

น าไขสนหลง ควรเกบใหไดปรมาณมากพอควร อยางนอย 3 ml เพอใหมโอกาสพบเชอไดมากขน ควรสงทนท ถาสงไมไดใหตงไวทอณหภมหอง ไมใสตเยนเพราะเชอ Cryptococcus neoformans จะตายไดเมอถกความเยน

78

อน ๆ เชน เลอด นาเจาะจากปอด ไขกระดก ชนเนอ ตองเกบดวยวธไรเชอ (sterile technique) และสงตรวจโดยเรว สงสงตรวจทมการแขงตวได (clot) เชน เลอด นาเจาะปอด ไขกระดก ตองใส anticoagulant สารกนเลอดแขงเวลาเจาะ เพอปองกนการ clot ซงจะทาใหเชอตดอยในกอน clot

ไมควรเกบสงสงตรวจไวในตเยนเพอรอการตรวจ เนองจากเชอราบางตวจะตายเมออยในอณหภมตา Safety precautions เพอความปลอดภยของผปฏบต และเพอปองกนการปนเปอนในอากาศ และการแพรกระจายของเชอ ควรทาใน Safety cabinet หรอ Laminar flow. ขนตอนการตรวจ (Examination of specimens) 1. การตรวจดวยกลองจลทรรศน (Microscopic exam)

เปนการตรวจเบองตน การตรวจดเชอราจากสงสงตรวจดวยกลอง อาจชวยในการตดสนขนตนวาเปนโรคตดเชอราหรอไม เนองจากเชอราเจรญชา เสยเวลารอคอยผลจากการเพาะเลยง

KOH หรอ NaOH preparation ใชในการตรวจเชอราจากสงสงตรวจดงตอไปน ขยผวหนง เลบ เสนผม หนอง , corneal scraping, vaginal

swab, ear swab และสงสงตรวจอน ๆ วางสงสงตรวจบน slide ทสะอาด หยดดาง KOH หรอ NaOH (10 – 20 %) ลงไป 1 หยด ปด cover glass องไฟเลกนอยเพอชวยเรงปฏกรยา KOH หรอ NaOH จะยอยพวก Keratin, เยอเมอก ทาใหเหนเชอชดเจนขน ถาไมองไฟตองวาง slide ทเตรยมไว 15 นาท จงนามาดดวยกลอง ใชกาลงขยาย 10 และ 40 x สามารถเหนเชอรา เปนสายรา หรอ yeast

อาจเตมส Lactophenol cotton blue หรอ Parker’s ink ลงไป เพอชวยใหเหนเชอราไดชดเจนขน India ink Preparation

ใชในการด capsule ของเชอ india ink ไมซมเขาส cell หรอ capsule ของเชอ เปนวธตรวจเฉพาะสาหรบ Cryptococcus neoformans สงสงตรวจไดแก นาไขสนหลง นามาปนเอาตะกอนมาตรวจ โดยหยดลงบน slide ผสมกบ india ink ปดดวย cover glass นามาดดวยกลองใชกาลงขยาย 10 และ 40 X จะพบ encapsulated yeast cells สวน capsule ทหมรอบตวเชอจะเหนสวางเปนวงกวางอยบนพนดา ภายใน capsule ม yeast ซงอาจพบ budding หรอไมพบกได

การยอมอน ๆ Gram stain เชอราทกตวตดกรมบวก ใชในการตรวจหา yeast จาก Oral swab หรอ Vaginal swab Geimsa หรอ Wright stain : ใชยอม blood smear, bone marrow smear หรอเสมหะ ในผปวยทสงสยวามการตดเชอ Histoplasma capsulatum

Hematoxylin – Eosin PAS (Periodic acid Schiff.) Gormori

นยมยอมพวกชนเนอ หรอ หนองจาก sinus tract เพอตรวจหา granule หรอ grain เปนการยอมทาง พยาธวทยา (หองยอมชนเนอ)

79

2. การเพาะเชอ (Culture) เพอยนยนชนดของเชอรา โดยเพาะสงสงตรวจลงบนอาหารเพาะเชอรา ทใชทวไป ไดแก

Sabouraud’s dextrose agar (SDA) SDA + Chloramphenical และ cycloheximide เพอยบยงการเจรญของ bacteria และ

saprophytic fungi กรณทสงสยวามการตดเชอ Cryptococcus neoformans จะเพาะลงบนอาหารพเศษ เมอ C. neoforman ขนจะให colony สนาตาล – ดา ทาใหแยกไดจาก yeast อน ๆ รวมทง Cryptococcus spp. อนดวย การเพาะเลยงนยมเลยงใน tube มากกวาใน plate เนองจากเชอราเจรญชา อาหารไมแหง spore ไมฟงงายเหมอนใน plate เพาะเลยงทอณหภมหอง 1 เดอน เชอราอาจปรากฏ colony ใหเหน ตงแต 2 วน – 2 สปดาห หรอเปนเดอน แลวแตชนดรา 3. การศกษาเพอบอกชนดของเชอรา (Identification)

ลกษณะ colony (Macroscopic exam) ดการเจรญ rate of growth ขนเรวหรอชา พวก saprophytic fungi จะเจรญเรวเหน colony ภายใน

2 – 3 วน สวน pathogenic fungi เจรญชา อาจกนเวลาหลายสปดาห ดลกษณะส ผวหนา หลง เชน เปนปย เปนผง สดานหนา และสดานหลง สทสรางลงในอาหาร

เลยงเชอ - yeast or yeast-like colony คลาย colony ของ bacteria - filamentous colony ไดแก mould ตาง ๆ - dimorphic fungi จะให colony เปน mould ทอณหภมหอง และให colony เปน yeast ท 37C ทสาคญ

ไดแก Histoplasma capsulatum, Sporotrichum schenckii, Penicillium marneffei

80

ลกษณะของเชอราทางกลองจลทรรศน (Microscopic examination)

ใช sterile technique เขยเชอมาดดวยกลอง ถาเปน yeast ใช loop เขย ถาเปน mould ใช needle ปลายงอ เขยเชอมาวางบน slide ทม mounting fluid หยดอย mounting fluid ทใชคอ lactophenol cotton blue แลวใช needle 2 อน คอยๆ เขยแยกเชอออกเบา ๆ เพอใหเหนลกษณะของเชอชดเจนขน ปดดวย cover glass อาจองไฟเลกนอยเพอไลฟองอากาศ นาไปตรวจดดวยกลองจลทรรศนกาลงขยาย 10, 40X (ไมคอยนยมใชหว oil เนองจาก mould มขนาดใหญ) ถาพบ spore หรอลกษณะเฉพาะอยางอนประกอบกบลกษณะ colony จะชวย identify ได นอกจากวธ needle mount หรอ tease mount แลว อาจใชเทปใส (sctoch tape หรอ sellotape) โดยวางดานเหนยวปดลงบนผวหนา colony ของเชอ ยกขนมาปดลงบน lactophenol cotton blue ซงหยดบน slide นาไปดดวยกลอง บางครงไมสามารถเหนการจดเรยงตวของ spore และกาน spore ทาให identify ไมได จาเปนตองใชวธอนชวย เชน slide culture Slide culture : ทาไดดงน 1. เตรยม slide วางบนแทงแกวงอใน plate ปดฝาเขา hot air oven 160C 3 ชม. 2. เตรยม SDA plate ตดเปนชนสเหลยมขนาดประมาณ 1 cm2 3. ใช loop หรอ microspatula หรอมด ตดและตก agar block ดวย sterile technique มาวางบน slide ใน plate ท

เตรยมไว 4. ใช needle ปลายงอเขยเชอ inoculate ลงทจดกลางดานขางทง 4 ดานของ agar block 5. ใชคมคบ (forceps) cover glass ทปราศจากเชอ ปดบน agar block เตมนากลนบรสทธลงใน plate เลกนอย

เพอใหมความชน เกบไวทอณหภมหองจนเกด spore รไดโดยการยกทง slide นนมาดดวยกลองกาลงขยายตา 6. เมอเหนม spore เกดขนแลว ใช forceps คบ cover glass มาวางหงายเขย agar block ทงลงในนายาฆาเชอ 7. หยด lactophenol cotton blue 1 หยด บน slide 2 แผน ปด cover glass นาไปดดวยกลอง ถาตองการเกบเปน permanent slide ใชกระดาษซบ mounting fluid ตามชอบ cover glass ใหแหง แลวปดขอบทง 4 ดานดวยยาทาเลบ

81

เทคนคการจ าแนก yeast (Identification methods for yeasts)

1. Germ tube

ใชทดสอบ Candida albicans ทสะดวกรวดเรว แตไมจาเพาะเชอ Candida อน เชน C. stellatioides อาจใหผล germ tube + ve ได วธทา inoculate yeast ลงใน serum อบไว 37C อานผลภายใน 3 ชม. โดยนามาหยดลงบน slide ปดดวย cover glass ดดวยกลอง ถาพบ germ tube อาจเปน C. albicans ตองทดสอบอยางอนเพอยนยน 2. Chlamydospore formation

เปนการทดสอบ C. albicans ทใหผลคอนขางแนนอน อาหารทใช Corn meal Tween 80 agar, Chlamydospore agar, Milk agar ทาโดย streak เชอลงบน media แลว cut ปดดวย cover glass เกบทอณหภมหอง 1 – 2 วน นามาดดวยกลองจลทรรศน C. albicans จะให Terminal Chlamydospore จานวนมาก 3. Carbon assimilation test

เปนการทดสอบความสามารถของเชอในการใชนาตาลชนดตาง ๆ เปนแหลงของ carbon ใชในการ identify yeast ทาโดย pour plate ผสม yeast กบ yeast nitrogen base agar เมอแขงตวใชกระดาษกรองแผนเลก ๆ (disc) ชบนาตาลชนดตาง ๆ วางบน agar เกบไวทอณหภมหอง อานผล 2 – 3 วน ผล + ve คอมเชอเจรญรอบ ๆ แผนนาตาลนน 4. Sugar fermentation test

เปนการทดสอบทางชวเคม ในการ identify yeast โดยใชปฏกรยาเชอใชนาตาลในสภาวะขาดออกซเจน ไดเปน ethanol และ carbon dioxide ผล + ve คอให gas ใน Durham tube 5. Urease test

ใชแยก Cryptococcus neoformans ออกจาก yeast-like fungi อน ๆ เชน Candida spp. โดย inoculate เชอบน Urea media เกบไวทอณหภมหอง นาน 18 - 48 ชม. Cryptococcus ม Urease enzyme สลาย Urea ได end product เปน NH3 มฤทธเปนดาง ทาใหเปลยนเปนสชมพ

82

การศกษาคณสมบตของเชอรา

วตถประสงคเมอจบปฏบตการแลว นกศกษาสามารถ 1. อธบายลกษณะทาง Macroscopic และ Microscopic ของเชอราได 2. ศกษาลกษณะ spore ของเชอราสายแตละชนด โดยดดวยกลองจลทรรศน 3. จาแนกชนดของเชอราบางชนด ทสามารถเจรญบนอาหารพเศษได 4. เขาใจและอธบายหลกการของปฏกรยาชวเคมทเกยวของในการพสจนชนดของเชอราไดถกตอง

ปฏบตการท 1 ลกษณะโคโลน yeast cell หลกการ

ลกษณะโคโลน เชน ความมน เยม สของ yeast cell บางชนดเปนสงทจะใชประกอบในการตรวจพสจนเชอราได วธท า

1. ใหนกศกษาบนทกลกษณะโคโลนของเชอราแตละชนดลงในตารางการรายงานผล 2. ศกษาลกษณะ Gram stain ของ yeast cell แตละลายพนธ บนทกผล

ผลการทดลอง

Yeast ลกษณะโคโลน

BA SDA

C. albicans

C. tropicalis

Cryptococcus neoformans

Rhodotorula

Trichosporon

ปฏบตการท 2 ลกษณะทาง Microscopic ของ yeast cell และ spore ของเชอราสาย หลกการ การยอมส gram เปนวธการขนตนททาใหทราบวาโคโลนทเหนเปน yeast cell สวนการศกษาลกษณะ spore ของราสายทาใหทราบโดยคราว ๆ วาเปน Mold genus ใด

83

วธการ ใหศกษารปรางของ yeast cell และลกษณะ spore ของราสายทยอม Gram stain และ Lactophenol cotton blue ผลการทดลอง

Yeast cells ลกษณะทาง Microscopic /Gram stain

Candida albicans

Cryptococcus neoformans

Trichosporon beigelii

Mold ลกษณะทาง Microscopic / Lactophenol cotton blue

Aspergillus spp.

Enicillium spp.

Fusarium spp.

Cladosporium spp.

ปฏบตการท 3 ลกษณะโคโลน ของเชอราสาย หลกการ

ผวหนาโคโลนของเชอราสายมไดหลายแบบ ขนกบชนดของ conidia ทมนสรางทาใหเหนลกษณะโคโลนทแตกตางกน วธท า

ใหศกษาลกษณะโคโลน ของเชอราสาย และบนทกผลลงตาราง

84

ผลการทดลอง

Mold ลกษณะโคโลน

Aspergillus

Pencillium spp.

Trichophyton mentagrophyte

Microsporum canis

Microsporum gypseum

Cladosporium spp.

ปฏบตการท 4 การพสจนเชอ Candida albicans หลกการ คณสมบต Germ tube formation และ Chlamydoconidia formation ชวยในการพสจนยนยนชนดของ Candida albicans วธท า Germ tube formation เขย colony ของ yeast cell ทไดรบลงใน tube ทม plasma อย 0.5 ml. Incubate ท 37 oC นาน 2-3 ชวโมง นามาทา wet mount บนทกผลทเหนในกลองจลทรรศน ลงในตารางบนทกผล

Chlamydoconidia formation

Streak colony ของ yeast cell ทไดรบลงบน milk medium Incubate ท 25 oC นาน 18-24 ชวโมง นามาดดวยกลองจลทรรศน บนทกผล ผลการทดลอง

Yeast cell Germ tube test Chlamydoconidia formation

C. albicans

C. tropicalis

85

ปฏบตการท 5 การพสจนเชอ Cryptococcus neoformans หลกการ การพสจนชนดของ C. neoformans โดยอาศยคณลกษณะพเศษของตวเชอไดแก การสราง capsule ลอมรอบ cell, การผลต enzyme phenol oxidase ทาใหเปลยนสของ media ทมเชอชนดนขนอยและการสราง urea ทาใหชวยในการพสจนยนยนเชอชนดนได วธท า India ink preparation : การสราง capsule

1. เขย colony yeast cell ผสมกบ NSS ใหเขากน หรอหยด specimen 1-2 หยด 2. หยด India ink 1 หยด ผสมใหเขากน 3. ปดดวย cover glass นาไปดดวยกลองจลทรรศน บนทกผลทเหน Modified caffeic acid counmeal agar : การผลต enzyme phenol oxidase 1. Streak colony yeast cell ทไดรบลงบน media 2. Incubate ท 25 oC นาน 18-24 ชวโมง 3. บนทกผลลกษณะโคโลนทขนบน media ชนดน

Urea hrydrolysis 1. Streak colony yeast cell ทไดรบลงบน slant ของ urea 2. Incubate muj 25 oC นาน 18-24 ชวโมง 3. บนทกผลลกษณะทเปลยนไปของ media ชนดน

ผลการทดลอง

Yeast cells India ink Modified caffeic acid cornmeal agar

Urea hydrolysis

C. albicans

Cryptococcus neoformans

ปฏบตการท 6 คณสมบตของ yeast cell ในการ assimilate น าตาลชนดตาง ๆ หลกการ เมอเลยง yeast cell ตระกล Candida ในภาวะทมอาหารครบถวนยกเวนนาตาลหลงจากนน จงเตมนาตาลทจะทดสอบแตละชนดเพอดความสามารถในการใชนาตาลเพอสรางพลงงานและเจรญในภาวะทมกาซออกซเจนของแตละสายพนธ ทาใหสามารถจาแนกของเชอตระกลนได วธท า ใหนกศกษาสงเกตการเจรญของเชอทมลกษณะขนขาวเปนวงรอบ DISC บนทกผลการใชนาตาลชนดตาง ๆ ของ yeast cells ทจดแสดงไว ลงในตารางบนทกผล

86

รายงานผล ถาเชอสามารถใชนาตาลชนดใด ไดจะมการเจรญรอบแผน DISC ของนาตาลชนดนน อานผลเปน บวก (+) ถาไมมการเปลยนแปลงรอบแผน DISC แสดงวาเชอไมสามารถใชนาตาลชนดนนได อานผลเปน ลบ (-) ผลการทดลอง

Yeast Assimilation

D M S L G Me Ce I X R T

C. albicans

C. tropicalis

D=Dextrose, M=Maltoes, S = Sucrose, L=Lactose, G = Galactose, Me = Melibiose, Ce = Cellobiose, I =Inositol, X = Xylose, R=Raffinose, T = Trehalose

87

ตารางแสดงปฏกรยาชวเคมของ Yeasts

Species Assimilation Fermentation

KNO3 Urea D M S L G I X R T D M S L G T

C. albicans + + + 0 + 0 0 0 + 0 + 0 F F 0 0 F F 0 C. stellatoidea + + 0 0 + 0 0 0 + 0 + 0 F F 0 0 0 0 0

C.parapsilosis + + + 0 + 0 0 0 + 0 + 0 F 0 0 0 0 0 0

C. tropicalis + + + 0 + 0 + 0 + 0 + 0 F F F 0 F F 0 C.guilliermondi + + + 0 + + + 0 + + + + F 0 F 0 F F 0 C.pseudotropicalis + 0 + + + 0 + 0 V + 0 0 F 0 F F F 0 0 C. krusei + 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 F 0 0 0 0 0 +

S. cerevisiae + + + 0 + 0 0 0 0 0 0 0 F F F 0 F 0 0

G. candidum + 0 0 0 + 0 0 0 + 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

T. glabata + 0 0 0 0 0 0 0 0 0 + 0 F 0 0 0 0 F 0

T. beigelii + + + + + + + + + + + + 0 0 0 0 0 0 0 +

T. pullurans + + + + + + + + + + + 0 0 0 0 0 0 0 + +

R. glutinis + + + 0 + 0 + 0 + + + 0 0 0 0 0 0 0 + +

R. rubra + + + 0 + 0 + 0 + + + 0 0 0 0 0 0 0 0 +

C.neoformans + + + 0 + 0 + + + + + 0 0 0 0 0 0 0 +

+= Positive0 = NegativeF= FermentiveV=Variable

©©©©©©©©

Ce Du Me

88

สวนท 2

89

ปฏบตการท 1 AEROBIC GRAM POSITIVE COCCI : FAMILY MICROCOCCACEAE

วตถประสงค 1. เพอใหเรยนรวธแยกและจาแนกแบคทเรยในกลม Micrococcaceae โดยเฉพาะตวทมความสาคญทางดานการแพทยไดอยางถกตองและรวดเรว 2. ใหทราบถงความสาคญของ Staphylococcus aureus ในการทาใหเกดโรคในคน ปฏบตการท 1 ลกษณะทสาคญ บางประการของ staphylococci และ micrococci สงทใหปฏบต

บนทกลกษณะตาง ๆ ของ staplylococci และ micrococci บนอาหารเลยงเชอชนดตาง ๆ (blood agar plate, Mannital salt agar และ Nitrate broth) รวมทงลกษณะทางชวเคมบางประการซงตงแสดงใหด ปฏบตการท 2 การเพาะเลยงและจาแนกชนดแบคทเรยในกลม Micrococcaceae อปกรณ สาหรบ 1 โตะ

1. เซรมของคน 1 หลอด 2. ไฮโดรเจน เปอรออกไซด (3% H2O2) 1 ขวด 3. พาราฟน (paraffin) 1 กระปอง สาหรบ 1 กลม 1. “unknow” broth culture 1 หลอด 2. Blood agar plate 1 จาน 3. Glucose O/F 2 หลอด 4. Tryptic soy broth 1 หลอด 5. Test tube sterile (ขนาด 13 X 75 มม.) 2 หลอด 6. Nitrate broth 1 หลอด

สงทใหปฏบต 1. แยกและจาแนกชนดแบคทเรยใน “unknown” broth culture 2. ตอบคาถามทายบท

วธปฏบต ทาการแยกและจาแนกชนดของแบคทเรยใน “unknown” broth culture โดยใช blood agar plate เปน

อาหารสาหรบแยกเชอ

90

ค าถาม 1. จงเขยนแผนภมและขนตอนของการจาแนกชนดของแบคทเรยทนกศกษาไดปฏบตการทดสอบเอง 2. จงอธบายทฤษฎของ Mannital salt agar และ Nitrate broth การอานผลและการแปลผลรวมถงผลประโยชน

ของการเลยงเชอทง 2 ชนดน 3. Goagulase negative staphylococci มเพยงชนดเดยวคอ S. epidermidis ใชหรอไม หากไมใชยงม

Staphylococcus species ใดบางอก

©©©©©©©©

91

ปฏบตการท 2 AEROBIC GRAM POSITIVE COCCI : FAMILY STREPTOCOCCACEAE

วตถประสงค

1. เพอใหสามารถแยกและจาแนกชนดของแบคทเรยในกลมของ Streptococcus spp. ซงมความสาคญทางการแพทยโดยอาศยทงลกษณะการเจรญเตบโต ลกษณะทางชวเคม

2. มความรความเขาใจในบทบาทของ Streptococcus species ในการทาใหเกดโรคตดเชอ ปฏบตการท 1

ลกษณะสาคญบางประการของ Streptococcus species สงทใหปฏบต

บนทกลกษณะตาง ๆ ของ streptococci ชนดตาง ๆ บน shop blood agar และ human blood agar รวมทงลกษณะทางชวเคมบางประการซงตงแสดงใหด

ปฏบตการท 2

การแยกและการจาแนกชนดของแบคทเรยในกลม Streptococcus species อปกรณ

1. Bacitracin dise (0.04 ยนต) 1 ขวด 2. Optochin dise 1 ขวด 3. Candle jar 1 กระปอง 4. S. aureus, beta – hemolytic 5. Sheep blood agar plate 1 จาน Human blood agar plate 1 จาน (สาหรบทา bacitracin, optochin suseeptibility tests) 6. “unknown” broth culture 1 หลอด 7. Bile esculin medium 1 หลอด 8. 6.5% NaCl medium 1 หลอด สงทใหปฏบต

1. แยกและจาแนกเชอใน “unknown” broth culture จนถงระดบชนด 2. ตอบคาถามทายบท

วธปฏบต ดจากหลกปฏบตในการจาแนกแบคทเรยใน “unknown” broth culture โดยใช human blood agar เปนอาหาร

สาหรบแยกเชอ

92

ค าถาม 1. จงเขยนแผนภมแสดงการแยก Streptococcus spp. ชนดตาง ๆ 2. การเกด beta-hemolysis ของ S. pyogenes เกดจากอะไร และการหาแอนตบอดตอสารนในเลอดผปวยม

ประโยชนอยางใดหรอไม

©©©©©©©©

93

ปฏบตการท 3 การศกษาคณสมบตของ Gram positive cocci

บทน า ในปฏบตการครงนนกศกษาจะไดเรยนรเกยวกบปฏกรยาทางชวเคมของเชอในกลม gram positive cocci พรอมกบศกษารปรางลกษณะทงทาง macroscopic และ microscopic คณสมบตเหลานใชชวยในการพสจนชนดของเชอในกลมน และจาแนกเชอ gram positive cocci ออกจากเชออนได วตถประสงค เมอจบปฏบตการครงนแลว นกศกษาสามารถ

1. อธบายรปราง ลกษณะการตดส การเรยงตวของเชอ gram positive cocci ได 2. อธบายลกษณะโคโลนของเชอทศกษาไดถกตอง 3. อธบายหลกการ และปฏบตตลอดจนแปลผลการทดสอบปฏกรยาทางชวเคมของเชอ gram positive cocci ได

ถกตอง การทดลองท 1 : ลกษณะโคโลนและรปรางลกษณะของเชอ gram positive cocci

หลกการ ลกษณะโคโลน และลกษณะทาง microscopic อนไดแก รปราง ขนาด การเรยงตว ตลอดจนความเปลยนแปลงของอาหารรอบๆโคโลนบนอาหารบางชนดเปนสงซงจะใชประกอบในการตรวจพสจนเชอแบคทเรยได วธท า

1. ใหนกศกษาบนทกลกษณะโคโลนของเชอแตละชนดลงในตารางรายงานผล 2. ใหนกศกษาเตรยม heat-fixed smear และยอม Gram stain ของเชอทไดรบ แลวรายงานรปราง ลกษณะ และการ

เรยงตวของเชอ ผลการทดลอง

เชอ ลกษณะโคโลนบน blood agar plate

(macroscopic) ลกษณะภายใตกลองจลทรรศน

(microscopic) Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Micrococcus spp. Alpha-Streptococci Beta-Streptococci Gamma-Streptococci Streptococcus pneumoniae

94

การทดลองท 2 การพสจนเชอใน Genus Staphylococcus หลกการ ในการพสจนเชอใน Genus Staphylococcus ซงมรปราง ลกษณะคลายคลงกบเชอ gram positive

cocci ใน genus อน จาเปนจะตองแยกออกจากเชอเหลานนโดยใช catalase test เสยกอน จากนนจงตรวจพสจนถงขน species โดยใชปฏกรยาทางชวเคมอนๆตอไป ซงปฏกรยาเลานไดแก coagulase test, glucose fermentation, mannitol fermentation และ Novobiocin resistance นอกจากนเชอ Staphylococcus บาง species ยงทาใหเกด hemolysis เหนไดชดเจนบน blood agar plate ดวย สาหรบปฏบตการครงน นกศกษาจะไดฝกปฏบตการพสจนชนดเชอใน genus Staphylococcus โดยใชปฏกรยาชวเคมบางปฏกรยาดงน 2.1 Catalase test

นายาทดสอบ 3% H2O2

วธทดสอบ slide method 1. ใช sterile inoculating needle เขยตรงกลางโคโลน ไปปายบน glass slide ทสะอาด 2. หยด 3% H2O2 1 หยด ลงไปบนบรเวณทปายเชอบน slide 3. ดฟองกาซทเกดขนในทนท

การแปลผล ผลบวก : มฟองกาซเกดขนทนท ผลลบ : ไมมฟองกาซเกดขน

ขอสงเกต 1. ไมควรนาเชอจาก blood agar มาทาการทดสอบ เพราะในเมดเลอดแดงม enzyme catalase อยดวย จะทาให

เกดผลบวกปลอมได (false positive) 2. หากปฏบตการผดขนตอน คอหยด3% H2O2 ลงไปกอน แลวจงปายเชอลงไปนน platinum ทใชทาเปน

inoculating needle อาจมองคประกอบทจะ catalyze ปฏกรยา ทาใหเกดผลบวกปลอมไดแตหากใช nichrome wire จะไมทาใหเกดผลบวกปลอม

ผลการทดลอง

เชอ ผลการทดสอบ

S. aureus

S. epiderrmidis

Streptococcus spp.

95

2.2 Coagulase test สงทตองใช 1. Test tube ขนาด 13x100 mm (sterile) 2. Trypticase soy broth (TSB) 3. Plasma (ใช sodium fluoride เปน anticoagulant) วธทดสอบ tube method 1. ผสม TSB กบ plasma ในอตราสวน 4: 1 แบงใส test tube หลอดละ 0.5-1 ml 2. เขยเชอจากโคโลนทตองการทดสอบ suspend ลงใน tube (ขอ1) แลว incubate ท 37oC 3. เมอครบ 4 ชวโมง นาออกมาอานผล หากยงไมพบ plasma clot ให incubate ตอไปจนครบ 18-24

ชวโมง แลวดผลอกครงหนง 4. ทา control positive และ negative เมอใช plasma ขวดใหมทกครง

การแปลผล ผลบวก : plasma แขงตวเปนกอนทงหมดหรอแขงเปนบางสวน ผลลบ : plasma เหลวเหมอนเดม

ขอสงเกต 1. plasma ไมควรใช citrate plasma เนองจากแบคทเรยบางชนดสามารถยอย citrate, plasma จะแขงตว 2. incubate นานเกนไป เชน ดผลหลง incubate 24 ชวโมง อาจทาใหกอนแขงของ plasma ถกยอยโดย

fibrinolysin เกดผลลบลวงได ผลการทดลอง

เชอ ผลการทดสอบ

S. aureus

S. epidermidis

2.3 Mannitol, Glucose Fermentation

สงทตองใช PR- mannitol, PR- glucose (phenol red) วธทดสอบ 1. ใช steriled inoculating needle แตะเชอทจะทดสอบ นามาแทงลงไปตรงๆใหลกเกอบถงกนหลอด PR-

mannitol, PR- glucose 2. นาไป incubate ท 37oC นาน 18-24 ชวโมง

96

การแปลผล ใหอานทงสวนบนและสวนลางของนาตาลทงสองชนดและรายงานเปนสวนบน / สวนลาง โดยใชสญลกษณดงน

+ หมายถง สของอาหารเปลยนเปนสเหลอง - หมายถง สอาหารคงเดม (สชมพอมสม) หรอ เปลยนเปนชมพแดง

ผลการทดสอบ

เชอ ผลการทดสอบ Glucose Mannitol

S. aureus

S. epidermidis

Staphylococcus coagulase negative

Micrococcus spp.

2.4 ทดสอบการดอตอ novobiocin (Novobiocin resistance)

สงทตองใช 1. novobiocin disk 5 ไมโครกรม 2. Mueller Hinton agar (MHA) วธท า ( Agar diffusion susceptibility) 1. เตรยม broth ของ Staphylococcus ใหมความขนเทากบ Mc. Farland NO. 0.5 2. ใช sterile swab จม broth (ในขอ1) บดพอหมาดๆ ปานถลงบน MHA วาง novobiocin 5 ไมโครกรม

(NB5 ) นาไป incubate 37oC 18-24 ชวโมง การแปลผล

ผลบวก : เชอดอตอยา novobiocin ไมมรอยยบยงรอบๆแผนยาหรอมรอยยบยงนอยกวา 16 mm

ผลลบ : เชอมความไวตอยา มรอยยบยงมากกวา 16 mm ผลการทดลอง

เชอ ผลการทดสอบ

S. aureus

S. saprophyticus

97

การทดลองท 3 : การพสจนเชอใน Genus Streptococcus วตถประสงค

เพอใหนกศกษาสามารถแยกและวนจฉยเชอ Streptococcus spp. ซงมความสาคญทางการแพทยได โดยอาศยทงสกษณะการเจรญเตบโตบนอาหารเลยงเชอและการทดสอบทางชวเคม

3.1 Optochin susceptibility test วธทดสอบ 1. Inoculate เชอทตองการทดสอบลงบน blood agar plate โดย streak ใหถๆ หรออาจใช swab ปายเชอ

ใหทว blood agar plate 2. ใชปากคบ (forceps) ท sterile คบ Optochin disk มาวางตรงกลางรอย streak ของเชอในขอ1. เชอละ 1

disk 3. นาไป incubate ท 37oC ใน CO2 incubator หรอ candle jar เปนเวลา 18-24 ชวโมง การแปลผล

Inhibition zone มากกวา 14 mm = susceptibility Inhibition zone นอยกวา 14 mm = resistant

ผลการทดลอง

เชอ ผลการทดสอบ

Alpha Streptococci

S. pneumoniae

3.2 Bacitracin susceptibility test

วธทดสอบ 1. Inoculate เชอทตองการทดสอบ ลงบน blood agar plate 2. ใช forceps ท sterile คบ Bacitracin disk (0.04 U) วางบนตรงกลางรอย streak ของเชอในขอ1. เชอละ

1 disk 3. นาไป incubate ท37oC เปนเวลา 18-24 ชวโมง การแปลผล

susceptible = ม inhibition zone ขนาดใดๆ กได resistant = ไมม inhibition zone รอบแผนยา

หมายเหต ความเขมขนของ Bacitracin disk 10 unit สาหรบทดสอบดความไวตอยา เพอใชในการรกษาผปวย นามา

ทดสอบไมได

98

ผลการทดลอง

เชอ ผลการทดสอบ

Beta Streptococcus gr. A

Beta Streptococcus gr. B

3.3 Hippurate hydrolysis

วธทดสอบ 1. เตรยม 1% sodium hippurate ในนากลน แบงใสหลอดจกเกลยวขนาด 13x100 mm หลอดละ 0.4 ml 2. ใช sterile loop เขยเชอจาก colony ละลายในนายาใหขน นาไป incubate 37oC อยางนอย 2 ชวโมง 3. ใสนายา ninhydrin 4 หยด 4. นาไป incubate 37oC 10 นาท และอานผล การแปลผล

ผลบวก : สนาเงน-มวง ผลลบ : ไมมส

หมายเหต 1. ถามสนาเงนจางๆ ควรทาการทดสอบซา 2. นายา 1% hippurate แบงใสหลอด 0.4 ml เกบใสตแชแขงนานถง 6 เดอน 3. นายา ninhydrin เกบในตเยน 4oC ไดนาน 4 เดอน ผลการทดลอง

เชอ ผลการทดสอบ

Beta Streptococcus gr. A

Beta Streptococcus gr. B

3.4 Bile-esculin (BE) hydrolysis

วธทดสอบ 1. streak เชอทตองการทดสอบลงบนผวหนา slant ของ media 2. นาไป incubate 37oC 18-24 ชวโมง

99

การแปลผล ผลบวก : เกดสดามากกวาครงหลอด ผลลบ : ไมเกดสดาหรอเกดสดาเพยงเลกนอยไมถงครงหลอด

ผลการทดลอง

เชอ ผลการทดสอบ

Gamma Streptococcus not gr. D not enterococci

Enterococci

3.5 Sodium chloride (6.5%) tolerance test

วธทดสอบ 1. inoculate เชอทตองการทดสอบ ลงบนผวหนา slant ของ media 2. นาไป incubate ท 37oC 24-48 ชงโมง การแปลผล

ผลบวก : มเชอขนและอาหารอาจเปลยนจากสมวงไปเปนสเหลอง ถาเชอสามารถใช glucose ได ผลลบ : ไมมเชอขน, อาหารยงคงเปนสมวงดงเดม

หมายเหต หากอานผลหลง incubate 24 ชวโมง แลวผลบวกยงไมชดเจน ตอง incubate ตอไปจนครบ 48 ชวโมง

เพอใหแนใจวาผลบวกจรง ผลการทดลอง

เชอ ผลการทดสอบ

Gamma Streptococcus gr. D not enterococci

Enterococci

การทดลองท 4 ใหนกศกษารายงานลกษณะของเชอแบคทเรย (Unknown) ทจดแสดงไว และตอบใหไดวาเปนแบคทเรยชนดใด

Unknown Macroscopic Microscopic Biochemical test Bacteria 1 2 3

100

ค าถาม 1. จงบอกความแตกตางทาง microscopic ระหวางเชอ Staphylococcus และ Streptococcus 2. การทดสอบใดทใชแยกระหวาง Staphylococcus และ Streptococcus 3. การทดสอบทยนยนวาเชอทพสจนคอ S. aureus คอการทดสอบใดบาง 4. การทดสอบทยนยนวาเชอทพสจนคอ S. saprophyticus คอการทดสอบใดบาง 5. S. pneumoniae มรปรางทาง microscopic ตางจาก Alpha- Streptococci อยางไรบาง 6. การทดสอบทใชแยก S. pneumoniae ออกจาก Alpha- Streptococci คอการทดสอบใด 7. การทดสอบทใชแยก Beta- Streptococcus gr. A ออกจาก Beta- Streptoccci คอการทดสอบใด 8. การทดสอบทใชแยก Beta- Streptococcus gr.B ออกจาก Beta- Streptoccci คอการทดสอบใด 9. การทดสอบทยนยนวาเชอทพสจนคอ Enterococci คอการทดสอบใด 10.จงเขยนแผนภมแสดงการแยก Streptococcus spp. ชนดตางๆ

©©©©©©©©

101

ปฏบตการท 4 AEROBIC GRAM NEGATIVE COCCI

ในการ identify เชอใน genus นอาจ แบงการทดสอบไดเปน 2 ระยะ คอ

1. การทดสอบขนตน (Presumptive identification) 2. การทดสอบอกครงเพอใหแนใจ (Confirmatory identification) การทาสอบในขนตนไดแก การยอมกรบและการทดสอบการใหเอนไซม oxidase หากพบแบคทเรย แกรมลบ

diplococci และการทดสอบ oxidase ใหผลบวกกนาจะเปน Neisseria spp. หากในสงสงตรวจไดรบจากบรเวณอวยวะสบพนธเพศชาย หรออวยวะสบพนธเพศหญงบรเวณคอมดลกยอมดพบเมดเลอดขาวทมหลาย loop (polymorphonrclear : PMN) จานวนมากและพบแบคทเรยแกรมลบ diplococci เชนกน กเปนไปไดมากวานาจะเปน N.gonorrhoeae

การทดสอบอกครงเพอใหแนใจ ไดแก การทดสอบการใชนาตาลตาง ๆ การทดสอบปฏกรยาทางชวเคมอนๆ และรวมถงการใชปฏกรยานาเหลอง เขาชวยในการจาแนกชนดของแบคทเรยดวย การทตองมการทดสอบอกครง เนองดวยผลการทดสอบขนแรก อาจมการผดพลาดไดโดยเฉพาะในการดการยอมกรมของเชอ เนองจากแบคทเรยแกรมลบ coccobacilli บาชนด เชน Moraxella spp. Acinetobacter spp. อาจดคลาย diplococci ได การทดสอบอกครงนจะสาคญเปนพเศษหากสงสงตรวจมาจากบรเวณในคอของผปวย เพราะบรเวณนนเปนทอยอาศยของ non-pathogenic neisseria ดงนน การทดสอบอกครงเพอความแนใจจะสามารถแปรผลได

การทดสอบการใชนาตาล (Carbohydrate degradation tests) การทดสอบการใชนาตาลตาง ๆ ถอวาเปนการทดสอบทสาคญมากของการทดสอบเพอความแนใจโดยเฉพาะ

อยางยงการแยก N. gonorrhoeae อออกจาก N. menigngitides การทาการทดสอบการใชนาตาลจะมหลายวธดวยกน แตใหนกศกษาทดลองเพยง 3 วธคอ

1. Conventional carbohydrate degradation tests cystine tryptic digest agar (CTA) เปน base medium ม พนอลเรด (phenol red) เปน pH อนดเคเกอร และใชความเขมขนของนาตาล 1 เปอรเซนต การทดสอบวธน อาหารเลยงเชอเปน semisolid เพาะเชอโดยการสแตป (stab) ลงไปในอาหารเลยงเชอ โดยใหลกประมาณครงหนงของความสงของอาหารเลยงเชอ บมไวทอณหภม 37 องศาเซลเซยส นาน 24-43 ชวโมง อานผล หากเชอใชนาตาลจะใหกรด ออกมาซงจะเปลยนแปลงสของอาหารเลยงเชอจากสแสดเปนสเหลอง (กรด) หากไมมการใชนาตาล อาหารเลยงเชอจะไมเปลยนเปนสแสดหรอแดง (ดาง)

2. Modified carbohydrate degradation tests ทกประการตางกนทความเขมขนของวน เปน 1.5 เปอรเซนต และทาอาหารเลยงเชอใหเปนสะแลนท (slant) การเพาะเชอนนใชเชอปรมาณคอนขางมากมาขดเชอลงบน สแลนท ไมตองสแตปลงไปในวนเลยการบมเชอและอานผลเชนเดยวกบในขอ 1

3. Rapid fermentation test เปนวธททาใหอานผลการใชนาตาลของเชอไดรวกเรวขน คอ ภายใน 15 นาท – 4 ชวโมง หลกการ คอใชเอนไซมซงแบคทเรย ผลตออกมาใชยอยนาตาลและเปลยนเปนกรด แตเอนไซมทแบคทเรยแตละตวสรางมนอยมาก จงตองใชเชอจานวนมากเพอใหมเอนไซม จานวนมากพอทจะเปลยนนาตาลให

102

เปนกรด ความสะดวกของวธนคอทกอยางไมตองทาใหปราศจากเชอ เพราะเชอททาการทดสอบจะตองมมากกวาเชอทจะบนเปอนหลายแสนเทา นายาทตองใชม 2 ชนด คอ 3.1 สารละลายปฟเฟอร หรอ BSS (Buffered balanced salt indicator solution) ประกอบดวย

K2HPO4 0.04 กรม KH2PO4 0.01 กรม KCl 0.3 กรม Phenol red (1% ag.soln) 0.4 กรม นากลน 100 มล.

3.2 สารละลายของนาตาลชนดตาง ๆ ความเขมขนอยางละ 20% (W/V) ไดแก นาตาลกลโคส, มอลโตส, ซโครล,แลคโตส และ ฟรคโตส วธท า

ก.ใชลฟ (loop) ตกเชอในจานอาหารเลยงเชอประมาณ 2 ลฟ (loop) เตม ๆ ใสลงใน BSS 1 มลลลตร เขยาจนเชอกระจายตวมากทสดเทาทจะทาได ข. นาหลอดทดลองขนาด 10 X 75 มลลเมตร เรยงลงในแรค (rack) หรอทวางหลอดทดลองเขยนชอนาตาลแตละตวกากบขางหลอด ค. ใชดรอปเปอร (dropper) หยดนาตาล (20%) ลงในหลอด ๆ ละ 1 หยด (1 หลอด ใสนาตาลชนดเดยว) ง. เตมสารละบายทมแบคทเรย (bacterial suspension) จากขอ ก. ลงในหลอดแตละหลอด หลอดละ 0.1 มลลลตร เขยาใหเขากน จ. นาไปบมไวท 37 c ในอางนาควบคมอณหภมดผลเมอเวลา 15,30 นาท และทก ๆ ชวโมงตอไป จนถง 4 ชวโมง หากผลบวกจะมสเหลอง ผลลบจะมสแสด หมาเหต : จะไมอานผลหลงจากบมทงไวนานกวา 4 ชวโมง เพราะหากมเชออนปนเปอน ทาใหเกดผลบวกปลอมขนได สงทจดท าใหสาหรบ 1 กลม 1. “UNKNOWN” broth culture 1 หลอด 2. Chocolate agar plate 2 จาน 3. CTA semisolif+sugars 5 หลอด 4. CTA slant+sugars 5 หลอด 5. Nutrient agar slant 1 หลอด 6. Nitrate broth 1 หลอด 7. Nitrite broth 1 หลอด 8. Buffered balanced salt indicator solution (BSS) 1 มล. 9. 20% (W/V) Sugar solution 5 หลอด (สาหรบ 1 โตะ)

103

10. หลอดทอลอง (ขนาด 10 X 75 มลลเมตร) 5 หลอด 11. ไปเปตต ขนาด 1 มลลลตร 1 อน สงทใหปฏบต

เพาะเลยงและจาแนกชนดของ Neisseria spp. ทไดรบโดยใชทง conventional และ rapid test วธปฏบต

1. ยอมกรมจาก broth culture ทไดรบ 2. เพาะเชอจาก broth culture ลงบน chocolate agarทง 2 จาน ดงรป 3. นา chocolate agar plate ทง 2 ใสลงในกระปองทจดเตรยมไวใหจดเทยนไขพรอมกบใสสาลชบนาพอเปยกลง

ไปดวย ปดฝาใหแนนแลวนาเขาบมท 37 c ทงไวขามคน 4. จากจานท 1 ใหนามายอมกรม, ทดสอบการใหเอนไซมออกซเดส (oxidase) และเพาะเลยงลงใน nitrate broth,

nitrite broth, nutrient agar slant, CTA semisolid และ CTA slant นาเขาบมไว ในอากาศธรรมดาท 37 c ทงไว 1 คน หมายเหต ใหใชเชอมาก ๆ ในการทดสอบ ยกเวน nutrient agar slant ใหใชขนาดปกต 5. Rapid fermentation test ใหใชเชอจาก chocolate agar plate จานท 2ในการทาและทาตามวธทไดกลาวไวแลว

ขางตน คาถาม 1. จากผลทไดจากปฏบตการครงน ขอใหวจารณถงผลดและผลเสยของ carbohydrate degradation test แตละวธ 2. การจาแนกชนดของ N. gonarrhoeae นนนอกจากการใชคณสมบตทางชวเคมแลวยงใชวธอน ๆ ไดอก ไดแกวธ

ใดบาง 3. ทาไมจงตองทาการทดสอบการใชนาตาลอกครง นอกเหนอจากการทดสอบในขนตน 4. ผลของการใชนาตาลของ N. gonorrhoease และ N. meningitidis 5. การทดสอบใดทงายทสดในการบอกวา เชอนนาจะเปน Neisseriae ททาใหเกดโรค

©©©©©©©©

104

ปฏบตการท 5 AEROBIC GRAM POSITIVE BACILLI

วตถประสงค

1. แยกและจาแนกชนดแบคทเรยในสกล Corynebacterium และ Listeria ไดอยางถกตอง 2. สามารถอธบายถงความสาคญทางการแพทยของแบคทเรยทง 2 สกล ดงกลาวได

ปฏบตการท 1 การแสดงลกษณะบางประการของ Corynebacterium, Listeria และ Bacillus species

สงทใหปฏบต ศกษาลกษณะโคโลนของเชอในสกล Corynebacterium บน Blood agar, Cystine tellurite agar, Loeffier

surum agar, Tinsdale’s medium และโคโลนของ Listeria monocytogenes และ Bacillus species บน Blood agar ตลอดจนคณสมบตทางชวเคมบางประการ ซงตงแสดงไว

ปฏบตการท 2

การแยกและจาแนกชนด แบคทเรยในกลม aerobes แกรมบวก ลกษณะเปนทอน สงทจดหาใหสาหรบ 1 กลม 1. “UNKNOWN” broth culture 1 หลอด 2. Blood agar 1 จาน 3. Cystine tellurite agar 1 จาน 4. Gelatin plate (สาหรบ 4 กลม) 1 จาน 5. Nitrate broth (เตม serum 10%) 1 หลอด 6. Urease (เตม serum 10%) 1 หลอด 7. Motility medium 1 หลอด 8. Hiss serum medium (กลโคส, มอลโตส,ซโครส,แปง, trehalose, rhamnose) อยางละ 1 หลอด สงทใหปฏบต

1. แยกและจาแนกชนด แบคทเรยใน “UNKNOWN” broth culture จนถงระดบชนด โดยใช blood agar เปนอาหารแยกเชอ

2. ตอบคาถามทายบท วธปฏบต

ดจากหลกการปฏบตสาหรบการแยกและจาแนกชนด แบคทเรย โดยใช Blood agar และ Cystine tellurite agar เปนอาหารสาหรบแยกเชอ คาถาม

1. หากนา C. diphtheriae มาทดสอบหา ทอกซน ดปทเรย จะตองใหผลบวกเสมอไปหรอไมเพราะเหตใด

105

2. หากนาแบคทเรยตวหนงมาทดสอบหา ทอคซน ดปทเรย แลวไดผลบวกแบคทเรยตวนนจะตองเปน C. diphtheriae เสมอไปหรอไมเพราะเหตใด

3. อาหารเลยงเชอสาหรบ C. diphtheriae ทดและเหมาะสาหรบการแยกเชอในครงแรก คออะไรบาง

©©©©©©©©

106

ปฏบตการท 6 AEROBIC GRAM POSITIVE BACILLI : ELEK’S TEST

Elek’s test เปนการทดสอบการสราง ทอกซน ดปทเรย ของ corynebacterium species อยางงาย ๆ ในหลอดทดลอง วธการทดสอบนผใชครงแรก คอ S.D.Elek ในป ค.ศ.1949 วธนใชปฏกรยาการเกด การตกตะกอน (precipitation) ในวนระหวาง ทอกซน ดปทเรย ซงสรางขนจากเชอทผลตทอกวน กบแอนตทอกซน ดปทเรย ซงผสมอยในเนอวนปฏกรยาจะปรากฎใหเหนไดภายใน 24-28 ชวโมง สงทจดหาให สาหรบ 2 โตะ 1. กระดาษกรองซงปราศจากเชอรปสเหลยมผนผาขนาด 1 x 6 ซ.ม. 10 แผน 2. แอนตทอกซน ดปทเรย ความเขมขน 1,000 I.U./มลลลตร 2 มลลลตร สาหรบ 1 โตะ 1. C. diphtheriae ทสามารถสราง ทอกซน ดปทเรย ได (positive control) 1 จาน 2. Corynebacterium species ทไมสามารถสราง ทอกซน ดปทเรยได (negative control) 1 จาน 3. “UNKNOWN” Corynebacterium species ซงไมทราบวาสามารถสรางทอกซนดปทเรย ไดหรอไม 1 จาน สาหรบ 1 กลม

1. Elek’s agar (10 มลลลตร) 1 หลอด 2. เพลตเปลาปราศจากเชอทม sterile bovine serum อย 2 มลลลตร 1 จาน สงทใหปฏบต 1. ทาการทดสอบหา C. diphtheriae ทสราง ทอกซน ดปทเรย จากเชอ unknown ทไดรบ 2. ตอบคาถามทายบท วธปฏบต

1. ทา Elek agar ใหละลายและอนไวทอณหภมประมาณ 45-50 องศาเซลเซยส 2. เท Elek agar ลงในเพลตเปลา ทม sterile bovine serum 2 มลลลตร 3. แกวงเพลต เบา ๆ หลาย ๆ ครงเพอใหเซรม และวน ผสมกนทวทงไวจนอาหารเลยงเชอเกอบแขง 4. เอาไมคบ (forcep) คบกระดาษกรองทปราศจากเชอ จมลงใน แอนตทอกซน โดยใหแผนกระดาษเปยกพอ

หมาด ๆ 5. นากระดาษกรองซงซบ แอนตทอกซน วางลงบน Elek agar ทเกอบจะแขงกดเลกนอยเพอใหแผนกระดาษอย

ใตวนเลกนอย 6. ทงไวสกพกหนงใหผวหนาของอาหารเลยงเชอแหง 7. ขดเชอทตองการทดสอบลงบนอาหารเลยงเชอดงกลาว พรอมทงเชอทใชเปน positive และ negative control

โดยใหรอยขดตงฉากกบกระดาษแตไมทบแผนกระดาษ

107

8. นาไปบมไวท 37 องศาเซลเซยส นาน 24-48 ชวโมง 9. ดตะกอน (precipitation line) ทเกดขน หากมแสดงวาเชอทบมทงไวสามารถสราง ทอกซน ดปทเรยได (ดง

รป) คาถาม 1. จงบอกสวนผสมของ Elek agar 2. ทาไมจงตองม positive control และ negative control strains

©©©©©©©©

108

ปฏบตการท 7 การศกษาคณสมบตของ Gram Positive Bacilli

วตถประสงค

1. อธบายลกษณะทาง microscopic ของเชอ gram positive bacilli ได 2. จาแนกชนดของ gram positive bacilli บางชนดทสามารถเจรญบนอาหารพเศษได 3. เขาใจและอธบายหลกการของปฏกรยาชวเคมทเกยวของในการพสจนชนดของเชอแบคทเรยในกลม gram

positive bacilli ไดถกตอง การทดลองท1 : ลกษณะโคโลนของเชอ Gram positive bacilli หลกการ

เชอในกลม Gram posotive bacilli ทกอโรคในคนและสตว มหลาย genus ทนามาใหศกษานเปนเพยงสวนหนงเทานน ลกษณะโคโลนและการเปลยนแปลงของอาหารรอบโคโลนบนอาหารชนดตางๆของเชอบางชนด มลกษณะเฉพาะและใชประกอบการพสจนชนดเชอได วธท า

ใหนกศกษาสงเกตลกษณะโคโลนของเชอแลวบนทกผล ผลการทดลอง

เชอ ลกษณะโคโลน

Corynebacterium. diphtheriae

Diphtheroides

Bacillus spp. การทดลองท 2 ลกษณะทาง microscopic ของเชอ Gram positive bacilli หลกการ

ในการศกษาลกษณะทาง microscopic ของเชอ Gram positive bacilli นน ใชการยอมเชอดวย Gram stain แลวตรวจดรปราง การตดส การเรยงตวของเชอ และสาหรบเชอทสราง spore ได จะเหนบรเวณทเปน spore ไมตดส วธทา

ใหยอมเชอดวย Gram stain แลวบนทกผล

109

ผลการทดลอง

เชอ ลกษณะทาง Microscopic

C. diphtheriae

Diphtheroides

Bacillus spp

การทดลองท 3 การพสจนชนดของเชอ Corynebacterium spp. หลกการ

คณสมบตในการ ferment นาตาลของเชอใน genus Corynebacterium จะเหนไดเมอเพาะเลยงเชอใน Cystine Tryptic Agar (CTA) base ทเตมนาตาลแตละชนดทตองการทดสอบลงไป ใน CTA base ม phenol red เปน pH indicator ซงใน uninoculated medium จะมสชมพอมสม หากเชอ ferment นาตาลชนดทใชทดสอบไดผลตผลสดทายเปนกรด สของ phenol red จะเปลยนเปนสเหลองและหากเชอใชนาตาลชนดนนไมได แตเจรญอยไดโดยอาศยกรดอะมโนในอาหารแทนจะไดผลตผลสดทายเปนดาง สของ phenol red ในอาหาร จะเปลยนเปนสชมพอมสม วธทา

1. ใช steriled inoculating needle เขยเชอทตองการทดสอบ แทงลงตรงๆใหลกเกอบถงกนหลอดของ CTA-glucose, sucrose, lactose และ maltose

2. นาไป incubate ท37oC 18-24 ชวโมง แลวอานผล การแปลผล

ผลบวก คอ อาหารเปลยนเปนสเหลอง ผลลบ คอ สของอาหารคงเดมหรอเปลยนเปนสชมพสม

ผลการทดลอง

เชอ ผลการทดลอง

CTA glucose CTA sucrose CTA lactose CTA maltose C. diphtheriae

Diphteroides

3.2 Elek’s Test

หลกการ เปนการทดสอบ toxigenic strain ของเชอ Corynebacterium diphtheriae โดยการขดเชอทตองการทดสอบ

ใหตงฉากกบกระดาษชบ Diphtheria antitoxin ซงวางอยในอาหารทม rabbit serum และ potassium tellurite เปน

110

องคประกอบ หากเชอททดสอบผลต Diphtheria toxin ได toxin จะ diffuse ออกมาจากบรเวณทเชอเจรญ ในขณะเดยวกน antitoxin กจะ diffuse ออกมาจากกระดาษทชบ antitoxin ไว เมอ toxin และ antitoxin ตาง diffuse มาพบกนจะทาปฏกรยาได precipretation product เหนเปนแนวสขาวขนในอาหาร (precipretin line) การแปลผล

ผลบวก คอ เหน precipretin line ทามม 45oC กบแนวกระดาษกรอง ผลลบ คอ ไมม precipretation เกดขน

ผลการทดลอง การเกด Precipretin line ใหวาดตามทเหน

©©©©©©©©

111

ปฏบตการท 8 FAMILY ENTEROBACTERIACEAE

วตถประสงค 1. จาแนกชนดของเชอในแฟมมล Enterobacteriacese ไดอยางถกตองและรวดเรวถงระดบสกล 2. อธบายถง การเกดโรค ของเชอในแฟมมลนได ปฏบตการท 1 ลกษณะของแบคทเรยในแฟมมล Enterobacteriaceae บนอาหารเลยงเชอชนดตาง ๆ สงทใหปฏบต บนทกลกษณะโคโลนของเชอในแฟมมล Enterobacteriaceae ทตงแสดงไว ปฏบตการท 2 การแยกและจาแนกชนดเชอในแฟมมล Enterobacteriaceae สงทจดหาให สาหรบ 1 กลม 1. “UNKNOWN” broth culture 1 หลอด 2. MacConkey agar plate 1 หลอด 3. TSI 1 หลอด 4. Indole test medium 1 หลอด 5. MR-VP medium 1 หลอด 6. Citrate medium 1 หลอด 7. Urease test medium 1 หลอด 8. Malonate-P.D. medium 1 หลอด 9. LD/OD media 1 หลอด 10. Motility test medium 1 หลอด สงทใหปฏบต

1. ศกษาและบนทกลกษณะโคโลนของแบคทเรยในแฟมมลบนอาหารเลยงเชอชนดตาง ๆ ซงตงแสดงไวใหคอ Blood agar (เปรยบเทยบกบ Staphylococci), MacConkey agar, Eosin methylene blue agar (EMB) และ Salmonella Shigella agar (SS-agar)

2. แยกและจาแนกชนดของแบคทเรยใน “UNKNOWN” broth culture จนถงระดบสกล 3. ตอบคาถามทายบททกขอ

112

วธการปฏบต การแยกและจาแนกชนดของแบคทเรยใน “UNKNOWN” broth culture ใหปฏบตตามหลกการปฏบตสาหรบการแยกและจาแนกชนดแบคทเรย โดยใช MacConkey agar plate เปนอาหารสาหรบการแยกเชอ คาถาม

1. ลกษณะสาคญทโคโลนของเชอในแฟมมล Enterobactoriaceae ตางจาก Staphylococci มอะไรบาง 2. Enterobacteriaceae ทใหโคโลนสชมพบน MacConkey agar มเชออะไรบาง 3. จงบอกลกษณะเฉพาะของโคโลนของ E. coli บน EMB agar 4. จงเขยนแผนภมแสดงการจาแนก เชอในแฟมมล Enterobacteriaceae (ถงระดบสกล)

©©©©©©©©

113

ปฏบตการท 9 FAMILY ENTEROBACTERIACEAE

ตอนท 2

สกล ESCHERICHIA, SHIGELLA, EDWARDSIELLA วตถประสงค

1. แยกและจาแนกชนดแบคทเรยในสกล Escherichia, Shigella และ Edwardsiella จนถงระดบชนดไดอยางถกตองและรวดเรว

2. มความเขาใจและสามารถทาการตรวจหา serotypes ของแบคทเรยในสกล Shigella และ Escherichia ได 3. สามารถอธบายถงความสาคญทางการแพทยของแบคทเรยทง 3 สกล นได

ปฏบตการท 1 ลกษณะบางประการของเชอในสกล Escherichia และ Edwardsiella สงทใหปฏบต บนทกลกษณะของเชอในสกล Escherichia และ Edwardsiella ทตงแสดงไวใหทงลกษณะบนอาหารเลยงเชอ ตาง ๆ และปฏกรยาทางชวเคมบางชนด ปฏบตการท 2 การแยกและจาแนกชนดของแบคทเรยในสกล Escherichia, shigella และ Edwardsiella สงทจดท าให สาหรบ 1 กลม 1. “UNKNOWN” broth culture 1 หลอด 2. MacConkey agar plate 1 จาน 3. SS agar plate 1 จาน 4. TSI 2 หลอด 5. Indole test medium 2 หลอด 6. MR-VP medium 4 หลอด 7. Citrate medium 2 หลอด 8. Urease test medium 2 หลอด 9. Motility test medium 2 หลอด 10. Malonate test medium 2 หลอด 11. PD medium 2 หลอด 12. LD medium 2 หลอด 13. Mannitol broth 2 หลอด 14. Glucose broth 2 หลอด 15. Tryptic soy broth (TSB) 2 หลอด

114

สงทใหปฏบต 1. ศกษาและบนทกลกษณะของแบคทเรยตาง ๆ ทตงแสดงไวทงลกษณะโคโลนและคณสมบตทางชวเคม 2. แยกและจาแนกชนดของแบคทเรยใน “UNKNOWN” broth culture จนถงระดบชนด โดยใช MacConkey agar

plate เปนอาหารสาหรบแยกเชอ 3. ตอบคาถามทายบท

วธการปฏบต ดจากหลกการปฏบตสาหรบการแยกและจาแนกชนดของแบคทเรย โดยใช MacConkey agar และ SS agar เปน

อาหารสาหรบแยกเชอ ปฏบตการท 3 การตรวจหา Species ของ Shigella species โดยการใชปฏกรยาทางนาเหลอง สงทจดหาให

1. Shigella species บน MacConkey agar plate (หมายเลข 1-4) 4 จาน 2. สไลดแกวสะอาดปราศจากไขมน 3. นาเหลองของกระตายทม antibodies ตอ Shigella dysenteriae (group A) 1 ขวด, Shigella flexneri (group B) 1

ขวด, Shigella boudii (group C) 1 ขวด, Shigella sonnei (group D) 1 ขวด และ polyvalent antiserum ตอ Shigella ทก species 1 ขวด สงทใหปฏบต

ทาการตรวจหาชนดของ Shigella species บน MacConkey agar plate ซงเตรยมไวใหและรายงานผลการตรวจ วธการปฏบต

1. หยดนาเกลอ ลงบนสไสด 2 หยด หางกนประมาณ 2.5-3 ชวโมง 2. ใชเขมเขยเชอหรอลฟ เขยโคโลนเพยงโคโลนเดยวบน MacConkey agar plate จานใดจานหนงใน 1 จานเพยง

จานเดยว, จดหมายเลขของแบคทเรยไว 3. ผสมเชอทเขยมาลงในนาเกลอ บนสไลดจนไดเนอเดยวกน 4. เผา ลฟ(ทเตรยมไวให) รอจนเยนจมลงในแอนตเซรน ตกแอนตเซรม ขนมา 1 ลฟ แลวนามาผสมกบแบคทเรย

บนสไลด เกลยใหเปนวงกลมเสนผาศนยกลางประมาณ 1.5 เซนตเมตร สาหรบแบคทเรยอกขางหนงใชเปน “negative control” โดยใหใชวธการเดยวกน แตใชนาเกลอแทนแอนตเซรม

5. เขยา สไลดดวยความเรวพอสมควรประมาณ 30 วนาท แลวสงเกตการจบกลมกนของแบคทเรย โดยดเทยบกบ “negative control” หากมการจบกลมในวงทผสมแอนตเซรม และไมมการจบกลมในวงทเปน “negative control” ใหอานผลเปน “+”

6. ทาการตรวจทละชนโดยเรมดวย polyvalent antiserum หากไดผลบวก จงคอยทาตอไปโดยทาซาชนท 1-5 ใหมแตเปลยนชนดของแอนตเซรม ไปเรอย ๆ

7.รายงานผลการตรวจชนดของแบคทเรย โดยการใชปฏกรยาทางนาเหลอง คาถาม

1. E. coli สามารถเจรญบน SS agar ไดหรอไม ถาเจรญไดจะใหโคโลนสอะไร

115

2. บอกลกษณะสาคญทใชแยกระหวาง E. coli และ Shigella sonnei 3. บอกการทดสอบทางชวเคมทมประโยชนในการแยกชนดของ Shigella spp.

©©©©©©©©

116

ปฏบตการท 10 FAMILY ENTEROBACTERIACEAE

ตอนท 3

สกล SALMONELLA , ARIZONA , CITROBACTER

วตถประสงค

1. แยกและจาแนกชนดของแบคทเรยใน สกล Salmonella , Arizona และ Citrobacter ไดจนถงระดบชนด อยางถกตองและรวดเรว

2. มความเขาใจและสามารถทาการตรวจ serotypes ของแบคทเรยใน สกล salmonella ได 3. สามารถอธบายถงความสาคญทางการแพทยของแบคทเรยทง 3 กลม ได

ปฏบตการท 1 ลกษณะยางประการของเชอ สกล Salmonella

สงทใหปฏบตการ บนทกลกษณะของเชอใน สกล Salmonella ซงตงแสดงไว

ปฏบตการท 2 การแยกและจาแนกชนดแบคทเรยใน สกล Salmonella , Arizona , Citrobacter

สงทจดหาให นศ. :สาหรบ 1 กลม 1. “UNKNOWN” broth culture 1 หลอด

2. MacConkey agar plate 1 จาน 3. SS- agar plate 1 จาน 4. TSI 2 หลอด 5. Indole test medium 2 หลอด 6. MR – VP test medium 2 หลอด 7. Citrate medium 2 หลอด 8. Motility test medium 2 หลอด 9. Urease test medium 2 หลอด 10. Malonate medium 2 หลอด 11. PD medium 2 หลอด 12. LD medium 2 หลอด 13. OD medium 2 หลอด 14. KCN test medium 2 หลอด 15. KCN control medium 2 หลอด 16. Tryptic soy broth (TSG) 2 หลอด

117

สงทใหปฏบต 1. แยกและจาแนกชนด แบคทเรยใน “UNKNOWN” broth culture จนถงระดบชนด โดยใช MacConkey agar

plate เปนอาหารในการแยกเชอ 2. ตอบคาถามทายบท

วธปฏบต ดจากหลกการปฏบต สาหรบการแยกและจาแนกชนด แบคทเรย โดยใช MacConkey agar และ SS-agar เปน

อาหารสาหรบแยกเชอ คาถาม

1. อาหารเลยงเชอ ซงใชในการแยกเชอ Salmonella species มอะไรบาง แตละชนดมประโยชนอยางไร 2. จงเขยนตารางแสดงปฏกรยาทางชวเคม ทใชแยกระหวาง S. typhi และ S. enteritidis bioserotype paratyphi A 3. จงเขยนแผนผงแสดงการวนจฉยแบคทเรย ซงอยใน สกล Salmonella จนถงระดบชนด

©©©©©©©©

118

ปฏบตการท 11 FAMILY ENTEROBACTERIACEAE

ตอนท 4

สกล KLEBSIELLA , PROTEUS , YERSINIA วตถประสงค

1. แยกและจาแนกชนดแบคทเรยใน สกล Klebsiella, Proteus และ yersinia ไดจนถงระดบชนด อยางถกตองและรวดเรว

2. สามารถอธบายถงความสาคญทางการแพทยของแบคทเรยใน ทง 3 สกล ได ปฏบตการท 1 ลกษณะบางประการของเชอใน สกล Klebsiella , Proteus และ Yersinia สงทใหปฏบตการ บนทกลกษณะของเชอทตงแสดงไวทงลกษณะโคโลนบนอาหารเลยงเชอชนดตางๆ และปฏกรยาทางชวเคมบางประการ ปฏบตการท 2

การแยก identify แบคทเรยในสกล Klebsiella , Proteus และ Yersinia สงทจดหาให : สาหรบ 1 กลม

1. “UNKNOWN” broth culture 1 หลอด 2. MacConkey agar plate 1 จาน 3. TSI 2 หลอด 4. Indole test medium 2 หลอด 5. MR – VP test medium 4 หลอด 6. Citrate medium 2 หลอด 7. Motility test medium 2 หลอด 8. Urease test medium 2 หลอด 9. Malonate- PD medium 2 หลอด 10. LD medium 2 หลอด 11. OD medium 2 หลอด 12. KCN test medium 2 หลอด 13. KCN control medium 2 หลอด 14. Tryptic soy broth (TSB) 2 หลอด

119

สงทใหปฏบต 1. ศกษาและบนทกลกษณะของแบคทเรยตาง ๆ ทตงแสดงไว 2. แยกและจาแนกชนด แบคทเรยใน “UNKNOWN” broth culture จนถงระดบชนด โดยใช MacConkey

agar plate เปนอาหารในการแยกเชอ 3. ตอบคาถามทายบท

วธปฏบต ดจากหลกการปฏบต สาหรบการแยกและจาแนกชนด แบคทเรย

คาถาม 1. ลกษณะเฉพาะของโคโลน Klebsiella species เปนอยางไร 2. บอกลกษณะทใชแยกระหวาง Klebsiella species และ Enterobacter species 3. เขยนแผนผงแสดงการแยกชนดของ Klebsiella species 4. จงเขยนแผนผงแสดงการแยกชนดของ Enterobacter species 5. จงเขยนแผนผงแสดงการแยกชนดระหวาง Providencia species และ Shigella species 6. เขยนแผนผงแสดงการแยกระหวางชนดตางๆ ของ Proteus species , Providencia species และ

Morganella species 7. เขยนแผนผงแสดงการแยกชนดของ Yersinia species

©©©©©©©©

120

ปฏบตการท 12 FAMILY VIBRIONACEAE AND GENUS CAMPYLOBACTER

วตถประสงค 1. แยกและจาแนกชนด แบคทเรยใน Vibrionaceae ไดอยางถกตองรวดเรว

2. สามารถบอกความแตกตางทสาคญระหวางแฟมมล Vibrionaceae และ แฟมมล Enterobacteriacese ได 3. มความเขาใจเกยวกบการแยกและจาแนกชนดแบคทเรย Campylobacter species จากสงสงตรวจ

ปฏบตการท 1 ลกษณะบางประการของแบคทเรยใน แฟมมล Vibrionaceae สงทใหปฏบตการ

ศกษาลกษณะโคโลน และปฏกรยาทางชวเคมบางประการของแบคทเรยใน แฟมมล Vibrionaceae ซงตงแสดงไว ปฏบตการท 2 การแยกและจาแนกชนด แบคทเรยใน แฟมมล Vibrionaceae สงทจดหาให : สาหรบ 1 กลม

1. “UNKNOWN” broth culture 1 หลอด 2. Blood agar plate 1 จาน 3. MacConkey agar plate 1 จาน 4. TCBS agar plate 1 จาน 5. อาหารสาหรบทดสอบแบคทเรยแกรมลบ ลกษณะแทง ไมใหเอนไซมออกซเดส (Oxidase)

(อยางละ 1 หลอด) ไดแก TSI , Indole , MR – VP medium (2 หลอด), ID, OD, Urease, Motility test mekium, Malonate – P.D. medium , Citrate medium

6. อาหารสาหรบทดสอบแบคทเรยแกรมลบลกษณะแหงไมใหเอนไซมออกซเดส (Oxidase) (อยางละ 1 หลอด) ไดแก TSI , Indole , MR – VP medium ( 2 หลอด) , citrate medium , mannitol, ID / OD /AD/ Control, ID, OD, AD, Glucose O/F medium (2 หลอด) Lactose broth, sucrose broth, salicin broth, tryptic soy broth , motility test medium อาหารสาหรบทดสอบในขอ 6 ทกลาวมานทงหมดเดม NaC1ลงไป 1% นอกจากนนยงม peptone water + 0% NaC1 , peptone water + 8% NaC1 และ peptone water + 10% NaC1 อยางละ 1 หลอด สงทใหปฏบต

1. ศกษาลกษณะโคโลนของแบคทเรยทตงแสดงไว คอ แบคทเรย แฟมมล Vibrionaceae บนอาหารเลยงเชอชนดตาง ๆ คอ Blood agar , MacConkey agar , TCBS agar เปรยบเทยบกบ แฟมมล Enterobacte-riacese

121

2. แยกและจาแนกชนดของแบคทเรยทกชนดทพบใน “UNKNOWN” โดยใช blood agar plate, MacConkey agar plate และ TCBS plate เปนอาหารเลยงเชอในการแยก วธปฏบต ดจากหลกการปฏบต สาหรบการแยกและจาแนกชนด แบคทเรย ปฏบตการท 3 ลกษณะทสาคญบางประการของ Campylobacter jejuni สงทใหปฏบต ศกษาลกษณะโคโลน , รปรางทางกลองจลทรรศนและลกษณะอน ๆ ของ C. jejuni ซงตงแสดงไว ปฎบตการท 4 ลกษณะ macroscopic และ salt tolerant

Growth on

Organisms Mac Conkey TCBS

NaCl

(0%) (8%)

V. cholerae

V. parahaemolyticus

Aeromonas

Plesiomonas

การทดสอบทางชวเคม (Biochemical test)

Organisms Oxidase TSI Urea Citrae MIL Decarboxylase

Motile Indole Lysine OD LD AD

V. cholerae

V. parahaemolyticus

Aeromonas

Plesiomonas

122

คาถาม 1. ลกษณะแตกตางระหวาง แฟมมล Vibrionaceae และ Enterobacteriacese ทเหนชด ๆ คออะไรบาง 2. TCBS ใชเพออะไร และเหตใดจงตองใช TCBS agar ดวยนอกเหนอจาก MacConkey agar แลว 3. Alkaline peptonw water ใชสาหรบทาอะไร 4. Halophilic bacteria หมายถงอะไร 5. Oxidase test positive และ negative ใหสอะไร พรอมยกตวอยางเชอทใหOxidase test negative และตวอยาง

เชอทให Oxidase test negative อยางละ 3 เชอ 6. V. cholerae O1 มก biotype ไดแกอะไรบาง และรไดอยางไรวาเปน O1 7. Aeromonas และ Plesiomonas แยกจาก Vibrio ไดเนองจากไมขนบนอาหารเลยงเชอใด 8. Aeromonas และ Plesiomonas แยกจากกนดวย Biochemical test ชนดใดบาง 9. Campylobacter jejuni มลกษณะ Gram stain เปนเชนไร เนองจากอะไร 10. เชอใดเปนเชอทขนไดดท 42 0C และ 5-10% CO2 11. Helicobacter pylori เปนสาเหตของโรค และใชสงสงตรวจทใชในการตรวจวนฉย ซงใหผล urease เปนเชน

ไร 12. จงเขยนแผนผงอยางสงเขปแสดงการแยก สกล และ ชนดตาง ๆ ใน แฟมมล Vibrionaceae

©©©©©©©©

123

ปฏบตการท 13 GRAM NEGATIVE COCCOBACILLARY FACULTATIVE BACTERIA

ปฏบตการท 1 การแสดงลกษณะบางประการของ Hemophilus species และ Bordetella pertussis สงทใหปฏบต ศกษาลกษณะของ Haemophilus species และ B. pertussis ทตงแสดงไวใหและบนทกไว ปฏบตการท 2 การแยกและจาแนกชนดของ Haemophilus species สงทจดหาใหสาหรบ 1 กลม

1. “UNKNOWN” broth culture 1 หลอด 2. Blood agar plate 2 จาน 3. X – factor disk 1 แผน 4. V – Factor disk 1 แผน 5. XV – factor disk 1 แผน 6. S. aureus (ใน TSA slant) 1 หลอด

สงทใหปฏบต 1. แยกและจาแนกชนด Haemophilus species ใน “UNKNOWN” โดยใช blood agar plate 2. การจาแนกชนดใช X. V. XV factor disk และใช S. aureus ในการ satellite phenomenon 3. ตอบคาถามทายบท

วธปฏบต 1. การทดสอบความตองการ X. V. XV. Factor (S)

1.1 ขดเชอทตองการทดสอบลงบน blood agar ใหถ ๆ 1.2 วง X , V และ XV, factor disk ลงบนจานอาหารเลยงเชอ 1.3 บมไวท 37 องศาเซลเซยสเบนเวลา 18 – 24 ช.ม. 1.4 สงเกตโคโลนทเกดขนรอบ disk แตละแผนวามโคโนลขนไดกรอบ disk แผนใด (ซงถอวาให

ผลบวก) 2. “Satellite phenomenon”

2.1 ขดเชอทตองการทดสอบลงบน blood agar plate 2.2 ขดเชอ S. aureus ลงในตงฉากกบแนว ขดเชอชนดแรก 2.3 บมไวท 37 องศาเซลเซยสเบนเวลา 18 – 24 ช.ม.

124

2.4 ดผลการเจรญของเชอทสงสยรอบโคโลนของ S.aureus หากมโคโลนทเจรญเตบโตไดดรอบ S. aureus มากกวาทอน ๆ นน คอ เชอทนามาทาการทดสอบใหผลบวก สาหรบ satellite phenomenon (ดงรป)

ค าถาม

1.จงอธบายการเกด satellite phenomenon 2.นอกจาก S. aureus แลวม microorganisms ใดอกหรอไมทสามารถทาใหเกด satellite phenomenon กบ

Haemophilus species 3.หากนาเชอทสงสยมาทา satellite phenomenon กบ S. aureus แลวไดผลบวก เชอทสงสยทจะตองอยในสกล

Haemophilus เสมอไปหรอไม

©©©©©©©©

125

ปฏบตการท 14 GENUS MYCOBACTERIUM

วตถประสงค

1. เพอไดเรยนรถงลกษณะตาง ๆ ของ Mycobacterium species โดยเฉพาะ M. tuberculosis และการ ทดสอบตางๆ บางชนด

2. เพอสามารถตรวจหาและรายงานผลการตรวจหา Mycobacterium species ในเสมหะของผปวยได อยางถกตอง ตลอดจนทราบถงจดทควรระวงตาง ๆ ปฏบตการท 1 การแสดงลกษณะบางประการของ Mycobacterium species สงทใหปฏบต ศกษาลกษณะตาง ๆ ของ Mycobacterium species ทงดวยตาเปลาและจากกลองจลทรรศน และบนทกผลลงในกระดาษบนทกผล ปฏบตการท 2 การตรวจเสมหะของผปวย เพอหา acid fast bacilli (AFB) สงทจดหาให สไลดซงปายเสมหะของผปวยเอาไวและอบดวยฟอรมาดไฮด (Formaldehyde) แลว 1 แผน ตอ 1 คน สงทใหปฏบต

1. ยอมสไลดซงไดรบโดยใชวธการยอม acid fast ตามวธของ Kinyoun 2. ดสไลด ซงยอมแลวและรายงานผลทพบลงในกระดาษบนทกผล

ค าถาม 1.ในการตรวจเสมหะของผปวยเพอหา acid fast bacilli นน มปจจยใดบาง ซงตองระมดระวง เพอไมใหเกด

ผลบวกหรอลบปลอม 2.การตรวจดวยกลองจลทรรศนนนมวธอนหรอไมนอกจากการยอม โดยวธของ Ziehl-Neelsen หรอ Kinyoun

หากมจงอธบายทฤษฎของวธนน 3.หากยอมไมพบเชอ acid fast bacilli ในเสมหะของผปวยกหมายถงวาผปวยไมมเชออยในปอด ใชหรอไม เพราะ

เหตใด ©©©©©©©©

126

ปฏบตการท 15 ANAEROBES

ปฏบตการท 1

การแยกเชอ anaerobes สงทจดหาให

ส าหรบ 1 โตะ 1. Anaerobic jar (พรอม palladium ทอบแลว) 1 ใบ 2. Disposable H2 , CO2 , generator envelop (GasPak) 1 ซอง

ส าหรบ 2 กลม 1. Blood agar plate สาหรบ anaerobes 1 จาน 2. Blood agar plate ธรรมดา 1 จาน 3. “UNKNOWN” broth culture 1 หลอด

สงทใหปฏบต

แยกเชอ anaerobes ใน “UNKNOWN” broth culture ใหไดเชอบรสทธ โดยใช blood agar plate เปนอาหารสาหรบแยกเชอแลวบมใน anaerobic jar วธปฏบต

1. บมเชอทตองการทดสอบลงบน blood agar plate สาหรบ anaerobes และลงบน blood agar (ธรรมดา)

2. ใส blood agar ทเพาะเชอแลวลงใน anaerobic jar 3. รอใหมจานเลยงเชอครบ 8 จานใน 1 jar เสยกอน แลวจงฉกซศองอนดเคเตอรออก แลวใสลงใน

jar โดยใหแผนกระดาษอนดเคเตอรหนออกภายนอก 4. ใหกรรกรตดสวนขนของ GasPak เตมนาลงไป 10 มลลลตร 5. รบปดฝา anaerobic jar ใชทหนบกระดาษยดใหแนน โดยใชเพยงมอหมนเทานน 6. วาง anaerobic jar ไวขางนอกตบมเชอกอน เพอศกษาปรากฏการณทเกดขน คอ

6.1 ความรอนทฝาของ anaerobic jar ใชมอแตะตรงกลางของฝาทก ๆ 1 นาท หลงจากปดฝา anaerobic jar แลว และบนทกไววา เมอใดทเรมรสกวารอนและจะรอนไปนานเทาใด 6.2 ไอนาทเกดขน สงเกตดวา เมอใดทเรมเหนไอนาเกาะอยทฝาดานในของ jar

7. หลงจากบนทกปรากฎการณในขอ 6 anaerobic jar ไปบมไวท 37 องศาเซลเซยส และหากมเวลาพอให สงเกตดวยวา เมอใดทอนดเคเตอรเปลยนเปนไมมส (นนคอ กระดาษจะมสขาว)

8. บมไว 48 ชวโมง หรอมากกวานน (จนกวาจะมปฏบตการครงตอไป)

127

9. ทาการยอมสแกรมของ unknown culture ปฏบตการท 2

การแสดงเกยวกบลกษณะบางประการของ Clostridium species สงทใหปฏบต

ศกษาลกษระโคโลนบน blood agar , ยอมสแกรมทงจาก blood agar และจากสงสงตรวจและคณสมบตทางชวเคมของ Clostridium บางชนดทตงแสดงไวใหดแลวบนทกไว ปฏบตการท 3

การจาแนกชนดของ anaerobes สงทจดหาให

ส าหรบ 1 โตะ 1. Anaerobic jar (พรอม palladium ทอบแลว) 1 ใบ 2. Disposable H2 , CO2 , generator envelop (GasPak) 1 ซอง 3. Blood agar plate 1 จาน ส าหรบ 2 กลม 1. Egg yolk agar 1 จาน 2. Gelatin plate 1 จาน 3. Blood agar plate (สาหรบ anaerobe) และ kanamycin disc 1000 ไมโครกรม/disc ส าหรบ 1 กลม 1. Litmus milk 1 หลอด 2. Peptone yeast extract broth 1 หลอด

3. Nitrate broth 1 หลอด 4. Peptone yeast extract 1 หลอด 5. Peptone yeast extract ซงมนาตาลตอไปนอยางละ 1 หลอด คอ

glucose, maltose , fructose , lactose , mannitol , rhamnose , trehalose , esculin สงทใหปฏบต

จาแนกชนด anaerobes ทแยกไดเปนเชอบรสทธแลว จากปฏบตการท 13.1 จนถงขนชนด หากสามารถทาได วธปฏบต

1. เปด anaerobic jar เพอเอาเชอทบมไวออกมาจาแนกเชอ identify 2. บมเชอลงบน blood agar plate ธรรมดาแลวบมใน candle jar (เพอตรวจสอบวาเปน strict

anaerobe หรอไม)

128

3. บมเชอลงในอาหารเลยงเชอทไดรบและยอมสแกรม 4. นาเขาบมไวใน anaerobic jar โดยวธเดยวกนในปฏบตการท 13.1 5. บมไวนาน 48 ชวโมง เปนอยางนอย จงนาออกมาอานผลตามตารางท

ปฏบตการท 4 การแสดงเกยวกบลกษณะบางประการของ non-spore forming anaerobes นอกจาก spore-forming anaerobes ซง คอ พวก clostridium species และยงม anaerobes อยอกพวกหนง คอ พวก non-spore forming anaerobes แบคทเรยกลมนมทงกรมบวกและลบ ทงพวก bacilli และ cocci ไดแก

ก. แกรมบวกลกษณะทอน ไดแก Actinomyces, Propionibacteriu, Eubacterium, Pibidobacterium และ Lactobacillus species เปนตน

ข. แกรมบวกลกษณะกลม เชน Peptococcus และ Peptostreptococcus species เปนตน ค. แกรมลบลกษณะทอน เชน Bacteroides และ Fusobacterium species เปนตน ง. แกรมลบลกษณะกลม เชน Vellonella และ Acidaninococcus species เปนตน

สงทใหปฏบต ศกษาลกษณะของ anaerobes ในกลมน ไดแก ยอมสแกรม ทงจากโคโลนและจากสงตรวจของผปวยลกษณะโคโลน เมดล การเรองแสง (สาหรบ B. melaninogenicus) และลกษณะทางชวเคมบางอยาง ซงตงแสดงไว ค าถาม 1. C. perfringens มลกษณะใดทพเศษตางจาก Clostriduium species อน 2. จงยกตวอยาง Clostriduium species ทสราง exotoxins ทมอนตรายตอมนษยมา 2 ชนด และบอกโรคทเกดจากเชอทง 2 ชนดน 3. การแยก Bacteroides species ออกจาก Fusobacterium species สามารถทาไดอยางไร หากไมใชลกษณะทางการยอมสแกรม ซงไมแนนอนนก 4. B. fragilis group มลกษณะใดสาคญบาง

©©©©©©©©

129

ภาคผนวก

การเพาะเชอแบคทเรย

เทคนคในการศกษาแบคทเรย

ลกษณะการเจรญของแบคทเรยในอาหารเลยงเชอ

การทดสอบทางชวเคมเพอตรวจวนจฉยแบคทเรย

130

การเพาะเชอแบคทเรย การนาแบคทเรยไปใส (inoculate) ในอาหารเลยงเชอเพอการเพาะเชอม 3 วธ ไดแก

1. Agar slant culture Agar slant culture เปนการเพาะเลยงแบคทเรยในอาหารเลยงเชอทบรรจในหลอดแกวและใชอาหาร

เลยงเชอทเปนอาหารแขงทวางใหมผวหนาลาดเอยง (slant) สาหรบวธการเพาะเลยงเชอมดงรปท 1 และ 2

รปท 1 ล าดบการเพาะเลยงใน agar slant ก. sterile needle ข. เขยเชอทเจรญในจานเพาะเชอ ค. sterile ปากหลอดแกวทจะนาเชอไปเพาะเลยง ง. นาเชอไปถายใสในอาหารเลยงเชอ agar slant ในหลอดแกว จ. sterile ปากหลอดแกวอกครงหนง และปดจกสาล ฉ. sterile needle เพอทาใหปราศจากเชอ (ทมา : Cappuccino and Sherman 1993 Microbiology : A Laboratory Mannual p.72)

131

รปท 2 การเจรญของแบคทเรยบน agar slant (ทมา : McKane and Kandel 1986 Microbiology p.93)

2. Agar deep culture Agar deep culture หรอ stab culture เปนการเพาะเลยงเชอแบคทเรยทคลายคลงกบ agar slant culture

เพยงแตตางกนทอาหารในหลอดแกวจะวางตงตรง เมอนาเชอมาเพาะเลยงกจะใช loop หรอ เขมเขยทมเชอแทงผานอาหารเลยงเชอจนถงกนหลอดแลวคอย ๆ ดง loop ออกมา ดงรปท 3

รปท 3 วธการท า stab culture A : นาเขมเขยเชอลนไฟเพอฆาเชอ B : เขย suspension ของเชอจากหลอดทมเชอ C : ถายเชอใสหลอดโดยใชเขมเขยเชอแทงลงไปในอาหารจนถงกนหลอด D : ลกษณะของเชอทเจรญ (ทมา : Swatek 1967 Textbook of Microbiology p.93) การเลยงเชอวธนสวนมากใชศกษาการเคลอนทหรอความตองการอากาศในการเจรญของแบคทเรย

132

3. Broth culture วธนเหมอนกบวธท 1 แตแตกตางกนทอาหารทใชเปนอาหารเหลว เมอใช loop เขยเชอมาใสใน

อาหารตองเขยา loop เพอใหเชอหลดออกไป วธนใชศกษาการใชสารอาหารตาง ๆ การเกดกาซ ฯลฯ การแยกเชอบรสทธ การแยกเชอแบคทเรยเพอใหไดเชอบรสทธมหลายวธ ดงน

1. Streak plate technique ม 2 วธ ไดแก 1.1 simple streak plate techniques ใช loop ทปราศจากเชอไปเขยเชอจาก suspension ทมเชอหลาย

ชนดผสมกนอยในหลอดแกว จากนนนามาขด (streak) บนอาหารเลยงเชอ ดงรปท 4 นาจานเพาะเชอไปบมเชอ (incubate) ทอณหภมหองหรออณหภมทเหมาะสมสาหรบการเจรญของแตละเชอ และใชเวลานานตามทตองการ

รปท 4 การขดเชอโดยวธ simple streak plate technique

1.2 cross streak plate technique จะใชเทคนคตาง ๆ เหมอนกบวธ simple streak plate technique แตตางกนเฉพาะวธการขดเทานน วธนมการขดเชอในจานเพาะเชอ ดงรปท 5 การจบ loop และจานเพาะเชอขณะขดเชอ ลกษณะของแนวขดเชอในจานเพาะเชอ

รปท 5 การขดเชอโดยวธ cross streak plate techinque

(ทมา : McKane Smith and Kandel 1986 Microbiology p.54 Smith 1981 Principles of Microbiology p.81)

133

หลกการขดเชอแบบ cross streak plate technique มดงน 1. นา loop จมเชอผสมแลวขดในแนวท 1 ใหขนานกนปดฝาจานเพาะเชอและนา loop ไปฆาเชอ 2. นา loop ทปราศจากเชอมาขดในแนวท 2 ใหขนานกน และตองใหรอยขดนตดกบแนวท 1 ปดฝาจานเพาะเชอ นา loop ไปฆาเชอ จากนนกขดดวยวธการเดยวกนจนถงแนวท 4 (รปท 4) ปดฝาจานเพาะเชอแลวบมเชอทอณหภมและเวลาทเหมาะสม เชอจะเจรญในจานเพาะเชอ ดงรปท 6

รปท 6 การเจรญของเชอในจานเพาะเชอจากการขดวธ cross streak plate technique (ทมา : McKane and Kandel 1986 Microbiology p.54)

อยางไรกตามวธ streak plate technique นอกจากทกลาวมาแลว ยงสามารถทาไดอกหลายวธ ดงรปท 7 ซงทกวธจะมหลกการพนฐานเหมอนกน แตแตกตางกนเฉพาะลกษณะการขดเทานน

รปท 7 การขดเชอโดยวธ streak plate technique แบบตาง ๆ (ทมา : Smith 1981 Principles of Microbiology p.82)

134

2. Pour plate technique การแยกเชอบรสทธแบบนมวธการดงน 1.นาอาหารเลยงเชอจานวน 3 หลอดไปหลอมใหละลาย ทงไวใหอณหภมประมาณ 45-50 องศา

เซลเซยส 2.นา loop ทปราศจากเชอจม suspension ของเชอผสมใสในอาหารเลยงเชอหลอดท 1 เขยาเพอใหเชอ

แพรกระจายทวทงหลอด 3.นา loop ทปราศจากเชอจมเชอผสมในอาหารเลยงเชอหลอดท 1 แลวใสในอาหารเลยงเชอหลอดท

2 เขยาใหเชอแพรกระจายทวทงหลอด พรอมกบนาอาหารเลยงเชอหลอดท 1 เทใสจานเพาะเชอท 1 4. นา loop ทปราศจากเชอจมเชอผสมในอาหารเลยงเชอหลอดท 2 แลวใสในอาหารเลยงเชอหลอด

ท 3 เขยาใหเชอแพรกระจายทวทงหลอด พรอมกบนาอาหารเลยงเชอหลอดท 2 และ 3 เทใสจานเพาะเชอท 2 และ 3 ตามลาดบ สาหรบลาดบการแยกเชอบรสทธดวยวธ pour plate technique ดงสรปในรปท 8

รปท 8 ล าดบการแยกเชอบรสทธวธ pour plate technique

(ทมา : Smith 1980 Microbiology and Pathology p.60)

135

เมอเทอาหารเลยงเชอในจานเพาะเชอแลวตองรบปดฝาและหมนจานเพาะเชอไปมาเพอใหอาหารกระจายทวจานเพาะเชอ นาไปบมเชอทอณหภมเหมาะสมตามเวลาทตองการ แลวตรวจผลการทดลอง ผลการแยกเชอวธนนนเชอจะเจรญในจานเพาะเชอท 1 มากทสด และนอยลงตามลาดบในจานเพาะเชอท 3 ซงจะมเชอเจรญนอยมา (รปท 9) เชอจะอยในโคโลนเดยว ๆ กระจายทวจานเพาะเชอเลอกโคโลนเดยว ๆ มาทาเปนเชอบรสทธได วธการนนอกจากจะเปนการแยกเชอบรสทธแลว ยงสามารถศกษาการเจรญในทมหรอไมมอากาศไดอกดวย ถาเชอเจรญเฉพาะบนผวหนาอาหาร แสดงวาเจรญไดดในสภาวะทมออกซเจน ถาเจรญกนจานเพาะเชอ แสดงวาเจรญไดดในสภาวะทไมมออกซเจน แตถาเจรญตากวาผวหนาอาหารลงมาเลกนอยทเรยกวา microaerophile แสดงวาเจรญไดดในสภาวะทมออกซเจนเพยงเลกนอยเทานน

รปท 9 ลกษณะการเจรญของโคโลนแบคทเรยแบบ pour plate technique (ทมา : Volk and Wheeler 1980 Basic Microbiology p.28)

3. Spread plate technique เปนการแยกเชอบรสทธทมวธการดงน

1. หยด suspension ของเชอผสม 0.1 มลลลตร ใสในจานเพาะเชอทมอาหารเลยงเชอแขง 2. ใชแทงแกวรปตว L เกลย suspension ของเชอใหแผกระจายทวผวหนาของอาหารเลยงเชอ 3. บมเชอทอณหภมหองหรออณหภมทเหมาะสมและระยะเวลาตามตองการ

สาหรบลาดบการแยกเชอบรสทธดวยวธ spread plate technique ดงสรปในรปท 10

รปท 10 ล าดบการแยกเชอบรสทธวธ spread plate technique (ทมา : Settlemire 1978 Microbiogy for Health Student p.42)

136

4. Enrichment culture technique เปนการแยกเชอแบคทเรยทตองการแตมจานวนนอยและอยปะปนกบแบคทเรยอน ๆ เนองจาก

จลนทรยและแบคทเรยตาง ๆ มจานวนมากมายและเจรญปะปนกน การทจะนามาแยกใหเปนเชอบรสทธดวยวธการดงกลาวมาแลวอาจไมไดผลนก เพราะแบคทเรยทตองการเหลานอาจมจานวนนอยและเจรญไดชา ดงนนการแยกเชอใหบรสทธจงทาไดโดยการจดสภาพแวดลอมใหเหมาะสมโดยเฉพาะดานอาหาร ในอาหารเลยงเชอตองใสสารบางอยางเพอเรงการเจรญของแบคทเรยทตองการเทานน เชน ตองการแยกแบคทเรยในดนทยอยสลาย alpha conideldrin ซงเปนสารประกอบในเนอไม ถาใช nutrient agar เปนอาหารเลยงเชอจะพบแบคทเรยนไดนอยมาและแบคทเรยอน ๆ ซงเจรญไดรวดเรวจะมจานวนมากกวา แตถาอาหารเลยงเชอประกอบดวยเกลอของสารอนนทรยตาง ๆ inorganic nitrogen source และ alpha conideldrin ซงเปนแหลงคารบอนจะมเฉพาะแบคทเรยทใช alpha conideldrin ไดเทานน สวนแบคทเรย อน ๆ ไมเจรญ จงแยกเปนเชอบรสทธได

5. Single cell isolation technique

วธนเปนการแยกเชอแบคทเรยจากเชอตาง ๆ ทผสมกนอยออกจากกนทละเซลลโดยใชเครองมอทเรยกวา micromanipulator (รปท 11) เครองมอนมปลายเรยวแหลม จมปลายนในของเหลวทมแบคทเรยในขณะทดจากกลองจลทรรศนแลวนาไปจมในอาหารเลยงเชอ เมอเชอเจรญกจะไดเชอบรสทธ

รปท 11 การแยกเชอบรสทธโดยใชเครองมอ micromanipulator ก. เครองมอ micromanipulator ข. ไดอะแกรมการแยกเชอบรสทธใหเปนเซลลเดยว

(ทมา : Pelczar and others 1986 Microbiology p.140)

137

เทคนคในการศกษาแบคทเรย เนองจากเชอแบคทเรยมขนาดเลกมากและเซลลของแบคทเรยใสเพราะความหนาแนนใกลเคยงกบนา มการหกเหของแสงนอย ดงนนการศกษาเกยวกบรปราง ลกษณะการเรยงตว หรอลกษณะพเศษอนๆ ของเชอตองมกรรมวธทชวยใหสามารถจาแนกความแตกตางของเชอแตละชนดได ซงวธทนยมใชกนอยางแพรหลายคอการยอมส (staining) สทใชยอมเชอแบคทเรยสวนใหญไดมาจากนามนดน และเวลายอมสจะเกดปฏกรยากบเซลลของเชอทาใหตดสชนดตางๆ กน แบคทเรยยอมตดส basic dye ไดดและสมาเสมอ การทมคณสมบตเปน basicphillic เนองจากม RNA จานวนมากกระจายไปทว cytoplasm ในรปของไรโบโซม สทนยมใชไดแก methylene blue, crystal violet, basic fuchsin, safranin เปนตน และเพอทจะทาใหมองเหนรปราง ลกษณะการตดสของเชอแบคทเรยไดดขนเมอนาไปดดวยกลองจลทรรศน สทใชยอมแบคทเรยเปนสสงเคราะหซงมสวนประกอบทางเคมตางกน สวนใหญจะอยในรปของเกลอ สม 2 ชนดใหญๆ โดยแบงตาม electric charge ใน ion ของส ไดแก 1. Acid dyes หรอ anionic dyes สชนดนมประจไฟฟาเปนลบ (anion) จงยอมตดไดดกบสารทมประจไฟฟา

บวก (cation) สชนดนใชยอม cytoplasm, granules และอนๆ เชน eosin (สนใชในรปของเกลอ sodium eosinate)

2. Basic dyes หรอ cationic dyes สชนดนมประจไฟฟาเปนบวกจงยอมตดไดดกบสารทมประจไฟฟาลบ สชนดนใชยอมนวเคลยสและโครมาตน (chromatin) เชน methylene blue (สนใชในรปของ methylene blue chloride)

กลไกการตดสยอมของแบคทเรย การยอมสเปนปฏกรยาการแลกเปลยนไอออน (ion) ของเซลลกบของส คอไอออนของสจะเขาไปแทนทไอออนบนสวนประกอบของเซลลจงเกดสารประกอบของเกลอออกมาและสจะตดเซลลแทน นอก จากนองคประกอบทางเคมของพวกกรดนวคลอกยงมสวนในกานเกดเกลออกดวย เปนเกลอของโซเดยมหรอโปตสเซยม เปนตน เนองจากเซลลของแบคทเรยมประจไฟฟาเปนลบ ดงนนจงดงดดไดดกบไอออนทมประจไฟฟาบวก เนองจากสทใชยอมแบคทเรยอยในรปของเกลอซงมทงประจบวกและลบอยดวยกน เมอยอมเซลลแบคทเรยทาใหเกดการแลกเปลยนประจระหวางสและเซลล เชนใช methylene blue chloride (MB+Cl-) ยอมเซลลแบคทเรยจะเกดการแลกเปลยนประจกนขน ทาใหเซลลตดสยอมของ methylene blue ดงสมการ (Bacterial cell Na+) + (MB+ Cl) (Bacterial cell MB+) + (Na+ Cl) วธการทาสเมยร (smear) 1. ถาเปน fluid culture หรอ fluid specimen หรอ swab ยกตวอยางเชนเชอทเลยงใน broth, หนอง, เสมหะ ฯลฯ ใหใช 1 loop ปายบนสไลด (slide) สะอาด ถา specimen นนสงมาเปน swab ใหใช swab ปายบนสไลด ระวงอยาให film ทปายบน สไลดหนาหรอบางเกนไป ถา

138

บางไปและ specimen นนบงเอญมเชออยคอนขางนอยจะมองไมคอยเหนแบคทเรย แตถาหนาเกนไปโดยเฉพาะเสมหะและหนองขนๆ โปรตนจะตกตะกอนบงแบคทเรยจนมองไมเหนและการตดส อาจผดพลาดจากการ decolorize ดวยแอลกอฮอลไมหมด บรเวณท สเมยรควรกวางประมาณ 1-2 ซม. ถากวางมากการ decolorize จะไมสมาเสมอทวกนทาใหตดส แตกตางกนไดใน field ทอยหางกนทาใหการตดสนผดพลาดได 2. การยอมจากโคโลน (colony) หยดนาเกลอ 1 หยดเลกๆ ลงบนสไลด ใช needle หรอ loop เขยเชอจากโคโลนมา emulsify ในหยดนาเกลอจนเปนเนอเดยวกน ถาเปนโคโลนขนาดเลกเชน streptococcus ใหใชทงโคโลน แตถาโคโลนขนาดใหญๆ ใหเขยมาเพยงบางสวนเทานน มฉะนนจะหนาแนนเกนไปจนมองไมเหนลกษณะการเรยงตว เวลา emulsify ควรระวงอยาใชความแรงมากเกนไปเพราะเชออาจกระเดนออกมาในอากาศ และการเรยงตวของแบคทเรยอาจผดไป เมอสเมยรเชอเรยบรอยแลวใหตงทงไวใหแหงเองทอณหภมหอง (air dry) แลวนาไปลนบนเปลวไฟโดยผานไปมา 3-4 ครง วธการนเรยกวา fixing มจดประสงคเพอชวยใหเซลลแบคทเรยตดแนนกบสไลดเวลายอมจะไดไมหลดออก และรกษาสภาพไมใหแบคทเรยบางชนดสลายตวหรอรปรางเปลยนแปลงไป นอกจากนนยงสามารถฆาเชอแบคทเรยดวยแตตองระวงอยาเผาใหรอนเกนไปเพราะรปรางและการตดสของแบคทเรยจะเปลยนแปลงไป เมอ fix แลวทงสไลดใหเยนกอนนาไปยอม วธการยอมสมหลายวธแลวแตวตถประสงค แบงเปน 4 วธดวยกนคอ

1. simple staining เปนการยอมสโดยใชสเพยงชนดเดยว เชน methylene blue, carbol fuchsin, gential violet, การยอมวธนจะเหนขนาด รปราง และการเรยงตวของแบคทเรยซงจะตดสตามสทยอม การยอมวธนมประโยชนไมมากนก สวนใหญจะใชควบคกบ differential staining (Gram stain) เพอศกษารปรางและลกษณะของแบคทเรยใหชดเจนขน เชน การวนจฉยโรคหนองใน โรคเยอหมสมองอกเสบจากเชอ Neisseria meningitidis มกนยมยอมสแกรมควบคกบ methylene blue จะชวยใหดรปรางเชอกอ-โรคไดชดเจนขน 2. Differential staining เปนการยอมสทสาคญและนยมกนมากทสด การยอมมหลายขนตอนและเปนการยอมทใชสมากกวา 1 ส วธนนอกจากเหนรปรางและการเรยงตวของแบคทเรยแลวยงสามารถจาแนกเชอตอไปไดอกเนองจากการตดสทแตกตางกน วธนมประโยชนมากในการพสจนแยกเชอแบคทเรยกอโรค Differential staining ทนยมใชม 2 วธ คอ 2.1 การยอมสแบบแกรม (Gram stain) ซงคดคนโดยนกจลชววทยาชาวเดนมารก คอ Christian Gram ในป ค.ศ. 1883 เปนการยอมสมากกวา 1 สโดยอาศยนายาลางส (decolorize) รวมดวย เปนวธทนยมใชมากทสด วธนสามารถแบงแบคทเรยออกเปน 2 พวก

139

คอ แกรมบวก (Gram positive)-ตดสนาเงนหรอสมวง แกรมลบ (Gram negative)- ตดสแดง มหลกการโดยสงเขปดงนคอ ทาใหเซลลตดแนนกบสไลดโดยใชความรอนแลวยอมดวยส Basic เชน methyl violet (หรอ gentian หรอ crystal violet) และม iodine-potassium iodide solution เปน mordant (ทาใหสตดแนน) แลวแบคทเรยจะตดสนาเงนของ methyl violet-iodine complex ภายในเซลล เมอลางดวยแอลกอฮอล (หรอผสม acetone) ซงเรยกวาการ decolorize เนองจากแบคทเรยทง 2 พวกนมสวนประกอบของ cell wall แตกตางกนทาใหมความทนทานตอการลางดวยแอลกอฮอลแตกตางกน โดยท cell wall ของแบคทเรยแกรมลบมสารไขมนในปรมาณสงทาใหแอลกอฮอลสามารถลาง dye complex สนาเงนภายใยเซลลใหหลดออก เมอ counterstain ดวยสแดงของ safranin จงตดสแดงตอไป สวน cell wall ของแบคทเรยแกรมบวกมสารไขมนนอยมากหรอไมมเลยทาใหแอลกอฮอลไมสามารถลาง dye complex ใหหลดออก เมอ counter stain ดวย safranin จงไมตดสแดงแตยงคงตดสนาเงนของ dye complex เดมอย Gram-variable หมายถงการทเชอชนดเดยวกนตดทงสแกรมบวกและแกรมลบบนสไลดเดยวกน สวนใหญเกดจากเทคนคการยอมทไมถกตอง เชน decolorize ไมสมาเสมอ, สเมยรหนาเกนไป, ใช old culture ของแกรมบวก (cell แกของแกรมบวกจะสญเสยคณสมบตการ retain dye complex) Gram-variables ทพบในธรรมชาตคอ Gardnerella vaginalis ซงทาใหเกดโรค nonspecific vaginitis และ Brahamella (Neisseria) catarrhalis ซงเปน normal flora ในลาคอ นอกจากนนยงม Gram-nonreactive ซงรวมเชอทไมสามารถยอมไดหรอยอมไดนอย เชน พวกเชอ spirochetes ขนตอนของการยอมสแกรมมดงน 1. smear เชอแบคทเรยลงบนแผน slide ตงทงไวใหแหงทอณหภมหอง (air dry) แลวนาไปผานเปลวไฟ 2-3 ครง

เพอ fix ใหเชอตดแนนกบ slide แลวตงทงไวใหเยน 2. ราดทบดวยส crystal violet ใหทวมรอย smear เปนเวลา 1 นาท 3. ลางออกดวยนาประปา (เปดนาไหลผานรอย smear เบาๆ ) แลวราดทบดวย Gram’s iodine solution ใหทวม

smear เปนเวลาอก 1 นาท 4. ลางออกดวยนาประปา แลวราดรอย smear ดวย decolorize (95% ethyl alcohol) เปนเวลา 5-10 วนาท 5. ลางออกดวยนาประปาแลวยอมสซา (counterstain) ดวยส safranin เปนเวลา 10 วนาทจงลางออกดวย

นาประปา ปลอยใหแหง สองดดวยกลองจลทรรศนโดยใช oil immersion lens (กาลงขยาย 100X) เชอแกรมบวกจะตดสมวงของ crystal violet สวนเชอแกรมลบจะตดสแดงของ safranin

140

กลไกของการตดสยอมแกรม 1. จากขนตอนท 2 พบวาเชอแบคทเรยทง 2 กลมจะตดสมวงของ crystal violet 2. หลงจาก fix ดวย iodine จะเกดการ form complex ระหวาง crystal violet และ iodine complex ขนทผนง

เซลล ซง complex นจะยดเกาะตดแนนกบผนงเซลลของแกรมบวกมากกวาแกรมลบ ทงนเพราะผนงเซลลของเชอแกรมบวกจะหนากวาของแกรมลบจงท าใหกก complex ไวไดดกวา

3. complex ทผนงเซลลของแกรมลบจะหลดออกไดงายเมอถกลางดวย decolorizeer (lipid solvent) ในขณะท comlex ทผนงเซลลของเชอแกรมบวกยงคงยดตดอย ทงนเพราะผนงเซลลของแกรมลบคอนขาง permeable ยอมใหสารละลายตางๆ ผานเขาออกไดงาย อกทง complex ยดกบผนงเซลลอยางหลวมๆ และผนงเซลลของเชอแกรมลบยงมสารพวก lipid อยดวยจงถกลางออกไดโดย lipid solvent สวนผนงเซลลของเชอแกรมบวกคอนขาง impermeable และ complex ยดตดแนนกบผนงเซลลและยงมสวนประกอบของ lipid นอยหรอไมมเลย ฉะนนในขนตอนนเชอแกรมบวกยงคงตดสมวงแตเชอแกรมลบจะไมตดสอะไรอยเลย

4. ขนตอนสดทายพบวา เชอแกรมลบจะตดสยอม (safranin) สแดงอนใหมได ในขณะทเชอ แกรมบวกจะตดสมวงอยางเกาอย

ตารางท 1 การเปลยนแปลงในการยอมสแกรมของแบคทเรยแกรมบวกและแกรมลบ

สและน ายาทใช ปฏกรยาทเกดขนกบแบคทเรย แกรมบวก แกรมลบ

Crystal violet Iodine solution Ethyl alcohol Safranin

เซลลตดสมวง crystal violet และ iodine จะตดภายในเซลล เซลลยงตดสมวง cytoplasm จะสญเสยนาจงเกดการเหยวหรอหดตวทาใหรของผน ง เ ซ ลล ม ขน าด เ ลก ท า ใ ห crystal violet-iodine complex ไมสามารถละลายออกมาไดเซลลจงตดสมวง เซลลไมทาปฏกรยากบสนจงตดสมวงตามเดม

เซลลตดสมวง crystal violet และ iodine จะตดภายในเซลล เซลลยงตดสมวง สารพวก lipid ถกทาลายออกจากผนงเซลล ทาใหรผนงเซลล มขนาดกวางขนเปนผลให crystal violet-iodine complex ละลายออกจากเซลลได เซลลตดสแดงของ safranin

การทเซลลแบคทเรยยอมตดสตางกนนขนอยกบความแตกตางในสวนประกอบและสรร-วทยาของแบคทเรยแตละชนด สาหรบความแตกตางของแบคทเรยแกรมบวกและแกรมลบแสดงดงตารางท 2

141

ตารางท 2 แสดงความแตกตางในคณสมบตและสวนประกอบของเซลลระหวางแบคทเรยแกรมบวกและแบคทเรยแกรมลบ คณสมบตและสวนประกอบของเซลล แบคทเรยแกรมบวก แบคทเรยแกรมลบ 1. ความหนาของผนงเซลล 2. mucopeptide 3. lipid 4. polysaccharide 5. mesosome 6. ชนดของสารพษ 7. ความไวตอยาปฏชวนะ

หนาแตไมซบซอน หนา นอย มาก ม exotoxin ไวคอนขางสง

บางกวาของแบคทเรยแกรมบวกแตซบซอนมากกวา บาง มาก นอย ไมมหรอมพบนอยมาก endotoxin ไวคอนขางตา

ตวอยางแบคทเรยทตดสแกรมบวกและแกรมลบ จาแนกตามรปรางและหมวดหมดงตารางท 3 ตารางท 3 แสดงแบคทเรยแกรมบวกและแกรมลบ จาแนกตามรปรางและหมวดหม

รปรางของเซลล แบคทเรยแกรมบวก แบคทเรยแกรมลบ Genus Family Genus Family

กลม (coccus) ทอนตรง (bacillus) Curved rod

Sarcina Micrococcus Micrococcaceae Staphylococcus Streptococcus Diplococcus Streptococcaceae Leuconostoc Lactobacillus Lactobacillaceae Propionibacterium Propionibacteriaceae Corynebacterium Corynebacteriaceae Bacillus Bacillaceae Clostridium

Neisseria Neisseriaceae Veilonella Escherichia Salmonella Enterobacteriaceae Shigella Azotobacter Azotobacteriaceae Rhizobium Rhizobiaceae Pseudomonas Pseudomonaceae Acenetobacter Vibrio Spirillaceae Desulfovibrio

142

ขอควรทราบเกยวกบเทคนคการยอมสแบบแกรม (Gram staining) การตดสผดไปจากทควรจะเปนเชนแกรมบวกกลายเปนแกรมลบ หรอในทางกลบกนนนเกดขนไดเสมอ ซงเกยวของกบปจจยหลายประการ เชนถา smear หนาเกนไปหรอบรเวณกวางเกนไปอาจ decolorize ไมหมดหรอไมสมาเสมอทวกน แกรมลบอาจตดเปนแกรมบวก หรอมทงบรเวณทตดสถกและผดในสไลดเดยวกนทาใหเกดการไขวเขวไมแนใจได ขนตอนททาใหการยอมสแกรมเกดการผดพลาดไดบอยคอ การ decolorize ดวยแอลกอฮอล มหลกคอใหเทแอลกอฮอลจนไมมส น ำเงนหลดออกมำอก สวนเวลาทใชอาจไมแนนอนขนกบความหนาบางของการ smear ถา smear หนาใชเวลานานกวา smear บาง ถา film หนาบางไมสมาเสมอกนให decolorize โดยถอบรเวณบางเปนหลก การพยายาม decolorize บรเวณทหนามากๆจะทาใหบรเวณทบางกลายเปน overdecolorization ซงบรเวณหนามากจะมองไมเหนเชออยแลวและไมมประโยชน อยางไรกตามขนกบความชานาญและเทคนคเปนหลกสาคญ ถาลางดวยแอลกอฮอลมากเกนไป (overdecolorization) จะทาให dye-complex ของแบคทเรยแกรมบวกอาจหลดออกมา ซงเมอ counterstain ดวยสแดง safranin กจะทาใหตดสผดเปนแกรมลบได ในทานองเดยวกนถาลางดวยแอลกอฮอลนอยเกนไป (underdecolorization) แบคทเรนแกรมลบอาจยงไมถก decolorize เมอ counterstain ดวย safranin จงไมตดสแดงของ safranin ทาใหตดสผดเปนแกรมบวก นอกจากนนแบคทเรยแกรมบวกทเปน old culture และ dead cell อาจตดสแกรมลบไดเนองจากเซลลสญเสยความสามารถในการ retain primary dye complex 2.2 Acid fast staining แบคทเรยกอโรคบางชนดยอมสแกรมไมตดเรยก Gram nonreactive ทสาคญทางการแพทยม 2 ชนด คอ Mycobacterium tuberculosis และ Mycobacterium leprae (กอโรควณโรคและโรคเรอนตามลาดบ) ตองยอมดวยวธ Acid fast staining วธแรกคอวธของ Ziel และ Neelsen เนองจากแบคทเรยทง 2 ชนดมผนงเซลล (cell wall) แตกตางจากแบคทเรยทวไป คอประกอบดวยสาร ไขมนหลายชนดทาให acid-alcohol ไมสามารถลางสแดงของ carbol fuchsin ใหหลดออก ในขณะทแบคทเรยและเซลลอนๆ ถกลางใหหมดจงสามารถตดสนาเงนของ methylene blue เมอ counterstain ในขนตอนสดทาย สวนแบคทเรยทง 2 ชนดดงกลาวขางตนยงคงตดสแดงของ carbol fuchsin จงอาจเรยกวา Acid fast bacilli (AFB) ประโยชนของการยอมสวธนคอเพอตรวจหาเชอ วณโรคเพราะทาสะดวกและรวดเรว Hot method of acid fast stain (Ziehl-Neelsen’s method) 1. หยดส Ziehl-Neelsen ใหทวมสไลด แลวใชไฟลนใตสไลดระยะหนง จนสงเกตวามควนลอยขนจงเอาไฟออก

แลวปลอยทงไวประมาณ 5 นาท ลางนา 2. decolorize ดวย acid-alcohol (alcohol ทม 3% HCl) จนไมมสทจะถกลางออกหรอจนกวาจะเหน acid-alcohol

ทลางมสชมพออนๆ เทานน ไมแดงเขมเหมอนทลางครงแรก ตามปกตจะใชเวลาประมาณ 1 นาท เทคนคในการลางควรเอยงสไลดไปมาเพอดสทถกลางออกชดเจนยงขน แลวลางออกดวยนากอกเบาๆ

3. counter stain ดวย methylene blue ประมาณ 2 นาทลางนาอกครง

143

4. ปลอยสไลดทยอมแลวนแหงเอง หรอซบใหแหงดวยกระดาษซบนาไปดดวยกลองจลทรรศน โดยใชกาลงขยายของ objective lens 100 เทา ซงตองใช oil immersion นอกจากนนยงม cold method of acid fast stain (Kinyoun’s method) ซงใชส Kinyoun แทนส Ziehl-Neelsen และไมตองลนไฟ โดยราดสนาน 5 นาทแลวทาตอเหมอนเดม

3. Negative staining เปนการยอมสเพอศกษาลกษณะรปรางของแบคทเรยโดยไมตองใชสยอม วธนทาใหสพนสไลด (back ground) เปนสดาเขม สทใชไดแก nigrosin หรอ indian ink ซงสจะไมตดเซลลแบคทเรยทาใหเหนเซลลโปรงใส สาหรบวธการยอมสมดงน โดยการเกลยเชอแบคทเรยลงบนสไลดทหยด nigrosin ไว ทงใหแหงในอากาศโดยไมตองลนไฟ นาไปตรวจดวยกลองจลทรรศน 4. การยอมพเศษอนๆ เพอศกษารายละเอยดและสวนประกอบของเซลลซงไมสามารถมองเหนไดโดยการยอมดวยวธธรรมดา เชน การยอมนวเคลยส, แฟลกเจลลา, cyst, สปอรและแคปซล การยอมนวเคลยสมวธการยอมดงน 1. ตด nutrient agar plate เปนรปสเหลยมดานเทาขนาด 1 ซม. แลวหยดเชอแบคทเรยลงไป ใชแทง-แกวรปตว L

เขยใหเชอแพรกระจายเตมจานเพาะเชอทงไว 3-4 ชวโมง 2. หยด osmic acid เขมขน 2% หรอ acetic acid ลงบนฝาจานเพาะเชอ 2-5 หยด กลบจานเพาะเชอใหสวนทม

อาหารและเชออยดานบนนาน 5 นาท เพอใหไอของกรด fix เชอ 3. เกลยเชอบน cover slip โดยกด cover slip ลงบนเชอในจานเพาะเชอ ยก cover slip ขน ทงใหแหงเอง 4. แช cover slip ใน ethyl alcohol เขมขน 70% นาน 5 นาทแลวลางดวยนา 5. แช cover slip ในกรดเกลอ 1 N ทอณหภม 60ซ. นาน 15-30 นาท ลางดวยนาจนกรดหมด 6. หยด giemsa บน cover slip 1-2 หยด ทงไวนาน 15 นาท 7. หยด glycerol บน slide 1 หยด แลวควา cover slip ทบลงไป แลวนาไปตรวจดดวยกลองจลทรรศน 8. สารพนธกรรมจะตดสเขยวของ giemsa สวนอนของเซลลไมตดส กำรยอม flagella ควรใชเชอทมอายนอยทเลยงบนอาหารเลยงเชอใหมๆ ปกตทใชกนทวไปอายของเชอประมาณ 2-12 ชวโมงและตองตรวจสอบการเคลอนทของเชอกอนเสมอ วธการยอม flagella โดย Liefson’s method มดงน 1. หยด suspension ของเชอแบคทเรยบน slide ทวางเอยงๆ ปลอยให suspension ไหลลงมาทงใหแหงในอากาศ 2. แช slide ในฟอรมาลน 2 นาท 3. หยด mordant บน slide โดยใชใหผานกระดาษกรองทงไวนาน 10 นาทแลวลางสออกดวยนา

144

4. หยดส methylene blue เขมขน 1% นาน 1 นาท ลางออกดวยนากลนทงใหแหง 5. นาไปตรวจดดวยกลองจลทรรศนจะเหน flagella เปนสชมพ กำรยอม cyst ใช Azotobacter sp. อาย 1-5 วน โดยวธการยอมคอ 1. เกลยเชอบน slide บรเวณทมหยดสแลวปดดวย cover slip 2. เชดนาและสทออกมานอก cover slip ใหหมด 3. นาไปตรวจดดวยกลองจลทรรศน เหนตวเซลลเปนสเขยว cyst ทยงเจรญไมเตมทตดสนาตาล สวน cyst ทเจรญ

เตมทแลวขอบนอกสดตดสนาตาลแก ถดมาไมตดสและสวนกลางเซลลตดสเขยว การยอมสสปอร การยอมสเพอศกษาสปอรของแบคทเรยนนทาไดยากเพราะสปอรไมยอมใหสซมผานไดงาย ดงนนตองใชความรอนชวยในการยอมดวยคอ วธ Scharffer-fulton ซงมวธการดงน 1. หยดส malachite green ใหทวมบรเวณทเกลยเชอไว นา slide ไปวางบนไอนาเดอดนาน 15 นาท โดยคอยเตมสบน slide อยาใหแหง ไอนาทเกดจะชวยใหสซมผาน spore coat ไดด แลวลางสออกใหหมดดวยนาเพอลางเอา malachite green ออกจากสวนอนๆ ใหหมดซบใหแหง หยดส safranin ลงไปนาน 1 นาท นาไปลางส ทงใหแหง ตรวจดดวยกลองจลทรรศน 2. การยอมสสปอรโดยวธน ตวเซลลแบคทเรยจะตดสแดงของ safranin สวนสปอรตดสเขยวของ malachite green 3. การยอมสสปอรมประโยชนในการจาแนกแบคทเรยใน Family Bacillaceae และ Genus Clostridium

145

ลกษณะการเจรญของแบคทเรยในอาหารเลยงเชอ

ลกษณะการเจรญของแบคทเรยทปรากฏ เชน ลกษณะการเจรญบนอาหารเลยงเชอชนดตาง ๆ สทเกดขน ความมากนอยของการเจรญ กลนของเชอ สามารถใชเปนเกณฑในการจดจาแนกชนดแบคทเรยได เพราะลกษณะการเจรญบนอาหารชนดตาง ๆ จะเปนลกษณะเฉพาะของเชอแตละชนด ในการศกษาลกษณะการเจรญของเชอบรสทธ จะสงเกตลกษณะดงตอไปน

1. การเจรญเปนโคโลนบนอาหารแขง (agar plate colony) ก. ขนาดของโคโลน (size) ศกษาขนาดของโคโลนวามขนาดเลกมาก (pinpoint) มเสนผาศนยกลางไมถงมลลเมตรจนถง โคโลน

ขนาดใหญทมเสนผาศนยกลาง 5-10 มลลเมตร แบคทเรยบางชนดมโคโลนขนาดจากดแมจะบมเชอไวเปนเวลานานกตาม หรอเชอบางชนด โคโลนมลกษณะเปนเมอกและลามไปถงโคโลนอน

ข. รปรางของโคโลน (form) โคโลนมรปรางลกษณะตาง ๆ กนดงน (ดงรปท 1)

Punctiform โคโลนมขนาดเลกมาก แตมองเหนดวยตาเปลา มเสนผาศนยกลางนอยกวา 1 มลลเมตร Circular โคโลนลกษณะกลม Filamentous โคโลนประกอบดวยเสนสายพนกนแนน irregular รปรางของโคโลนไมแนนอน rhizoid ลกษณะการเจรญมการแตกตางกงกานไมแนนอนและมลกษณะคลายราก

ค. ขอบหรอรมของโคโลน (margin, edge) ขอบหรอรมของโคโลนมหลายรปแบบขนอยกบชนดของแบคทเรย บางชนดมขอบเรยบเปนวงกลม

บางชนดขอบไมเรยบเปนรอยหยก หรอมสวนทยนออกคลายนวมอ เปนตน ลกษณะขอบมดงน คอ (รปท 1) entire ขอบโคโลนเรยบ undulate ขอบโคโลนเปนคลนโคงเวาเลกนอย lobateขอบโคโลนเปนคลนโคงเวาและยนมาก erose ขอบโคโลนเปนหยกเปนซไมสมาเสมอ filamentous ขอบโคโลนเปนเสนสายยาวไมแนนอน curled ขอบโคโลนเปนเสนซอนกนเปนคลนและหยกในลกษณะทขนานกน

146

ง. พนผวของโคโลน (surface texture) พนผวของโคโลนของแบคทเรยบางชนดอาจเรยบเปนมนวาวหรอขรขระ หรอเปนเมอกเยมบางชนด

บนผวหนาเปนรอยหยกหรอเปนรอง สาหรบเชอบรสทธทก ๆ โคโลนบนผวอาหารวนควรมลกษณะโคโลนเปนแบบเดยวกน แตบางครงอาจเกดการแปรผนได เนองจากเกดการผาเหลาทาใหเซลลปกตซงเคยสรางโคโลนชนดเรยบ (smooth) มบางเซลลเปลยนไปสรางโคโลนชนดขรขระ (rough) เนองจากเซลลทผาเหลา (R mutant) ไมสามารถสรางแคปซลได จงทาใหโคโลนไมเรยบ

สาหรบแบคทเรยททาใหเกดโรคหลายชนด พนผวโคโลนอาจแสดงความรนแรงของเชอได เชน โคโลนเรยบ (S colonies หรอ Smooth colonies) ของเชอ S.pneumoniae หรอ Salmonella sp. มกเปนพวกทาใหเกดโรครนแรง ในขณะทโคโลนหยาบหรอขรขระ (R colonies หรอ Rough colonies) ไมทาใหเกดโรครนแรง แตสาหรบเชอ Mycobacterium tuberculosis จะตรงขามกน คอ พนผวโคโลนทขรขระจะแสดงวาเปนพวกทาใหเกดโรครนแรง

จ. ความสงของโคโลน

ความสงของโคโลนจะแตกตางไปตามชนดของแบคทเรย บางชนดโคโลนแบนบางชนดโคโลนนนมากเกอบเปนรปครงวงกลมกม ความสงของโคโลนมลกษณะดงน คอ (รปท 6.6)

flat โคโลนแบนราบตดกบอาหาร raised โคโลนความหนาสงขนมาจากผวหนาอาหาร convex โคโลนมความนนโคงขนเลกนอย pulvinate โคโลนมความนนมากโคงขนจากผวอาหารมาก

ขนาดโคโลนของแบคทเรยบางสกลเมอเลยงในสภาวะทเหมาะสม

สกลและเชอสาย อาหารทใชเพาะเลยง สภาวะทเพาะเลยง ขนาดโคโลน

(เสนผาศนยกลางเปน มม.) Mycoplasma pneumoniae PPLO agar 37 oC , 2 สปดาห 0.1-1 Streptococcus pyogenes Blood agar 37 oC, 18-24 ซม. 0.5 Haemophilus influenzae Blood agar 37 oC, 18-24 ซม. 0.5-1 Neisseria gonorrhoea Chocolate agar 37 oC, 72 ซม. 1-2 Salmonella typhl MacConkey agar 37 oC, 18-24 ซม. 1-2 Corynebacterium diphtheriae Cystine agar 37 oC, 24-48 ซม. 1-2 Escherichia coli Nutrient agar 37 oC, 18-24 ซม. 1-3 Bacteroides fragilis BHIA* 37 oC, 18-24 ซม.** 1-3 Bacillus cereus Blood agar 37 oC, 18-24 ซม. 4-5 Clostridium perfringens BHIA* 37 oC, 18-24 ซม.** 4-5 * BHIA = Brain Heart Infusion Agar ทเตมเฮมน (hemin) **ในสภาวะไรออกซเจน

147

รปท 1 แสดงลกษณะโคโลนแบบตาง ๆ บนอาหารแขง

ฉ. ความหนด (consisency) ของโคโลน ความหนดนทดสอบไดโดยใชเขมเขยแตทโคโลนแลวยกเขมขนเชอบางชนดสรางโคโลนทมความหนดดวยเนวเหลว (butyrous) บางชนดมความหนดมาก (viscous)เปนเสนสาย (string) หรอเปนยาง (rubbery) ซงโคโลนจะหลดออกมาจากผวอาหารวนเมอใชเขมเขยบางชนดโคโลนมความแหงมาก เปราะ และเปนผง เมอใชเขมเขยจะแตกกระจายออก

ช. ความขน (optical features) ของโคโลน โคโลนอาจขน (ทบแสง) โปรงแสง

ซ. การสรางสหรอรงควตถ (chromogenesis หรอ pigmentation) แบคทเรยบางชนดสรางรงควตถและเปนสทไมละลายนา จงทาใหโคโลนเกดเปนสตาง ๆ ขน ตวอยางแบคทเรยบางชนดทสรางสได คอ

Flectobacillus majorสรางสชมพ Serratia marcescensสรางสแดง Chromobacteriumสรางสมวง Staphylococcus aureusสรางสเหลองทอง

148

Micrococcus luteusสรางสเหลอง Derxia gummosaสรางสนาตาล Bacteroides melaninogenicusสรางสดา

แบคทเรยบางชนดสรางรงควตถทละลายนาได สจงละลายและแพรเขาสอาหารว นโดยรอบ เชน Pseudomonas aeruginosa สรางรงควตถสฟาทละลายนาไดเรยกวา ไพโอไซแอนน (pyocyanin) รงควตถบางชนดละลายนาไดและตกตะกอนอยในอาหารเลยงเชอ เชน P. chlororaphis สรางรงควตถทเรยกวา คลอโรแรฟน (chlororaphin) ซงตกตะกอนและสะสมไวในรปผลกสเขยวรอบ ๆ โคโลน รงควตถบางชนดทละลายนาไดนนยงเกดการเรองแสงได (fluorescent) โดยจะทาใหอาหารทอยรอบ ๆ โคโลนเกดประกายสวางหรอเปนสฟาแกมเขยวเมอถกแสงอลตราไวโอเลต เชน เชอ P. aeruginosa สรางรงควตถทเรยกวา ไพโอเวอดน (pyoverdin) ทเกดการเรองแสงได นอกเหนอไปจากการสรางรงควตถไพโอไซแอนนไดแลว ในการทจะทาใหแบคทเรยสรางรงควตถซงเปนลกษณะเฉพาะไดนน จะตองควบคมสภาพตาง ๆ เชน อาหารเลยงเชอพเศษ อณหภมในการบมเชอทพอเหมาะและสภาพอน ๆ ทตองการ เช น เชอ Mycobacterium kansasii จะสรางรงควตถสเหลองซงเปนสารบตา-คาโรทน (B carotene) เฉพาะเมอโคโลนถกแสงสวางเทานน

2. ลกษณะการเจรญของเชอจลนทรยทเจรญในอาหารเหลว (broth culture) ไดแกลกษณะดงตอไปน 1. ปรมาณการเจรญเตบโต (amount of growth) ของเชอจลนทรยเมอเจรญในอาหารเหลว อาจม

ปรมาณนอย ปานกลาง หรอมาก 2. ชนดของการเจรญและการกระจาย เชอจลนทรยอาจกระจายทวอาหารอยางสมาเสมอ ทาให

อาหารขนทวทงหลอด หรอการเจรญอาจเกดมากทผวหนาอาหารเปนแผนบาง ๆ (pellicle) หรอการเจรญมมากทกนหลอดจงตกตะกอนทกนหลอด (sediment) เปนตน การเจรญในอาหารเหลวมรายละเอยดดงน (รปท 2)

ก. การเจรญทผวหนาอาหารเหลว none ไมมการเจรญทผวหนา ring การเจรญเปนวงรอบตดอยทขอบหลอดแกว pellicle การเจรญเปนแผนลอยอยทผวหนาอาหาร flocculent การเจรญประกอบดวยกลมแบคทเรยเกาะกนเปนกอนอยทผวหนาอาหาร

ข. การเจรญใตผวหนาอาหาร none ไมมการเจรญใตผวหนา turbid การเจรญมลกษณะขนและเปนตะกอน granular การเจรญประกอบดวยแกรนลเลกจานวนมาก

ค. ปรมาณการเจรญ มาก ปานกลาง หรอนอย ง. การตกตะกอนทกนหลอด

none ไมมการตกตะกอน granular ตะกอนเปนแกรนลละเอยด flocculent ตะกอนเปนกลมกอน viscid ตะกอนเปนเยอเหนยว

149

flaky ตะกอนเปนแผนมากมายแยกจากกน

รปท 2 ลกษณะการเจรญของแบคทเรยในอาหารเหลว 3. ลกษณะการเจรญของเชอจลนทรยทเจรญในอาหารวนเอยง (slant)

slant คอ หลอดอาหารวนทวางเอยงลาดไวในขณะทวนเยนจนแขง เมอวนแขงตวผวหนาอาหารแขงจะเอยงลาดเปนการเพมพนท และงายตอการเลยงจลนทรยทตองการอากาศ (aerobes) และพวกแฟคลเตตฟแอนแอโรบส (facultative anaerobes) การเลยงจลนทรยทาไดโดยใชลปแตะเชอแลวลากบนผวหนาอาหารเปนเสนตรงจากกนหลอดขนมาครงเดยว

ลกษณะการเจรญมดงน (รปท 3) ก. ปรมาณเชอทเจรญ มาก ปานกลาง หรอนอย ข. รปรางการเจรญ

filiform ลกษณะการเจรญสมาเสมอตามรอบขดเชอ echinulate การเจรญมรอยหยกทขอบคลายฟนเลอย beaded การเจรญไมสมาเสมอ แยกกระจายออกตามแนวทขดเชอ arborescent การเจรญแตกกงกานคลายตนไม rhizoid การเจรญแตกกงคลายราก effuse การเจรญมนอย บาง และกระจดกระจาย

รปท 3 ลกษณะการเจรญของจลนทรยในอาหารวนเอยง

150

การทดสอบทางชวเคมเพอตรวจวนจฉยแบคทเรย

ในการแบงแยกแบคทเรยออกเปนพวกตาง ๆ นนนอกจากการใชคณสมบตทมองเหนดวยตาเปลา เชน รปราง, การตดส, ลกษณะของ flagella แลวเรายงใชลกษณะอน ๆ อกทสาคญทสด คอ คณสมบตทางชวเคมของแบคทเรย คณสมบตทางชวเคมทกลาวมานนหากจะกลาวโดยสรป ไดแก ความสามารถในการใชสารตาง ๆ เปน carbon (C)-source และ nitrogen (N)-source, การม enzyme ทส าคญบางชนด, ความทนหรอไวตอยาปฏชวนะหรอสารเคมบางชนด, การสราง end product(s) (อยางเดยวหรอหลายอยาง) จากการใช carbon หรอ nitrogen-source คณสมบตตางๆ เหลานมประโยชนมากโดยชวยใหสามารถแบงแบคทเรยออกเปนกลม ๆ ไดเปน genus และ species ตาง ๆ ในการทาการทดสอบทางชวเคมของแบคทเรยแตละชนดนน องคประกอบทสาคญมากประการหนง คอ การเตรยมเชอสาหรบทดสอบ สงทตองคานงถง คอ เชอนนตองเปนสายพนธทบรสทธ (pure culture) นนคอ ตองเปนเชอชนดเดยว หามมเชออนปะปนมาอยางเดดขาด หากเชอทนามาทดสอบมเชออนปะปนมาจะทาใหไมสามารถ identify ไดหรอยงกวานนจะทาให identify ผดไดอยางงายดาย อกประการหนง คอ ความสมบรณของเชอ ทนามาทดสอบ เนองจากการทดสอบทางชวเคมนเปนการดความสามารถของเชอในการใชสารตาง ๆ หรอการผลต enzyme(s) ตาง ๆ ดงนนเชอททดสอบตองอยในสภาพทสมบรณเตมท หาไมแลวคณสมบตตาง ๆ เหลานอาจลดลงได จงควรเพาะเลยงเชอใน enriched media หรออยางนอยกควรเปนอาหารเลยงเชอซงปลอดจากสารยบยงตาง ๆ ซงอาจยบยงคณสมบตทางชวเคมบางประการของเชอได 1 Bile esculin test หลกการ เปนการทดสอบความสามารถของเชอทจะ hydrolyse esculin ใหเปน esculetin และ glucose ซง esculetin กจะทาปฏกรยากบ Ferric ion ในอาหารเกดตะกอนสดาของ phenolic iron complex นอกจากนนการทดสอบนยงเปนการทดสอบความสามารถของ เชอในการทนตอ bile (10-40%) ดวย สงทตองใชBile esculin medium 1 หลอด วธทดสอบ 1. inoculate เชอทตองการทดสอบลงบน bile esculin medium agar slant ไมตอง stab 2. incubate 37 องศาเซลเซยส 18-24 ซ.ม. 3. อานผล การอานผล ผลบวก : เกดสดาขนบรเวณ slant หรอทวทงหลอด ผลลบ : ไมมสดาเกดขน 2. CAMP - test

151

หลกการเพอทดสอบความสามารถของเชอในการให CAMP - factor ซงสามารถทาปฏกรยา เสรมฤทธกบ beta-hemolysin (beta - lysin) จาก Staphylococcus species ในการทาใหเมดเลอดแดงของแกะหรอววแตกและใหรปรางของ hemolytic zone เปนรปหวลกศร สงทตองใช 1. Blood agar plate ทใชเลอดแกะ 1 จาน 2. S. aureus ทให beta - lysin หรอ beta toxin วธทดสอบ

1. ใช loop ขดเชอ S. aureus เปนทางยาวตรงกงกลางของ blood agar plate 2. ใช loop ขดเชอทตองการทดสอบ (beta-hemolytic streptococcus) ลงบน blood agar โดยขด

ตงฉากกบแนวทขด S. aureus ไว และใหขดจากดานนอกเขามาหา S. aureus (ดงรป) 3. Incubate 37 องศาเซลเซยส 18-24 ซ.ม. 4. อานผล

การอานผล ผลบวก : เกด hemolytic zone ระหวาง S. aureus กบ เชอททดสอบเปนรปหวลกศร (ดงรป) ซงหมายถงวาเชอททาการทดสอบนาจะเปน beta-hemolytic streptococcus group B ผลลบ : ไมม hemolytic zone หรอมแตไมเปนรปลกศร 3. Carbohydrate utilizasion (oxidation/farmentation) test หลกการเปนการทดสอบความสามารถของเชอในการใชนาตาลชนดตางๆ ซงผลจากการใชนาตาล

เหลานจะไดกรด หรอกรดและกาซ สงทตองใชBasal medium ผสมนาตาลชนดตาง ๆ (เชน glucose, lactose, sucrose, maltose ฯลฯ)

อยางละ 1 หลอด Basal medium มหลายชนดแลวแตการใชงาน ไดแก 1. Basal medium สาหรบ gram negative rod (fermentative) เปน broth ซงผสม andrade's

indicator (กรด : แดง, ดาง : เหลอง) ม test tube ขนาดจว (Durham tube) ใสลงไปดวยเพอดกาซเกดขน

2. Basal medium สาหรบ gram negative rod (non-fermentative) เปน semisolid media โดยม bromthymol bule เปน indicator(กรด : เหลอง, ดาง : นาเงน, เปนกลาง : เขยว)

เชอทตองการทดสอบ

S. aureus

Sheep blood agar Hemolytic Zone ของ S.aureus

Hemolytic Zone รปตวลกศร

152

3. Basal medium สาหรบพวก neisseria species เปน semisolid media เรยกวา Cystine tryptic agar (CTA) บ phenol red เปน indicator (กรด : เหลอง, ดาง : แดง)

4. Basal medium สาหรบพวก Corynebacterium species เปน broth ซงม serum ววเปนสวนผสมและม andrade's indicator เปน pH-indicator เรยกวา "Hiss serum medium"

5. Basal medium สาหรบพวก anaerobes เปน broth แตไมผสม pH-indicator วธทดสอบ

1. incubate เชอทตองการทดสอบลงในอาหารแตละหลอด (หากเปน semisolid ใช stabประมาณ 1/2 ของหลอด สาหรบ CTA และ Hiss serum medium ใหใช heavy inoculum)

2. incubate 37 องศาเซลเซยส 18-24 ซ.ม. หรอมากกวา 3. อานผล การเกดกรด หรอกรดและกาซ การอานผล

1. ส าหรบ gram negative rod (fermentative) ผลบวก : broth เปลยนจากสเหลองไปเปนสแดง หากมกาซใน durham tube แสดงวา

เกดทงกรดและกาซ ผลลบ : broth ไมเปลยนส และไมมฟองกาซใน durham tube

2. ส าหรบ gram negative rod (non-fermentative) ผลบวก : media เปลยนจากสเขยวไปเปนสเหลอง ผลลบ : media เปนสเขยวเหมอนเดม หรอเปลยนเปนสนาเงน (หากเปนสนาเงนให

อานวา alkaline) 3. ส าหรบ CTA

ผลบวก : media เปลยนจากสแสดไปเปนสเหลอง ผลลบ : media เปนสแสดเหมอนเดม หรออาจเปลยนเปนสแดงกได

4. ส าหรบ Hiss serum medium ผลบวก : media เปลยนจากขาวขนไปเปนสชมพขน ซงอาจมการแขงตวของ broth

หรอไมกได ผลลบ : media ไมเปลยนส

5. ส าหรบพวก anaerobes การอานผลตองเดม methyl red solution ลงไป ผลบวก : media เปนสแดง ผลลบ : media เปนสเหลอง

หมายเหต หากผลบวกยงไมชดเจนตอง incubate ตอไปอกจนกวาจะแนใจวาใหผลบวกจรงหรอไม 4. Catalase test หลกการ เปนการตรวจหา enzyme catalase ซงเปนตวเรงการปลอยออกซเจนออกจาก H2O2 ดงสมการ

153

2H2O2 2H2O+O2 สงทตองใช 1. Slide ทสะอาด 1 แผน (หรอ test tube 1 หลอด) 2. Hydrogen peroxide ความเขมขน 3-30% วธทดสอบ วธท 1 Slide method (เปนวธทแนะนา)

1. ใช inoculating needle เขยตรงกลาง colony (pure) แตะบน glass slide ทสะอาด 2. หยด 3% H2O2 1 หยด ลงบนเชอบน slide โดยใช dropper หรอ pasteur pipette 3. ดฟองกาซทเกดขนในทนท (ตองทาตามลาดบ อยาหยด H2O2 ลงบน slide กอน

เพราะ platinum needle จะทาใหเกด false positive ได แตหากใช Nichrome wire จะไมทาใหเกดฟอง)

วธท 2 Tube method ทาโดยเตม H2O2 (3%) 1 มล. ลงใน tube ทเปน ager slant ซงเพาะเลยงเชอทตองการ

ทดสอบเอาไว ดฟองกาซซงเกดขนทนท อาจทาการทดสอบแบบเดยวกนนไดโดยการใช broth culture ทเพาะเลยงใหม ๆ แทนทจะเปนเชอทเลยงบน agar slant

อนงทง 2 วธนไมแนะนาใหใชเชอจาก blood agar เพราะในเมดเลอดแดงม enzyme catalase อยดวย

การอานผล ผลบวก : มฟองกาซเกดขนทนท ผลลบ : ไมมฟองกาซเกดขน 5. Decarboxylase test (lysine, ornithine และ arginine) หลกการ เปนการทดสอบหา enzyme decarboxylase ของเชอ ในการทจะ decarboxylate amino

acids ชนดตาง ๆ โดยให amine เปน end product ซงจะทาให pH ของอาหารเลยงเชอเปนดาง

สงทตองใช 1. Decarboxylase medium ทไมม amino acid control 1 หลอด 2. Decarboxylase medium ทม amino acid (Lysine หรอ Ornithine หรอ Arginine) อยางละ 1 หลอด 3. Sterile paraffin หรอ mineral oil วธทดสอบ

Catalase

154

1. Inoculate เชอทตองการทดสอบลงใน decarboxylase medium ทง tube ทมและไมมamino acid

2. หยอด sterile paraffin หรอ mineral oil ใหสงจากหนา media ประมาณ 1 ซ.ม. 3. incubate ท 37 องศาเซลเซยส นาน 18-24 ชวโมง

การอานผล ตองอานผลเทยบกบ control tube เสมอ ผลบวก : control tube เปนสเหลอง tube ทม amino acid เปนสมวง ผลลบ : control tube เปนสเหลอง tube ทม amino acid เปนสมวง 6. Indole test หลกการ เปนการทดสอบความสามารถของเชอในการปลดปลอย indole จาก tryptophan สงทตองใช

1. Tryptophan broth หรอ peptone broth (หรอ broth ใดกตามทมปรมาณ tryptophan สง 1 หลอด)

2. Kovacs' indole reagent วธทดสอบ

1. inoculate เชอทตองการทดสอบลงใน broth 2. incubate 37 องศาเซลเซยส 18-24 ชวโมง 3. อานผลโดยหยด Kovacs' indole reagent ลงใน broth เขยาใหเขากนกบ broth 4. ทงให Kovacs' indole reagent และ broth แยกชนจากกนสงเกตดสทเกดขนในชนของ

Kovacs' indole reagent ซงจะอยชนบนเหนอ broth การอานผล ผลบวก : Kovacs' indole reagent เปลยนจากสเหลองไปเปนสแดง ผลลบ : Kovacs' indole reagent ยงคงเปนสเหลองเหมอนเดม 7. Motility test หลกการ เพอทดสอบความสามารถในการเคลอนทของเชอ ซงเนองมาจากการทเชอม flagellum(a)

เชอทสามารถเคลอนทไดจะสามารถเคลอนออกจากบรเวณใหมซงจะเกดการเจรญเตบโต และแบงตวยงบรเวณนนตอไป

สงทตองใช Motility test medium ซงเปน semi-solid medium (agar 0.4 -0.5%) 1 หลอด วธทดสอบ

155

1. Inoculate เชอทตองการทดสอบลงใน motility test medium โดย Stab เพยงครงเดยวดวย needle ลงในอาหาร ประมาณ 2/3 ของสวนสงของอาหาร

2. incubate 37 องศาเซลเซยส นาน 18-24 ช.ม. 3. นามาอานผล หากยงใหผลลบ ใหทงไวทอณหภมหองตอไปอก 1-2 สปดาห สงเกตการ

เปลยนแปลงเปนระยะ การอานผล ผลบวก : เหนการเจรญของเชอออกมานอกรอย Stab หรอไมมรอยการเจรญทชดเจนบรเวณ

รอย Stab แต medium ทงหลอดขนกวาเดม ผลลบ : เหนการเจรญของเชออยางชดเจนทบรเวณรอย Stab โดยเหนขอบเขตของเชอท

เจรญอยางชดเจน แมจะ incubate ตอจนครบ 2 สปดาหกไมมการเปลยนแปลง 8. Deoxyribonuclease test หลกการ เปนการทดสอบถงคณสมบตของเชอในการยอยสลาย Deoxyribonucleic acid (DNA)

โดยการใช enzyme deoxyribonuclease สงทตองใช

1. Agar medium ซงผสม DNA 0.2%1 จาน 2. 1 N HCl หรอ Toluidine blue 0 หรอ Methyl green

วธทดสอบ 1. Inoculate เชอทตองการทดสอบลงบน DNA agar plate โดย inoculate เปนวงกลมขนาด

เสนผาศนยกลางประมาณ 1-1.5 ซ.ม. (DNA agar 1 จาน ควรใชทดลองเชอได 4 สายพนธ)

2. Incubate 37 องศาเซลเซยส นานอยางนอย 48 ชวโมง 3. อานผลโดยการเตม 1 N HCl หรอ toluidine blue 0 หรอ Methyl green ประมาณ 1-2

ม.ล.ลงในจานอาหารเลยงเชอรอสก 3-5 นาท เพอใหเกดปฏกรยา การอานผล

1. เมอทดสอบดวย 1 N. HCL ผลบวก : เกด zone ใสรอบเชอท inoculate บรเวณอนใน medium เกดความขน ขาว ผลลบ : ไมม zone ใสเกดขนรอบเชอท inoculate และเกดความขนขนในอาหารเลยง

เชอทงจาน 2. เมอทดสอบดวย toluidine blue 0

ผลบวก : เกด zone สชมพรอบเชอท inoculate (สวนอนเปนสนาเงน) ผลลบ : ไมม zone สชมพเกดขน อาหารเลยงเชอเปนสนาเงนของส toluidine bule 0

3. เมอทดสอบดวย Methyl green

156

ผลบวก : เกด zone ใสรอบเชอท inoculate (สวนอนเปนสเขยว) ผลลบ : ไมม zone ใสเกดขน อาหารเลยงเชอเปนสเขยวของส Methyl green

9. Gelatin liquefaction test หลกการ เพอทดสอบความสามารถของเชอในการยอยสลาย gelatin โดยการใช enzymes ในกลม

ของ gelatinases การทดสอบนมหลายวธแตไดเลอกใหนกศกษาทดลองปฏบตเพยง 2 วธ คอ

1. การใช gelatin agar และอานผลโดยการใช acid mercuric chloride 2. การใช gelatin broth และอานผลโดยการดการ liquefy gelatin

วธท 1 การใช gelatin agar สงทตองใช

1. Nutrient agar หรอ brain heart infusion agar ซงผสม 0.4% gelatin 1 จาน 2. Acid mercuric chloride solution

วธทดสอบ 1. Inoculate เชอทตองการทดสอบลงบน gelatin agar plate โดย inoculate เปนวงกลม

ขนาดเสนผาศนยกลางประมาณ 1-1.5 ซ.ม. (gelatin agar 1/จาน ควรใชทอสอบเชอได 4 สายพนธ)

2. Inoculate 37 องศาเซลเซยส นานอยางนอย 48 ชวโมง 3. อานผลโดยเตม acid mercuric chloride ประมาณ 1-2 มล. ลงในจานอาหารเลยงเชอ รอ

สก 3-5 นาท เพอใหเกดปฏกรยา การอานผล ผลบวก : ม zone ใสเกดขนรอบ เชอท inoculate ลงไป ผลลบ : ไมม zone ใสเกดขนโดย medium เปลยนจากใสไปเปนขนทงจาน วธท 2 การใช gelatin broth สงทตองใช 1. Nutrient gelatin broth1 หลอด 2. ตเยนหรอถาดนาเยน (นา + นาแขง) วธทดสอบ

1. Inoculate เชอทตองการทดสอบลงใน nutrient gelatin broth 2. Incubate 37 องศาเซลเซยส อยางนอย 48 ชวโมง 3. อานผลโดยนาหลอดทมเชอ และ nutrient gelatin broth ซงยงไมได inoculate อก 1

หลอด ใสในตเยนหรอแชในนาเยน ประมาณ 5-10 นาท หรอจนกวา nutrient gelatin broth หลอดทไมมเชอเกดการแขงตว

157

การอานผล ผลบวก : nutrient gelatin broth ยงคงเปนของเหลวเหมอนเดมไมไดเกดการแขงตวเหมอนกบ

หลอดทไมมเชอ ผลลบ : nutrient gelatin broth แขงตว เชนเดยวกบหลอดทไมมเชอ 10. Oxidation-Fermentation test (O-F test) หลกการ เปนการทดสอบระบบการใชนาตาลของเชอวาเปนชนดทตองอาศยออกซเจน (oxidative)

หรอไมตองอาศยออกซเจน (Fermentative) สงทตองใช

1. O/F basal medium (ซงใช bromthymol blue เปน indicator) และเตมนาตาลทตองการทดสอบลงไปในความเขมขน 1% 2 หลอด

2. Sterile Paraffin (ชนดแขง) หรอ minaral oil วธทดสอบ

1. Inoculate เชอทตองการทดสอบโดย stab ลงใน O/F medium ทง 2 หลอด 2. หยอด paraffin ชนดแขง (ซงอนใหละลายแลว) หรอ sterile mineral oil กไดลงใน O/F

medium 1 หลอด (Fermentative tube) อก 1 หลอดไมตองหลอด (Oxidative tube) 3. incubate 37 องศาเซลเซยส นาน 18-24 ชวโมง 4. อานผลการเกดกรดในอาหารโดยดการเปลยนส

การอานผล การใชนาตาลแบบ oxidative : หลอดทหยอด paraffin (F-tube) ไมมการเปลยนส (-) หลอดทไมไดหยอด Paraffin (O-tube) มการเปลยนสจากเขยว

เหลอง (+) หรอ O/F +/- การใชนาตาลแบบ fermentative : หลอดทหยด paraffin (F-tube) มการเปลยนสโดยเปลยนจากเขยว

เหลอง (+) หลอดทไมไดหยอด Paraffin (O-tube) มการเปลยนสโดยเปลยนจากเขยว เหลอง (+) หรอ O/F +/+

ไมมการใชนาตาล : ไมมการเปลยนสเกดขนทง 2 หลอด หรอ O/F -/- 11. การสราง pigment โดย Pseudomonas species หลกการPseoudomonas บาง species เชน P. aeruginosa, P. fluorescent เปนตน สามารถให

pigment ไดแตในอาหารธรรมดาบางครง เชอจะไมสามารถสราง pigment ได ตองใชอาหารเลยงเชอเฉพาะเพอกระตนการสราง pigment

สงทตองใช 1. "A" medium of King หรอ King's medium for pyocyanin production หรอ King p

medium1 หลอด

158

2. "B" medium of King หรอ King' s medium for fluorescein production หรอ King F medium1 หลอด

วธทดสอบ 1. Inoculate เชอทตองการทดสอบลงบนหนา slant ของอาหารเลยงเชอทง 2 หลอด 2. Incubate 37 องศาเซลเซยส นาน 18-24 ชวโมง และอาจ incubate ตอในอณหภมหอง

ตอไปอก 24-48 ชวโมง 3. อานผลโดยดสทเกดขน

การอานผล1. ส าหรบ King P medium ผลบวก : อาหารเลยงเชอจะมสนาเงนเขยวเทากบเชอให pyocyanin ผลลบ : อาหารเลยงเชอไมเปลยนส 2. ส าหรบ King E medium ผลบวก : อาหารเลยงเชอมสเหลอง-เขยวเทากบเชอให fluorescein หรอ pyoverdin ผลลบ : อาหารเลยงเชอไมเปลยนส 12. การสราง pigment โดย beta-hemolytic Streptococcus group B หลกการเชอ beta-hemolytic Slreptococcus group B จะสามารถสราง pigment สแสดได ในอาหาร

เลยงเชอทม peptone และแปงและตองอยในสภาวะ anaerobic หรอ microaerophilic สงทตองใชอาหารเลยงเชอทมสวนประกอบของ peptone และแปง (Proteose peptone rice ager หรอ

PPR) วธทดสอบ

1. ใช needle เขยเชอทตองการทดสอบจานวนมากพอสมควร (ใช heavy inoculum มากกจะใหผลไดแนนอน) stab ลงใน PPR medium โดย stab ลงระหวางอาหารเลยงเชอกบผวแกวดานในของหลอด

2. นาไป incubate ท 37 องศาเซลเซยส นาน 18-24 ชวโมง 3. อานผล

การอานผล ผลบวก : เกด pigment สแสดขนในบรเวณท inoculate เชอลงไป ผลลบ : ไมมสเกดขน 13. Potassium cyanide test หลกการเปนการทดสอบความสามารถของเชอทจะมชวตและเจรญไดในอาหารเลยงเชอทม

potassium cyanide ผสมอย สงทตองใช

159

1. KCN broth base ซงไมม KCN (เปน negative control)1 หลอด 2. KCN broth base ซงผสม KCN (7.5 มลลกรมตอ 100 ม.ล.)1 หลอด

วธทดสอบ 1. Inoculate เชอจาก broth culture (หรอ suspension ของเชอทตองการทดสอบใน broth

หรอ sterile NSS) ลงใน KCN broth base ทงหลอดทม KCN และหลอดทไมม KCN หลอดละ 1 loop

2. incubate ท 37 องศาเซลเซยส นาน 18-24 ชวโมง 3. อานผลโดยดความขนทเกดขน

การอานผล ผลบวก : เชอสามารถเจรญไดในอาหารทม KCN ผสมดงนน หลอดทไมม KCN (Negative control) ขน หลอดทม KCN (KCN tube) ขน ผลลบ : เชอถกยบยงในอาหารทม KCN ผสม ดงนน หลอดทไมม KCN (Negative control) ขน หลอดทม KCN (KCN tube)ใส 14. Starch hydrolysis test หลกการ เพอทดสอบความสามารถของเชอในการยอยสลายแปงโดยการใช enzymes สงทตองใช

1. Starch hydrolysis test agar 2. Iodine solution

การทดสอบ 1. Inoculate เชอทตองการทดสอบลงบน Starch hydrolysis agar plate โดย inoculate เปน

วงกลมขนาดเสนผาศนยกลางประมาณ 1-1.5 ซ.ม. (Starch hydrolysis agar 1 จาน ควรใชทดสอบเชอได 4 สายพนธ)

2. Incubate 37 องศาเซลเซยส นานอยางนอย 48 ชวโมง 3. อานผลโดยอาจอาน zone ใสรอบเชอหรอเพอใหเหนชดอาจใช iodine solution ชวยใน

การอานโดยเตม iodine solution ประมาณ 1-2 มล. ลงในจานอาหารเลยงเชอแลวอานผล การอานผล 1. โดยไมใช iodine solution ผลบวก : เหน zone ใสเกดขนรอบเชอ ผลลบ : ไมม zone ใสเกดขน 2. โดยใช iodine solution

160

ผลบวก : เหน zone ใสเกดขนรอบเชอและอาหารทอยโดยรอบ zone เปนสนาเงน ผลลบ : ไมม zone ใสเกดขนและอาหารเปนสนาเงนเขม 15. Susceptibility tests หลกการ เปนการทดสอบคณสมบตเฉพาะของเชอบางชนดซงสามารถถกยบยงการเจรญเตบโต

ไดดวยสารเคมหรอยาปฏชวนะบางชนด ในทนจะแนะนาเพยง 2 ชนด คอ 1. Bacitracin susceptibility test 2. Optochin susceptibility test

สงทตองใช 1. Blood agar plate1 จาน 2. Bacitracin disc (0.04 unit)1 แผน 3. Optochin (Ethyl hydrocuprein HCL) 1 แผน วธทดสอบ

1. Inoculate เชอทตองการทดสอบลงบน blood agar plate โดย Streak ใหถ ๆ หรออาจใช swab ปายเชอใหทว blood agar plate กได

2. ใชปากคบปราศจากเชอคบ bacitracin หรอ optochin disc วางลงบน blood agar plate ใชปากคบกดเบา ๆ เพอใหแผนยาตดกบอาหารเลยงเชอ

3. นาไป incubate ท 37 องศาเซลเซยส นาน 18-24 ชวโมง (การ incubate ใน candle jar เนองจากการทดสอบทง 2 ชนดนจะทาใหกรณทสงสยวาเชออาจเปน beta-hemolytic Streptococcus group A หรอ S. pneumoniae ซงตองการ CO2 ในการเจรญเตบโตเฉพาะอยางยงคอ S. pneumoniae

4. นามาอานผล การอานผล ผลบวก : ม inhibition zone รอบแผนยาทวางลงไป สาหรบ bacitracin disc zone จะกวาง

เทาใดกไดถอวาเปนผลบวกทงหมด สาหรบ optochin disc เสนผาศนยกลางของ zone ควรจะกวางอยางนอย 18 มม.

ผลลบ : ไมม zone เกดขนหรอม zone แตเสนผาศนยกลางของ zone นอยกวา 18 มม. 16. Tolerance tests หลกการ เปนการทดสอบความทนของเชอตอสารเคมบางชนดหรอสภาพบางอยาง tolerance

tests ซงแยกกลาวไปบางแลวในตอนตน ไดแก Potassium cyanide test และ Bile

161

esculin test (bile tolerance test) ดงนนในปฏบตการนจะกลาวถง tolerance tests ชนด อน ๆ นอกเหนอจากการทดสอบทง 2 ซงกลาวไปแลว ไดแก

1. ความสามารถในการเจรญบนอาหารทม Sodium chloride 0.5% 2. ความสามารถในการเจรญบนอาหารทม cetrimide เปนสวนผสม 3. ความสามารถในการเจรญบนอาหารทอณหภมสงกวาปกต คอท 42 องศาเซลเซยส 4. ความสามารถในการเจรญบนอาหารทม 2,3,5- Triphenyl tetrazolium chloride เปนสวนผสม

สงทตองการ อาหารเลยงเชอทใชทดสอบ ไดแก 1. 6.5% NaCl agar slant1 หลอด 2. Cetrimide agar slant1 หลอด 3. Tryptic soy agar slant1 หลอด 4. TTC blood agar slant1 หลอด

วธทดสอบ 1. Inoculate เชอทตองการทดสอบลงบนอาหารทตองการใชโดยใช inoculum นอยถง ปานกลาง หามใช heavy inoculum 2. นาไป incubate ท 37 องศาเซลเซยส 18-24 ชวโมง ยกเวนในการทดสอบ ความสามารถในการเจรญท 42 องศาเซลเซยส ให incubate ท 42 องศาเซลเซยส 18- 24 ชวโมง 3. อานผล

การอานผล ส าหรบ 6.5% NaCl agar slant ผลบวก : มเชอขนและอาหารเปลยนจากสมวงไปเปนสเหลองถาเชอสามารถให glucose ได ผลลบ : ไมมเชอขน, อาหารยงคงเปนสมวงดงเดม ส าหรบ TTC blood agar slant ผลบวก : มเชอขนและโคโลนของเชอมสแดงจดเนองจากมการเปลยน TTC ไป ผลลบ : ไมมเชอขน ส าหรบ Cetrimide agar slant และการเจรญท 42 องศาเซลเซยส ผลบวก : มเชอขน ผลลบ : ไมมเชอขน 17. Oxidase test หลกการ เปนการตรวจหา Cytochrome C oxidase (หรออาจเรยกวา Indophenol oxidase) โดย

Cytochrome oxidase นจะ oxidise สารทใชทดสอบคอ 1% tetramethyl-p-phenylene

162

diamine dihydrochloride (Kovacs' oxidase reagent) จากสารไมมสหรอมวงออน ใหไดสมวงเขม

สงทตองใช 1. กระดาษกรองขนาดประมาณ 2-3 ตารางเซนตเมตร 2. 1% Tetramethy-p-phenylene diamine dihydrochloride (Kovacs' oxidase reagent)

วธทดสอบ 1. วางกระดาษกรองลงใน petri disk 2. หยด Kovacs' oxidase reagent ลงบนกระดาษ 1-2 หยด 3. ใช loop หรอ needle เขยเชอทตองการทดสอบจากโคโลนบนจานอาหารเลยงเชอขดลง

บนกระดาษกรองทหยด Kovacs' oxidase reagent ไวแลว 4. สงเกตดสมวงเขมซงจะเกดขนภายใน 10 วนาท หากใหผลบวก

การอานผล ผลบวก : เชอเปลยนเปนสมวง (เขม) ภายในเวลา 5-10 วนาท ผลลบ : เชอไมเปลยนสหรอเปลยนเปนสมวงออน ๆ โดยใชเวลานานกวา 10 วนาท 18. Triple sugar iron agar (TSI) หลกการ เปนการทดสอบความสามารถของเชอในการใช glucose, lactose และ sucrose ซงจะไดกรด

และอาจมกาซ เปน end product นอกจากนนยงเปนการทดสอบถงความสามารถของเชอในการสราง hydrogen sulfide อกดวย

สงทตองใช Triple sugar iron sugar 1 หลอด วธทดสอบ

1. Inoculate เชอซงตองการทดสอบลงบนผวหนาของ Triple sugar iron agar และ Stab ลงในอาหารจงถงกน tube ดวยโดยใช needle

2. Incubate 37 องศาเซลเซยส นาน 18-24 ชวโมง 3. อานผลโดยดการเกดกรด, ดาง และการสราง hydrogen sulfide

การอานผล อานผลทเกดขนหรอไมเกดขน 3 ชนด คอ 1. การใชนาตาล โดย

1.1 หากใช glucose เพยงชนดเดยว Slant จะเปลยนจากสแดงสม แดงเขม (Alkaline หรอ K) สวนกน tube (butt) จะเปลยนจากแดงสม เหลอง (Acid หรอ A) หรอ K/A

1.2 หากใชนาตาล glucose รวมกบ lactose และ/หรอ sucrose Slant และ butt จะเปลยนจากสแดงสม เหลอง หรอ A/A

163

1.3 หากไมใชนาตาลตวใดเลย อาจมปฏกรยาหลายชนด คอสวน slant อาจไมมอะไรเปลยนแปลงเลยหรอเปลยนเปนสแดงเขม (K) และ butt ไมมการเปลยนสเลย (N) หรอเปลยนเปนสแดงจดหรอ N/N, K/N, K/K

2. การเกดกาซใน media โดยอาจมมากหรอนอยกได กาซอาจดนอาหารออกมาหรอทาใหอาหารมรอยแตก

3. การเกด hydrogen sulfide โดยจะเกดสดาขนใน TSI (จะเกดขนใน TSI ไมไดเกดตรงผว slant หากพบสดาบรเวณ slant อาจเปน pigment จากเชอมากกวา)

19. Urease test หลกการ เปนการทดสอบหา enzyme urease ซงจะยอย urea ใหไดแอมโมเนยซงจะให pH ทเปนดาง

(pH ~ 8.0) สงทตองใชChristensen's area agar (pH 6.8) วธทดสอบinoculate เชอทตองการทดสอบลงบน Christensen's urea agar slant ไมตอง stab แลว

incubate 37 องศาเซลเซยส นาน 24-48 ชวโมง การอานผล ผลบวก : เปลยนไปเปนสชมพ ผลลบ : ไมมการเปลยนส 20. Citrate test หลกการ เปนการทดสอบดวาแบคทเรยสามารถใช citrate เพยงอยางเดยวเปนแหลงคารบอน (carbon

source) ไดหรอไม ถาแบคทเรยสามารถใช citrate เพยงอยางเดยวได จะเจรญและให alkaline product เกดขน ซงเปนผลให indicator ในอาหารเลยงเชอซงไดแก bromthymol blue เปลยนจากสเขยวเปนสนาเงน

สงทตองใชSimmons’ citrate agar slant วธทดสอบinoculate เชอทตองการทดสอบโดยการ streak บนผว Simmons’ citrate agar slant ไมตอง

stab แลว incubate 37 องศาเซลเซยส นาน 24-48 ชวโมง สงเกตการเปลยนสของ medium และการเจรญของแบคทเรย

การอานผล ผลบวก : มแบคทเรยขนและ medium เปลยนสจากสเขยวเปนสนาเงน ผลลบ : ไมมแบคทเรยขนและ medium ไมเปลยนส (สเขยว)

164

ENTEROBACTERIACEAE

Organism TSI H2S mot ind cit ure LDA

mal OD man ara rha sor LDC

Citrobacter amalonaticus K(A)/A - + + + + -/- -

C. diversus K(A)/A - + + + +/- -/- +

C. freundii K(A)/A + + - + +/- -/-

Edwardsiella tarda K/A + + + - - -/+

Enterobacter aerogenes A/AG - + - + - -/+ + + + +

Ent. agglomerans A/AG - + - +/- - -/+ - + + -

Ent. cloacae A/AG - + - + +/- -/- + + + +

Ent. gergoviae A/AG - + - + + -/+ + + + -

Ent. sakazakii A/AG - + - + - -/- + + + -

Escherichia coli A(K)/AG - +/- + - - -/+

Hafnia alvei K/A - + - - - -/+ + + + -

Klebsiella oxytoca A/AG - - + + + -/+ -

K.ozanae K(A)/AG - - - -/+ - -/- - -

K. pneumoniae A/AG - - - + + -/+ -

K. rhinoscleromatis K(A)/AG - - - - - -/- + -

Morganella morganii K/A - + + - + +/-

Proteus mirabilis K(A)/AG + + - +/- + +/-

Prot. penneri K/A - + - - + +/-

Prot. vulgaris K(A)/A + + + -/+ + +/-

Providencia alcalifaciens K/A - + + + - +/- -

Prov. rettgeri K/A - + + + + +/- +

Prov. stuartii K/A - + + + -/+ +/- -

165

ENTEROBACTERIACEAE (ตอ)

Organism TSI H2S mot ind cit ure LDA

mal OD man ara rha sor LDC

Salmonella choleraesuis K/A +/- + - -/+ - -/+ +

S. enteritidis K/A + + - + - -/+ +

S. paratyphi A K/A - + - - - -/- +

S. typhi K/A +w + - - - -/+ -

Serratia marcescens K(A)/A - + - + - -/+ + - - +

S. liquefaciens A/A - + - + - -/+ + + - +

S.rubidea K(A)/A - + - + - -/+ - + - -

Shigella boydii(C) K/A - - -/+ - - -/- - +

S. dysenteriae(A) K/A - - -/+ - - -/- - -

S. flexneri(B) K/A - - -/+ - - -/- - +

S. sonnei(D) K/A - - - - - -/- + +

Yersinia enterocolitica K/A - - -/+ - +/- -/- + + - +

Y. pestis K/A - - - - - -/-

Y. pseudotuberculosis K/A - - - - + -/-

หมายเหต ยกเวน LDA/LDC

: +/- = +>-

: -/+ = ->+

+ = >= 80% ใหผล +

- = <= 20% ใหผล -

166

บรรณานกรม แหลงขอมล http://wulib.wu.ac.th

ดวงพร คนธโชต. อนกรมวธานของแบคทเรยและปฏบตการ. กรงเทพฯ : โอเดยนสโตร, 2537. 202 หนา : ภาพ ประกอบ ; 24 ซม. (QR81 ด5อ 2537)นงลกษณ สวรรณพนจ และ ปรชา สวรรพนจ. จลชววทยาทวไป. พมพครงท 2. กรงเทพฯ : สานกพมพจฬาลงกรณมหาวทยาลย, 2541. 735 หนา : 26 ซม. (QR41.2 น2จ 2541)

นนทนา อรณฤกษ. การจาแนกแบคทเรยกลมแอนแอโรปส = Classification of anaerobic bacteria. กรงเทพฯ : โอเดยนสโตร, 2538. 185 หนา : ภาพประกอบ ; 24 ซม. (QR89.5 น63ก 2538)

วลาวณย เจรญจระตระกล. จลนทรยทมความสาคญดานอาหาร. กรงเทพฯ : โอเดยนสโตร, 2539. 258 หนา : ภาพประกอบ ; 24 ซม. (QR115 ว6จ 2539)

สมบรณ ธนาศภวฒน. เทคนคการเกบรกษาจลนทรย = Preservation techniques of microorganisms.พมพครงท 2. กรงเทพฯ : สานกพมพจฬาลงกรณมหาวทยาลย, 2544. 193 หนา : ภาพประกอบ ; 21 ซม. (QR151 ส4ท 2544)

สวณ สภเวชย และ มาลย วรจตร. แบคทเรยพนฐาน = Basic bacteriology. พมพครงท 2. กรงเทพฯ : โรงพมพศรยอด, 2540. 248 หนา : ภาพประกอบ ; 26 ซม. (QR82.Z9 ส7บ 2540)

อมรวฒน นาวหวาน. การปนเปอนทางแบคทเรยในภาชนะสมผสอาหาร : กรณศกษา : รานจาหนายอาหารมหาวทยาลยวลยลกษณ. นครศรธรรมราช : สานกงานสาธารณสขอาเภอทาศาลา, 2542. 38 หนา ; 29 ซม. (QR75 อ4ก 2542)

Kaiser GE. Biol 230 Laboratory Manual. [Online] Available from url; http://www.cat.cc.md.us/courses/ bio141/labmanua/toc.html. Accessed on June 2001.

Pacarynuk LA and Danyk HC. Principles of Microbiology (LABORATORY MANUAL). The University of Lethbridge. May 2002.

Troy Biologicals. Microbiology and Medical Supplies!. [online] Available from homepage url; http://www.troybio.com/images/Product_Images_BBL/BBL.htm. Accessed on May 2002.

©©©©©©©©