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无创性产前诊断 Non-invasive test for prenatal diagnosis. 浙江大学医学院附属妇产科医院 田永红. Non-invasive test for prenatal diagnosis. Overview. ★ 全世界每年约有 500 万缺陷儿出生，巨大的精神和经济负担。产前诊断， 及时 发现，及时终止妊娠是防治出生缺陷的重要措施。我国每年人口出生缺陷已达 80 ～ 120 万人，占我国出生人口的 4 ％～ 6 ％。. Women’s Hospital. Non-invasive test for prenatal diagnosis. - PowerPoint PPT Presentation
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无创性产前诊断Non-invasive test for prenat
al diagnosis
浙江大学医学院附属妇产科医院田永红
Overview
★ 全世界每年约有 500 万缺陷儿出生，巨大的精神和经济负担。产前诊断，及时发现，及时终止妊娠是防治出生缺陷的重要措施。我国每年人口出生缺陷已达 80 ～ 120 万人，占我国出生人口的 4 ％～ 6 ％。
Non-invasive test for prenatal diagnosis
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Overview
★ 产前诊断又称宫内诊断或出生前诊断，是指在胎儿出生前用各种方法诊断胎儿是否患有某种遗传病或先天性疾病的一种手段，是人类细胞遗传学、分子遗传学、生物化学和临床医学实践紧密结合的一门学科
★ 分为创伤性和无创性两种
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★ 母亲血清生物学筛查 ，单项检查阳性率低，特异性差，往往采用联合筛查的方法。
★ 植入前遗传学诊断 (preimplantation genetic diagnosis ， PGD)
★ 宫腔灌洗收集滋养细胞★ 超声检查、胎儿镜★ 羊水、绒毛★ 脐带血★X 线检查★ 磁共振成像检查★ 母血胎儿成分
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Overview
Summary
Fetal cells
Cell-free fetal (cff) DNA
Cell-free fetal (cff) RNA
母血胎儿成分
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Fetal cells
[1] 滋养层细胞 [2] 胎儿淋巴细胞[3] 胎儿粒细胞[4] 胎儿有核红细胞 (nucleated red blood cell ， NRBC
) 胎儿有核红细胞被认为是目前产前诊断最理想的
细胞，因其具有以下特点： 包含完整的胎儿基因组可反映胎儿全部遗传信息
；孕早期即出现在母体外周血中，且数量相对较多，孕 11 周时在母体循环中占全部红细胞总数的10% ，区别于其他细胞的形态学特征和多种筛选标记。
Non-invasive test for prenatal diagnosis
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Technologic consideration★ 根据 NRBC 的物理特性分离：包括密度梯度离
心法和显微操作分离★ 免疫学方法分离：磁性激活细胞分选法是利用
磁珠标记的抗体与相应细胞结合后在磁场作用下将 NRBC从母体血中分离
★ 最近报道的亲和素分离法，使大豆凝集素 (SBA)
与 NR—Bc表面半乳糖残基结合，分离胎儿 RBC
★由于缺乏一种完全特异性的筛选标记，且孕妇 外周血中的 NRBC 部分为母亲来源的，目前利
用 NRBC进行非创伤性产前诊断时，须对分离到的 RBC来源进行鉴定 :Y 染色体 PCR扩增； FISH鉴
定；基因连锁分析
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Clinical applications
★21三体， 13 三体综合征和 18三体综
合征★常染色体遗传病 地中海贫血 ★感染的产前诊断 HCMV★X连锁隐性遗传病 Duchenne 综
合征
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Consideration & prospect
★ 母体外周血中胎儿细胞数量极少，应用于产前诊断的关键在于细胞的分离，纯化和鉴定。目前还没有一种可靠的特异性检测手段可以简单的将母体外周血中的胎儿细胞分离出来，关于能否经过培养得到胎儿有核红细胞的克隆及具体培养条件等问题仍存在分歧。
★ 利用胎儿细胞进行产前诊断因其操作复杂，价格昂贵，目前也只是停留在实验室研究阶段，且只涉及到了胎儿性别诊断，非整倍体，部分单基因遗传病和感染性疾病的诊断，更多的疾病仍在探讨之中。这些都将是今后该领域的发展方向。
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Summary
Fetal cells
Cell-free fetal (cff) DNA
Cell-free fetal (cff) RNA
母血胎儿成分
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4
Cell-free fetal (cff) DNA
Lo YM, Corbetta N, Chamberlain PR, Rai V, Sargent IL, Redman CWG, Wainscoat JS.1997. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. Lancet 350:485–487.
Non-invasive test for prenatal diagnosis
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Tissue source
①主要源于胎盘滋养细胞 [Guibert et al., 2003, Hum Reprod 18:1733–1736.] ，小部分源于胎儿造血细胞 [Cheung et al.
, 1996, Nature Genet 145:264–268.] 。②胎儿组织在发育过程中自然凋亡，释放出的 DNA 经母 -
胎 界面进入母血循环中 [Bischoff et al., 2005, Repro BioMed Online 76:349–351.] 。③胎儿 DNA直接从胎儿组织中释放，经母 - 胎界面进入
母血中，药物终止妊娠的妇女血浆中的胎儿 DNA 含量持续升高直至胚胎排出 。
④妇血中胎儿细胞。胎儿细胞通过胎盘屏障渗透到母体，被母体的免疫系统识别为异物，受到免疫攻击，致使细胞核膜溶解， DNA释放入母血循环中。
⑤血浆中胎儿 DNA升高可能与其清除率下降有关，肝肾是清除胎儿 DNA 的主要器官，而一些妊娠合并症例如子痫前期 - 子痫，孕妇的肝肾功能下降，而导致胎儿游离 DNA 异常增高。
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Cff DNA Kinetics
DNA 的基本特点①含量是孕妇血液中胎儿细胞的 DNA 970倍
。②含量有一定的变化规律。妊娠第 5 周开始可
检出胎儿游离 DNA ，随着孕周增加而增加，存在个体差异。
③ 不同于母体 DNA 。妊娠后血浆母源性 DNA分子长度明显增加，而血浆胎源性 DNA 分子较母源性分子长度短很多，提取、分离胎儿 DNA更容易、便捷。
④分娩后短时间内消失，平半衰期为 16.3min (4-30min) ， 2h就无法检出。
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Technologic considerationPCR是目前用来定性和定量诊断胎儿 DNA的主要技术套式 PCR、引物延伸预扩增 [PEP]-
PCR法、实时荧光定量 Q-PCR法及比较基因组杂交 (comparative genome hybridization， CGH)等
。
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Clinical application
①性连锁疾病 ② Rh 血型不合
③父系遗传性疾病④染色体非整倍体胎儿⑤早产 [Farina et al., 2005 Am J Obstet Gynecol 193:4
21–425.]
另外，胎儿游离 DNA 水平的升高还与妊娠剧吐、羊水过多、子痫前期和 HELLP综合征等
有关。
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Consideration & prospect问题： [1] 胎儿 DNA 的释放机制未完全明了，参与的优势细胞群未证实；
[2] 母血循环中胎儿 DNA 是否有转录活性。最近发现，母胎血浆 DNA 的嵌和性也是一种双向现象，母血中可找到胎儿 DNA ，在胎血中也可找到母 DNA ，为进一步研究母胎之间交互作用的研究打开新局面
[3]提取： PCR假阴性、假阳性，性别的局限性，大部分染色体病不能有效诊断等。
展望： 1．广泛而深远的应用价值，必定会有更多胎儿 DNA遗传标志用于产前诊断
2．孕胎儿游离 DNA ，其浓度较高，比细胞法更快速、可靠、简便易行，而且产后短时间内即可清除，不干扰诊断，有利于临床推广。
3．很多病理妊娠的发病机制可通过研究母血中胎儿 DNA ，在分子水平上揭示疾病的发生、发展，发展趋势及预后。
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Summary
Fetal cells
Cell-free fetal (cff) DNA
Cell-free fetal (cff) RNA
母血胎儿成分
1
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3
4
Cell-free fetal (cff) RNA
Poon LLM, Leung TN, Lau TK, Lo YMD. 2000. Presence of fetal RNA in maternal plasma. Clin Chem 46:1832–1834.
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Tissue source
★ Fetal hematopoietic cells [Wataganara et al., 2004 Ann NY Acad Sci 1022:129–134.] and the placenta [Ng et al. 2003 Proc Natl Acad Sci USA 100:
4748–4753 & Tsui et al., 2004 J Med Genet41:461–497.]can contribute to the pool of cff mRNA d
etected in the maternal circulation.
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Cff mRNA Kinetics
①Placental mRNA transcripts can be detected in the plasma of a pregnant woman by the 4th week of gestation and have a median half-life of 14 min [Chiu et al., 2006 Clin Chem 52:313–316.].
② There appears to be a preponderance of 50 mRNA fragments of circulating placental RNA in maternal plasma [Wong et al., 2005 Clin Chem 51:1786–1795.].
③one important distinction between cff DNA and cff mRNA is that total cff RNA levels do not rise throughout pregnancy.
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Technologic considerations★ Messenger RNA, in general, is notoriously
unstable.
★ The authors also found that mRNAwas stable after a single freeze/thaw cycle. This unexpected finding suggests that cff mRNA might be stabilized through particle-binding [Ng et al., 2002 Clin Chem 48:1212–1217.].
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Clinical application
★ Circulating levels of mRNA have been used to diagnose both preeclampsia [Ng et al., 2003 Clin Chem 49:727–731.] and aneuploidy [Oudejans et al., 2003 Clin Chem 49:1445–1449.].
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Summary
Fetal cells
Cell-free fetal (cff) DNA
Cell-free fetal (cff) mRNA
母血胎儿成分
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Summary
★ 十多年来，取得了长足发展
★加深对生理妊娠、病理妊娠的理解
★ 发展方向：早期、快速、准确、无创伤、高通量、低成本和低劳动强度
Non-invasive test for prenatal diagnosis
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Non-invasive test for prenatal diagnosis
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一滴水，一滴水，
可以反映太阳的光辉！可以反映太阳的光辉！
一滴血，一滴血，
可以预测胎儿的健康？可以预测胎儿的健康？
Non-invasive test for prenatal diagnosis
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