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シーケンスのためのDesign Studioでのトラブルシュート-TSCAについて

シニアテクニカルアプリケーションサイエンティスト酒井名朋子

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本日のOutline

Design の過程

Design Studioでの言葉の定義

• Score• Coverage

Coverageを改善する

• SNPs• Specificity• GC content/ homopolymers• Cross binding

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本日のOutline

Design の過程





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アンプリコンのサイズを選択する(150, 175, 250, 425bp)– ターゲット領域におけるProbeの間隔を決定するパラメターとなります

ターゲット領域を入力する

– 位置情報(Coordinate)や遺伝子名を入力

– それぞれのターゲットサイズ: 1bp- 24kb– 各ターゲットの累積最大値: 650kb

隣り合うターゲット

– 近すぎるターゲットに対するWarining: 2つのターゲット領域が指定したアンプリコンサイズより小さい場合にはMergeされる

– Probeの設計領域 : coordinates ＋1アンプリコン分の長さまで設計領域と定義

– ターゲット領域をMergeすることでプローブ数を抑え、Designを改善させる

ProjectがDSにSubmitされると・・

– ターゲット領域において既知の変異やGC含量、リピート配列等がチェックされ

– ターゲット領域にProbeを充てる

cross binding、 overlap 、特異性についてProbe QCを行う

– DesignStudio はGapを埋めるために数度再設計を行う

– 最終Probeセットが計算され、結果として表示される

ターゲット配列

TSCA Design の過程について

250bp 250bp

Probe design される領域

ex: アンプリコン250bpの場合

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ターゲット名ターゲット位置情報(Coordinate)

ターゲットをカバーするために必要なア

ンプリコン数

SNPs を避けるかどうかのOption

ProbeによりカバーされるSNPs

アンプリコンによりカバーされる領域の割合％

Design 結果のスコア

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Scoreとは

– Design Score: AmpliconがWorkするかどうかを示すin silicoでの成功率

Probeと領域に存在するSNP、 GC 含量、特異性を元に算出

DesignStudio からはDesign StudioのProbe QCを通ったプローブのみを結果として表示

設計が難しい領域はScoreが下がる

Coverage とは

– ターゲット領域がアンプリコンによりカバーされる割合

– Probeが設計できないとCoverageが低くなる

SNPs 特異性

GC 含量/ホモポリマー

ProbeのCross binding


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本日のOutline

Design の過程





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SNPが存在するとアルゴリズムがProbeをデザインしづらくなる

– 特にAvoid SNPのOptinをONにした場合

SNPsが原因でCoverageが低くなる

* * * * * *** * *SNPの位置はdbSNP131 で定義されたもの

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Avoid SNPs を“Yes”にすると: ターゲット領域の一部のみしかカバーされないことがある

X X X X X X X X

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Avoid SNPs を“OFF”にすると: SNP にかかわらずProbeが設計されるのでカバーされる領域が増える

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✔

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“Avoid SNP” を “No”にすると:• Gapが減る• カバーされる領域が増える• カバーされるターゲット数が増える

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Oligo Poolに含まれるProbeは一定のスペックを満たさなければならない

SNPがProbeの設計に及ぼす影響

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Mean Coverageの0.2x以上でカバーされている領域

Mean Coverageの0.2x以下でカバーされている領域

Coverage

アンプリコン

でカバーされている

ターゲット領域の割合

MeanCoverageの0.2x



– Coverage Uniformityに関するスペック: 80% 以上のターゲット領域がMean Coverageのx0.2以上でカバーされる必要がある

MeanCoverage

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– Coverage Uniformityに関するスペック: 80% 以上のターゲット領域がMean Coverageのx0.2以上でカバーされる必要がある

“Avoid SNPS”をNoにすることでProbe設計の自由度が増す

– しかしProbes はDesign Studioで持っている QCをパスする必要がある

SNPはProbeのハイブリ効率に影響がない場合もある

– 参照元のdbSNP 131が正しくAnnotateしていない、出現頻度が低いSNPまで登録されている

– プローブ長は22-30ntと比較的短い

SNPに影響されるターゲットはシーケンス深度（Depth）を増やして読むことが望ましい


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特異性が低い: ターゲット外の配列をたくさん含んでいる

– 最終的にターゲットサイトから外れます

ターゲット領域を移動、拡張する

– Coordinateを変えることでProbeの組み合わせが変わり、特異性が上がる場合がある

特異性が低くCoverage が上がらない場合

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– 最終的にターゲットサイトからは外れる




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– 最終的にターゲットサイトから外れる




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– 最終的にターゲットサイトから外れる




✔

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領域を拡張してみる

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領域を拡張することでDesign Studioが特異性の高いProbeをデザインでき、ターゲット領域の

Coverageをあげることができる

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GC含量が高い場合、もしくはホモポリマー（特定塩基の繰り返し）が存在する場合はProbeが設計できない

特異性を上げるための改善と同様、ターゲット領域の拡張、移動、領域を分割して再入力

GC 含量、ホモポリマーが原因でCoverageが低い場合

…GGCCCGCCCGG AAAAAAAAAAAAA

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GC含量が高い場合、もしくはホモポリマー（特定塩基の繰り返し）が存在する場合はProbeが設計できない

特異性を上げるための改善と同様、ターゲット領域の拡張、移動、領域を分割して再入力

どのようにGC含量ホモポリマーが問題と特定するか?

DesignStudioからUCSC Genome Browserにジャンプ


…GGCCCGCCCGG AAAAAAAAAAAAA

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Cross bindingとは: Oligo pool中で2つ以上のProbeがお互いにアニールしてしまう

– Probe-Probeが相互にハイブリ

Cross Bindingを起こしているProbeの一つがDesign中に削除される

ターゲット領域をカバーするためのProbeの数が減る

Probe のCross Bindingが原因でCoverage が低い場合

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Coverageが低い原因はProbe

か？ターゲット領域か？

Isolate the target of interest into its own project

Still low coverage?

Difficulty due to target itself

Improved coverage?

Try expanding region

coordinatesTry targeting in a separate project

Probe のCross Bindingが原因でCoverage が低い場合どのようにCross Bindingが問題と特定するか

*By removing other probes, we can narrow in on the cause of low coverage

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Coverageが低い原因はProbeか？ターゲット

領域か？

Projectを当該ターゲット領域だけにしてみる

Still low coverage?

Difficulty due to target itself

Improved coverage?


coordinates

Try targeting in a separate

project


*ほかのターゲット領域を除く

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領域か？


まだCoverageが低い場合

ターゲット領域の問題

Improved coverage?


coordinates

Try targeting in a separate

project



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領域か？


まだCoverageが低い場合

ターゲット領域の問題

Coverageが改善した場合

ターゲット領域を拡大する

ターゲットを別Projectで入力

してみる



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DesignStudio にてDesignを始めるためには最小16アンプリコン必要Projectサイズが小さい方が結果が早く帰って来る

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例で使用したターゲットでは54% から 73%に改善Probeが少ない方が当該ターゲットはCoverageが良い

Original Projectでターゲット領域を拡張してみる

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まとめ

Design の過程

• amplicon sizeを選択する

• 領域をに入力する

• DS でプローブを作りデザインプールを結果として返す


• Score: design score, AmpliconがWorkするかどうかのin silicoでの評価

• Coverage: アンプリコンがカバーするターゲット領域の割合


• SNPs: “avoid SNPs” を “no”にする

• Specificity: ターゲット領域を拡張、移動する

• GC 含量/ ホモポリマー: ターゲット領域を拡張、移動、分割する

• Cross binding: 1ターゲットのみを取り出しProbeとターゲットの原因を切り分ける

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Technical Bulletin: How DesignStudio works for TSCA– https://icom.illumina.com/MyIllumina/Bulletin/rEc70eUsskSDF31s-qdCQQ/how-

design-studio-works-for-tsca

FAQ and troubleshooting tech note– http://www.illumina.com/documents/products/other/faq_tsca_designstudio.pdf

TSCA support page– http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_custom_amplicon.ilm

n

TSCA data sheet– http://www.illumina.com/documents/products/datasheets/datasheet_truseq_custom_a

mplicon.pdf

Technical Support Webinars– http://support.illumina.com/training/sequencing.ilmn

参考資料

Documents

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