50 години ИИРХМеждународна научно-практическа конференция

""ХХррааннии,, ттееххннооллооггииии ии ззддррааввее""Сборник доклади

50 years FoodRDIInternational Scientific-Practical Conference

""FFoooodd,, TTeecchhnnoollooggiieess && HHeeaalltthh""Proceedings Book

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА БИОЛОГИЧНО АКТИВНИ ВЕЩЕСТВА В КЛУБЕНИ НА ТОПИНАМБУР (Helianthus tuberosus L.)

Н. Тр. Петкова1, Р. З. Вранчева2, И. Г. Иванов1, П. П. Денев1, Ат. И. Павлов1,4, Й. Н. Алексиева3

1Катедра „Органична химия“, 2Катедра „Аналитична химия“, 3Катедра „Хранене и туризъм“,

Университет по хранителни технологии – гр. Пловдив, бул. Марица 26, 4Институт по микробиология – БАН

E-mail: petkovanadejda@abv.bg, denev57@abv.bg

ANALYSIS OF BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCES IN TUBERSOF JERUSALEM ARTICHOKE (Helianthus tuberosus L.)

N. Tr. Petkova1, R. Z. Vrancheva2, I. G. Ivanov1, P. P. Denev1, A. I. Pavlov1,4, J. N.Aleksieva3

1Department of Organic Chemistry,2Department of Analytical Chemistry,

3Departament of Catering and Tourism,University of Food Technology, 26, Maritza Blvd., Plovdiv, 4002

4The Stephan Angeloff Institute of Microbiology, BASE-mail: petkovanadejda@abv.bg, denev57@abv.bg

Резюме Проведени са ултразвукова и микровълнова екстракции на клубени от топинамбур с вода, метанол и

70%-ен етанол. Съдържанието на фруктани (40-67 % с.в.) е установено чрез резорцинолов метод и TLC анализ. Определено е количеството на общите феноли и флавоноиди в екстрактите, кaкто и антиоксидантната им активност чрез методите DPPH, ABTS, FRAP и CUPRAC. Най-висока е антиоксидантна активност на етанолния екстракт от микровълновата екстракция, което се свързва с високото количество общи феноли.

Ключови думи: инулин, резорцинолов метод, общи феноли, антиоксидантна активност, Helianthus tuberosus L.

AbstractThe ultrasonic and microwave assisted extractions of tubers from the Jerusalem artichoke (Helianthus tuberosus

L.) with water, methanol and 70 % ethanol were carried out. The fructan contents (40-60 % dw) were analyzed by theresorcinol method and TLC analysis. The total phenolic contents and the total flavonoid concentration of the extractswere estimated, as their antioxidant activities were determinated by DPPH, ABTS, FRAP and CUPRAC methods. Theethanol extracts obtained by the microwave extraction showed the greatest antioxidant activity, which was probablydue to the highest content of total phenols.

Key words: inulin, resorcinol assay, total phenols, antioxidant activity, Helianthus tuberosus L.

Увод Helianthus tuberosus L. е многогодишно растение от семейство Сложноцветни – Asteraceae

(Compositae), което произхожда от Северна Америка [14]. В България то е известно под различни

049

наименованията: топинамбур, гулия, земна ябълка или йерусалимски артишок [2]. Днес в световен мащаб топинамбурът се отглежда за получаване на фураж, биоетанол и за производство на биомаса (под формата на стъбла и клубени) [14, 17]. Той е преспективна суровина както в областта на хранителната индустрия за производството на функционални храни и напитки, така и във фитотерапията и лечебната козметика [4]. Това, което го отличава от другите преработвани растителни суровини, е богатият въглехидратен комплекс и преди всичко високото съдържание на полизахарида инулин в подземните му органи - клубени.

Инулинът е фруктан, чиято верига е съставена основнo от β-(2→1) фруктозилфуранозилни остатъци, която обикновено, но не винаги завършва с един α-глюкопиранозен остатък [21, 26]. Степента му на полимеризация (DP) варира от 2 до 70. Олигофруктозите (или фруктоолигозахаридите) са фруктани от инулинов тип с DP между 2 и 12 [21]. Инулинът и олигофруктозите спадат към групата на разтворимите диетични влакнини и действат като пребиотици, тъй като стимулират растежа на Bifidobacteria, които от своя страна ги ферментират до късоверижни мастни киселини предимно оцетна и пропионова и до газове [12]. Тези фруктани от инулинов тип понижават нивото на холестерола и кръвната захар, а по последни изследвания притежават антиракови и имуностимулиращи свойства [10].

Съдържанието на инулин в топинамбура варира в границите 7-30 % за свежа маса и е >75 % (средно 50 %) [6, 14], отнесено спрямо сухо вещество. В състава на Helianthus tuberosus L.преобладава главно нискомолекулната фракция фруктани, като 20 % от веригите са с DP>10 [3, 9, 14].

Клубените на топинамбура са богат източник на минерали, витамин С и витамини от група B; 2,5-дихидроксибензоена киселина, хелиангин (регулиращ растежа на растенията) и спермин [2], сескитерпена β-бизаболен, на който се дължи характерния аромат на термично необработените клубени [14]. В клубените му се съдържат още полифенолите съединения: 4-хидроксибензоена киселина, кафеeна, ферулова, хлорогенова, р-кумарова и ванилинова киселина, които играят важна роля в потъмняването на клубените при технологичната им обработка [1, 2].

Поради богатото съдържание на биологично активни вещества в клубените на топинамбур, за екстрахирането им се използват различни техники с цел по-пълното им извличане и запазване на тяхната активност. В литературата за екстракция и изолиране на инулин и фруктоолигозахариди от са описани и разработени много методи, които се основават главно на водна екстракция с горещa вода [3, 8], ускорена екстракция с различни разтворители [22], ултразвукова, микровълнова екстракции [13, 18] и екстракция при високо хидростатично налягане. Последната екстракционна техника съчетана с ензимно действие показва значителни предимства при извличане на фруктоолигозахариди и други биологично активни вещества, съдържащи се в топинамбура [15].

Освен в листата на растението, където се откриват в значително количество, флаваноиди се съдържат и в клубените на Helianthus tuberosus L. [27]. За провеждане на екстракцията им се използват предимно водно-алкохолни разтвори [19]. Клубените на топинамбура се отличават и с висока антиоксидантна активност [23], като в епидермиса им се акумулират полифеноли в по-високи концентрации. На този факт се дължи и по-висока антиоксидантна активност на получените от клубените екстаркти [24].

Цел на настоящето изследване бе анализът на въглехидратният състав на клубени от топинамбур отглеждан в България, както определянето на антиоксидантната активност на екстракти, получени от него. Изследвани са два метода за екстракция (ултразвуково и микровълново въздействие) и три различни екстрагента (метанол, 70%-ен етанол и вода), за да се установят най-подходящите условия за екстракция на фруктани и биологично активни вещества с антиоксидантна активност.

Материали и методи Kлубените на топинамбура (Helianthus tuberosus L.) са събрани през месец септември на 2011 г.

от района на с. Костиево, обл. Пловдив. След измиване, нарязване, изсушаване и смилане те са пресяти през лабораторно сито с диаметър на светлия отвор 1 mm. Влагата в брашното от клубени е определна по метод AOAC 945.32 чрез сушене на корените при 105 °C до постоянно тегло [7].

Ултразвукова екстракция. Ултразвуковата екстракция е проведена във вана SIEL UST 5.7-150 (Gabrovo, Bulgaria) с

честота на ултразвука 36 kHz и ултразвукова мощност 240 W. Екстракцията на клубените от топинамбур е извършена в три центрофужни епруветки с винт и вместимост от 15 ml, в които

050

предватително се претеглят по 0,5 g брашно от смлени клубени. Към всяка проба е прибавен по 10 ml екстрагент, съответно: метанол, 70 %-ен етанол и вода. Ултазвуковата екстракция е проведена при температура 50 °С, в продължение на 15 min и честота на ултразвука 36 kHz. Всеки от получените екстракти се филтрува през хартиен филтър с диаметър на порите 0,45 μm. Екстракционният процес се повтаря трикратно.

Микровълнова екстракция. Микровълновата екстракция е извършена в микровълнова фурна CROWN с мощност 700 W и

честота 2450 MHz в продължение на 4 min при средна мощност 541 W. Екстракционният процес отново се извършва в три центрофужни епруветки със същите екстрагенти, както в описаната по-горе процедура. След края на екстракцията пробите екстрахирани със съответния разтворител се филтруват през хартиен филтър с диаметър на порите 0,45 μm. Екстракционният процес се повтаря още два пъти.

След приключване на трикратната екстракция със съответния разтворител проведена под микровълново или ултразвуково въздействие се отчита се общият екстракт получен за всеки екстрагент. Всяка проба се разработва с по 3 повторения.

Тънкослойна хроматография (TLC). На TLC плака Kieselgel 60 F254 (Merck, Germany) се накапват по 5 μl от съответния метанолeн,

етанолeн и водeн екстракт. Като стандарти се използват по 5 μl глюкоза, фруктоза, захароза (Sigma Aldrich), олигофруктози (Frutafit CLR с DP 7-9 и Frutafit HD с DP 9-12), инулин (Frutafit TEX, със средна DP 22 и Raftiline HP с DP 25), всички с концентрация 2 mg/ml. За развитието на тънкослойните хроматограми се използва мобилна фаза със състав: n-BuOH:i-PrOH:H2O:CH3COOH (7:5:4:2), а визуализирането им се осъществява с дифениламин-анилин-H3PO4-ацетон (1:1:5:50) [18].

Спектрофотометрично определяне количеството на фруктани в клубени на топинамбур. Количеството на фруктаните (инулин и фруктоолигозахариди) в метанолните, етанолните и водните екстракти е определно чрез разработен от нас спектрофотометричен метод базиран на позната реакцията на Селиванов [5]. За анализа е използван кетозо-специфичният реактив резорцинол, който в присъствие на фруктани води до получаване на цветното съединение, чиято абсорбцията се измерва при дължина на вълната 480 nm [6].

Определяне на общи феноли и флаваноиди. Количеството на общи феноли в получените екстракти е определено по метода на Folin–

Ciocalteu [24]. Резултатите са представени като милиграм еквиваленти галова киселина. Съдържанието на общи флавоноиди в екстрактите също е определено спектрофотометрично [16]. Резултатите са представени като милиграм еквиваленти кверцетин.

Анализ на антиоксидантната активност. Антиоксидантната активност на получените екстракти от клубени на Helianthus tuberosus L.

след ултразвуково и микровълново въздействие e определена по четири метода:DPPH метод. Изследваният екстракт (0,15 ml) се смесва с 2,85 ml прясно приготвен разтвор на

DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) (0,1 mM в метанол). Реакционната смес се инкубира на тъмно за 15 min при 37 °С. Редукцията на абсорбцията се отчита спектрофотометрично при 517 nm [16].

ABTS метод: ABTS радикалът се приготвя чрез смесване в еквимоларни количества ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (7 mM в д. H2O) и калиев персулфат (2,45 mM във вода) и престой за 16 h на тъмно. Преди анализ 2 ml от ABTS радикала се разтварят в метанол в съотношение 1:30 до получаване на крайна адсорбция 1,0÷1,1 при 734 nm. За анализа: 0,15 ml от изследвания екстракт се смесва с 2,85 ml прясно приготвен разтвор на ABTS радикала. Реакционната смес се инкубира на тъмно за 15 min при 37 °С. Редукцията на адсорбцията се отчита спектрофотометрично при дължина на вълната 734 nm [20].

FRAP метод: Реагентът се приготвя от смесването на предварително приготвени 0,3 М ацетатен буфер с рН 3,6, 10 mM 2,4,6-tripyridyl-s-triazine (TPTZ) и 20 mM FeCl3x6H2O в съотношение 10:1:1. Изследваният екстракт (0,1 ml) се добавя към 3 ml FRAP реагент. Реакционната смес се инкубира за 5 min при 37 °С на тъмно. Абсорбцията на формираното цветно вещество се измерва придължина на вълната 593 nm [11].

051

CUPRAC метод: Инициирането за протичане на реакцията започва чрез смесване на 1 ml CuCl2x2H2O, 1 ml Neocuproin (7,5 mM в метанол),1 ml 0,1 М амониев ацетатен буфер с рН 7; 0,1 ml от изследвания екстракт и 1 ml д. H2O. Реакционната смес се инкубира за 20 min при 50 °С на тъмно. След охлаждане на сместа абсорбцията на полученото съединение се отчита при 450 nm [20].

Резултатите и от четирите метода са представени като милимола Trolox еквиваленти (mM TE). Статистическата обработка на получените резултати е извършена с програма MSExcel 2010.

Резултати и обсъждане Представените резултати от TLC анализа (Фиг. 1) на метанолните, 70 %-ните етанолни и

водните екстракти, получени при ултразвукова и микровълнова екстракции на изследваните клубени от топинамбур показват, че във всички проби се открива наличие на фруктоза и захароза. Характерно за фруктановия профил на растението Helianthus tuberosus е високото съдържание на фруктоолигозахариди със средна степен на полимеризация DP 12, сравнена със стандартите фруктоолигозахариди Frutafit CLR (DP 7-9) и Frutafit HD (DP 9-12). Използването на метанол (17 и 18) като екстрагент благоприятства за фракционирането на олигофруктози от клубени на топинабур, тъй като в тези екстракти почти не се наблюдава наличие на високомолекулен инулин с DP 22. При екстракциите проведени с вода и 70 %-ен етанол в по-голяма спепен се извличат фруктоолигозахариди, както и инулин, подобен на използваните страндти с DP 22 и 25. Получените резултати покават, че клубените на Helianthus tuberosus L. са богат източник на фруктоолигозахариди и инулин - разтворими фибри, за които е известно, че оказват благоприятен ефект върху гастроинтестиналния тракт при човека [10,12].

Фиг. 1 Тънкослойна хроматограма на екстракти от топинамбур (Heliathus tuberosus L.)получени при ултазвуково въздействие с екстрагентите метанол (17), 70 %-ен етанол (13), вода (14) и

при микровълнова екстракция с метанол (18), 70 %-ен етанол (15), вода (16); стандарти Glu - глюкоза, Fru - фруктоза, Suc - захароза, фруктоолигозахариди: CLR - Frutafit CLR (DP 7-9) и HD -

Frutafit HD (DP 9-12); инулин: TEX -Frutafit TEX (DP 22) и RH -Raftiline HP (DP 25)

Таблица 1 Съдържание на фруктани от инулинов тип в екстракти от клубени от топинамбур Вид на екстракцията Ултразвуково въздействие Микровълново въздействие Използван екстрагент CH3OH 70%

C2H5OHд. H2O CH3OH 70%

C2H5OHд. H2O

Фруктани (инулин и ФОС*) и фруктоза, %, d.w**

3,9±0,5 46,5±0,4 65,8±1,2 3,1±0,7 44,5±0,3 22,6±2,1

*ФОС –фруктоолигозахариди, **dw– сухо вещество.

Според получените резултати от резорциноловия спектрофотометричен метод за определяне на фруктоза и фруктани, като най-подходящи разтворители за екстракцията на инулин и фруктоолигозахариди от клубени на топинамбур при ултазвуково и микровълново въздействие трябва да се използват 70 %-ен етанол и дестилирана вода (Табл.1). Най-висок добив на фруктани се получава при водна екстракция, съчетана с ултразвуково въздействие - 65,8 % с.в. По-ниският добив, получен при проведената микровълнова екстракция най-вероятно се дължи на кратката

052

продължителност на екстракционния процес – само 4 мин. По-продължителна екстракция при 700 W води до загуби на екстрагент и неудобство при пробоподготовка.

Таблица 2 Антиоксидантна активност на екстракти от клубени на топинамбур Вид на екстракцията

Ултразвуково въздействие Микровълново въздействие

Използван екстрагент

CH3OH 70 %C2H5OH

H2O CH3OH 70 %C2H5OH

H2O

DPPH(mM TE*/g dw)

73,95±0,12 84,72±0,11 н.а. 68,73±0,12 166,25±0,15 3,62±0,17

ABTS(mM TE/g dw)

48,06±0,23 65,91±0,21 н.а. 39,59±0,20 137,60±0,23 47,32±0,19

FRAP(mM TE/g dw)

31,00±0,14 61,48±0,17 17,27±0,16 31,02±0,16 105,31±0,13 28,17±0,19

CUPRAC(mM TE/g dw)

105,43±0,21 143,23±0,12 64,91±0,13 83,94±0,24 257,40±0,32 83,50±0,24

Общи феноли (mg GAE**/g dw)

5,67±0,21 6,70±0,19 5,97±0,24 3,73±0,27 10,53±0,24 5,24±0,27

Общи флавоноиди (mg EQ***/g dw).

6,15±0,31 16,75±0,27 12,75±0,23 5,63±0,11 25,64±0,20 12,03±0,15

н.а – не е отчетена активност; *TE – Trolox еквиваленти, **GAE – еквиваленти галова киселина ***EQ еквиваленти кверцетин.

Получените резултати от антиоксидантната активност на изследваните екстракти показват, че етанолът (70 %) е най-подходящият екстрагент за екстракция на вещества с антиоксидантно действие (Табл. 2). Максимално е и количество на общи феноли и флавоноиди извлечени с този екстрагент. При микровълново въздействие количеството на екстрахираните фенолни съединения и флавоноиди (10,53±0,24 mg GAЕ/g dw; 25,64±0,20 mg EQ/ g dw) е съответно по-високо с 58 % и 65 % спрямо количествата получени в екстрактите при ултразвуково въздействие. На този факт се дължи и най-високата отчетена антиоксидантна активност на тези екстракти от клубени на топинамбур, както при методите определящи радикал улавяща активност на антиоксиданта (DPPH и ABTS), така и при методите, отчитащи степента на електронен трансфер на антиоксиданта към радикала (FRAP и CUPRAC). Анализираните клубени на топинамбур от есенната реколта се отличават с по-високо съдържание на общи феноли в сравнение с тези събрани през пролетния сезон [24]. Освен това екстрактите от изследваните български клубени на Helianthus tuberosus L. показват значително по-висока антиоксидантна активност в сравнение с публикуваните данните за китайски сортове [23].

Заключение При изследваните от нас условия най-голямо количество инулин и фруктоолигозахриди от

топинамбур (Helianthus tuberosus L) се извличат при водна екстракция съчетана с ултразвуково въздействие. Най-подходящият екстрагент за извличане на биологично активни вещества с антиоксидантно действие е 70 %-еният етанол. Получените при микровълнова екстракция етанолни екстракти от клубени на топинабур показват най-висока антиоксидантна активност и по четирите използвани метода DPPH, ABTS, FRAP, CUPRAC. Получените резултати показват, че освен като източник на диетични фибри – инулин и олигофруктози, клубените на топинамбура (Helianthustuberosus L.) са преспективна суровина за извличане на биологично активни вещества с високо антиоксиданто действие.

Благодарности Авторският колектив изказва благодарности на проект BaSe Food n.227118 на Европейската

комисия по Седма рамкова програма (FP7/2007-2013) за оказаната финансова подрепа.

Литература [1] Бредихина, В. А., В. Ю. Бархатов (1998). Способ производства пюреобразных консервов на основе

топинамбура. Росс. патент, RU 2105499 С1.

053

[2] Делчев Н., (2010). Изолиране, химична, физикохимична и технологична характеристика на въглехидратния състав на Helianthus tuberosus L. Дисератция за получаване на научнa и-образователната степен „доктор“, УХТ, Пловдив, стр. 3,14-18.

[3] Денев, П. П., Н. Д. Делчев, Г. Т. Добрев, И. Н. Панчев, Н. А. Кирчев, (2010). Изолиране и характеристика на инулин от топинамбур. ISSN 1311-0179. Списание „Хранително-вкусова промишленост”, бр. 3, 47-5.

[4] Петков, В.,( 1982). ред. Съвременна фитотерапия. Мед. и физк., София. [5] Петкова, Н., М., Саватинова, Б.,Витанова, П., Денев, (2011). Спектрофотометричен метод за

определяне на фруктани в храни. Научни трудове на Пловдивски университет „Паисий Хилендарски“ – Химия, т. 38, кн. 5, с. 47-55.

[6] Петкова Н., Денев П., (2012). Екстракция и определяне на фруктани (инулин и олигофруктози) в лечебни растения. Екология и здраве. Сборник на докладите от деветата научно-техническа конференция с международно участие. ISSN 1314-1880. Академично издателство на Аграрния университет. Пловдив. 399-404.

[7] AOAC International (2007). Official methods of analysis, 18th edn, 2005; Current through revision 2, 2007(On-line). AOAC International, Gaithersburg, MD

[8] Abou-Arab, A., H. Talaat, F. Abu-Salem, (2011). Physico-chemical properties of inulin produced fromJerusalem artichoke tubers on bench and pilot plant scale. Australian J. of Basic and Applied Sciences, 5(5): 1297-1309

[9] Bagaoutdinova, R. I., G. P. Fedoseyeva, Т. F. Okoneshnikova (2001). Fructose-containing carbohydrates in plants of different families localization and content. Chemistry and Comp. Simulation, Butlerov Com. Vol. 2, No.5.

[10] Barclay, T., M. Ginic-Markovic, P. Cooper, N. Petrovsky, (2010). Inulin - a versatile polysaccharide withmultiple pharmaceutical and food chemical uses. J. Excipients and Food Chem. 1 (3).

[11] Benzie I.F.F and J.J. Strain,(1996). Ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of “antioxidantpower”: The FRAP assay. Anal. Biochem. 239, 70-76

[12] Gibson G. R. and M. B. Roberfroid, (1995). Dietary modulation of the human colonic microbiota:introducing the concept of prebiotics. J Nutr. 125, 1401–1412

[13] Hu JianFeng; Qiu ShuYi, (2009), Comparison of different inulin extraction technologies from Jerusalemartichoke. Guizhou Agricultural Sciences. No. 10, 181-183

[14] Kays, St. J., St. F. Nottingham, (2008). Biology and Chemistry of Jerusalem artichoke: Helianthustuberosus L. CRC Press.

[15] Kim D., J.P. Fan, H.Ch. Chung, G. D. Han, (2010). Changes in extractability and antioxidant activity ofJerusalem artichoke (Helianthus tuberosus L.) tubers by various high hydrostatic pressure treatments. Food Science andBiotechnology. Vol. 19, No 5.

[16] Kivrak I., M.E. Duru, M. Öztürk, N. Mercan, M. Harmandar, G. Topçu, (2009). Antioxidant,anticholinesterase and antimicrobial constituents from the essential oil and ethanol extract of Salvia potentillifolia. FoodChem., 116:470-479

[17] Li, X., S. Hou, M. Su, M. Yang, S. Shen, G. Jiang, et al. (2010). Major energy plants and their potential forbioenergy development in China. Environmental Management. 46. 579–589

[18] Lingyun W., W. Jianhua, Zh. Xiaodong, I. Da, Y. Yalin, C. Chenggang, F. Tianhua, Zh. Fan,( 2007).Studies of the extraction technical conditions of inulin from Jerusalem artichoke tubers, Journal of Food Engineering.Vol. 79, 1087-1093

[19] Liu L., T. Kong, H. Wang, W. Ma, (2008). Extraction Technic of Flavonoids from Halianthus Tuber.Journal of Shanxi Agricultural Sciences. Vol.9

[20] Marchev, A., A. Petrova, D. Nedelcheva, I. Lazarova, B. Trucheva, N. Kostova, V. Bankova, A. Pavlov(2011). GS/MS profiles and antioxidant activity of extract from Lavandula vera MM and Rosa damascene Mill. cellsuspension cultures. Scientific works-UFT. Vol. LVIII (2). 183-188.

[21] Niness K.,(1999). Inulin and Oligofructose: What Are They J. Nutr. July 1. vol. 129 no. 7 , 1402S-1406s.[22] Saengkanuk, А., Nuchadomrong, S., Jogloy, S., Patanothai, A., Srijaranai, S., (2011), A simplified

spectrophotometric method for the determination of inulin in Jerusalem artichoke (Helianthus tuberosus L.) tubers. EurFood Res Technol. 233:609–616

[23] Saikaew, S., R. Tangwongchai, and A. Sae-Eaw, (2010). The effect of temperature and storage time on thechemical and physical compositions changes of KaenTaWan (Helianthus tuberosus L.) tubers after harvesting.Agricultural Science J. Vol. 41. No.3/1 (Suppl.) p 249-252.

[24] Seljåsen, R., Slimestad, R., (2005), Fructooligosaccharides and phenolics in flesh and peel of springharvested Helianthus, SHS Acta Horticulturae 744: I International Symposium on Human Health Effects of Fruits andVegetables

[25] Stintzing F. and K. Nerbach (2005). Color, betalain patern and antioxidant properties of cactus Pear(Opuntia spp.) clones agric. Food Chem. 53: 442-451

[26] Van Laere, A. and Van Den Ende, (2002). Inulin metabolism in dicots: chicory as a model system. Plant,Cell and Environment. 25. 803-813

[27] Yang M., L. Wang, J. Wu, Zh. Li, (2011). Study on Antioxidant Activity of Flavonoids from Helianthustuberosus L. leaves in vitro, Guizhou Agricultural Sciences, vol. 4.

054