結核菌鑑定-ICT method

林口長庚醫院 醫檢部

郭安靜

2013/9/5, 2013/9/6

1

大綱

• Introduction

• Identification of Mycobacterium --Immunochromatographic test (ICT) – BD MGIT™ TBc Identification Test

– TiBiliaTM (Capilia TB test)

– SD Bioline TB Ag

• 結核菌認可實驗室結核鑑定-ICT調查表

• Conclusion

2

Policy Framework for Implementing New Tuberculosis Diagnostics, WHO. 2010

3

M. tuberculosis identification

Positive

AFB culture

Morphology

Phenotypic Approach

Biochemical

and growth tests

(Slow)

Genotypic

Approach

DNA probes

DNA Sequencing

with amplification

w/o amplification

Molecular

biology

Immunochromatography

(fast)

4

Identification of M. tuberculosis

• Culture – Conventional biochemical test

– High-performance liquid chromatography (HPLC)

– Nucleic acid amplification test (NAATs)

– Immunochromatographic test (ICT)

5

Identification procedure

• Phenotypic methods

CLSI, M48-A 6

Morphology-M. tuberculosis

• Flocculation(絮凝): granular, non-homogeneous suspension

• Acid fast stain from broth：cord-like appearance

serpentine cords

of varying length

or district linear clumping

7

Cords

Long striped bacilli

GNB-like

Fine-striped

Sea urchin

Long bacilli

Short bacilli

Eur J Clin Microbiol Infect Dis (1998) 17:493-500 8

Eur J Clin Microbiol Infect Dis (1998) 17:493-500

Sensitivity 74.5%, specificity 98%, PPV 96%, NPV 84%

J Clin Microbiol 2000;38:1426-1429

Sensitivity 90%, specificity 100%, PPV 100%, NPV 83%

9

Morphology-M. tuberculosis

• Colony morphology: – buff-coloured (never pigmented)

– rough

– waxy

– appearance of bread crumbs(麵包屑) or cauliflower(菜花).

10

M. fortuitum/M. chelonae

• rapid-growers – produce visible colonies in

less than a week

– the time of subculture

• Colony : R/S

11

M. avium-introcellular complex

• dispersed aspect(分散)

• non-chromogenic mycobacteria

• Colony: St/R

Eur J Clin Microbiol Infect Dis (1998) 17:493-500 12

M. kansasii

• beaded appearance, strip

• Photochromogens

• Colony: SR/S

13

M. gordonae

• Scotochromogens

• Colony : S

14

Conventional biochemical test

+ +

15

MTB is a slow-growing microorganism: solid media

cultures should be read at day 2 for contamination

and then weekly for 8 weeks before being reported

as negative.

MTB colonies on solid media show a characteristic

morphology used for presumptive identification.

Presumptive identification from positive liquid culture

can be performed by ZN staining (presence of

“cords”).

Contaminated cultures showing presence of MTB

could be re-decontaminated.

Culture results should be recorded regularly and

reported promptly.

16

New Laboratory Diagnostic Tools for tuberculosis Control, WHO. 2008

17

Mycobacterium Diagnosis In Clinical Lab

Clinical Specimen

Culture Solid media

Liquid Media (MGITTM)

Identification

Biochemical

Molecular methodology

Rapid Test (ICT)

Susceptibility testing

Proportional Method

Modified Proportional Method (MGITTM)

Sample processing

21 Days

10 Days

14 -21 Days

15-30 Days

18 Days

4 + hours

15 min

21 Days

12 Days

18

結核菌鑑定-ICT method

19

Immunochromatographic test (ICT)

• A species-specific secreted antigen, MPT-64, ESAT-6/CFP10

• Simple. Easy. Accurate.

• Results in 15 minutes. – BD MGIT™ TBc Identification Test

– TiBiliaTM (Capilia TB test)

– SD Bioline TB Ag

– ESAT-6/CFP-10 complex strip assay (Formosa Biomedical Technology Corp., Taiwan)

20

Distribution of Diagnostic Antigens in mycobacterial species

The LANCET. 2000. 356: 1099-1104

21

Distribution of Diagnostic Antigens in mycobacterial species

The LANCET. 2000. 356: 1099-104 22

廠牌 BD TBC ID Tibilia SD Bioline TBAg

Antigen MPT64 MPT64 MPT64

Time 15 min 15 min 15 min

sample Positive MGIT liquid

culture colony, liquid

culture

Colony, Condensation fluid(Solid cultures) or

Liquid cultures 需要sample

量 100 μl 100 μl 100 μl

Positive result

M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, and M. microti

M.tuberculosis H37Rv, H37Ra, M.africanum, M.bovis deer, M.microti, M.bovis BCC-Tokyo, -Russia, -Moreau

M. tuberculosis complex, M. tuberculosis, M. africanum, and M. bovis

Negative result

NTM NTM, M.bovis BCG – Glaxo, -Pasteur, -

Tice NTM

Detection limit

5 × 105 CFU/ml 1.2 x 106CFU/mL 105 CFU/ml

23

廠牌 BD TBC ID Tibilia SD Bioline TBAg

Antigen MPT64 MPT64 MPT64

Time 15 min 15 min 15 min

產品限制

1.有些M. bovis BCG亞菌株不會產生MPT64, 造成陰性結果

2.MPB64 gene mutation

1.有些M. bovis BCG亞菌株不會產生

MPT64, 造成陰性結果

2.MPB64 gene mutation

3.檢體中含有可產生

protein A菌株(S. sureus)

1.有些M. bovis BCG亞菌株不會產生MPT64, 造成陰性結果

2.MPB64 gene mutation

備註 25 tests/kit 20 tests/kit 25 tests/kit

必須保存在2–35°C，不可冷凍。使用前必須回

復至室溫

必須保存在2–30°C，不可冷凍。使用前必

須回復至室溫

必須保存在1–30°C，不可冷凍。使用前必須回復

至室溫

*colony：1 μl loop colonies into 200 μl extraction buffer

*colony：3~4 colonies into 100 μl extraction buffer 24

1. Have a positive MGIT tube (manual or 960)

2. Perform an AFB smear and see AFB in smear from + tube

3. Pipette 100 uL from MGIT tube into device

4. Wait 15 minutes then read results

5. If positive, report as Mtbc. If negative, report as AFB, not Mtbc

Invalid Test Negative Test for TBc (no MPT64 antigen detected)

Positive Test for TBc (MPT64 antigen present)

TB

Pipette 100ul

MGIT+ AFB+

1 step

TBc ID

25

Specimen Preparation

Liquid

Media

Solid

Media

Stain

1. Mix well

2. 100 μl

1. 1 μl loop colonies

2. Extraction Buffer 0.2ml

3. Mix well

4. 100 μl

26

Operation and Interpretation

Minimum Detection Limit- 1.2 x 106 CFU/ml 27

SOP

• MGIT培養管呈現陽性並進行抗酸菌染色陽性之後，必須於10天內完成試劑組測試。

• 試劑組必須回溫至室溫下使用。

• 將抗酸性染色陽性的MGIT培養管均勻混合，不可離心。

• 打開MGIT培養管蓋子，用無菌的吸管取100 μL檢體加到已標示檢體編號的試劑接種區，關上MGIT培養管蓋子，開始計時15分鐘。

• 15分鐘後進行判讀，切勿超過60分鐘判讀。

28 CDC-SOP 初稿

Reading-positive

• 陽性(具有MPT64抗原)：在”T”位置及”C”位置均呈現紅至粉紅色線條。”T”位置及”C”位置的線條強度有可能不同。背景應為白色或是淡粉紅色。

29 CDC-SOP 初稿

Reading-Negative

• 陰性(不具有MPT64抗原)：在”C”位置呈現紅至粉紅色線條。此線條的顯現表示試劑的功能性正常以及操作步驟無誤。當陰性試驗發生時必需使用分子鑑定以偵測陽性MGIT培養管是否有MTBC核酸，分子鑑定未偵測到MTBC核酸才可以發MTBC陰性報告。

30 CDC-SOP 初稿

Reading-Invalid

• 無效試驗：在”C”位置沒有紅至粉紅色線條。或者背景值太深蓋過”T”位置及”C”位置判讀區域皆屬於無效試驗。當無效試驗發生時必需重複試驗。

31 CDC-SOP 初稿

Quality control

• 內部品管：每個試劑皆有內部品管，其結果顯示在反應區的”C”位置線條。此線條的顯現表示試劑的功能性正常以及操作步驟無誤。

• 外部品管：陽性及陰性外部品管應與檢體採取相同操作步驟。 – 取陽性MGIT培養管內含已知結核菌群(MTBC)為陽性品管液，結果應為陽性；

– 取未接種之MGIT培養管為陰性品管液，結果應為陰性。

32 CDC-SOP 初稿

J CLIN MICROBIOL, 2011, 49:4343-6 33

Meta-analysis : 20 study (3087 Mtb, 1900 NTM) Capilia TB test : 9 BioLine SD Ag : 5 MGIT TBcID: 7

J CLIN MICROBIOL, 2011, 49:4343-6

34

• The mpb64 gene was sequenced for 27 of 53 (51%) clinically independent isolates for which the MPT64 ICT gave a false-negative result, and a mutation was demonstrated in 23 (85%) of those 27 isolates

• Among 10 isolates that gave a false-positive MPT64 ICT result, 7 (3 M. kansasii, 2 M. avium complex [MAC], 1 M. chelonae, and 1 M. gordonae) were identified at the species level.

1.1%

0.2%

35 CDC-SOP 初稿

Limitation

• 本試劑無法排除細菌-結核菌群共同生長的干擾。

• 本試劑無法區分結核菌群(MTBC)中單一菌種。

• 本試劑結果應與病人臨床症狀及其他診斷方法合併考量作為判讀結果。

• 當MPT64抗原產生基因突變時，本試劑陰性結果

無法完全排除結核菌群(MTBC)的存在。

• 在結核菌群(MTBC中一些M. bovis BCG亞株因缺乏分泌MPT64能力，故無法為本試劑所偵測。

36 CDC-SOP 初稿

Limitation

• 檢體內有Staphylococcus aureus時，可能有偽陽性結果。

• 少數文獻報告M. marinum、M. flavescens有弱的陽性訊號，M. intracellulare、M. avium-intracellulare complex及M. chelonae有偽陽性結果。使用免疫呈色法陽性應同時注意固態培養基菌落型態及觀察液態培養基菌液外觀，MTBC生長通常為綿絮狀或顆粒狀，如果混濁通常為NTM或細菌生長情形，觀察抗酸菌染色抹片時，要注意是否有非抗酸菌體。如有上述情形，免疫呈色法結果陽性，應再進行分子鑑定確認。

37 CDC-SOP 初稿

Limitation

• 免疫呈色法靈敏度與MPT64在檢體內的量有關，MGIT培養管呈現陽性並進行抗酸菌染色陽性，但免疫呈色法陰性，可將檢體先置入培養箱培養3日後再重覆進行試驗。

38 CDC-SOP 初稿

結核菌認可實驗室結核鑑定-ICT調查表

分發32份

回收31份

回收率 (96.9%)

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實驗室目前使用結核菌鑑定主要的方法為？ • ICT (28/31=90%)

• 其他 – BluePointTM MycoID Kit

– MycoCheck, CMP

– Probe Tec

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目前 實驗室使用的ICT試劑廠牌？

• BD MGIT™ TBc (8/28=28.5%)#

• TibiliaTM (11/28=39.3%)*#

• SD Bioline TB Ag (12/28=42.9%)*

• 其他-X

*#二家使用二種廠牌

如果同時使用二種廠牌，需有comparison的結果

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實驗室何時開始使用 ICT作結核菌鑑定?

42

實驗室使用ICT鑑定的時機?

• MGIT陽性、AFB陽性之所有檢體。(19/28=67.9%)

• MGIT陽性、AFB陽性之檢體，每一位病人只作一支。(5/28=17.9%)

• MGIT陽性、AFB陽性、菌落疑似MTBC之所有檢體。(1/28=3.6%)

• MGIT陽性、AFB陽性、菌落疑似MTBC之檢體，每一位病人只作一支。(2/28=7.1%)

• 其他：MGIT陽性、AFB陽性之檢體，每位病人3個月內同類型檢體只作一支 (1/28=3.6%)

43

44

陽性件數 陽性人次 疑似MTBC件數 疑似MTBC人次 非ICT方法

-1 SD median +1 SD

90.9 97.7

疾管署閾值 90%

11.1%

33.3%

50%

操作的頻率 如果一個病人只做一支，少數TB mix NTM的情況下有可能遺漏TB

實驗室發MTBC陽性報告的條件？

• ICT陽性，即發MTBC。-X

• ICT陽性、配合AFB抺片有cord 的型態，發MTBC。(14/28=50%)*

• ICT陽性、配合菌落疑似MTBC型態，發MTBC。(19/28=67.9%)*

• 其他-X

• *四家使用二種方法

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實驗室發NTM陽性報告的條件？

• ICT陰性，即發NTM。-X

• ICT陰性、配合AFB抺片有無cord的型態，發NTM。(7/28=25%)*

• ICT陰性、配合菌落非MTBC型態，發NTM。(25/28=89.3%)*

• 其他(配合生化或分子鑑定結果)(8/27=29.6%) #

• *四家使用二種方法

• #同時配合菌落型態

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當ICT鑑定結果與特徵形態不合時，實驗室採用的不符合處理程序？

• 使用第二種鑑定方法 – NAAT (25/28=89.3%)*

– 傳統生化鑑定(5/28=17.9%)*

• *二家使用二種方法

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使用ICT鑑定MTBC之偽陽性情況？

• 偽陽性率 0.0002~1.4%。(5/28=17.9%)

• 目前為止，曾發現偽陽性1-12件。(8/28=27.5%)

• 未曾發現偽陽性。(13/28=46.4%)

• 其他-未提供。(2/28=7.1%)

• 三個廠牌皆有偽陽性

• 如菌落疑似MTBC之檢體作ICT，則無偽陽性

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使用ICT鑑定MTBC之偽陰性情況？

• 偽陰性率0.005-3.6%。(12/28=42.9%)

• 目前為止，曾發現偽陰性 1-16件。(10/28=35.7.0%)

• 未曾發現偽陰性。(4/28=14.3%)

• 其他-未提供。(2/28=7.1%)

• 三個廠牌皆有偽陰性

• 如疑似MTBC菌落之檢體作ICT或同一病人只作一次，則偽陰性偏高

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其他使用經驗可與各認可驗室作分享 • 判讀時需要與菌落型態一起確認

• 當band太弱時，須留意是否有偽陽性的情形

• 偽陽性問題，與試劑偶發的問題有關，發生率很低

• 偽陰性的問題，可能是有NTM同時存在而MTBC菌量很少所導致

• MGIT(+) AFS染色陽性後,放置於37 ℃三天後操作ICT,可以得到更明顯的ICT結果。

• 如果一個病人只做一支，少數TB mix NTM的情況下有可能遺漏TB。

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結論

• Studies have demonstrated that the rapid speciation tests compare favorably with other established phenotypic or genotypic methods.

• This test provides results within 15 minutes and is highly sensitive and specific (98.6% and 97.9%, respectively).

New laboratory diagnostic tools for tuberculosis control, WHO, 2008 51

結論

• No additional equipment or consumables are needed to perform the test and can detect TB even when mixed with nontuberculous mycobacteria.

• The test detects organisms belonging to M. tuberculosis complex but does not specifically identify M. tuberculosis strains.

New laboratory diagnostic tools for tuberculosis control, WHO, 2008 52

結論

• Expired reagents affect the results of identification tests.

• The immunochromatographic test allows fast identification of TB complex from positive cultures.

• 流程上應思考 – 配合菌落發報告

– 結核鑑定時效7天達成率 • 操作的時機點

• 操作的頻率

– 如何降低偽陽性及偽陰性

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Thanks for your attention

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