Embed Size (px)
Citation preview
Пятигорский медико-фармацевтический ин сти тут- филиал государственного бюджетного образовательного учреждения
высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет»
Министерства здравоохранения Российской Федерации
На правах рукописи
Ш Е Р И Е В Л ( Г X А М О К О В А )
Ф А Т И М А К У Ш Б И Е В Н А
Ф А Р М А К О Г Н О С Т И Ч Е С К О Е И ЗУ Ч Е Н И Е Л А П Ч А Т К И БЕЛОЙ -
P O T E N T IL L A A L B A L., И Н Т Р О Д У Ц И Р О В А Н Н О Й НА
С Е В Е Р Н О М К А В К А ЗЕ
ДИССЕРТАЦИЯ
на соискание ученой степени кандидата фармацевтических паук
по специальности 14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия
Научный руководитель: МЕЛИК-ГУСЕЙНОВ ВАЛЕРИЙ ВЛАДИМИРОВИЧ
доктор биологических наук, профессор
2
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ГЛАВА 1 БОТАНИЧЕСКАЯ И ФИТОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
РОДА ЛАПЧАТКА POTENTILLA L.
1. Систематика и ботаническая характеристика растений рода Potentilla L.
семейства Rosaceae..................................................................................................... 12
2. Фитохимическая характеристика растений рода Potentilla L ............................18
2.1 Фитохимическая характеристика некоторых видов лапчатки.......................18
2.2 Фитохимическая характеристика лапчатки белой........................................... 19
3. Биологическая активность соединений и препаратов лапчатки и применение их
в народной и научной медицине...................................................................................... 22
3.1Биологическая активность и применение различных видов лапчатки........22
3.2 Биологические свойства и применение лапчатки белой Potentilla alba L .28
ВЫВОДЫ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ................................................................. 33
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Объекты исследования............................................................................................. 34
2.2 Методы исследования............................................................................................... 35
2.2.1 Биологические м етоды ...............................................................................35
2.2.1.1 Метод фенологических наблюдений.................................................................. 35
2.2.2 Методы обнаружения и идентификации биологически активных
соединений..........................................................................................................................36
2.2.2.1 Изготовление извлечений для проведения качественных
реакций................................................................................................................................. 36
2.2.2.2 Дубильные вещества............................................................................................ 36
2.2.2.3 Аминокислоты.......................................................................................................36
2.2.2.4 Фенольные соединения......................................................................................... 36
3
2.2.2.5 Полисахариды......................................................................................................... 37
2.2.2.6 Органические кислоты.......................................................................................... 38
2.2.3 Хроматографические методы.................................................................... 38
2.2.3.1 Методы тонкослойной и бумажной хроматографии........................................38
2.2.3.2 Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии.............................. 41
2.2.4 Спектральные методы.................................................................................45
2.2.4.1 Эмиссионный спектральный анализ.................................................................. 45
2.2.4.2 УФ-спектрофотометрия.........................................................................................45
2.2.5 Титриметрические методы.........................................................................47
2.2.6 Гравиметрические методы.........................................................................48
2.2.7 Фармакологические методы ..................................................................... 48
2.3 Микробиологические методы................................................................................. 50
2.4Методы стандартизации с ы р ь я .............................................................................. 50
2.4.1 Отбор проб для анализа............................................................................................50
2.4.2 Методы морфолого-анатомического исследования............................................ 50
2.4.3 Определение числовых показателей качества сырья.......................................... 50
2.4.4 Определение сроков хранения сырья..................................................................... 51
2.5 Статистическая обработка данных........................................................................51
ГЛАВА 3 ВЫДЕЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ
АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ИЗ КОРНЕВИЩ С КОРНЯМИ ЛАПЧАТКИ
БЕЛОЙ
3.1 Выделение и идентификация фенольных соединений...........................................52
3.2 Изучение органических кислот.................................................................................. 57
3.3 Изучение полисахаридного состава...........................................................................59
3.4 Изучение дубильных веществ.................................................................................... 62
3.4.1 Количественное определение дубильных веществ................................... 62
4
3.4.2 Валидация методики УФ-спектрофотометрического определения
дубильных веществ в пересчете на кислоту галловую.................................................64
3.5 Изучение аминокислотного состава.......................................................................... 67
3.6Изучение элементного состава....................................................................................69
ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ 3 .................................................................................................. 73
ГЛАВА 4 МОРФОЛОГО-АНАТОМИЧЕСКИЕ И ТОВАРОВЕДЧЕСКИЕ
ИССЛЕДОВАНИЯ СЫРЬЯ ЛАПЧАТКИ БЕЛОЙ
4.1 Морфологические признаки вида............................................................................. 74
4.2Анатомические строение и диагностические признаки лапчатки белой............. 76
4.2.1 Анатомическое строение подземных органов........................................... 76
4.2.2 Анатомическое строение травы ................................................................... 81
4.3 Определение товароведческих показателей.............................................................88
ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ 4.................................................................................................. 90
ГЛАВА 5 ИНТРОДУКЦИОННЫЕ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ
ИССЛЕДОВАНИЯ ЛАПЧАТКИ БЕЛОЙ
5.1 Изучение онтогенеза лапчатки белой в условиях интродукции...........................91
5.2 Изучение прироста биомассы лапчатки белой в условиях интродукции........... 94
5.3 Биологические исследования......................................................................................98
5.3.1 Определение острой токсичности водно-спиртового извлечения из
корневищ с корнями лапчатки белой.............................................................................. 98
ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ 5................................................................................................ 103
ЗАКЛЮ ЧЕНИЕ............................................................................................................... 104
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................................ 106
ПРИЛОЖЕНИЯ
5
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы
В настоящее время потребность в лекарственных средствах растительного
происхождения и интерес к ним научной и народной медицины постоянно растет.
Однако в результате усиления антропогенной нагрузки на природные популяции
лекарственных растений и учащения случаев нерегламентированной заготовки,
человечество столкнулось с проблемой сокращения их численности. Одним из
путей сохранения генофонда ценных лекарственных растений вне мест их
естественного обитания (ex situ) является интродукция и создание искусственных
агропопуляций, в том числе в ботанических садах.
Одним из ценнейших лекарственных растений, нуждающихся в сохранении,
является лапчатка белая Potentilla alba L.
Лапчатка белая - многолетнее травянистое растение семейства розоцветных
(Rosaceae), произрастающее в центральных районах европейской части России,
Крыму, Средней и Восточной Европе. Зарослей не образует, встречается
рассеянно, часто отдельными экземплярами, не более 2-3 растений на 1 м2.
За счет высокого содержания йода и способности оказывать влияние на
уровень гормонов щитовидной железы - тироксина (Т4) и трийодтиронина (Т3),
лапчатка белая широко применяется для коррекции гипофункции и гиперфункции
щитовидной железы. В народной медицине разных стран лапчатка белая
используется также при лечении инсульта, инфаркта, атеросклероза, гипертонии,
язвы желудка. Лекарственным растительным сырьем являются корневища с
корнями, которые содержат углеводы, сапонины, фенолкарбоновые кислоты,
флавоноиды, дубильные вещества.
В настоящее время вследствие интенсификации сельского и лесного хозяйства,
массовых заготовок сырья в природных местообитаниях данный вид становится
всё более редким и введен в Красную книгу ряда регионов России. В целях
сохранения лапчатки белой существует необходимость во введении в культуру,
6
однако вопросы биологии, возможности интродукции и сохранения ex situ
данного вида являются практически неизученными.
В связи с этим введение в культуру на территории Северного Кавказа редкого
и исчезающего вида, проведение фитохимических и биологических исследований
лапчатки белой в условиях интродукции, разработка нормативной документации
и внедрение в фармацевтическую практику нового лекарственного растительного
сырья является актуальной задачей для фармацевтической науки и практики.
Степень разработанности темы
Фитохимическое изучение травы и корневищ с корнями лапчатки белой
проводилось российскими исследователями в Институте общей и
экспериментальной биологии СО РАН (Улан-Удэ) (Водопьянова А.М., Архипова
Э.В.) и белорусскими исследователями (Башилов А.В.). Работа по введению в
культуру лапчатки белой осуществлялась в Беларуси в Центральном
ботаническом саду Национальной Академии наук, где создана коллекция из 8
видов и внутривидовых таксонов рода Potentilla L.
Работы российских ученых были посвящены изучению только дикорастущей
лапчатки белой. Работ по введению в культуру данного вида, изучению
особенностей его онтогенеза в условиях интродукции и состава биологически
активных веществ не проводилось.
Исходя из этого, нами была определена цель диссертационной работы и
поставлены задачи, необходимые для ее реализации.
Цель и задачи работы
Целью работы явилась интродукция лапчатки белой в условиях Северного
Кавказа и экспериментальное обоснование применения корневищ с корнями
культивируемого вида в качестве источника полифенолов, органических кислот,
полисахаридов и йода.
Поставленная цель предполагала решение следующих задач:
7
1. Осуществить интродукционные исследования лапчатки белой на базе
Эколого-ботанической станции «Пятигорск» БИН РАН (Ставропольский
край), Ботанического сада Кабардино-Балкарского государственного
университета и в Зольском районе Кабардино-Балкарии;
2. Установить диагностические морфолого-анатомические признаки;
определить товароведческие показатели сырья.
3. Исследовать фитохимический состав корневищ с корнями
интродуцированного вида;
4. Определить острую токсичность извлечений из культивируемых
образцов;
5. Разработать «Инструкцию по сбору и сушке» и проект ФС «Лапчатки
корневища с корнями».
Связь задач исследования с проблемами фармацевтических наук
Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно
исследовательских работ ПМФИ - филиала ВолгГМУ Минздрава России по
зарегистрированной теме: «Фармакогностическое исследование дикорастущих и
культивируемых растений с целью расширения сырьевой базы и внедрения в
медицинскую практику» (№ Гос. регистрации 01201354514).
Научная новизна
Впервые проведены исследования по введению в культуру лапчатки белой в
условиях Северного Кавказа. Впервые установлен состав БАС корневищ с
корнями интродуцированной лапчатки белой. В составе фенольных соединений
лапчатки белой были идентифицированы впервые кофейная, феруловая кислоты,
гесперидин и лютеолин-7-гликозид.
В корневищах с корнями исследуемого вида установлен состав
полисахаридов, органических кислот; определено количественное содержание
йода.
8
Впервые проведено морфолого-анатомическое изучение корневищ с
корнями и травы лапчатки белой; установлены характерные диагностические
признаки и товароведческие показатели сырья.
Теоретическая и практическая значимость работы
Теоретическая значимость. В результате изучения химического состава
подземных органов интродуцированной лапчатки белой доказана
целесообразность ее применения как источника фенольных соединений,
полисахаридов, органических кислот и йода.
Практическая значимость. Проект ФС «Лапчатки корневища с корнями»
внедрен на экспериментальном участке ЗАО «Ст.-Медифарм» (г. Москва) (акт
внедрения - 2014 г.). В качестве интродуцента предложна лапчатка белая для
посадки на территории сельскохозяйственных угодий Кабардино-Балкарской
республики в виде лекарственной культуры (акт внедрения - 2012 г.). Разработана
«Инструкция по сбору и сушке корневищ с корнями лапчатки белой».
Технологическая схема производства препарата «Лапчатки белой настойка»
апробирована в производственных условиях экспериментального участка ООО
«Бивитекс» (г. Нальчик, КБР) (акт апробации - 2012 г.).
Результаты научных исследований по интродукции лапчатки белой на
Северном Кавказе внедрены в учебный процесс кафедры ботаники и
используются на лабораторных и лекционных занятиях студентов 2-3 курса
Медицинского колледжа Кабардино-Балкарского университета (акт внедрения -
2013 г.).
Методология и методы исследования
Методология фармакогностического исследования подразумевает научно
обоснованную и целесообразно организованную последовательность действий и
включает несколько блоков: информационно-исследовательский,
фитохимический, технологический, стандартизационный и фармакологический.
9
При проведении работы использовались следующие методы исследований:
биологические, химические, физико-химические, микробиологические,
технологические и фармакологические.
Положения, выносимые на защиту:
1. Результаты интродукционных исследований лапчатки белой в условиях
Северного Кавказа;
2. Данные о комплексной оценке растительного сырья, включающей
фитохимические, фармакологические и микробиологические исследования
корней и корневищ лапчатки белой, интродуцированной на Северном
Кавказе;
3. Результаты морфолого-анатомических исследований корневищ с корнями и
травы лапчатки белой;
4. Результаты определения острой токсичности извлечения из корневищ с
корнями лапчатки белой.
Личное участие автора в получении результатов, изложенных в
диссертации
Автором проведен литературный поиск и обоснован выбор направления
исследований, проведен фитохимический анализ корневищ с корнями лапчатки
белой, выполнена статистическая обработка всех экспериментальных
исследований. Соискателем лично выполнены исследования по определению
острой токсичности; разработан проект фармакопейной статьи и проведена ее
апробация на экспериментальном участке ЗАО «Ст.-Медифарм» (г. Москва).
Автор принимал участие в научных конференциях, написании научных статей для
публикаций.
10
Степень достоверности и апробация результатов
Достоверность полученных результатов достигается благодаря
использованию современных фармакогностических, химических, физико
химических, технологических, биологических и фармакологических методов,
позволяющих получать воспроизводимые и однозначные результаты. Результаты
измерений статистически обработаны.
Основные положения диссертационной работы доложены на XIV
международной научной конференции «Биологическое разнообразие Кавказа и
Юга России» (г. Махачкала, 5-7 ноября 2012 г.) и научной конференции ПМФИ -
филиала ВолгГМУ «Разработка, исследование и маркетинг новой
фармацевтической продукции» в 2013 г.
По результатам диссертационного исследования опубликовано 11 печатных
работ, включая 3 работы в журналах перечня ВАК РФ.
Структура и объем диссертации
Работа изложена на 145 страницах машинописного текста и состоит из
введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, 4 глав
собственных исследований, заключения, списка цитируемой литературы,
включающего 127 источников, из которых 29 иностранных авторов и
приложения. Диссертация иллюстрирована 30 рисунками и 25 таблицами.
11
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
БАВ - биологически активные вещества
БАС - биологически активные соединения
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография
ГФ - государственная фармакопея
КБГУ - Кабардино-балкарский государственный университет
КБР - Кабардино-балкарская республика
ОФС - общая фармакопейная статья
РСО - рабочий стандартный образец
ТСХ - тонкослойная хроматография
ФС - фармакопейная статья
ФСП - фармакопейная статья предприятия
12
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
БОТАНИЧЕСКАЯ И ФИТОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
РАСТЕНИЙ РОДА ЛАПЧАТКА POTENTILLA L.
1. Систематика и ботаническая характеристика растений рода Potentilla L.
семейства Rosaceae
Семейство розоцветные Rosaceae - одно из крупнейших семейств цветковых
растений, включающее около 100 родов и 3000 видов и объединяющее деревья,
кустарники и травы большей частью с очередными, реже супротивными,
простыми или сложными листьями, часто снабженными прилистниками. Цветки
розоцветных актиноморфные, обычно обоеполые, с 5-членным (редко 3-4
членным или более чем 5-членным) околоцветником. Число тычинок,
расположенных кругами, неопределенное, или в 2-4 раза превышает число
лепестков, или редуцировано до 4-1. Чашелистики, лепестки и тычинки
расположены по внутреннему краю цветочной трубки — гипантия, в центре
которого находится от 1 до многих плодолистиков. Плодолистики свободные,
реже они срослись между собой, а иногда также с гипантием, образуя нижнюю
или полунижнюю завязь. Плоды розоцветных сухие или сочные, листовки,
коробочки, орешки, костянки, яблоки. Семена без эндосперма [22,24].
Большинство розоцветных являются энтомофильными растениями, но
не имеют ярко выраженных приспособлений к различным агентам опыления
в строении. Цветки их белые, розовые, ярко-красные, красноватые, реже желтые
(но никогда не бывают голубыми).
На основании различий, главным образом, в морфологии плодов
и в основных хромосомных числах семейство разделяется на 4 подсемейства:
спирейные (Spiraeoideae) — плод — листовка, редко коробочка, основные
хромосомные числа 8 и 9; розовые (Rosoideae) — плоды-орешки, многоорешки,
13
многокостянки, часто с участвующим в образовании плода гипантием, основные
хромосомные числа 7, 9, реже 8; яблоневые (Maloideae) — плод — яблоко,
основное хромосомное число 17; сливовые (Prunoideae) — плод — костянка,
основное хромосомное число 8 [24].
Род Potentilla L. [от лат. potentilla (сила)] относится к подсемейству розовые,
насчитывает около 500 видов и является одним из наиболее полиморфных родов
флоры России. Данный род принадлежит к числу групп, в которых происходит
интенсивное расо- и видообразование, а также гибридизация видов друг с другом,
а в некоторых случаях и с другими родами, например, Fragaria и Sibbaldia.
История изучения систематики рода Potentilla L. разделяется на 4 основных
периода [40].
1 период. 1753-1816 гг. (от К.Линнея до Хр. Нестлера).
Род Potentilla был впервые описан К. Линнеем в 1753 г., который в состав
рода включил 22 вида. После К. Линнея в 1760-1790 гг. изучением рода
занимались ботаники М. Адансон, Г. Кранц, И. Скополи, Ж. Ламарк, Г. Г арднер и
Н. Некер. На территории России впервые род Potentilla изучался И. Гмелиным и
П. Палласом.
2 период. 1816-1908 гг. (от Хр. Нестлера до Т. Вольфа).
В работе Хр. Нестлера «Monographia de Potentilla» (1816) были предприняты
попытки классификации лапчаток, в качестве главного признака автор принимает
форму листьев (перистые, пальчатые, тройчатые).
Далее Л. Траттиником придавалось большое значение внутривидовой
изменчивости лапчаток. Им также была предпринята попытка классификации
рода на группы по внешнему облику растения.
Большой вклад в изучение Potentilla внесли ботаники, работающие в
России: И. Бунге, К. Ледебур, Н.Турчанинов и К.Максимович.
Наиболее значимой научной работой этого периода была работа Хр. Лемана
«Revisio Роtentillarum iconibus illustrate» (1856). Многочисленные виды Potentilla
объединены Хр. Леманом в группы, для определения которых им был разработан
14
ключ. В качестве основных диагностических признаков Хр. Леман использовал
жизненную форму растений, характер соцветия, опушенность плодиков и форму
листьев.
3 период. 1908-1941 гг. (от Т.Вольфа до С.В. Юзепчука).
Этот период является переломным в изучении рода Potentilla. В 1908 г.
вышла работа Т. Вольфа «Monographie der Gattung Potentilla», которая не утратила
научного значения и по сегодняшний день. В отличие от своих предшественников
Т. Вольф принимает в качестве главных для внутриродовой систематики не
вегетативные, а генеративные признаки: форму столбика, место его прикрепления
к плодику, а также наличие или отсутствие опушенности плодиков. Т.Вольфом
была детально изучена морфология и биология лапчаток, их история и на этой
основе разработана новая система рода. Род Potentilla автор разделил на две
секции: Trichocarpae (опушенно-плодные) и Gymnocarpae (голоплодные) [127].
Параллельно с работой Т. Вольфа и в контакте с ним над родом Potentilla на
территории Средней Азии работал В.И. Липский (1906), который полностью
принял систему Т. Вольфа и его взгляды на объем вида.
После выхода монографии Т. Вольфа в 1933 г. вышла обработка рода во
«Флоре Западной Сибири» Крылова П.Н. (1933), достоинства которой - удобный
для определения видов ключ и подробная характеристика распределения видов.
4 период. С 1941 г. (обработка рода С.В. Юзепчуком) и до настоящего
времени.
Обработка рода Potentilla для «Флоры СССР» С.В. Юзепчуком (1941) дала
новый толчок в изучении рода. Следуя, в целом, системе Т. Вольфа, С.В. Юзепчук
дополнил и несколько изменил ее. Наряду с традиционным морфологическим
методом С.В. Юзепчук использовал и географический метод исследования.
Большой вклад в изучение лапчаток в этот период внесли систематики И.
Сояк и Р. Камелин. И. Сояком было выделено значительное число новых
таксонов, при этом основное внимание было уделено азиатским и сибирским
видам лапчаток. Р.В. Камелин в работе «Материалы к флоре Памиро-Алая
15
Potentilla biflora Willd» (1969) рассматривает вопросы происхождения и
первоначального развития рода Potentilla [40].
Таким образом, род Potentilla L. относится к числу сложнейших в
систематическом отношении родов цветковых растений. Одни авторы (Wolf,
Sоjak и др.) включают в род Dasyphora Raf. и Comarum L. Другие ботаники
(Юзепчук, Hutchinson, Положий, Лошкарева и т.д.) все три указанных рода
признают в качестве самостоятельных. Часть исследователей (Linne, Гроссгейм,
Камелин) выделяют в качестве самостоятельного род Comarum, при этом оставляя
Dasyphora в роде Potentilla. Иногда (Chrtek et Sojak, Sojak) из рода Comarum, в
свою очередь, выделяется род Farinopsis Chrtek et Sojak. Некоторыми
исследователями признаются в качестве самостоятельных выделяемые из
Potentilla роды Drymocallis Fourr. (Rydberg), Sibbaldiopsis Rydb., Argentina Lam.
(Rydberg, Sojak), Schistophyllidium (Juz.) Ikonn. (Иконников, Sojak). И. Сояк
(Sojak) считает более целесообразным разделение PotentillasL. на секции, в целом,
по его мнению, соответствующие категории Grex в работеТ. Вольфа
«Monographie der Gattung Potentilla»: Sect. Multifidae, Pensylvanicaes.str. [39].
Род Лапчатка являлся одним из самых обширных во флоре бывшего СССР.
В светлых лесах встречается лапчатка белая (P. alba L.), серебристая (Р. аrgentea
L.) - в европейской части, Сибири и на Кавказе, полуобнаженная (P. semiglabra
Juz.) - в Восточной Сибири и на Дальнем Востоке, многонадрезная (P. multifida L.)
- в Заволжье, Сибири и на Дальнем Востоке.
Виды рода Potentilla L. - многолетние, редко дву- или однолетние травы,
полукустарники и полукустарнички с пальчатыми, перистыми или тройчатыми
листьями. Цветки одиночные или в соцветиях, большей частью жёлтые. Гипантий
блюдцевидный, при плодах нередко увеличенный. Чашелистики в 2 кругах,
общим числом 10, наружные, хорошо развитые, обычно цельнокрайные, реже на
верхушке зубчатые, иногда с глубоким вырезом. Лепестков 5, реже 4, на
верхушке обычно выемчатых, редко с цельной закругленной верхушкой. Тычинки
многочисленные (15-30). Цветоложе обычно выпуклое, жесткое, не
16
разрастающееся, реже разрастающееся при созревании плодов. Столбики обычно
верхушечные, реже боковые или базальные, конические, нитевидные, реже
веретеновидные. Околоцветник обычно 4-5-членный. Плодики - многочисленные
односеменные орешки, обычно голые, реже у основания плодика и над местом
прикрепления столбика, иногда и по всей поверхности волосистые, нередко по
поверхности плодика с заметной ребристостью или ямчато-сетчатые [88].
Основные отличительные признаки некоторых видов лапчатки представлены в
таблице 1.
Таблица 1 - Отличительные признаки некоторых видов лапчатки [44]
Диаг
нос
тиче
ские
приз
наки Лапчатка
прямостоячая Potentilla erecta (L.)
Raeuschel
Лапчатка серебристая
Potentilla argentea L.Лапчатка гусиная
Potentilla anserina L.Лапчатка белая Potentilla alba L.
Подземныеорганы
Корневища неравномерно утолщенные, цилиндрические или клубневидные
Корень стержневой, в верхней части покрыт остатками листьев
Корень стержневойКорневища неравномерно утолщенные, светлые на срезе
Опушение РедкоеГ устое,беловойлочное, на стеблях и с нижней стороны листьев
Густое, шелковистосеребристое, с нижней стороны листьев
Густое, шелковистосеребристое, прижатое
ЛистьяСидячие, тройчатые, с 2 прилистниками, образуют на стебле «лапку»
Черешковые, 5- пальчатосложные
Черешковые, непарно-прерывистоперистые с 4-10 парами листочков
Черешковые, чешуевидные, в числе 1-2 с маленькими яйцевидно-ланцетными прилистниками
Для нас наибольший научный интерес представляла лапчатка белая
(Potentilla alba L.).
Лапчатка белая (Potentilla alba L.) (межиперщица, пятилистник,
пятиперстник, пятипал, пятипальник, пятиперстень и др.) - многолетнее
травянистое растение, 8-25 см высоты с толстым маловетвистым, длинным (до 50
см и более) черно-бурым корневищем, светлым на срезе, укороченными
многолетними вегетативными и однолетними генеративными побегами,
образующими прикорневую розетку. Вегетативный побег с чешуевидными
17
листьями развивается ежегодно из верхушечной почки главной оси растения, а
пазушные почки образуют боковые побеги, развитие которых постепенно
приводит к прекращению деятельности верхушечной почки. Генеративные побеги
развиваются из пазух низовых листьев. Прикорневые листья на длинных
черешках, пальчато-сложные, состоят из 5 обратно-ланцетных листочков, сверху
темно-зеленые, снизу шелковистые, с темно-бурыми прилистниками. Стеблевые
листья небольшие, чешуевидные, в числе 1 -2 с маленькими яйцевидно
ланцетными прилистниками. Все растение покрыто прижатыми шелковистыми
серебристыми волосками [7].
Цветет в апреле-июне. Преимущественно энтомофил. Цветки белые, до 3 см в
диаметре, на длинных цветоносах, собраны по 2-5 в верхушечные полузонтики.
Венчик из 5 свободных лепестков, чашечка с подчашием. Тычинок и пестиков
много. Завязь верхняя. Плоды - орешки, морщинистые, при основании
волосистые. Созревает в июне-августе. Размножается преимущественно
семенами, вегетативное размножение встречается редко. Растет в достаточно
осветленных местах в широколиственно-еловых и сосновых лесах, остепненных
лугах, иногда среди кустарников, преимущественно на свежих плодородных
супесчаных и суглинистых почвах. Распространена лапчатка белая в центральных
районах европейской части России, Кавказе, Средней Европе, Балканах [97].
Является ценным декоративным растением [54].
Лапчатка белая относится к редким и исчезающим растениям и внесена в
Красную книгу ряда регионов России, в том числе Смоленской, Ульяновской,
Московской области и республики Мордовия [6,53,62].
Имеется ряд исследовательских работ по введению видов рода лапчатка в
культуру [34, 70].
18
2. ФИТОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАСТЕНИЙ РОДА
POTENTILLA L.
2.1 Фитохимическая характеристика некоторых видов лапчатки
В результате многочисленных фитохимических исследований установлено,
что виды рода Лапчатка содержат полифенолы, танины, тритерпеноиды и
флавоноиды [112].
Корневище лапчатки прямостоячей содержит до 14-31%, а в надземной
части 4-12% дубильных веществ протокатехиновой группы, кристаллический
эфир торментол, тилирозид, метилбревифолинкарбоксилат, флавоноиды, хинную
и эллаговую кислоты, флобафены, воск, смолы, камедь, крахмал. В надземной
части растения содержится витамин С, наибольшее количество которого находят
в период полного цветения, органические кислоты (яблочная и эллаговая), а также
флобафены, воск, смолы, камедь и крахмал. В составе фенольных соединений
корневищ идентифицированы: кемпферол, хлорогеновая кислота, галловая
кислота, танин, цикориевая кислота, гесперидин, лютеолин-7-гликозид, эллаговая
кислота, салициловая кислота, коричная кислота, кверцетин. При этом из веществ
фенольной природы преобладают кемпферол и гесперидин, из оксикоричных
кислот - хлорогеновая кислота, из фенолокислот - галловая кислота, в
значительном количестве содержится также свободная эллаговая кислота [16,
123].
В надземной части лапчатки гусиной были обнаружены эфирное масло,
стероиды (ситостерин), тритерпеноиды (торментол), витамин С, дубильные
вещества, высшие алифатические углеводороды (н-нонакозан), цериловый спирт,
катехины, хиноны, фенолкарбоновые кислоты (феруловая, и-кумаровая,
эллаговая), флавоноиды (мирицетин, кемпферол, кверцетин, цианидин,
дельфинидин) [105]. В корневищах - дубильные вещества, лейкоантоцианиды,
антоцианы, тилирозид, метилбревифолинкарбоксилат, эллаговая кислота,
19
хлорогеновая кислота, кемпферол-3-О-рутинозид, акацетин-7-О-рутинозид,
генистеин, потентилин, дифлавоноидный эфир триксиниковой кислоты, 2,6-
диметил-2,3-дигидро-4-оксо-4н-пиран-2-уксусная кислота, тритерпеновые
сапонины и полисахариды, состоящие из рамнозы, арабинозы, глюкозы и
галактозы [60, 114].
В лапчатке вильчатой, лапчатке многонадрезанной, лапчатке
кустарниковой, произрастающих на территории восточной Сибири, были
обнаружены дубильные вещества, флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты,
кумарины; рутин, кверцетин, изокверцетин, кемпферол, гиперозид, кофейная,
феруловая, и-кумаровая, коричная, синаповая кислоты [25].
Внадземнойчасти P. argentea, P. erecta, P. fruticosa, P. nepalensis var. 'Miss
Wilmott' and P. Thuringiaca обнаружены флавоноиды: миквиелин, изокверцетин,
гиперозидирутин [125].
Из этилацетатной фракции лапчатки неодетой (Potentilla evestita Th. Wolf)
были выделены 2,6р,7р-тригидрокси-4-метил-19-норпрегна-1,3,5(10)-триен-17-1 и
11а,17а, 21-тригидроксипрегна-4, 16(22)-диен-3,20-дион [116].
2.2 Фитохимическая характеристика лапчатки белой
Подземная часть Potentilla alba L. (корневища с корнями) содержит
углеводы (главным образом крахмал), иридоиды, сапонины, фенолкарбоновые
кислоты, флавоноиды (кверцетин), дубильные вещества (галлотанин) до 17%
(максимум в фазу цветения), фитостерины (Р-ситостерол (ситостерин) и Р-
ситостерол-3-О-Р-Б-глюкопиранозид (даукостерин)) [8, 20].
Надземная часть содержит сапонины, фенолкарбоновые кислоты,
флавоноиды (рутин), дубильные вещества до 6%. В листьях обнаружены
фенолкарбоновые кислоты и их производные (кумаровая и эллаговая кислоты),
флавоноиды (кверцетин, кемпферол, цианидин) [61].
20
Методом ВЭЖХ в надземной части лапчатки белой, интродуцированной в
Центральном ботаническом саду Национальной академии наук Беларуси,
идентифицировано 7 индивидуальных компонентов полифенольного комплекса,
среди которых мажорным компонентом был кверцетин-3-рутинозид (табл.2).
Таблица 2 - Результаты ВЭЖХ-анализа надземной части лапчатки белой [8, 73]
№
п/пНазвание вещества
Содержание,
мг/100 г сухой массы
1 Неохлорогеновая кислота 284,952 Хлорогеновая кислота 186,643 и-Кумаровая кислота 87,524 Эпикатехин 274,155 Кверцетин-3 -рутинозид 1569,756 Кверцетин-3-глюкозид 136,697 Кверцетин-3 -арабинозид 56,23Общая сумма фенольных соединений 10589,36
Количественное содержание флавоноидов в пересчете на рутин и
абсолютно сухое сырье составило 3,2% [9].
В этилацетатно-спиртовом извлечении травы лапчатки белой методом
хромато-масс-спектрометрии определено 14 высших жирных кислот, из которых
10 - насыщенные, 2 - мононенасыщенные и 2 полиненасыщенные (линолевая и
линоленовая) карбоновые кислоты, которые относятся к эссенциальным
(незаменимым) (табл. 3).
21
Таблица 3 - Состав липидного комплекса надземной части лапчатки белой [1]
№п/п Жирные кислоты Общая
формулаСодержание, % (от суммы
жирных кислот)
1 Лауриновая(додекановая) С 12:0 1,93
2 Миристиновая (тетрадекановая) С 14:0 1,83
3 Пентадекановая (пентадециловая) С 15:0 0,71
4 Пальмитиновая (гексадекановая) С 16:0 51,91
5 Пальмитолеиновая (гексадеценовая) С16:1n9 4,73
6 Гептадекановая (маргариновая) С 17:0 0,87
7 Стеариновая (октадекановая) С 18:0 11,52
8 Олеиновая (октадеценовая) С18:1n9 2,54
9 Линолевая (октадекадиеновая) С18:2п9,12 4,38
10 Линоленовая (октадекатриеновая) С18:3п9,12,15 13,63
11 Арахиновая (эйкозановая) :0С2 2,60
12 Хенейкозановая С21:0 0,34
13 Бегеновая (докозановая) С22:0 1,90
14 Тетракозановая (лигноцериновая) :0С2 1,10
Согласно результатам атомно-эмиссионного спектрального анализа
лапчатка белая содержит алюминий, цинк и марганец в количествах,
превышающих критерий степени концентрирования минеральных элементов для
нетрадиционных растений в 1,7, 2,5 и 3,0 раза соответственно. В мажорных
концентрациях содержатся кальций, кремний, бор, железо, никель. Следует
отметить, что Potentilla alba L. содержит элементарный йод и йодистую кислоту
[66].
Показано, к моменту цветения лапчатки белой в больших количествах
накапливается селен. Во время второй фазы цветения в течение одного
вегетационного периода содержание селена в листьях ниже и существенно
снижается (в 1,5-2,0 раза) к концу вегетации [66].
22
3. БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ СОЕДИНЕНИЙ И
ПРЕПАРАТОВ ЛАПЧАТКИ И ПРИМЕНЕНИЕ ИХ В НАРОДНОЙ И
НАУЧНОЙ МЕДИЦИНЕ
3.1 Биологическая активность и применение различных видов лапчатки
Растения рода Potentilla L. широко используются как в народной, так и в
официальной медицине [48].
Так, лапчатка гусиная (Potentilla anserine L.) входит в состав
противосудорожного сбора для детей, является ранозаживляющим,
спазмолитическим и антисептическим средством при лечении заболеваний
органов желудочно-кишечного тракта; обладает желчегонной активностью [92].
Используется для предотвращения и уменьшения симптомов предменструального
синдрома (ПМС), а также для лечения нарушений менструального цикла
(полименорея, олигоменорея, аменорея, дисменорея, мено- и метроррагии),
маточных кровотечений, воспалительных заболеваний, заболеваний молочных
желез, менопаузальных нарушений за счет наличия фитоэстрогенов и
компонентов, действующих как регуляторы гормональной активности [14].
Фракция полисахаридов Potentilla anserine L. invitro и invivo проявляет
иммономодулирующую и дозозависимую антиоксидантную активность [108].
При этом антиоксидантная активность полисахаридного комплекса увеличивается
при модификации селеном [119].
Спиртовый экстракт лапчатки гусиной обладает способностью защищать от
апоптоза ткань миокарда после ишемии и лимфоциты селезенки [109, 120].
Тритерпеноидные сапонины из надземной части Potentilla anserine L. проявляют
активность против вируса гепатита B [100], а фракция танинов из травы обладает
антимутагенным действием [118].
Лапчатка гусиная, обладающая способностью уменьшать продукцию
секрета бронхиальных желез, применяется в составе сборов в фитотерапии кашля
у детей при обильной мокроте. В случае выраженного отека слизистых оболочек
23
дыхательной системы в начале заболевания к составу сбора добавляют корень
лапчатки прямостоячей, проявляющей вяжущие и десенсибилизирующие
свойства [31].
Добавка к корму водорастворимых полисахаридов лапчатки гусиной,
лапчатки серебристой и лапчатки прямостоячей увеличивает массу тела крыс по
сравнению с контрольными животными максимально на 17,51% (лапчатка
гусиная), 16,95% (лапчатка серебристая), 15,82% (лапчатка прямостоячая). При
кормлении кроликов травой лапчаток наблюдается увеличение количества
лейкоцитов (при СОЭ в норме) и гемоглобина; достоверное увеличение белка в
сыворотке крови за счет глобулиновой фракции, что свидетельствует о
повышении иммунобиологической реакции. При экспериментальной анемии
полисахариды лапчатки гусиной стимулируют кроветворную функцию костного
мозга и нормализуют состояние крови. Включение травы лапчаток гусиной и
прямостоячей в рацион кормления кроликов предупреждает метеоризм
кишечника и желудка и увеличивает лактационный период крольчих на 10-15
дней [67].
Корневища лапчатки прямостоячей (прямой) - P. recta оказывают вяжущее,
бактерицидное, противовоспалительное и кровоостанавливающее действие [32].
Лапчатка прямостоячая входит в состав желудочных, желчегонных и
противодиарейных сборов, используется для лечения головной боли, как
антигельминтное, гемостатическое и противовоспалительное средство при
заболеваниях дыхательных путей. Наружно используют при геморрое путем
аппликации [43,77]. Нередко ее применяют наружно в виде примочек и ванн при
ожогах, экземах, жирной себорее и воспалительных заболеваниях кожи [5].
В народной медицине лапчатка прямостоячая используется при туберкулезе
легких, эмфиземе, малокровии, язве желудка, подагре, ревматизме [94].
Имеются данные о применении настоев и отваров из листьев, стеблей и
соцветий лапчатки прямостоячей и серебристой при лечении больных желтухой,
острыми и хроническими гепатитами и циррозом печени с застойными явлениями
24
(отеки, асцит) [57]. У больных нормализуется содержание билирубина в крови,
увеличивается диурез, уменьшаются геморрагии, отеки и асцит. Полагают, что в
основе механизма лечебного действия лежит способность дубильных веществ и
флавоноидов лапчатки уменьшать проницаемость капилляров и клеточных
мембран [2,74].
Водные извлечения из корневищ лапчатки прямостоячей проявляют
высокий уровень ингибирования (0,00194-0,108 мг/мл) 40 культур Candida spp.,
выделенных от людей с дисбактериозом кишечника [30].
Применение экстракта корней лапчатки прямостоячей укорачивает срок
диареи, вызванной ротавирусом, и уменьшает явления обезвоживания, что может
быть эффективным для лечения ротавирусной диареи у детей [104]. Отвар
лапчатки прямостоячей в сочетании с полынью горькой, ромашкой аптечной и
рядом других растений рекомендуется к применению в фитотерапии
функциональной патологии кишечника, особенно синдрома раздраженного
кишечника [85]. Также отвар корня лапчатки прямостоячей предлагается
использовать для уменьшения медикаментозной нагрузки в комплексной терапии
воспалительных заболеваний толстой кишки у детей [84].
Кроме того, лапчатка прямостоячая, сочетающая капилляроукрепляющие,
кровоостанавливающие свойства с выраженным противовоспалительным и
антимикробным эффектом, применяется в фитотерапии гинекологических
заболеваний [15].
Экстракты лапчатки прямой (P. recta) и выделенные из них соединения -
эллагитанин и агримониин, проявляют антирадикальную активность. При этом
изолированный агримонин также ингибирует ферментативную активность
липоксидазы и гиалуронидазы [111]. Кроме того, экстракты лапчатки прямой
проявляют антикариесную активность и предлагаются к применению как
антикариесный препарат в средствах по уходу за полостью рта [124].
Сотрудниками лаборатории радиационной физиологии при Томском
государственном университете выявлена эффективность препаратов лапчатки
25
гусиной и лапчатки кустарниковой в отношении повышения устойчивости к
воздействию ионизирующего излучения, что позволяет рекомендовать
использование данных видов для коррекции изменений и профилактики
возможных последствий воздействия излучения в малых дозах [38].
Препараты из надземных органов лапчатки вильчатой, лапчатки
многонадрезанной и кустарниковой обладают сильной антимикробной
активностью и способностью усиливать иммунный ответ, а сухие экстракты из
лапчатки многонадрезанной и кустарниковой достоверно повышают скорость
желчеобразования и снижают уровень холестерина и билирубина в опытах in vivo
[25, 55].
Комплекс полифенольных соединений лапчаток гусиной, пижмолистной
обладают цитостатической активностью по отношению к прививаемым опухолям
in vitro. Кроме того, отвар лапчатки пижмолистной обладает
противовоспалительным и противовирусным действием [55, 57].
Водные экстракты лапчатки кустраниковой, лапчатки норвежской,
пенсильванской, Кранца, лапчатки непальской подавляют активность
миофибробластов, оказывают антирадикальную дозозависимую активность и
могут быть использованы для профилактики и лечения онкологических
заболеваний [121].
В опытах на крысах показано, что этанольный экстракт корней лапчатки
сверкающей (Potentilla fulgens Wall. ex Hook.), широко используемой в
традиционной индийской медицине для лечения диабета, рака и диареи, обладает
гастропротекторной активностью и снижает секрецию желудочного сока, что
позволяет применять его в терапии язвенной болезни желудка [106].
Метанольный экстракт корней лапчатки сверкающей за счет содержания
кемпферола и эллаговой кислоты проявляет антиопухолевую активность против
асцита Эрлиха и раковых клеток линии MCF 7 [117], а этанольный экстракт
корней проявляет антигельминтную активность против цестодов и трематодов,
сравнимую с эффектом антигельминтного препарата Praziquantel [115]. Кроме
26
того, спиртовый экстракт корней лапчатки сверкающей обладает
антигипергликемической и антигиперлипидемической активностью.
Львовскими учеными установлено, что этанольный экстракт из листьев
Potentilla fruticosa L. проявляет антимикробную активность против грамм (+)
(Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis), грамм (-) Escherichia coli, Klebsiella
pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis), спорообразующих
бактерий (Bacillus subtilis, Bacillus cereus) и грибов (Candida albicans) [110].
Транс-тилирозид, выделенный из этанольного экстракта лапчатки
китайской (Potentilla chinesis), понижает уровень триглицеридов, общего
холестерина, уровень глюкозы в крови и нормализует липидный обмен, снижая
уровень липопротеидов низкой плотности и увеличивая уровень липопротеидов
высокой плотности. Кроме того, транс-тилирозид проявляет антиоксидантную
активность и снижает уровень малонового альдегида у крыс, больных диабетом
[107].
Метанольный экстракт цветков Potentilla chinensis в концентрации 10 мг/мл
уменьшает сокращение мышц приблизительно на 70% за 60 минут, что
сопоставимо с активностью блокатора кальциевых каналов Верапамила и токсина
ботулина, широко применяемого в косметологии, что дает возможность
многостороннего применения Potentilla chinensis в косметологии и медицине [98].
Лапчатка бесцветная (Potentilla discolor Bunge) широко используется при
лечении диабета в Китае [99]. Флавоноидный и тритерпеноидный экстракты
лапчатки бесцветной оказывают гипогликемический и гиполипидемический
эффект в эксперименте на крысах с диабетом и диетой, обогащенной
холестерином, а также проявляют антиоксидантную активность и защитное
действие на Р-клетки поджелудочной железы [99,102].
Водные извлечения из надземной части видов лапчатки Potentilla: P.
anserina, P. argentea, P. erecta, P. fruticosa, P. grandiflora, P. nepalensisvar. «Miss
Willmott», P. recta, P. rupestrisand, P. thuringiaca показывают высокую
антимикробную активность против Helicobacter pylori [122].
27
Этанольный экстракт лапчатки ползучей (Potentilla reptans L.), широко
используемой в турецкой народной медицине, увеличивает содержание
липопротеидов высокой плотности и проявляет антиоксидантную активность
[101].
Лапчатка серебристая (Potentilla argentea L.) входила в состав сбора для
приготовления микстуры по прописи М.Н. Здренко, а также используется как
вяжущее, гемостатическое, противовоспалительное, антигельминтное и средство
для лечения распираторных инфекций [57].
Лапчатка курильская в составе «тибетского» зеленого чая (лапчатка
курильская, бадан, малина, земляника, красный корень), обладающего
мочегонным и антибактериальным действием, является дополнением к
медикаментозному лечению пиелонефрита у беременных женщин [76].
Виды рода лапчатка входят в состав различных препаратов и БАДов [126].
Выпускают фасованное сырье, в т.ч. фильтр-пакеты лапчатки прямостоячей.
Кроме того, лапчатка прямостоячая входит в состав сбора с
противомикробным и противовоспалительным действием «Фитантис», который
применяется в комплексной терапии острых и хронических кишечных инфекций,
при дисбактериозе кишечника, воспалительных заболеваниях кожи и полости рта
(стоматитах, гингивитах) [72].
Состав сбора «Фитантис»:
Сбор растительный - сырье измельченное 1 пачкакорневища лапчатки прямостоячей 37,5%листья мать-и-мачехи 12,5%листья подорожника большого 25,0%трава тысячелистника обыкновенного 12,5%листья шалфея лекарственного 12,5%
Также лапчатка прямостоячая входит в состав комбинированного препарата
«Алтайский эликсир», который представляет собой водно-спиртовое извлечение
28
из 24 видов лекарственного растительного сырья и применяется при астении,
умственном и физическом переутомлении, неврастении и периоде
реконвалесценции [72].
Лапчатка кустарниковая наряду с дудником (дягилем) лекарственным,
геранью луговой, подорожником большим, календулой аптечной, копеечником
чайным, составляет фитосорбционный биостимулирующий комплекс
«Бережник», подавляющий опухолевый рост. Проведенные исследования
свидетельствуют о целесообразности использования БАД «Бережник» у больных
со злокачественными опухолями с профилактической целью для уменьшения
токсического действия химиотерапии, восстановления резистентности организма
и потенцирования общеукрепляющего и детоксицирующего эффектов [13].
Имеются сведения о применении корневищ лапчаток прямостоячей и гусиной
в качестве красильных растений. Красильный эффект обусловлен содержанием в
лапчатке прямостоящей конденсированных танидов и катехинов, лапчатке
гусиной - дубильных веществ и флавоноидов [37].
3.2 Биологические свойства и применение лапчатки белой Potentilla alba L.
Первые клинические исследования лапчатки белой были проведены
украинскими исследователями Г.К. Смыком и В.В. Кривенко в начале 1970-х
годов. В качестве объекта исследования использовали настой всего растения
целиком, собранного во время цветения. Уже после месяца лечения пациенты
отмечали улучшение состояния здоровья: уменьшались явления тиреотоксикоза,
экзофтальма, тахикардии, тремора рук. После 2-3 курсов лечения значительно
уменьшалась в размерах щитовидная железа от III до I стадии, а в некоторых
случаях - до нормальных размеров. Кроме того, нормализовались показатели
основного обмена и ЭКГ, уменьшалось содержание глюкозы и холестерина в
крови, снижалось артериальное давление [69]. Кроме того, пациенты отмечали
уменьшение раздражительности, улучшение сна, нормализацию веса [93].
29
Дальнейшее изучение фармакологической активности показало, что
галеновые препараты лапчатки белой проявляют низкую токсичность. При
применении надземной части растения происходит стимулирование центральной
нервной системы, а подземной - усиливается диурез (на 28%). Также было
установлено, что лапчатка белая проявляет антибактериальную активность,
способствует рассасыванию мягких опухолей, узловых образований. Подземная
часть растения применяется при цинготных состояниях [7].
Отвар лапчатки белой используют как вяжущее и гемостатическое средство.
Кроме того, фитотерапевты рекомендуют применять растение при профилактике
и терапии заболеваний печени, сердечно-сосудистой системы и желудочно
кишечного тракта (диарее, желудочно-кишечных коликах, язв), а также как
антисептическое и ранозаживляющее средство. Экстракты на основе корневищ с
корнями применяют при подагре, ревматизме, желтухе, дизентерии. В народной
медицине Беларуси рекомендуется пить отвар травы лапчатки белой при
гинекологических заболеваниях.
Флавоноиды, содержащиеся в растении, благотворно влияют на стенки
кровеносных сосудов, повышая их эластичность и проницаемость. БАВ растения
усиливают гемопоэз, благотворно влияют на работу миокарда, снижают
тахикардию, нормализуют артериальное давление, понижают уровень
холестерина, помогают восстановлению организма после перенесенного инсульта
и инфаркта [7].
Особое значение имеет использование лапчатки белой в зонах с высоким
радиоактивным фоном («чернобыльская» и т.п.) с целью выведения из организма
радионуклидов, а также в регионах с йодной недостаточностью [7]. На
Белорусском Полесье еще с XVIII столетия заболевания щитовидной железы
успешно лечили с помощью лапчатки белой, листья и корни которой употребляли
в виде отвара вместо чая. Благодаря этому в данном регионе практически не было
очагов эндемического зоба.
30
Клинически установлено, что флавоноидные компоненты, полученные из
лапчатки белой, дают хорошие результаты при коррекции гиперфункции
щитовидной железы, часто сопровождаемой нарушениями работы вегетативной
нервной системы. Исследования последних лет показали, что наилучший
результат можно получить при совместном использовании подземных органов
лапчатки белой, копеечника европейского и родиолы холодной. Последние два
растения также обладают способностью воздействовать на эндокринную систему
человека, усиливая, таким образом, воздействие лапчатки белой на организм
человека, помогают нормализовать гормональные и обменные процессы в
организме, оказывая тем самым более эффективное воздействие и на щитовидную
железу [7, 9].
Корневища с корнями содержат спектр фенольных соединений, обладающих
антиоксидантной активностью и обуславливающие противовоспалительное и
адаптогенное действие [103]. Применение сухого экстракта лапчатки белой
оказывает антиоксидантное действие и повышает выносливость [113].
Имеются сведения, что отвар лапчатки белой предотвращает ломкость
кровеносных сосудов всего тела, в том числе и мозга [41].
С учетом патогенеза гипотиреоза разработано многокомпонентное средство
«Тиреотон», в состав которого входят сухие экстракты из корневищ с корнями
лапчатки белой (Potentilla alba L.), шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis
Georgi) и родиолы розовой (Rhodiola rosea L.). Курсовое введение данного
комплексного растительного средства способствует нормализации уровня
тиреоидных гормонов и морфометрических показателей, главным образом за счет
наличия в составе средства производных кофейной кислоты, в частности
эллаговой, способных связываться с тиреотропным гормоном (ТТГ). Также
данный эффект обусловлен содержанием йода и аниона йодистой кислоты,
микроэлементов (цинк и селен), присутствие которых необходимо для
физиологического функционирования тиреоидных гормонов в организме, а также
благодаря наличию флавоноидов (байкалин, скутеллярин), гликозидов
31
(салидрозид, родиолозид), содержащихся в экстрактах шлемника байкальского и
родиолы розовой, которые дополняют и усиливают действие экстракта лапчатки
белой. В результате проведенных исследований установлено, что «Тиреотон» в
дозе 50 мг/кг оказывает выраженное влияние на тиреоидный статус при
экспериментальном гипотиреозе, восстанавливая структуру щитовидной железы
[3]. Курсовое введение животным «Тиреотона» перорально в дозе 50 мг/кг в
течение 21 дня сопровождается повышением уровня тироксина (Т4) в крови крыс
в 2,2 раза, трииодтиронина (Т3) - на 47 %, тиреотропного гормона (ТТГ)
уменьшается на 50 % по сравнению с данными контрольной группы. Индекс
дейодирования составил 7,02, что практически соответствует индексу
дейодирования интактной группы животных.
В опытах на мышах установлена иммуномодулирующая активность сухого
экстракта лапчатки белой и «Тиреотона». Показано, что испытуемые средства в
экспериментально-терапевтической дозе 10 мг/кг способны ослаблять
супрессивное действие цитостатика азатиоприна на антителогенез и
клеточноопосредованную иммунную реакцию гиперчувствительности
замедленного типа и фагоцитоз макрофагов, что выражается в повышении
иммунологических показателей [90], а также способствуют уменьшению
когнитивно-эмоциональных расстройств у животных. Полученные данные
аргументируют целесообразность применения сухого экстракта лапчатки белой и
«Тиреотона» в комплексном лечении и профилактике иммунодефицитных
состояний, в том числе, заболеваний щитовидной железы [4, 91].
В Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН (Улан-Удэ)
разработан растительный комплексный препарат «Тиреонорм», включающий
сухие экстракты корневища лапчатки белой, плоды боярышника кроваво
красного, корневища валерианы лекарственной, для лечения гипотиреоза, в т.ч.
неврологических синдромов, таких как повышенная нервная возбудимость и
реактивность, общее двигательное беспокойство, суетливость, депрессия. В
эксперименте на животных показано, что препарат увеличивает ориентировочно -
32
исследовательскую активность, способствует уменьшению тревожности
животных, улучшает антиамнестическую активность и может применяться для
коррекции неврологических проявлений тиреотоксикоза [17, 18].
Компанией «Эвалар» выпускается растительный комплекс (капсулы и крем)
Эндокринол, который содержит клинически апробированные экстракты
лекарственных растений - спирто-водно-глицериновый экстракт лапчатки белой,
водный экстракт звездчатки средней, масляный экстракт льнянки обыкновенной
для лечения заболеваний щитовидной железы.
Украинской компанией «Омнифарма Киев» выпускаются капсулы «Альба»
(1 капсула содержит 300 мг чистого экстракта корня лапчатки белой) для
монотерапии или для комбинированной консервативной терапии диффузного и
смешанного доброкачественного эутиреоидного зоба, а также в комплексном
лечении тиреотоксического и гипотиреоидного зоба [36].
Помимо этого, на основе экстракта корневищ и корней лапчатки белой
выпускаются БАДы «Тирео-Вит», «Нуксен» VII с лапчаткой белой, «Лапчатка+»,
«Эндокринол» и «Эндонорм», которые рекомендуется использовать при
различных заболеваниях щитовидной железы, таких как: гипотиреоз, гипертиреоз
(гиперфункция, тиреотоксикоз, болезнь Базедова-Грейвса, диффузный
токсический зоб), аутоиммунный тиреоидит, эутиреоидный зоб (диффузный,
узловой/многоузловой) и гиперплазия щитовидной железы.
33
ВЫВОДЫ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ
1. Виды рода лапчатка широко применяются в официальной и народной
медицине разных стран.
2. Благодаря богатому составу БАВ, в том числе содержанию элементарного
йода и йодистой кислоты, корневища с корнями лапчатки белой
используются для лечения заболеваний щитовидной железы и входят в
состав ряда препаратов и БАДов (Тиреотон, Эндокринол и т.д.).
3. Запасы лапчатки белой во флоре России весьма ограничены. Вид относится
к числу редких и исчезающих.
4. Нет сведений о фитохимическом составе лапчатки белой, произрастающей
на Северном Кавказе и о возможности интродукции вида в условиях
Ставропольского края.
Исходя из этого, интродукция лапчатки белой в условиях Северного Кавказа и
фитохимическое изучение интродуцированного вида является актуальной
задачей.
34
ГЛАВА 2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Объекты исследования
Объектами фитохимического исследования явились корневища с корнями
лапчатки белой, интродуцированной на территории Эколого-ботанической
станции «Пятигорск» БИН РАН (Ставропольский край).
Интродукционные исследования проводились на территории Эколого
ботанической станции «Пятигорск» БИН РАН (Ставропольский край),
Ботаническом саду Кабардино-Балкарского государственного университета
(КБГУ) в г. Нальчик и Зольском районе Кабардино-Балкарии.
Почвы Эколого-ботанической станции щелочные, подстилающими
породами являются машукские травертины с высоким содержанием кальция.
Здесь они представлены предкавказскими чернозёмами. В Зольском районе
Кабардино-Балкарской Республики (КБР) распространены кавказские чернозёмы
на верхнемеловых известняках. В условиях Ботанического сада КБГУ развиты
предкавказские чернозёмы на глинистых сланцах.
Сбор подземных органов интродуцированных растений проводили поздней
осенью в период цветения к концу третьего года жизни растения, поскольку
именно в этот период происходило формирование значительной подземной
биомассы. Очищенные от гнилых частей, отмытые от земли корневища и корни
сушили при комнатной температуре методом воздушно-теневой сушки, в
помещении с хорошей вентиляцией, разложив на подстилках и периодически
перелопачивая. Время между сбором и сушкой не превышало 2 часов. Крупные
подземные органы перед сушкой разрезали на части. Сушку считали законченной,
когда корневища и корни не гнулись, а ломались при сгибании. После сушки
корневища с корнями отсеивали ситом от оставшейся земли и пыли.
35
2.2 Методы исследования
2.2.1 Биологические методы
2.2.1.1 Метод фенологических наблюдений
Для интродукции лапчатки белой использовался посадочный материал,
взятый в естественных условиях произрастания в Липецкой области (Красненский
район, деревня Жаркий Верх) и окрестности г. Липецка. В соответствии с
рекомендациями Г.К. Смыка с соавторами материнское корневище разделялось на
черенки длиной 1-3 см с придаточными корнями и спящими почками. С одного
взрослого растения, таким образом, получали от 10 до 50 полноценных черенков.
После этого они высаживались непосредственно в грунт во второй половине
октября - начале ноября.л
Для исследований были заложены 3 участка площадью 10*10 м на
территории Эколого-ботанической станции «Пятигорск» БИН РАН
(Ставропольский край), Ботаническом саду Кабардино-Балкарского
государственного университета (КБГУ) в г. Нальчик и Зольском районе
Кабардино-Балкарии. Ширина междурядий при посадке составляло 40 см,
расстояние между растениями в рядах - 20 см. В дальнейшем агротехника
выращивания заключалась в двухразовой прополке в течение сезона вегетации и
соблюдении полива при продолжительном засушливом периоде. Поскольку
внесение минеральных и комплексных удобрений не рекомендуется, для 50%
высаженных растений использовалось небольшое внесение перегноя и
дальнейшая подкормка биогумусом периодичностью один раз в месяц.
Фенологические наблюдения мы начали сразу после появления первых
всходов и продолжали до 2013 г. включительно, применяя известные методики
[19, 49].
36
2.2.2 Методы обнаружения и идентификации биологически активных
соединений
2.2.2.1 Изготовление извлечений для проведения качественных реакций
5,0 измельченного сырья экстрагировали 50 мл воды очищенной или спирта
этилового 20%, 40% и 70% путем нагревания с обратным холодильником на
кипящей водяной бане в течение часа. Извлечение фильтровали, экстракцию
повторяли трижды. Полученные водные и спиртовые извлечения использовали
для идентификации биологически активных соединений (БАС) в корневищах с
корнями лапчатки белой [51, 89].
2.2.2.2 Дубильные вещества
Наличие дубильных веществ устанавливали в водных и спиртовых
извлечениях из корневищ с конями лапчатки белой качественными реакциями:
- с раствором желатина;
- с раствором железоаммониевых квасцов;
- с раствором антипирина;
- с раствором формальдегида;
-с раствором натрия нитрата [83].
2.2.2.3 Аминокислоты
К водному извлечению добавляли свежеприготовленный 0,1% водный
раствор нингидрина [95] и нагревали. Сине-фиолетовое окрашивание
наблюдалось при охлаждении.
2.2.2.4 Фенольные соединения
Наличие фенольных соединений устанавливали в спиртовых извлечениях из
корневищ с корнями лапчатки белой качественными реакциями (цианидиновая
проба, с раствором натрия гидроксида и с раствором свинца ацетата) [23] и
хроматографическими методами.
37
Использовали восходящую одномерную тонкослойную и бумажную
хроматографию в различных системах растворителей:
- бутанол - кислота уксусная - вода (4:1:2);
-15% кислота уксусная;
- 2% кислота уксусная;
- этилацетат - кислота муравьиная - вода (10:2:3);
- хлороформ - спирт этиловый - вода (14:6:0,2);
- хлороформ - спирт метиловый (8:2).
Для приготовления извлечения к 1 г измельченного растительного сырья
добавляли 30 мл 40% спирта этилового, нагревали на водяной бане в течение 45
минут с обратным холодильником. После охлаждения извлечение фильтровали,
очищали хлороформом от липофильных веществ в делительной воронке, снова
фильтровали через бумажный фильтр, сгущали до получения густого остатка,
который растворяли в спирте этиловом 95% и использовали для предварительного
обнаружения фенольных соединений методом бумажной и тонкослойной
хроматографии [50]. В качестве стандарта использовали растворы рутина,
кверцетина, гиперозида, лютеолин-7-гликозида, гесперидина, галловой,
феруловой, кофейной и хлорогеновой кислот в 40% этаноле в концентрации 0,5
мг/мл. Пробы наносили объемом по 10 мкл. Высушивали на воздухе в течение 10
15 минут. Детектирование зон адсорбции проводили в видимом и УФ свете до и
после обработки хромогенными реактивами - парами аммиака, спиртовым
раствором алюминия хлорида и железа хлорида (III) (30 г/л) в 95% спирте
этиловом [8, 21].
2.2.2.5 Полисахариды
Для обнаружения полисахаридов к концентрированным водным
извлечениям добавляли трехкратные объемы спирта этилового 96%. Выпадал
осадок. Колбу охлаждали в холодильнике в течение двух часов [75]. Осадок
38
отделяли, промывали спиртом этиловым 96% и ацетоном, высушивали. С 2%-ным
раствором осадка проводили реакцию с реактивом Фелинга.
2.2.2.6 Органические кислоты
Предварительное определение органических кислот проводили методом
восходящей хроматографии на бумаге FN-16 в системах растворителей бутанол -
муравьиная кислота - вода (18:2:5) (I), этиловый эфир - муравьиная кислота -
вода (18:5:9) (II) после обработки 0,5% раствором бромфенолового синего (pH
9,2) относительно стандартных образцов органических кислот [12].
Дальнейшее изучение органических кислот проводили методом ВЭЖХ.
2.2.3 Хроматографические методы
Хроматографию применяли для качественного и количественного анализа
БАС.
2.2.3.1 Методы тонкослойной и бумажной хроматографии
Хроматографирование осуществляли на пластинках (ПТСХ-П-А-УФ), а
также хроматографической бумаге FN-16.Активировали пластинки «Silufol» и
«Sorbfil» в сушильном шкафу при температуре 120° С в течение 1 часа [96].
Определение аминокислот методом ТСХпосле кислотного гидролиза
Получение гидролизата:
1 г измельченных корневищ с корнями отвешивали в стеклянную ампулу,
прибавляли 20 мл 6 н кислоты хлористоводородной, заполняли ампулу азотом,
заплавляли и нагревали 24 часа при 110° С. В процессе гидролиза 2-3 раза
содержимое ампулы осторожно перемешивали круговыми движениями. После
окончания гидролиза охлаждённую ампулу вскрывали, раствор переливали в
фарфоровую чашку. Раствор выпаривали под вакуумом до сиропообразного
состояния и приливали 10 см3 воды, выпаривали досуха, повторяя процедуру 2-3
39
раза до исчезновения запаха кислоты хлористоводородной [35]. Далее остаток
растворяли в 10% растворе спирта пропилового.
Приготовление стандартных растворов аминокислот
Готовили 0,1 М растворы каждой аминокислоты в 10% спирте пропиловом.
Для этого около 0,001 г (точная навеска) каждой аминокислоты растворяли в 10
мл 10% изопропилового спирта. При растворении цистина, метионина, лейцина,
изолейцина, тирозина и аспарагиновой кислоты сначала добавляли несколько
капель концентрированной хлористоводородной кислоты до полного их
растворения.
ТСХ анализ проводили на пластинах марки «Сорбфил» в системе
растворителей н-бутиловый спирт - кислота уксусная - вода (4:1:1). Камеру
предварительно насыщали в течение 12 часов. Пробы и стандарты наносили
микрошприцем.
Пластина №1:
Проба №1 - 10 мкл
Проба №2 - 10 мкл
Проба №3 - 10 мкл
Триптофан - 0,1 М - 1 мкл
Тирозин - 0,1 М - 1 мкл
Треонин - 0,1 М - 1 мкл
Лейцин - 0,1 М - 1 мкл
Метионин - 0,1 М - 1 мкл
Лизин солянокислый - 0,1 М - 1 мкл
Цистин - 0,1 М - 1 мкл
Изолейцин - 0,1 М - 1 мкл
Валин - 0 ,1 М - 1 мкл
Г лутамин - 0,1 М - 1 мкл
40
Пластина № 2:
Проба №1 - 10 мкл
Проба №2 - 10 мкл
Проба №3 - 10 мкл
Аспарагиновая кислота - 0,1 М - 1 мкл
Аспарагин - 0,1 М - 1 мкл
Аргинин - 0,1 М - 1мкл
Лизин 2% - 1 мкл
Глицин 2% - 1 мкл
Аланин 10% - 0,2 мкл
После высушивания пластинку обрабатывали 0,5% раствором нингидрина
в ацетоне и нагревали в сушильном шкафу при 60°С в течение 15 мин.
Идентификацию аминокислот проводили по значению Rf в сравнении с
модельными образцами.
Также определение состава аминокислот осуществляли на аминокислотном
анализаторе Amino acid analyzer T339M.
Определение дубильных веществ
Определение дубильных веществ в подземных органах лапчатки белой
проводили методом ТСХ в системе растворителей:
спирт бутиловый - кислота уксусная - вода (4:1:2);
спирт бутиловый - кислота уксусная - вода (40:12:28);
эфир диэтиловый - уксусная кислота ледяная - гексан - этилацетат
(20:20:20:40);
муравьиная кислота безводная - этилацетат - толуол (10:30:60).
Обнаружение зон адсорбции БАВ проводили в УФ свете при длинах волн
254 и 365 нм, с последующей обработкой раствором железа (III) аммония
41
сульфата 1% (квасцов железоаммониевых раствор 1%), ванилина раствором в
хлористоводородной кислоте 2%, алюминия хлорида спиртовым раствором 2%.
2.2.3.2 Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии
Методом ВЭЖХ устанавливали состав фенольных соединений,
полисахаридов, органических кислот и количественное содержание галловой и
хлорогеновой кислот в корневищах с корнями лапчатки белой.
Определение состава фенольных соединений
Изучение состава фенольных соединений проводили на жидкостном
хроматографе «Gilston» модели 305 с ручным инжектором (модель Rheodyne
7125 USA). Обработку результатов осуществляли с помощью программы
МультиХром для «Windows». Использовали металлическую колонку размером
4,6х250 мм Kromasil C18, размер частиц 5 микрон, подвижная фаза - спирт
метиловый - вода - кислота фосфорная концентрированная - тетрагидрофуран
(370:570:5:60). Подача элюента осуществлялась со скоростью 0,8 мл/мин.
Детектировали с помощью УФ - детектора «Gilston» (UV/VIS модель 151) при
длине волны 254 нм. Анализ проводили в течение 60 минут при комнатной
температуре.
Около 10,0 г измельченного до размера частиц, проходящих сквозь сито с
диаметром отверстий 2 мм, сырья помещали в колбу вместимостью 200 мл,
добавляли 60 мл спирта этилового 70 % и нагревали на кипящей водяной бане с
обратным холодильником в течение 1 часа с момента закипания. После
охлаждения смесь фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу объёмом
50 мл и доводили спиртом этиловым 70 % до метки (исследуемый раствор).
Параллельно готовили серию 0,05 % растворов сравнения в 70% спирте
этиловом: рутина, кверцетина, лютеолина, лютеолин-7-гликозида, гесперидина,
апигенина, гиперозида, дигидрокверцетина, кемпферола, витексина,
изовитексина, нарингенина, байкалина, изорамнетина, галловой кислоты,
кофейной кислоты, хлорогеновой кислоты, цикориевой кислоты, коричной
42
кислоты, феруловой кислоты, эллаговой, о-кумаровой, умбеллиферона,
эскулетина, кумарина, метоксикумарина, эпигалокатехингаллата, эпикатехина.
По 20 мкл исследуемого раствора и растворов сравнения вводили в
хроматограф и проводили анализ.
Количественное определение галловой и хлорогеновой кислот
Около 10,0 г лекарственного сырья помещали в колбу вместимостью 200
мл, добавляли 70 мл спирта этилового 70 % и нагревали на кипящей водяной бане
с обратным холодильником в течение 1 часа с момента закипания. Смесь
охлаждали, фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу объёмом 50 мл
и доводили спиртом этиловым 70 % до метки (испытуемый раствор);
Параллельно готовили 0,05 % растворы в 70% спирте этиловом. Для этого
около 0,05 г (точная навеска) галловой или хлорогеновой кислот помещали в
мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляли 25 мл спирта этилового 70 %,
перемешивали до растворения и доводили объём до метки тем же растворителем.
(РСО).
По 20 мкл исследуемого раствора и раствора РСО вводили в хроматограф и
проводили анализ.
Расчёт количественного содержания галловой и хлорогеновой кислот
производили методом абсолютной калибровки с помощью компьютерной
программы «МультиХром» для «Windows» по формуле:
q о/ = sисх хст анд *1 ° ° *У1° ° где, 0 5станд *а*(1 00 - W) ,
S исх. - площадь пика галловой или хлорогеновой кислот в исследуемом
растворе;
S станд. - площадь пика стандартного раствора РСО галловой или
хлорогеновой кислот;
С% - концентрация галловой или хлорогеновой кислот в испытуемом
образце, %;
С станд. - концентрация РСО хлорогеновой или галловой кислот, г/мл;
43
а - навеска исследуемого образца, г.
V - объём разведения образца;
W - влажность сырья, %.
Полисахариды
Исследование сахаров проводили методом ВЭЖХ на хроматографе
«Gilston». Обработку результатов осуществляли с помощью программы
«МультиХром» для «Windows». Детектирование: УФ-детектор при длине волны
190 нм. Неподвижной фазой служила металлическая колонка Altech OA-1000
Organic Acids размером 6,5x300 мм; подвижной фазой - 0,005 М раствор кислоты
серной. Элюент подавался со скоростью 1 мл/мин. Продолжительность анализа
составила 42 минуты.
Для исследования 10,0 г сырья помещали в колбу объёмом 200 мл,
добавляли 70 мл воды очищенной и нагревали на кипящей водяной бане с
обратным холодильником в течение 1 часа с момента закипания. Охлаждали,
фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл, и
объём доводили водой очищенной до метки (исследуемый раствор).
Для сравнения готовили серию растворов сравнения сахаров следующим
образом:
По 0,60 г рамнозы, ксилозы, мальтозы, сорбитола, глюкозы, лактозы,
арабинозы, сахарозы, фруктозы, галактозы помещали в мерную колбу
вместимостью 50 мл, растворяли в 25 мл воды очищенной и доводили подвижной
фазой до метки, перемешивали (растворы сравнения).
По 20 мкл исследуемых растворов и растворов сравнения сахаров вводили
в хроматограф и проводили анализ.
44
Органические кислоты
Условия хроматографирования: хроматограф Gilston; металлическая
колонка Altech OA-1000 Organic Acids размером 6,5x300 мм; подвижная фаза:
0,005М раствор кислоты серной. Скорость подачи элюента 1 мл/мин.
Продолжительность анализа 42 минут. Детектирование: УФ-детектор «Gilston»
UV/VIS модель 151 при длине волны 210 нм. Обработку результатов
осуществляли с помощью программы «МультиХром» для «Windows».
Около 10 г сырья измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с
диаметром отверстий 2 мм, помещали в колбу вместимостью 200 мл, заливали
100 мл воды и нагревали на кипящей водяной бане в течение 2-х часов. После
охлаждения количественно переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл,
доводили объём извлечения 0,005М раствором кислоты серной до метки,
перемешивали и фильтровали через бумажный фильтр (раствор А). 10 мл
раствора А помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводили 0,005 М
раствором серной кислоты до метки, перемешивали (испытуемый раствор).
По 20 мкл испытуемого раствора и растворов РСО лимонной, щавелевой,
яблочной (маликовой), янтарной, виннокаменной, салициловой и аскорбиновой
кислот последовательно вводили в хроматограф и хроматографировали в
приведенных выше условиях.
Для приготовления растворов РСО лимонной, щавелевой, яблочной
(маликовой), янтарной, виннокаменной кислот около 0,025 г лимонной,
щавелевой, яблочной (маликовой), янтарной, виннокаменной и аскорбиновой
кислот помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяли в 25 мл 0,005
М раствора серной кислоты и доводили тем же растворителем до метки (растворы
сравнения).
45
2.2.4 Спектральные методы
2.2.4.1 Эмиссионный спектральный анализ
Элементный состав лапчатки белой после озоления определяли методом
испарения на дифракционном спектрографе ДФС-8 в Центральной испытательной
лаборатории Федерального государственного унитарного предприятия
«Кавказгеолсъемка» (г. Ессентуки). Стандартами являлись государственные
образцы горных пород и руд.
2.2.4.2 УФ-спектрофотометрия
Методом УФ-спектрофотометрии определяли количественное содержание
дубильных веществ, осаждаемых раствором коллагена 1% в пересчете на
галловую кислоту и суммы фенолкарбоновых кислот в пересчете на кислоту
галловую.
Для определения количественного содержания дубильных веществ,
осаждаемых раствором коллагена 1%, около 2,0 г (точная навеска) измельченных
корневищ с корнями лапчатки помещали в колбу вместимостью 500 мл,
добавляли 250 мл нагретой до кипения воды очищенной и кипятили с обратным
холодильником в течение 30 мин при перемешивании. Охлаждали до комнатной
температуры и фильтровали через вату. Первые 50 мл фильтрата отбрасывали.
Аликвоту переносили в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводили водой
очищенной до метки (раствор А).
Параллельно к 30 мл водного извлечения добавляли раствор коллагена 1%.
Смесь взбалтывали 60 мин, фильтровали через бумажный фильтр. 5 мл фильтрата
переносили в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводили водой очищенной до
метки (раствор В).
Измеряли оптическую плотность обоих растворов на спектофотометре при
длине волны 277 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Раствором сравнения была
вода очищенная.
46
Содержание дубильных веществ, осаждаемых раствором коллагена 1% в
пересчете на галловую кислоту и абсолютно сухое сырье в процентах (Х) в сырье
определяли как разницу между содержанием дубильных веществ в растворах А и
В [28].
Для определения суммы фенолкарбоновых кислот прямым
спектрофотометрическим методом около 1 г (точная навеска) измельченных до
размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм,
корневищ с корнями лапчатки помещали в колбу вместимостью 100 мл,
прибавляли 50 мл 50% спирта этилового и нагревали на кипящей водяной бане с
обратным холодильником в течение 1 часа. Извлечение охлаждали, фильтровали в
мерную колбу вместимостью 100 мл через складчатый бумажный фильтр, и объем
раствора доводили 50% спиртом этиловым до метки (раствор А).
5 мл раствора А помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, и объем
раствора доводили до метки спиртом этиловым 50% и перемешивали (раствор Б).
Оптическую плотность раствора Б измеряли на спектрофотометре при длине
волны 276 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 10 мм. В качестве
раствора сравнения использовали спирт этиловый 50%. Параллельно измеряли
оптическую плотность раствора СО кислоты галловой.
Для приготовления СО кислоты галловой около 0,05 г (точная навеска)
кислоты галловой помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляли
50 мл 50% спирта этилового и перемешивали до растворения, затем объем
доводили тем же растворителем до метки. 2 мл полученного раствора помещали в
мерную колбу вместимостью 100 мл и доводили объем тем же растворителем до
метки.
Содержание суммы фенолкарбоновых кислот в пересчете на кислоту
галловую и абсолютно сухое сырье в процентах (Х) вычисляли по формуле:— D *т О * 2 *1 0 0 *1 0 0 *1 0 0 *1 0 0 где
D0 *1 О О *1 0 0 *т*( 1 0 0 - W) ’ д
D - оптическая плотность испытуемого раствора;
47
D0 - оптическая плотность раствора СО кислоты галловой;
m - масса навески сырья, г;
m0 - масса навески СО кислоты галловой, г;
W - потеря в массе при высушивании сырья, %.
2.2.5 Титриметрические методы
Титриметрически устанавливали количественное содержание дубильных
веществ (методом перманганатометрии и методом перманганатометрии в
сочетании с осаждением дубильных веществ желатином) и йода
(бромйодометрическим методом после сжигания навески по ГФ XI).
Для приготовления извлечения для определения дубильных веществ около
0,8 г (точная навеска) измельченного до размера частиц 2 мм сырья заливали 100
мл воды очищенной и нагревали на кипящей водяной бане в течение 30 минут.
Полученное извлечение настаивали еще в течение 30 минут при комнатной
температуре, затем фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу
емкостью 100 мл и доводили до метки водой очищенной.
Перманганатометрическое определение
Перманганатометрическое титрование проводили по методике ГФ XI. Для
этого 10 мл полученного извлечения отбирали в колбу вместимостью 1000 мл,
прибавляли 500 мл воды очищенной, 25 мл индигосульфокислоты и титровали
при перемешивании 0,02 М раствором калия перманганата до золотисто-желтого
окрашивания. Параллельно проводили контрольный опыт.
Перманганатометрический метод в сочетании с осаждением дубильных
веществ желатином
В 20 мл полученного извлечения проводили осаждение дубильных веществ
48
1% раствором желатина в 10% растворе натрия хлорида. Образующийся осадок
отфильтровывали. 10 мл фильтрата помещали в колбу вместимостью 1000 мл,
прибавляли 500 мл воды очищенной, 25 мл индигосульфокислоты и титровали
при перемешивании 0,02 М раствором калия перманганата до золотисто-желтого
окрашивания. Содержание других окисляющихся веществ (Х2) рассчитывали по
вышеприведенной формуле, в которой брали вместо V1 значение V2 - объема
раствора калия перманганата (0,02 моль/л), израсходованного на титрование
извлечения после осаждения дубильных веществ, мл.
Содержание дубильных веществ, определенных методом
перманганатометриии в сочетании с осаждением дубильных веществ желатином
(Хз):Хз = Xi - Х2 , где
Х 1 - общее содержание веществ, окисляющихся при титровании раствором
калия перманганата;
Х2 - содержание других окисляющихся веществ.
2.2.6 Гравиметрические методы
Методом гравиметрии проводили количественный анализ полисахаридов [27].
2.2.7 Фармакологические методы
Исследование «острой» токсичности выполнялось на аутбредных мышах
обоего пола весом 22,0-24,0 г, полученных из вивария Пятигорского медико
фармацевтического института. Животные, прошедшие двухнедельный карантин,
находились в пластмассовых клетках группами при смешанном освещении в
условиях свободного доступа к воде и корму. При исследовании острой
токсичности были сформированы группы из 5 самок и 5 самцов для каждой дозы.
При проведении фармакологического эксперимента мы руководствовались
следующими нормативными документами: приказом МЗ РФ № 267 от 19.06.03 г.
49
«Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» и
Национальным стандартом РФ ГОСТ Р 53434 - 2009 «Принципы надлежащей
лабораторной практики» [58].
При изучении острой токсичности экстракт лапчатки белой вводился
однократно. Дозы, необходимые для регистрации ЛД50, были установлены
экспериментальным путем.
Клиническое наблюдение за каждым животным проводилось в течение
первого часа после введения препарата, ежедневно в последующем.
Фиксировались следующие показатели: особенности поведения, интенсивность и
характер двигательной активности, наличие и характер судорог, координация
движений, тонус скелетных мышц, реакция на тактильные, болевые, звуковые и
световые раздражители, частота и глубина дыхательных движений, состояние
волосяного и кожного покрова, органов чувств, положение хвоста, количество и
консистенция фекальных масс, частота мочеиспускания и окраска мочи.
Производили подсчет количества погибших животных в ходе эксперимента [63].
Осмотр животных в клетках содержания с целью выявления смертности или
признаков отклонения в состоянии здоровья, производили ежедневно.
Массу тела определяли с помощью электронных весов однократно перед
введением для точного расчета вводимой дозы.
Ежедневно визуально отмечали отклонения в потреблении корма и воды
выжившими животными в отдельных клетках. Через 14 дней после введения
выжившие животные подверглись эвтаназии путем декапитации под эфирным
наркозом. Расчет LD50 производили с использованием пробит-анализа по методу
Прозоровского.
При вскрытии погибших животных визуально осматривали внутренние
органы, отмечали патологические изменения их цвета, размера и расположения.
50
2.3 Микробиологические методы
Определение микробиологической чистоты сырья лапчатки белой
Пробу сырья измельчали стерильными ножницами на мелкие куски.
Методом квартования выделяли образцы и переносили в стерильную колбу со 100
мл стерильного раствора натрия хлорида изотонического. Колбу с исследуемым
образцом встряхивали на качалке 15 минут. Из полученного смыва, условно
соответствующего разведению 1:10, готовили последующие десятикратные
разведения в растворителе до 10-6. Испытание проводили чашечным агаровым
методом. Для каждого разведения использовали 2 чашки Петри с определенной
питательной средой. Посевы инкубировали при температуре 32,5±2,5°С на среде
№ 1 и при температуре 22,5±2,5° С на среде № 2 в течение 5 суток.
2.4 Методы стандартизации сырья
2.4.1 Отбор проб для анализа
При проведении отбора проб для товароведческого анализа
руководствовались ОФС 42-0013-03 «Правила приемки лекарственного
растительного сырья и методы отбора проб» и ГФ XI.
2.4.2 Методы морфолого-анатомического исследования
Изучение внешних признаков сырья лапчатки белой проводили согласно
методикам ГФ XI издания и Сборнику методических рекомендаций по
стандартизации ЛС [65].
Растительный материал для микроскопического изучения представлял
собой свежесобранные и высушенные растения, фиксированные в системе этанол-
глицерин-вода в соотношении 1:1:1. Микроструктура стебля, корневища, корня,
листовой пластинки и черешка листовой пластинки изучалась на поперечных
срезах, а также на микропрепаратах нижней и верхней эпидермы листовой
пластинки. Поперечные срезы приготавливались лезвием безопасной бритвы от
руки.
51
Окрашивание микропрепаратов на наличие лигнифицированных элементов
проводили при помощи спиртового раствора флороглюцина и раствора кислоты
серной 50%, локализацию крахмальных зерен - реактивом Люголя. В ходе
эксперимента использовали временные микропрепараты, которые фиксировали в
растворе глицерина. Анатомические исследования проводили при помощи
микроскопа Биолам с увеличением объективов x4; x10; x40. Сегменты
анатомических срезов фотографировали с помощью микроскопа «Биолам»,
люминисцентного микроскопа Микромед-3-Люм с увеличением объективов x4;
x10; x40 (светофильтры зеленый (G) и нейтральный (N)) и цифрового
фотоаппарата Samsung NV4.
2.4.3 Определение числовых показателей качества сырья
Общие числовые показатели (влажность, зольность, содержание
экстрактивных веществ, содержание примесей) определяли согласно методикам
ГФ XI [27] и ГФ XII [26].
2.4.4 Определение сроков хранения сырья
Срок годности сырья определяли на образцах, хранившихся в сухом,
хорошо проветриваемом помещении, в защищенном от прямых солнечных лучей
месте, в бумажных мешках по ГОСТ 17768-90 в условиях лаборатории. Каждые 6
месяцев в образцах в 6 повторностях определяли содержание БАС и числовых
показателей.
2.5 Статистическая обработка данных
Статистическая обработка результатов экспериментов осуществлялась при
помощи компьютерной программы Ехсе1 с использованием t-критерия
Стьюдента.
52
ГЛАВА 3 ВЫДЕЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ
АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ИЗ КОРНЕВИЩ С КОРНЯМИ ЛАПЧАТКИ
БЕЛОЙ
3.1 Выделение и идентификация фенольных соединений
Выделение и идентификацию фенольных соединений в исследуемом сырье
проводили по методикам, описанным в главе 2, пункте 2.2.2.4.
Результаты тонкослойной и бумажной хроматографии извлечения из
корневищ с корнями лапчатки белой показали наличие рутина, кверцетина,
цинарозида, кислоты кофейной, хлорогеновой и феруловой (табл.4,5).
Таблица 4 - Результаты хроматографического анализа фенольных
соединений корневищ с корнями лапчатки белой (тонкослойная хроматография)Значения Rf в системах* Окраска в УФ свете
Идентифицировано
I II III допроявления
послеобработки
парамиаммиака
после обработки спиртовым раствором
хлорида алюминия- 0,92-0,93 0,29-0,30 голубая усиление
окраскисеро-зеленая кофейная
кислота- - 0,42-0,43 желто-
коричневаяусилениеокраски
желто-зеленая Рутин
- 0,16-0,17 0,48-0,49 фиолетовоголубая
фиолетовая желто-коричневая феруловаякислота
0,57-0,58 0,68-0,69 0,64-0,65 коричневая желтая желто-коричневаяцинарозид
(лютеолин-7-гликозид)
0,96-0,97 - 0,85-0,86 желтая желтая желто-коричневая Кверцетин
- 0,53-0,54 - светлоголубая
усилениеокраски желто-коричневая
неидентифици
ровано
0,25-0,26 - - желтая усилениеокраски желто-коричневая
неидентифици
ровано
- - 0,91-0,93 светлоголубая
усилениеокраски желто-коричневая
неидентифици
рованоПримечаниеI - этилацетат-кислота муравьиная-вода очищенная (10:2:3);II - хлороформ-спирт метиловый (8:2);III-хлороформ-спирт этиловый-вода очищенная (14:6:0,2).
53
Таблица 5 - Результаты хроматографического анализа фенольных
соединений подземных органов лапчатки белой (бумажная хроматография)
Значения Rf в системах* Окраска в УФ светеИдентифици
рованоI II III Допроявления
Послеобработки
парамиаммиака
После обработки спиртовым раствором
алюминия хлорида0,42-0,43 0,17-0,18 - коричневая желтая желто-коричневая цинарозид0,62-0,64 0,68-0,69 0,49-0,50 голубая серо-зеленая хлорогеновая
кислота0,67-0,68 0,55-0,56 - желто
коричневаяусилениеокраски
желто-зеленая рутин
0,80-0,81 0,48-0,49 0,54-0,55 светлоголубая
усилениеокраски
серо-зеленая кофейнаякислота
0,83-0,84 0,41-0,42 - коричневая коричневая желто-коричневая кверцетин0,87-0,88 0,38-0,39 0,30-0,31 фиолетово
голубаяфиолетовая желто-коричневая феруловая
кислота0,11-0,12 - - желто
коричневаяусилениеокраски
желто-зеленаяне
идентифицировано
- 0,89-0,90 - фиолетовоголубая
фиолетовая усиление окраскине
идентифицировано
ПримечаниеI - бутанол-кислота уксусная-вода (4:1:2);II - кислота уксусная 15%;III - кислота уксусная 2%.
Таким образом, предварительно методами бумажной и тонкослойной
хроматографии в извлечении из корневищ с корнями лапчатки белой были
идентифицированы фенольные соединения, представленные флавоноидами
(рутин, кверцетин, цинарозид) и фенолокислотами (кофейная, хлорогеновая и
феруловая кислоты).
Результаты определения фенольных соединений методом ВЭЖХ приведены
в таблице 6.
54
Таблица 6 - Состав фенольных соединений подземных органов лапчатки белой
Время,мин
Высота пика, mV
Площадь пика, mV*сек
Концентрация, % от суммы фенольных соединений
(метод внутренней нормализации)
Название соединения
3,39 291,89 5604,48 5,69 Танин
3,90 275,60 6494,16 6,60 Г алловая кислота
4,16 835,78 12483,66 12,68 ЭГКгаллат
5,54 90,80 6127,37 6,22 Хлорогеноваякислота
6,67 58,57 3356,02 3,41 Кофейная кислота
8,39 110,35 8671,22 8,81 Феруловая кислота
9,75 36,87 3278,53 3,33 Дигидрокумарин
11,72 25,26 1919,71 1,95 Эпикатехин
13.39 24.00 1051.17 1,07 Лютеолин-7-глюкозид
14,17 31,15 3694,70 3,75 Г есперидин
18,59 14,16 1982,01 2,01 Не идентифицировано
23,45 110,50 14964,29 15,20 Коричная кислота
26,86 19,02 1624,35 1,65 Элаговая кислота
28,90 22,03 3468,29 3,52 Не идентифицировано
35,67 62,68 12422,50 12,62 Не идентифицировано
40,16 29,39 5576,74 5,66 Не идентифицировано
54,58 2,46 619,35 0,63 Не идентифицировано
59,86 9,18 2213,38 2,25 Кверцетин
65,67 0,94 123,12 0,13 Не идентифицировано
69,92 0,69 144,03 0,15 Не идентифицировано
80,49 8,53 2623,11 2,66 Не идентифицировано
55
Рисунок 1 - Хроматограмма ВЭЖХ фенольных соединений корневищ с корнями лапчатки белой
56
В составе фенольных соединений подземных органов лапчатки белой при
наличии доступных стандартов было идентифицировано 13 веществ фенольной
природы, представленных фенолкарбоновым кислотами (галловая кислота,
хлорогеновая кислота, кофейная кислота, феруловая кислота, коричная кислота,
эллаговая кислота), флавоноидами (рутин, лютеолин-7-глюкозид (цинарозид),
кверцетин, кемпферол, апигенин), дубильными веществами (танин) и кумаринами
(дигидрокумарин). Мажорными фенольными соединениями явились коричная
кислота (15,2%), ЭКГгаллат (12,7%), и феруловая кислота (8,8%) [45,86,87].
Определение количественного содержания галловой и хлорогеновой кислот
Поскольку наиболее сильной антиоксидантной активностью из фенольных
соединений обладают галловая и хлорогеновая кислоты, нами было принято
решение об их количественном определении.
Результаты количественного определения галловой и хлорогеновой кислот в
подземных органах сырья лапчатки методом ВЭЖХ представлены в таблице 7.
Таблица 7 - Результаты количественного определения галловой и хлорогеновой
кислот в подземных органах сырья лапчатки методом ВЭЖХ (n=6, P=95%)
Содержание, % X S S-X T (p,f) Дл: е,%
Г алловой кислоты 0,16 0,15 0,06 2,57 0,05 2,1Хлорогеновой
кислоты 0,17 0,07 0,03 2,57 0,07 1,9
Таким образом, в корневищах с корнями лапчатки белой методом ВЭЖХ
было определено количественное содержание галловой и хлорогеновой кислоты,
которое составило соответственно 0,16±0,05% и 0,17±0,08% в пересчете на
абсолютно сухое сырье.
57
3.2 Изучение органических кислот
Предварительное определение органических кислот методом восходящей
бумажной хроматографии позволило определить наличие щавелевой и маликовой
кислот, что подтвердилось результатами ВЭЖХ-анализа.
Результаты определения органических кислот методом ВЭЖХ приведены в
таблице 8.
Таблица 8 - Состав органических кислот подземных органов лапчатки белой
Время,мин
Высота пика, mV
Площадьпика,
mV*сек
Концентрация, % от суммарного содержания
органических кислот (метод внутренней
нормализации)Название соединения
4,34 662,04 13304,65 75,95 Щавелевая кислота
6,47 15,56 205,89 1,18 Маликовая кислота
6,91 27,27 1584,76 9,05 Не идентифицировано
10,18 16,15 1648,77 9,41 Не идентифицировано
12,92 3,68 153,16 0,87 Не идентифицировано
13,81 3,51 436,06 2,49 Не идентифицировано
17,08 1,71 108,88 0,62 Не идентифицировано
19,43 0,78 75,35 0,43 Не идентифицировано
При наличии доступных стандартов были идентифицированы щавелевая и
маликовая (яблочная) кислоты [79]. Количественное содержание щавелевой
кислоты в сумме органических кислот составило 79,95 %, яблочной (маликовой) -
1,18%.
58
mV
7001
600-
500-
400
300
200
100-
\!№
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32
Рисунок 2 - Хроматограмма ВЭЖХ органических кислот корневищ с корнями лапчатки белой
59
3.3 Изучение полисахаридного состава
Изучение полисахаридного состава проводили методом ВЭЖХ.
Выход полисахаридного комплекса составил 2,87±0,21% от массы
корневищ с корнями лапчатки белой. Полисахаридный комплекс был аморфным
водорастворимым веществом светло-коричневого цвета, без запаха, давал
положительные реакции осаждения со спиртом, ацетоном, реакцию Фелинга
после кислотного гидролиза.
Результаты определения состава полисахаридного комплекса методом
ВЭЖХ приведены в таблице 9.
Таблица 9 - Состав полисахаридного комплекса подземных органов лапчатки
белой
Время,мин
Высота пика, mV
Площадь пика, mV*сек
Концентрация, % от полисахаридного
комплекса (метод внутренней
нормализации)Название соединения
4,47 777,75 52564,55 53,83 Не идентифицировано
6,46 138,78 2040,20 2,09 Сахароза
6,95 252,41 14556,60 14,91 Арабиноза
10,18 150,02 16906,10 17,31 Не идентифицировано
13,72 40,92 7000,18 7,17 Не идентифицировано
17,11 23,31 2033,03 2,08 Не идентифицировано
19,38 13,58 1971,48 2,02 Не идентифицировано
23,23 4,75 575,47 0,59 Не идентифицировано
При наличии доступных стандартов в составе подземных органов лапчатки
белой были идентифицированы арабиноза и сахароза. Мажорным сахаром среди
идентифицированных явилась арабиноза, содержание которой, согласно методу
внутренней нормализации, составило 14,91%.
60
Рисунок 3 - Хроматограмма ВЭЖХ полисахаридного комплекса корневищ с корнями лапчатки белой
3.4 Изучение дубильных веществ
Растительные полимерные фенольные соединения - дубильные вещества -
являются перспективными ингибиторами процессов окисления органических
веществ наравне со своими мономерными аналогами (фенолкарбоновыми
кислотами, флавоноидами), чья антиокислительная активность известна давно и
широко исследуется. Хотя антиокислительная способность дубильных веществ мало
изучена, что связано, прежде всего, с их сложной химической структурой, тем не
менее, данная группа веществ, имея ряд преимуществ перед простыми фенолами
(хорошая растворимость в воде и т.д.), может быть во многих случаях разумной
альтернативой фенольным антиоксидантам [10].
Дубильные вещества в извлечении из подземных органов лапчатки белой
обнаруживали с помощью качественных реакций (табл. 10).
Таблица 10 - Результаты проведения качественных реакций на дубильные вещества
в водном извлечении из корневищ с корнями лапчатки белой
№ Реактив Аналитический эффект реакции
1 1% раствор желатина помутнение
2 1% раствор антипирина аморфный осадок
3 Раствор железо-аммонийных квасцов (без осаждения)
черно-синее окрашивание
4 Раствор формальдегида темный осадок
5 Фильтрат с 1% раствором железоаммонийных квасцов
сине-черное окрашивание
6 Натрия нитрат бурое окрашивание
В результате проведения качественных реакций установлено, что при
взаимодействии с 1% раствором желатина появлялась муть, исчезающая от избытка
реактива; с 1% раствором антипирина выпадал аморфный осадок; с раствором
железоаммониевых квасцов - черно-синее окрашивание (гидролизуемые дубильные
вещества) и осадок. При добавлении кислоты хлористоводородной и 40% раствора
формальдегида после кипячения образовался осадок, который указывал на
62
присутствие конденсированных дубильных веществ. Полученный осадок
отфильтровывали и к фильтрату добавляли раствор железо-аммонийных квасцов и
кристаллический свинца ацетат, появлялось фиолетовое окрашивание,
подтверждающее присутствие гидролизуемых дубильных веществ. Реакция с натрия
нитратом в присутствии 0,1 н кислоты хлористоводородной приводила к бурому
окрашиванию.
Проведенные качественные реакции показали, что корневища с корнями
лапчатки белой содержат дубильные вещества и гидролизуемой и
конденсированной группы.
В результате хроматографических исследований, проведенных по методикам,
описанным в главе 2, пункте 2.2.3.1, в извлечениях из корневищ с корнями были
идентифицированы танин и кислота галловая.
3.4.1 Количественное определение дубильных веществ
Европейская фармакопея в качестве показателя содержания действующих
веществ в ЛРС, приводит показатель - содержание дубильных веществ, осаждаемых
гольевым порошком, в пересчете на пирогаллол. Этот показатель по сравнению с
показателем содержания дубильных веществ в пересчете на танин (по ГФ Х1)
значительно ниже, поскольку по ГФ Х1 под названием «дубильные вещества»
определяется сумма всех полифенольных соединений, извлекаемых водой и
титруемых перманганатом калия 0,02М в присутствии индигосульфокислоты [29].
Разработанные на сегодняшний день методы количественного анализа
дубильных веществ основываются на нескольких принципах. Это, во-первых,
осаждение дубильных веществ различными реагентами (желатином, формалином,
солями тяжелых металлов), во-вторых, окисление перманганатом калия, йодом, в-
третьих, колориметрия с использованием окрашивания растворов фенольных
соединений различными реактивами (молибдатом аммония, железо-тартратным
реактивом), а также спектрофотометрия при определенной длине волны [59].
63
Для количественного определения дубильных веществ использовали метод
перманганатометрии и УФ спектрофотометрии в пересчете на галловую кислоту
после осаждения дубильных веществ 1% раствором коллагена (см. главу 2, пункт
2.2.4.2). При исследовании УФ спектра поглощения спиртового извлечения из
корневищ с корнями лапчатки белой установлено, что при длине волны 276±2 нм
наблюдается выраженный максимум, аналогичный максимуму поглощения раствора
кислоты галловой.
Результаты определения представлены в таблицах 11,12.
Таблица 11 - Содержание осаждаемых дубильных веществ, суммы
полифенольных соединений, не осаждаемых фенольных соединений в пересчете на
галловую кислоту, определенных методом спектрофотометрии (Х,%)
Содержание группы БАВ, % на абсолютно сухое сырьеосаждаемых
дубильных веществне осаждаемых
фенольных соединенийсуммы фенольных
соединений
8,57 ± 0,02 5,71 ± 0,04 14,28 ± 0,09
Таблица 12 - Метрологические характеристики методики количественного
определения дубильных веществ в пересчете на галловую кислоту методом
УФ спектрофотометрии
Сырье n X S S-X
P, % T (p,f) Ах £,%
Корневища с корнями лапчатки белой 6 8,57% 0,02 0,008 95 2,57 0,02 3,4
Результаты количественного определения дубильных веществ в сырье
методом перманганатометрии представлены в таблице 13.
64
Таблица 13 - Метрологические характеристики перманганатометрической
методики количественного определения содержания дубильных веществ
Сырье n X S S—X
P, % T (p,f) Ах £,%
Корневища с корнями лапчатки белой 6 16,37% 0,02 0,008 95 2,57 0,12 3,1
Содержание дубильных веществ в корневищах с корнями лапчатки белой,
определенное перманганатометрически, составило 16,37±0,12%.
Таким образом, количественное содержание дубильных веществ,
определенное различными методами, составило от 8,57 ± 0,02% до 16,37±0,12%.
Значение, полученное при определении методом перманганатометрии, завышено,
поскольку данным методом определяется сумма всех полифенольных соединений,
извлекаемых водой и титруемых перманганатом калия.
3.4.2 Валидация методики УФ спектрофотометрического определения
дубильных веществ в пересчете на кислоту галловую
Определение линейности методики
Линейность методики - это наличие прямопропорциональной зависимости
оптической плотности от концентрации или количества определяемого вещества в
анализируемой пробе.
Линейность выражается уравнением линейной регрессии у = ax + b. Параметр b
градуировочной функции характеризует отрезок, отсекаемый на оси ординат и
соответствующий значению холостого опыта, а коэффициент a характеризует
наклон градуировочной кривой и является отражением чувствительности методики.
Значения параметров a и b вычисляются методом регрессионного анализа с
помощью программы Excel. Для аналитических целей можно использовать
методику, для которой зависимость функции от аргумента коррелируется с
коэффициентом г, который должен быть >0,99.
Определение линейности методики количественного определения проводили на
растворе стандартного образца кислоты галловой (Fluka, кат. № 48630).
65
Брали около 0,1 г кислоты галловой, 50 мл 50% спирта этилового и 10 мл 10%
раствора натрия гидроксида и доводили объем до метки 50% спиртом этиловым,
перемешивали (раствор А).
Из раствора А готовили 6 растворов с разной концентрацией. Для этого в мерные
колбы вместимостью 100 мл последовательно вносили 0,5 мл, 1,0 мл, 1,5 мл, 2,0 мл,
2,5 мл и 3 мл раствора А, добавляли 10 мл раствора натрия гидроксида и доводили
объем до метки спиртом этиловым 50% (получали 0,0005%; 0,001%; 0,0015%;
0,002%, 0,0025% и 0,003% растворы). Измеряли оптическую плотность каждого
раствора при длине волны 267 нм. Далее строили градуировочный график
зависимости оптической плотности от концентрации и рассчитывали коэффициент
корреляции (рис. 4).
Таблица 14 - Определение линейности методики
Объем 0,1% раствора, мл 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
Концентрация полученного раствора, % 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025 0,003
Оптическая плотность 0,136 0,233 0,389 0,473 0,583 0,671
А,ьтсонтолс
ксечитпО
y = 2 1 7 ,6 6 x + 0 ,0 3 3 3
Концентрация кислоты галловой, %
Рисунок 4 - Г радуировочный график зависимости оптической плотности от
концентрации кислоты галловой
66
Как следует из представленного графика, все экспериментальные точки
находятся вблизи линии тренда, а величина коэффициента а незначительная.
Определение прецизионности
Прецизионность (воспроизводимость) - это характеристика случайного
рассеяния. Данная характеристика бывает трех уровней:
- повторяемость (сходимость);
- промежуточная прецизионность (внутрилабораторная воспроизводимость);
- межлабораторная воспроизводимость.
Для целей фармацевтического анализа достаточно первого уровня.
Таблица 15 - Результаты определения прецизионности методикиколичественного определения дубильных веществ в пересчете на кислоту галловую в корневищах с корнями лапчатки белой
Результат анализа г/100мл ( X, — X) 21(Xi Метрологические характеристики
8,30 -0,27 0,0729
8,90 0,33 0,1089Хср =8,57
8,40 -0,17 0,0289SD=0,089
8,71 0,15 0,0225RSD=2,67%
8,50 -0,07 0,0049
8,63 0,06 0,0036
Как видно из полученных данных, прецизионность соответствует
предъявляемым требованиям (2,67<2,7%).
Определение правильности
Правильностью аналитической методики называется степень близости
экспериментальных результатов к истинному значению во всей области измерений.
67
Таблица 16 - Результаты установления правильности методики
количественного определения дубильных веществ в корневищах с корнями
лапчатки белой
№ Уровень
Взято кислоты
галловой, г/100 мл
Найдено кислоты
галловой, г/100 мл
R,% Метрологическиехарактеристики
1 1 5,87 5,86 99,83 R = 99,76%
RSD-3,08%2 1 5,59 5,50 98,383 1 5,49 5,49 100,004 2 8,76 8,75 99,885 2 8,57 8,50 99,186 2 8,88 8,92 100,457 3 12,92 12,92 100,008 3 10,95 10,94 99,909 3 13,55 13,58 100,22
Значение открываемости должно быть в пределах 98-102%, что соответствует
полученным данным и позволяет утверждать, что правильность методики
соответствует предъявляемым требованиям.
Таким образом, нами была проведена валидационная оценка методики УФ
спектрофотометрического количественного определения дубильных веществ в
извлечении из корневищ с корнями лапчатки белой по показателям: линейность,
правильность и прецизионность.
3.5 Изучение аминокислотного состава
Известно, что аминокислоты являются важнейшими компонентами,
участвующими во всех жизненных процессах. Помимо аминокислот, являющихся
составной частью белков, живые организмы обладают постоянным резервом свобод
ных аминокислот в тканях и клеточном соке. Они находятся в динамичном
68
равновесии при обменных реакциях [68], кроме того, часть аминокислот является
эссенциальными (незаменимыми), что обуславливает диетическую ценность
растения [95].
Для обнаружения аминокислот проводили качественную реакцию с
нингидрином. Хроматографически в корневищах с корнями лапчатки белой было
идентифицировано 11 аминокислот (лейцин, лизин, фенилаланини, аргинин,
аспарагин, глицин, глутамин, триптофан, тирозин, треонин, лизин солянокислый,
цистин), в том числе 4 незаменимые - лейцин, лизин, фенилаланин, тритофан, и 1
частично заменимая аминокислота - аргинин.
Результаты определения состава аминокислот методом жидкостной
хроматографии приведены в таблице 17.
Таблица 17 - Содержание аминокислот в подземной части лапчатки белой
Аминокислота Химическое название
Количественноесодержание
% от веса воздушно
сухого сырьяг/кг
Незаменимые аминокислотыЛейцин а- аминоизокапроновая 0,17 1,73Лизин а,е- диаминокапроновая 0,07 0,72Трептофан 2-амино-3 -(3 -индолил)пропионовая к-та 0,20 2,01Фенилаланин а- амино-Р-фенилпропионовая 0,04 0,36
Частично заменимые аминокислотыАргинин а- амино-а-гуанидин-н-валериановая 0,16 1,61
Заменимые аминокислотыАспарагин а- аминоянтарная 0,38 3,81Г лицин а- аминоуксусная 0,35 3,51Г лютамин а- аминоглутаровая 0,25 2,54Серин а- амино-Р-оксипропионовая 0,27 2,68Тирозин а- амино-Р-оксифенилпропионовая 0,09 0,93Цистин дисульфид цистеинаОбщая сумма аминокислот 1,98 19,90Сумма незаменимых аминокислот 0,48 4,82Сумма частично заменимых аминокислот 0,16 1,61Сумма заменимых аминокислот 1,34 13,47
69
Согласно результатам анализа, содержание аминокислот в траве лапчатки
белой составило 19,90 г/кг. Идентифицировано 11 аминокислот, около 24 % из
которых - незаменимые. В числе незаменимых аминокислот преобладают
трептофан (2,01 г/кг) и лейцин (1,73 г/кг), в числе заменимых - аспарагин (3,81 г/кг)
и глицин (3,51 г/кг).
Мажорной аминокислотой является заменимая аминокислота аспарагин (3,81
г/кг), в следовых количествах представлены лизин (0,72 г/кг) и фенилаланин (0,36
г/кг).
3.6 Изучение элементного состава
Известно, что нативные комплексы элементов растений могут быть
использованы в качестве лекарственных и профилактических средств в комплексной
терапии различных заболеваний, а также в качестве маркеров в биогеохимических,
биологоэкологических и фитохимических исследованиях [52].
Известно, что существует генетический и экологический факторы
формирования элементного состава растений. Их приоритетность меняется в
зависимости от условий окружающей среды, при техногенном загрязнении
экологический фактор становится ведущим [56]. Поэтому усиление антропогенной
нагрузки на окружающую среду позволяет рассматривать проблему оценки
экологической чистоты лекарственных растений как одну из важнейших
экологических проблем современности, т.к. химические элементы, которые
накапливаются в растении, могут, с одной стороны, обеспечивать
фармакологический эффект, с другой стороны, содержание некоторых может
являться причиной токсического воздействия. Исходя из этого, изучение
лекарственных растений как объектов экологического мониторинга признано
актуальным направлением в совершенствовании качества фитопрепаратов и
исследования антропогенного влияния на окружающую среду [42] .
В соответствии с рекомендацией диетологической комиссии Национальной
академии США ежедневное поступление химических элементов с пищей должно
70
находиться на определенном оптимальном уровне, представленном в таблице 18.
Таблица 18 - Нормы суточного поступления химических элементов в
организм человека
Химический элемент
Суточное поступление, мг
Взрослые Дети
Калий 2000-5500 530Натрий 1100-3300 260Кальций 800-1200 420Магний 300-400 60Цинк 15 5Железо 10-15 7Марганец 2-5 1,3Медь 1,5-3,0 1,0Молибден 0,075-0,250 0,06Хром 0,05-0,2 0,04Кобальт 0,2 0,001Селен 0,05-0,07 -Фтор 1,5-4,0 -Иод 1,5-4,0 0,6
Первые 4 элемента относятся к макроэлементам в силу того, что их
содержание в организме превышает 10- %, а остальные - к микроэлементам.
Большинство микроэлементов являются ^-металлами и входят в состав ферментов.
Например, марганец входит в состав 12 различных ферментов, медь - в 30, железо -
70, а цинк - более чем в 100. При малом поступлении элементов снижается
активность ферментов, в состав которых входит данный элемент, что
сопровождается характерными симптомами.
Особое внимание следует обратить на такой микроэлемент, как йод. В
настоящее время около 300 миллионов человек в мире имеют клинические
проявления недостатка йода в организме - эндемический зоб и гипотиреоз. Около
20 млн. человек в мире имеют недоразвитие интеллекта из-за того, что в детстве не
получали йода в достаточном количестве. В настоящее время жители России в
среднем употребляют 40-80 мкг йода в сутки, в то время как в США на среднего
жителя приходится 400-800 мкг, в Японии - 1500 мкг в сутки. От количества
71
поступающего ежесуточно йода в организм зависит работа эндокринной системы.
Учитывая то, что большая часть нашей страны (около 70%) относится к зонам с
пониженным содержанием природного йода, рекомендовано в плане здорового
питания ежесуточно потреблять 100-200 мкг йода [33].
В результате проведенных исследований в пробах корневищ с корнями
лапчатки белой обнаружено 38 химических элементов (табл. 19) [80].
Таблица 19 - Элементный состав золы корневищ с корнями лапчатки белой
Элементы Содержание, % от веса золы воздушно-сухого сырьяБарий <0,01Бериллий <0,0001Ванадий <0,0001Висмут <0,0001Вольфрам <0,003Галлий <0,003Г афний <0,0001Г ерманий <0,003Железо <0,2Индий >0,003Иттербий <0,003Иттрий <0,01Кадмий <0,01Калий >5,0Кальций >5,0Кобальт <0,0003Кремний >0,1Лантан >0,01Литий >0,02Магний >0,3Марганец >5,0Медь >0,50Молибден <0,001Натрий >0,5Никель <0,001Ниобий <0,0003
72
Олово <0,003Свинец <0,0015
продолжение таблицы 19
Серебро >0,01Скандий <0,003Стронций <0,002Сурьма <0,0003Таллий <0,0001Титан <0,03Фосфор >10Хром >0,01Цинк <0,02Цирконий <0,003
Таким образом, элементный состав лапчатки белой представлен в том числе
эссенциальными (Cu, Zn, Mn, Fe, Mo, P, Co, Cr, S) и условно-эссенциальными (Ba,
Ni, Si,V) элементами [46]. Можно также отметить высокое содержание марганца и
фосфора.
Обнаружение йода в корневищах с корнями лапчатки белой проводили по реакции
с крахмалом в присутствии сульфаминовой кислоты. Количественное определение йода в сырье лапчатки проводили по методике ГФ XI изд. после сжигания пробы [27]. Содержание йода составило 0,66±0,04%, что объясняет широкое использование лапчатки для лечения и профилактики заболеваний, связанных с недостатком йода, поскольку
известно, что йод, содержащийся в растительном сырье, усваивается лучше, чем
вводимый в виде препарата йодистого калия. Часто лапчатку используют в виде
настойки или экстракта. Нами были проведены исследования по разработке
технологической схемы производства настойки и ее стандартизации, которые
отражены в Приложении 1.
Поскольку в РФ отсутствуют нормативная документация, регламентирующая
ПДК тяжелых металлов для ЛРС, полученные результаты сравнивали с ПДК
СанПиН 2.3.2.560-96 «Гигиенические требования к качеству и безопасности
продовольственного сырья и пищевых продуктов» [64]. Установлено, что
73
содержание свинца, никеля и цинка в корневищах с корнями лапчатки белой не
превышает ПДК, установленных СанПиН 2.3.2.560-96.
74
ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ 3
1. Установлен состав БАС подземных органов лапчатки белой,
интродуцированной на Северном Кавказе: выявлено наличие фенольных
соединений, органических кислот, полисахаридов и аминокислот.
2. Методом ВЭЖХ определен состав фенольных соединений корневищ с
корнями лапчатки белой. Установлено, что мажорными фенольными
соединениями являются коричная кислота (15,2% от суммы фенольных
соединений), ЭКГгаллат (12,7% от суммы фенольных соединений), и
феруловая кислота (8,8% от суммы фенольных соединений). При этом
кофейная, феруловая кислоты, гесперидин и лютеолин-7-гликозид в сырье
лапчатки белой были идентифицированы впервые.
3. В составе органических кислот корневищ с корнями лапчатки белой были
идентифицированы и количественно определены щавелевая кислота (79,95
% от суммы органических кислот) и маликовая (яблочная) кислота (1,18%
от суммы органических кислот).
4. В составе полисахаридного комплекса методом ВЭЖХ были
идентифицированы и определено количественное содержание арабинозы
(14,91% от полисахаридного комплекса) и сахарозы (2,09% от
полисахаридного комплекса).
5. Различными методами определено количественное содержание дубильных
веществ в корневищах с корнями лапчатки белой.
6. Изучен элементный состав подземный органов лапчатки белой.
Выявлено, что мажорным макроэлементом является фосфор, в числе
микроэлементов преобладает марганец. Установлено присутствие и
количественное содержание йода 0,66±0,04%. Содержание токсичных
элементов не превышает ПДК, установленных СанПИН.
75
ГЛАВА 4 МОРФОЛОГО-АНАТОМИЧЕСКИЕ И ТОВАРОВЕДЧЕСКИЕ
ИССЛЕДОВАНИЯ СЫ РЬЯ ЛАПЧАТКИ БЕЛОЙ
4.1 Морфологические признаки вида
Объектом морфологического изучения явились надземные и подземные
органы лапчатки белой, собранные в условиях интродукции на территории
Ботанического сада г. Нальчик в фазу цветения. Образцы гербария, собранного
автором диссертационной работы, находятся на кафедре ботаники Пятигорского
медико-фармацевтического института.
Лапчатка белая - многолетнее травянистое растение, 10-25 см высотой,
подземные органы представлены мощным горизонтальным маловетвистым
корневищем, покрытым многочисленными мелкими придаточными корнями.
Побеги многочисленные, восходящие, тонкие, опушенные. Опушение образовано
прижатыми шелковистыми волосками. Цветоносы 2-5 цветковые короче черешков
листьев. Прикорневые листья пальчато-сложные, черешковые, с прилистниками,
расположенными в основании черешка. Прилистники имеют темно-бурую окраску,
с ланцетными острыми ушками.
Стеблевые листья сильно редуцированы, с мелкими яйцевидно-ланцетными
прилистниками, листочки продолговато-ланцетные, клиновидно суживающиеся к
основанию, на верхушке с немногочисленными острыми прилегающими
зубчиками, сверху практически голые, снизу шелковисто-прижато-волосистые (рис.
5).
76
Рисунок 5 - Гербарный образец лапчатки белой (Potentilla alba L.)
Цветки актиноморфные, диаметром 12-15 мм, на хорошо развитых
цветоножках, подчашие образовано линейно-ланцетными элементами, чашечка
состоит из яйцевидно-ланцетных чашелистиков. Лепестки белые, широко-обратно
77
яйцевидные, выемчатые. Лепестки значительно длиннее чашелистиков. Андроцей
представлен многочисленными тычинками, гинецей апокарпный, столбики
вытянутые, рыльца слегка утолщенные (рис.6).
Рисунок 6 - Цветок лапчатки белой (Potentilla alba L.)
А - вид сверху, Б - вид снизу
4.2 Анатомические строение и диагностические признаки лапчатки белой
4.2.1. Анатомическое строение подземных органов
Анатомическое строение подземных органов изучали на поперечных срезах
корня и корневища. Корень имеет вторичное строение, покровная ткань
представлена перидермой. Клетки феллемы таблитчатой формы, клеточные стенки
пропитаны суберином. Перициклическая зона образована паренхимными клетками.
Флоэма представлена мелкими ситовидными элементами. В паренхимных клетках
флоэмы расположено большое количество крахмальных зерен (рис.7А, Б).
78
Б
Рисунок 7 - Анатомическое строение корня лапчатки белой
79
А - общий вид поперечного среза, Б - фрагмент поперечного среза(ув.х40)
Рисунок 8 - Проводящая система корня (световой микроскоп) (ув.*40)
80
Рисунок 9 - Проводящая система корня (люминисцентный микроскоп) (ув.*40)
Рисунок 10- Анатомическое строение корневища в зоне паренхимы сердцевины
лапчатки белой (ув.*40)
Рисунок 11 - Анатомическое строение корневища (паренхима сердцевинных лучей)
лапчатки белой (ув.*40)
81
Рисунок 12 - Анатомическое строение корневища лапчатки белой
(межпучковая паренхима) (ув.*40)
Рисунок 13 - Межпучковая паренхима корневища лапчатки белой
(ув.х40)
Зона камбия отчетливо заметна на поперечном срезе, она разделяет флоэму и
ксилему. Ксилема также характеризуется максимальной паренхиматизацией.
Крахмалоносные клетки достаточно обильно представлены и в зоне радиальных
лучей. Сосудистые элементы имеют выраженное лучевое строение, в
82
люминисцентном освещении имеют характерное свечение. Характерно наличие
обкладки сосудистых элементов (рис.7Б).
При изучении строения первичной ксилемы выявлены следующие
особенности, первичная ксилема триархна, кроме того выявлена максимальная
лигнификация сосудистых элементов (рис.8,9).
При изучении анатомического строения корневища следует отметить, что
анатомическое строение данного органа изменяется в зависимости от возраста
органа. В центральной зоне на поперечном срезе корневища располагается
паренхима сердцевины, образованная живыми крупными паренхимными клетками
округлой формы. Клеточные стенки либо не утолщенные, либо слабо
лигнифицированные. В лучевой паренхиме можно обнаружить одиночные друзы
оксалата кальция и многочисленные сферокристаллы (рис.10, 11) [81].
Проводящая система пучкового типа, проводящие пучки коллатерального
типа имеют вытянутую форму. Флоэмная структура неоднородна, содержит
ситовидные элементы и паренхимные элементы. Ситовидные элементы
представлены мелкими клетками. Ксилема содержит наряду с проводящими
элементами механические и паренхимные элементы. Волокна имеют небольшой
диаметр и расположены ближе к сосудам. Сосуды достаточно крупные, округлой
формы (рис.12,13).
4.2.2 Анатомическое строение травы
Лист гипостоматический. Верхняя эпидерма листовой пластинки представлена
клетками прямоугольной и слегка вытянутой формы. Антиклинальные стенки
эпидермальных клеток практически прямые. Клеточная стенка слегка утолщена.
Устьиц нет. Опушение представлено простыми одноклеточными волосками с
бородавчатой кутикулой. Волоски расположены по краю листовой пластинки. По
жилкам расположены многочисленные достаточно крупные друзы оксалата кальция,
образующие кристаллоносную обкладку (рис.14). По краю листовой пластинки
83
располагаются трихомы в виде простых одноклеточных волосков, клеточная стенка
утолщена (рис.15).
Рисунок 14 - Верхняя эпидерма листовой пластинки лапчатки белой (ув.*40) А - клетки жилки с кристаллоносной обкладкой
Б - эпидермальные клетки
Рисунок 15 - Опушение по краю листовой пластинки лапчатки белой (ув.*40) А, Б - простые одноклеточные волоски с утолщенными стенками
84
Рисунок 16 - Нижняя эпидерма листовой пластинки лапчатки белой (ув. *40) А - эпидермальные клетки, Б - клетки жилки и головчатый волосок
Рисунок 17 - Трихомы листовой пластинки лапчатки белой (ув.*40)
85
Рисунок 18 - Поперечный срез листовой пластинки (ув.*40)
Рисунок 19 - Поперечный срез черешка листа лапчатки белой (ув.*40)
Нижняя эпидерма листовой пластинки представлена клетками
изодиаметричной формы, антиклинальные стенки эпидермальных клеток слабо
волнистые. Устьичный аппарат аномоцитного типа. Количество побочных клеток,
окружающих устьице, колеблется от 3 до 5. Кроющие трихомы представлены
простыми одноклеточными волосками с утолщенными стенками и мелкими
головчатыми волосками (рис.17). Одноклеточные волоски достаточно обильно
расположены с нижней стороны листовой пластинки (рис.16).
86
На поперечном срезе листовой пластинки под верхней эпидермой, которая
представлена одним слоем крупных клеток, покрытых кутикулой, расположен
столбчатый мезофилл, клетки которого образуют 2-3 слоя хлорофиллоносной ткани.
Проводящая система представлена коллатеральными проводящими пучками,
расположенными одиночно в областях главной и второстепенных жилок. Под
нижней эпидермой в области главной жилки расположена колленхима (рис.18).
Черешок листа на поперечном сечении имеет треугольно - седловидную
форму. С адаксиальной стороны расположена характерная выемка, в области
которой эпидерма покрыта многочисленными простыми одноклеточными
волосками. Под эпидермой в 1, реже 2 слоя расположена пластинчатая колленхима.
Проводящая система пучкового типа, имеет характерное дорзовентральное
строение. Количество проводящих пучков - 3. Дорзальный проводящий пучок имеет
подковообразную форму, может быть агрегатным. Вентральные проводящие пучки
имеют более вытянутую форму (рис.19).
Флоэма ориентирована к наружной стороне, ксилема к внутренней зоне
листовой пластинки. Все проводящие пучки армированы со стороны флоэмы.
Вокруг проводящего пучка расположена паренхимная обкладка, представленная
мелкими паренхимными клетками. В субэпидермальном слое в клетках наблюдается
содержимое желтого цвета.
Что касается особенностей строения цветка, то они изучались как при
помощи светового, так и люминисцентного микроскопа. На препаратах с
поверхности генеративные органы представлены многочисленными тычинками с
удлиненными филаментами, гинецей апокарпный (рис. 20 А).
Фертильные элементы цветка состоят из чашелистиков и лепестков. Лепестки
значительно длиннее чашелистиков. Лепестки имеют белую окраску, на
поверхностном препарате хорошо заметны жилки, а также расположенные в
эпидерме железистые трихомы, которые имеют характерное свечение в
люминисцентном освещении (рис. 20 А).
87
По краю чашелистика хорошо видно густое опушение, образованное
длинными простыми одноклеточными трихомами (рис.21). Изучение особенностей
строения лепестков венчика проводили на микропрепаратах верхней и нижней
эпидермы лепестка. Нижняя эпидерма состоит из клеток с зигзагообразными
антиклинальными стенками.
Верхняя эпидерма имеет клетки с более прямыми антиклинальными стенками.
Характерно наличие сосочковидных выростов клеток эпидермы, выполняющих, по
- видимому, нектароносную функцию.
Анатомическое строение эпидермы чашелистика сходно с особенностями
строения эпидермы стеблевых листьев. Характерно опушение, образованное
простыми одноклеточными волосками.
Эпидермальные клетки имеют ромбовидную форму, прямые антиклинальные
стенки. Устьичные аппараты расположены только на нижней стороне чашелистика.
При увеличении х 40 хорошо заметны кристаллические включения,
ориентированные ближе к жилкам [82].
Рисунок 20 - Анатомическое строение эпидермы лепестка венчика лапчатки белой(ув.*40)
88
Рисунок 21 - Анатомическое строение эпидермы чашелистика лапчатки белой при
увеличениях х10 (А) и х40 (Б)
Проведенные исследования позволили выделить диагностические признаки
как надземных, так и подземных органов лапчатки белой, к которым можно отнести:
Листовая пластинка дорзовентрального типа. Характерна кристаллоносная
обкладка жилок, образованная друзами оксалата кальция. Густое опушение
образовано простыми одноклеточными волосками с утолщенной стенкой. Листовая
пластинка гипостоматическая, устьичный аппарат аномоцитного типа.
Черешок листа имеет треугольно - седловидную форму на поперечном
сечении. Клетки колленхиматозной паренхимы пропитаны содержимым желтого
цвета. Проводящая система пучкового типа, образована тремя коллатеральными
проводящими пучками.
Корневище цилиндрической формы. Проводящая система пучкового типа.
Характерна обкладка сердцевинных лучей, образованная сферокристаллами и
друзами.
Корень вторичного строения, характеризуется хорошо развитой паренхимой
радиальных лучей. Ксилема образована сосудистыми элементами, вокруг которых
сосредоточены клетки с содержимым желтого цвета [81, 82].
89
4.3 Определение товароведческих показателей
Согласно требованиям нормативной документации на ЛРС [71], нами по
стандартным методикам, изложенным в ГФ XI, были проведены товароведческие
исследования на 6 сериях сырья и разработаны числовые показатели для корневищ с
корнями лапчатки белой (табл. 20).
Таблица 20 - Числовые показатели корневищ с корнями лапчатки белой
Показатель Содержание, %
Влажность 9,93-10,87
Зола общая 6,89-8,01
Зола, нерастворимая в 10% кислоте хлористоводородной 3,19-3,36
Экстрактивные вещества, извлекаемые
- спиртом этиловым 40 % 10,96-11,12
- спиртом этиловым 70 % 12,15-13,07
- спиртом этиловым 96 % 2,06-2,89
Количественное содержание кислоты хлорогеновой 0,17-0,22
Количественное содержание кислоты галловой 0,16-0,19
Органические примеси 1,56-1,68
Минеральные примеси 0,87-0,95
Таким образом, на основании проведенных исследований предложены
показатели и нормы качества для сырья лапчатки белой, которые положены в
основу разработанной нами ФС «Лапчатки корневища с корнями» (табл. 21).
Таблица 21 - Показатели норм качества «Лапчатки корневища с корнями»
Показатели Методы НормыВнешние признаки Внешние признаки В соответствии с ФС 42-Микроскопия Микроскопический В соответствии с ФС 42-Качественные реакции К 5 мл водного извлечения прибавляют 1 мл 1%
водного раствора железоаммониевых квасцов и встряхивают
Раствор приобретает черно - зеленое окрашивание (конденсированные дубильные вещества)
Влажность ГФ XI, вып. 1, С. 285-286 Не более 10%Зола общая ГФ XI, вып. 1, С. 24 Не более 5%Зола нерастворимая в 10% HCl
ГФ XI, вып. 1, С. 25 Не более 2%Органические примеси ГФ XI, вып. 1, С. 276 Не более 2%Минеральные примеси ГФ XI, вып. 1, С. 276 Не более 1%Количественноеопределение
ВЭЖХ (содержание галловой и хлорогеновой кислот методом абсолютной калибровки)
Галловой кислоты - не менее 0,15% Хлорогеновой кислоты - не менее 0,16%
Микробиологическаячистота
ГФ XII ОФС 42-0016-07 Категория 4 АУпаковка ГФ XI, вып. 2, С. 381 В мешки тканевые или льно-джуто-кенафные не более
ГОСТ 6077-80 40 кг неттоМаркировка ГФ XI, вып. 12, С. 384
ГОСТ 14192-96На этикетке указывается наименование предприятия- изготовителя, его товарный знак, юридический адрес,
название лекарственного средства на русском и латинском языках, масса 40 кг при влажности не более
12 %, регистрационный номер, номер серии, срок годности, условия хранения, «Продукция прошла
радиационный контроль»Транспортировка ГФ XI, вып. 2, С. 385 ГОСТ 14192-77 и ГОСТ 17768-80Срок годности 2 года
91
ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ 4
Установлены диагностические признаки травы и корневищ с корнями
лапчатки белой. Листовая пластинка дорзовентрального типа с кристаллоносной
обкладкой жилок, образованной друзами оксалата кальция. Густое опушение
образовано простыми одноклеточными волосками с утолщенной стенкой.
Устьичный аппарат аномоцитного типа. Черешок листа имеет треугольно -
седловидную форму на поперечном сечении. Клетки колленхиматозной
паренхимы пропитаны содержимым желтого цвета. Проводящая система
пучкового типа, образована тремя коллатеральными проводящими пучками.
Корневище цилиндрической формы. Проводящая система пучкового типа.
Характерна обкладка сердцевинных лучей, образованная сферокристаллами и
друзами. Корень вторичного строения, характеризуется хорошо развитой
паренхимой радиальных лучей. Ксилема образована сосудистыми элементами,
вокруг которых сосредоточены клетки с содержимым желтого цвета.
Разработаны числовые показатели для сырья (корневищ с корнями) лапчатки
белой:
- влажность - не более 10%;
- содержание общей золы - не более 5%,
- золы нерастворимой в растворе кислоты хлористоводородной 10% - не
более 2%;
- органической примеси - не более 2%;
- минеральной примеси - не более 1%.
92
ГЛАВА 5 ИНТРОДУКЦИОННЫЕ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ
ИССЛЕДОВАНИЯ ЛАПЧАТКИ БЕЛОЙ
Интродукционные исследования лапчатки белой проводились на
территории Эколого-ботанической станции «Пятигорск» БИН РАН
(Ставропольский край), Ботаническом саду Кабардино-Балкарского
государственного университета (КБГУ) в г. Нальчик и Зольском районе
Кабардино-Балкарии.
5.1 Изучение онтогенеза лапчатки белой в условиях интродукции
Продолжительность вегетативного периода в наших условиях сходна с
таковыми в средней полосе России. Начало вегетации начинается в конце марта -
начале апреля, как правило, сразу после схода снега и началом среднесуточных
положительных температур. В таблице 22 представлен фенологический спектр за
2010-2012 года. Из этих данных видно, что, несмотря на относительную
отдаленность опытных участков друг от друга, основные этапы вегетации мало
отличаются по срокам, а разница меду ними составляет не более одной недели.
Таблица 22 - Фенологический спектр лапчатки белой на опытных участках 2010-
2012 гг.
Опытныеучастки
Началовегета
ции
Бутонизация
Началоцветения
Массовоецветение
Конеццветения
Созревание
семян
Конецвегета
ции
Пяти
горс
к 25.03.10
31.03.1104.04.12
15. 04.10
17. 04.11 10. 04.12
20.04.10
23.04.1122.04.12
10.05.10
14.-05.1127.04.12
11.06.10
13.06.1110.06.12
14.06.10
17.06.1110.06.12
15.11.10
10.11.11
КБГУ
29.03.11
16.04.12
11.04.11
08.04.12
20.04.11
12.04.12
01.05.11
17.04.12
17.05.11
02.05.12
22.05.11
15.05.12
10.10.10
13.10.11
р= ю % Ио " Л Sп оО 15 м а
5.04.11
10.04.12
16.04.11
15.04.12
26.04.11
20.04.12
06.05.11
24.04.12
24.05.11
10.05.12
12.06.11
22.05.12
30.10.10
03.10.11
93
Рисунок 22 - Интродукционные образцы лапчатки белой на опытных делянках
бот. сада КБГУ
Рисунок 23 -Интродукционные образцы лапчатки белой в Зольском районеКабардино-Балкарской республики
94
Анализ вегетации за три года наблюдений несколько отличается. В первый
год жизни у опытных растений цветение отсутствовало. Наиболее ранние сроки
начала вегетации наблюдались в 2010 г., а наиболее поздние - в 2012 г. При этом
дальнейшие этапы фенофаз в эти же годы происходили в более сжатые сроки.
Объясняется это разницей в наступлении положительных среднесуточных
весенних температур. В 2010 году весна началась относительно рано по
сравнению с последующими годами наблюдений, однако в 2012 году, несмотря на
более поздние сроки начала весны (начало апреля), остальные этапы вегетации л.
белой происходили в достаточно короткие сроки. Переход от отрицательных к
положительным температурам был достаточно резким, в результате чего
произошло быстрое таяние снежного покрова. Дальнейшее быстрое потепление в
апреле привело к более раннему началу цветения. В 2011 году этапы вегетации
наоборот несколько затянуты, что связано с поздним сходом снежного покрова,
при этом весенний и летний периоды были более прохладными и дождливыми по
сравнению с другими годами. Наиболее наглядно это прослеживается на рисунке
24, где представлена диаграмма продолжительности периода цветения за 2010
2012 года. В графике представлены усредненные данные за три года.
Рисунок 24 - График активности цветения лапчатки белой за 2010-2012 гг.
95
5.2 Изучение прироста биомассы лапчатки белой в условиях интродукции
Темпы прироста биомассы, как и фенологические наблюдения, показывают
степень адаптации лапчатки белой к почвенно-климатическим условиям нашего
региона. В терапевтических целях используются корневища с корнями, в которых
происходит наибольшее накопление действующих веществ. По этой причине при
исследовании темпов прироста общей биомассы растений, наибольшее внимание
уделялось характеру прироста корневищ с корнями.
Приживаемость черенков при весенних наблюдениях 2010 года составило
98%, что указывает на устойчивость их к зимнему периоду с отрицательными
значениями температур. Формирование надземной массы растений происходило
из спящих почек с началом вегетативного периода. В течение первого года жизни
растения не цвели, при этом происходило активное нарастание как надземной, так
и подземной частей растений. На одном черенке при этом формируется от 1 до 3
побегов. К концу первого года формируются полноценные розетки листьев.
Анализ увеличения общей биомассы показывает, что после года жизни прирост
черенков составляет от 150 до 230%. При средней массе черенков 1,5-2 г, осенью
средняя масса живых растений вместе с надземной частью составила 4,7 г.
Средняя масса черенков и растений первого года жизни высчитывалась из расчета
общей массы 100 экземпляров опытных растений.
На второй год жизни происходит дальнейшее нарастание корневища и
увеличение надземной вегетативной части. Размеры корневища увеличились от 4
до 7-8 см, что составляет 90-100% от исходного размера. Около 30% опытных
образцов в этом возрасте уже вступают в стадию цветения. Средняя масса
растений к концу вегетативного периода второго года составила 7,3 г.
На третий год жизни большая часть экземпляров (около 90%) вступают в
стадию цветения. Размеры корневища увеличиваются до 10 см, а увеличение
биомассы составляет около 30%. На рисунке 25 представлен график прироста
биомассы в течение вегетационного периода. Наиболее активный рост лапчатки
белой отмечается в начале вегетации и в период активного цветения, после чего
96
прирост растений постепенно снижается и к концу вегетации полностью
прекращается.
Положительные результаты дало использование биогумусных удобрений
при выращивании лапчатки белой в наших условиях. Подкормка использовалась
для 50% опытных растений, для чего опытные участки были разделены на две
равные части.
По нашим данным в течение трех лет наблюдений происходило более
активное развитие опытных экземпляров, отмечался значительный прирост как
вегетативной, так и подземной частей растений, по сравнению с растениями,
подкормка которых не производилась. Взвешивание опытных образцов на
третьем году жизни показало, что средняя масса корневищ с корнями на 23%
выше на участках, где использовались биогумусные удобрения.
В таблице 23 приведена средняя масса корневищ с корнями лапчатки белой
на трех опытных участках с использованием подкормки и без нее.
97
Таблица 23 - Сравнительные данные массы корневищ с корнями лапчатки белой
с разных опытных участков при использовании биогумусных удобрений
УчастокМасса корневищ с корнями
без подкормки, гМасса корневищ с корнями с использованием биогумуса, г
Пятигорск 996,7 1206,1КБГУ 875,4 1076,7
Зольский район КБР 967,1 1184,7
Наибольший прирост при использовании биогумуса отмечается у растений
в Ботаническом саду КБГУ и Зольском районе КБР - 23% и 22,5%
соответственно. В условиях города Пятигорска разница между массой растений с
использованием подкормки и без неё составила 21%.
Таким образом, можно отметить положительное влияние подкормки
биогумусными удобрениями на рост и развитие лапчатки белой в условиях
Северного Кавказа.
Согласно литературным данным растения рекомендуется выкапывать на
сырье через 4-5 лет после посадки. В течение этого периода происходит наиболее
активный рост подземной части и накопление веществ, после чего темпы роста
корневища значительно уменьшаются. Наши данные показывают, что наиболее
активный прирост подземной части отмечается в первые три года и уже к концу
третьего года жизни формируются полноценные корневища, которые можно
использовать в медицинских целях. Общая биомасса растений за это время
увеличилась в 10 раз, по сравнению с исходной массой черенков.
На рисунке 26 приведен график характера роста лапчатки белой в течение
первых пяти лет жизни. Хотя наши исследования охватывают только три года,
выводы о дальнейшем развитии растений нами сделаны на основания
экстраполирования собственных данных с данными Г.К. Смык с соавторами
(1982).
98
Рисунок 26 - График темпа роста лапчатки белой в течение первых пяти лет
после черенкования
Таким образом, наиболее удобным способом размножения является деление
материнского корневища на черенки. К концу третьего года жизни корневища
полностью сформированы и пригодны для фармацевтического применения. Для
увеличения темпов роста подземной части лапчатки белой нами рекомендовано
использование биогумусных удобрений [47,78].
99
5.3 Биологические исследования
5.3.1 Определение острой токсичности водно-спиртового извлечения из
корневищ с корнями лапчатки белой
Г ибель животных наблюдалась в первые, очень редко на вторые сутки после
введения веществ. Выжившие животные двое суток отказывались от еды, и сутки
от воды. После чего потребление пищи и воды восстанавливалось.
Наблюдение за животными в ходе острого эксперимента показало, что
животные всех групп после введения переставали двигаться и в течение 30-60
минут занимали боковое положение. Наблюдалось тахипноэ. Животные,
получавшие 6000 и 6250 мг/кг, в таком положении находились в течение 12-13
часов. После этого выжившие животные совершали попытки вставать и
перемещаться по клетке. У животных, получавших 6500 - 6750 мг/кг, боковое
положение сохранялось от 12 до 18 часов, после чего у выживших животных
медленно восстанавливалась двигательная активность. При получении
животными дозы 7000 мг/кг смерть наступала в течение суток (табл. 24, 25).
Таблица 24 - Определение «острой» токсичности водно-спиртового
извлечения из корневищ с корнями лапчатки белой у мышей самцов
Водно-спиртовое извлечение из подземных органов лапчатки белой
Исследуемые дозы, мкг/кг массы тела крыс-самцов
Доза 6000 6250 6500 6750 7000Выжило 5 4 2 1 0Погибло 0 1 3 4 5
ЛД50 с доверительным интервалом 6477,09±110,07
Нижняя граница ЛД50 6241,02Верхняя граница ЛД50 6713,17
0Л 6090,73ЛД16 6175,66ЛД84 6778,53
00Л 9929,25Уровень значимости 0,05
100
Рисунок 27- Г рафик регрессии
Таблица 25 - Определение «острой» токсичности водно-спиртового извлечения
из корневищ с корнями лапчатки белой у мышей самок
Водно-спиртовое извлечение из подземных органов лапчатки белой Исследуемые дозы, мкг/кг кг массы тела крыс-самок
Доза 6000 6250 6500 6750 7000Выжило 5 4 3 1 0Погибло 0 1 2 4 5
ЛД50 с доверительным интервалом 6522,91±110,07
Нижняя граница ЛД50 6286,83Верхняя граница ЛД50 6758,98
0 6136,54ЛД16 6221,47ЛД84 6824,34
00Л 6909,27Уровень значимости 0,056975,06
101
Рисунок 28 - График регрессии
Результаты вскрытия мышей, погибших в остром опыте при введении
максимальной дозы
У животных, погибших в опытах острой токсичности, не наблюдалось
выраженных изменений внутренних органов грудной и брюшной полостей
(рис.29). В верхней части грудной полости над сердцем располагался крупный
тимус. Левый желудочек сердца был обескровлен, что свидетельствует об
остановке сердца в систоле (рис.30А). Кровенаполнение органов грудной и
брюшной полостей без особенностей. При вскрытии черепной коробки
отмечали резко выраженный отек мозга, ткань мозга имела водянистую
консистенцию. Консистенция мозга отличалась водянистой, студнеобразной
структурой (рис. 30Б).
102
Рисунок 29 - Результаты вскрытия животных, погибших при определении острой
токсичности
А
103
Б
Рисунок 30 - Результаты вскрытия животных, погибших при определенииострой токсичности
А - обескровленный левый желудочек;Б - студнеобразная консистенция мозга.
Таким образом, по классификации токсичности веществ Сидорова водно
спиртовое извлечение из корневищ с корнями лапчатки белой относится к 5
классу токсичности [11], т.е. практически нетоксичных веществ. Токсичность для
самцов и самок не имеет значимых отличий.
104
ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ 5
1. Составлены феноспектры и графики роста и прироста биомассы
лапчатки белой в условиях интродукции на Северном Кавказе.
2. Определено влияние подкормки биогумусными удобрениями на рост и
развитие лапчатки белой.
3. Установлено, что по классификации токсичности веществ (К.К.
Сидоров, 1973) водно-спиртовое извлечение из корневищ с корнями
лапчатки белой относится к 5 классу токсичности, т.е. практически
нетоксичных веществ и токсичность для самцов и самок не имеет
значимых отличий.
105
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
1. Проведены интродукционные исследования лапчатки белой на базе
Эколого-ботанической станции «Пятигорск» БИН РАН (Ставропольский
край) и Ботанического сада Кабардино-Балкарского государственного
университета в г. Нальчик и Зольском районе Кабардино-Балкарии.
Установлено, что лапчатка белая легко поддается интродукции в условиях
Северного Кавказа, обладает высокой урожайностью подземной части. Для
увеличения темпов роста подземной части лапчатки белой нами
рекомендовано использование биогумусных удобрений.
2. В корневищах с корнями интродуцированного вида методом ВЭЖХ
установлен качественный состав фенольных соединений, углеводов и
органических кислот. В составе фенольных соединений идентифицированы
танин, галловая кислота, хлорогеновая кислота, кофейная кислота,
феруловая кислота, дигидрокумарин, эпикатехин, лютеолин-7-гликозид,
гесперидин, коричная кислота, эллаговая кислота, кверцетин, ЭГКгаллат.
Мажорными фенольными соединениями явились коричная кислота (15,2%
от суммы фенольных соединений), ЭКГгаллат (12,7% от суммы фенольных
соединений), и феруловая кислота (8,8% от суммы фенольных соединений).
При этом кофейная, феруловая кислоты, гесперидин и лютеолин-7-гликозид
в сырье лапчатки белой были идентифицированы впервые. В составе
углеводов идентифицированы арабиноза (14,9% от полисахаридного
комплекса) и сахароза (2,1% от полисахаридного комплекса); в составе
органических кислот - щавелевая (76,0% от суммы органических кислот) и
маликовая (яблочная) (1,2% от суммы органических кислот) кислоты.
Установлено количественное содержание йода - 0,66±0,4%. Изучен
элементный состав подземный органов лапчатки белой. Установлено, что
мажорным макроэлементом является фосфор, в числе микроэлементов
преобладает марганец. Содержание токсичных элементов не превышает
ПДК, установленных СанПИН.
106
3. Проведено морфолого-анатомическое исследование и установлены
диагностические признаки корневищ с корнями и травы лапчатки белой.
Листовая пластинка дорзовентрального типа. Характерна кристаллоносная
обкладка жилок, образованная друзами оксалата кальция. Густое опушение
образовано простыми одноклеточными волосками с утолщенной стенкой.
Устьичный аппарат аномоцитного типа. Черешок листа имеет треугольно -
седловидную форму на поперечном сечении. Клетки колленхиматозной
паренхимы пропитаны содержимым желтого цвета. Проводящая система
пучкового типа, образована тремя коллатеральными проводящими
пучками. Корневище цилиндрической формы. Проводящая система
пучкового типа. Характерна обкладка сердцевинных лучей, образованная
сферокристаллами и друзами. Корень вторичного строения, характеризуется
хорошо развитой паренхимой радиальных лучей. Ксилема образована
сосудистыми элементами, вокруг которых сосредоточены клетки с
содержимым желтого цвета.
4. Установлено, что по классификации токсичности веществ (К.К. Сидоров,
1973) водно-спиртовое извлечение из корневищ с корнями лапчатки белой
относится к 5 классу токсичности, т.е. практически нетоксичных веществ и
токсичность для самцов и самок не имеет значимых отличий.
5. Разработан проект ФС «Лапчатки корневища с корнями» и «Инструкция по
сбору и сушке корневищ с корнями лапчатки белой».
Таким образом, проведенные исследования показали идентичность состава
биологически активных веществ дикорастущей и введенной в культуру на
территории Северного Кавказа лапчатки белой, что позволяет сохранить лапчатку
белую в естественных условиях обитания и рекомендовать интродуцированный
вид в качестве лекарственного растительного сырья для получения лекарственных
средств тиреотропного действия.
107
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Абдулкафарова, Е.Р. Исследование жирных кислот травы лапчатки белой
(Potentilla alba L.) / Е. Р. Абдулкафарова, А. М. Ковалева, Т. В. Ильина //
Modem medicine and pharmaceutics: actual problems and prospects of
development: мaterials digest of the XXX International Research and Practice
Conference and the II Stage of the Championship in medical and pharmaceutical
sciences, London, 16-23 August, 2012. - London, 2012. - Р. 108-109.
2. Андрукович, А.И. О применении отвара лапчатки прямостоячей для
лечения гепатитов и циррозов печени / А.И. Андрукович // Материалы 1 -го
съезда терапевтов Тюменской области. Тюмень, 1970. - С.48-50.
3. Архипова, Э.В. Влияние «ТиреоТона» на морфофункциональное состояние
щитовидной железы при экспериментальном гипотиреозе / Э.В. Архипова,
Г.Х. Дамдинова // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2012. - № 6 (88). - С. 55
59.
4. Архипова, Э.В. Влияние экстракта Potentilla alba L. и комплексного
средства «Тиреотон» на течение экспериментального гипотиреоза:
автореф. дис. ... канд. мед. наук: 14.03.06 // Архипова Эржена
Владимировна. - Улан-Удыэ, 2012. - 21 с.
5. Бальнеотерапия в современной медицинской практике / Ю.А.
Серебренникова [и др.] // Вестник ВГУ. - 2005. - № 1. - С. 225-235.
6. Батырева, В.А. Вид, занесённый в Красную книгу Смоленской области:
Лапчатка Белая (Potentilla alba L.) [Электронный ресурс] / В.А. Батырева //
Красная книга. Часть VI. Грибы (Mycota), Лишайники (Lichenes), Растения
(Planta). - Режим доступа:
http: //www. redbook67. ru/gribi/lapchatka_belaya_potentilla_alba_L/.
7. Башилов, А.В. Potentilla alba L. - эффективное средство при
тиреотоксикозе / А.В. Башилов // Вестник ВГМУ. - 2009. - Т. 8, № 3. - С.
1-9.
108
8. Башилов, А.В. Использование Potentilla alba L. в качестве лекарственного
растительного сырья в условиях республики Беларусь / А.В. Башилов //
Экологический вестник. - 2010. - № 3. - С. 85-89.
9. Башилов, А.В. К вопросу о фармаколого-биохимическом обосновании
практического использования Potentilla alba /А.В. Башилов // Известия
национальной академии наук Беларуси. Серия биологических наук. - 2012.
- № 1. - С. 119-123.
10. Белый, А.В. Антирадикальная активность дубильных веществ корневищ
Bergenia сrassifoHa в реакции с 2,2-дифенил-1-пикрилгидразилом / А.В.
Белый, Н.И. Белая // Химия раст. сырья. - 2012. - № 3. - С. 121-126.
11. Березовская, И.В. Классификация химических веществ по параметрам
острой токсичности при парентеральных способах введения / И.В.
Березовская // Хим.-фармац. журн. - 2003. - Т.37, № 3. - С. 32-34.
12. Биологически активные вещества сухого экстракта какалии копьевидной
/Д.Н. Оленников и др.] // Химия растительного сырья. -2004. - №3. - С. 59
62
13. Бородин, Ю.И. Растительные биологически активные добавки как
средства «фоновой» коррекции в онкологии / Ю.И. Бородин, В.Н.
Горчаков // Сибирский онкологический журнал. - 2005. - № 2. - С. 45-49.
14. Ботоева, Е.А. К вопросу о фитоэстрогенах (обзор литературы) / Е.А.
Ботоева // Бюллетень ВСНЦ СО РАН. - 2010. - № 2. - С. 234-238.
15. Ботоева, Е.А. Лекарственные растения, применяемые в лечении
воспалительных заболеваний женских половых органов / Е.А. Ботоева,
И.П. Убеева, С.М. Николаев // Вестник Бурятского госуниверситета. -
2010. - № 12. - С. 283-287.
16. Бубенчикова, В.Н. Изучение состава фенольный соединений лапчатки
прямостоячей методом ВЭЖХ / В.Н. Бубенчикова, Ю.А. Сухомлинов //
Вестник ВГУ. - 2005. - № 2. - С. 160-161.
109
17. Водопьянова, А.В. Влияние «Тиреонорма» на функциональное
состояние центральной нервной системы / А.В. Водопьянова, Л.Н.
Шантанова // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2011. - № 1. - С. 128-130.
18. Водопьянова, А.М. Фармакологическая коррекция тиреотоксикоза
комплексным растительным средством «Тиреонорм»: автореф. дис. ...
канд. мед. наук: 14.03.06 // Водопьянова Анна Михайловна. - Улан-Удэ,
2012. - 20 с.
19. Вопросы онтогенеза растений: Межвузовский сборник / Отв. ред. Э. В.
Шестакова, ред. кол. Л. А. Жукова, Е. И. Михайлова, А. А. Пекпаев и др. -
Йошкар - Ола, изд-во МарГУ, 1988. - 124с.
20. Выделение и идентификация фитостеринов из корней и корневищ
лапчатки белой / В.И. Шейченко [и др.] // Вопросы биологической,
медицинской и фармацевтической химии. - 2009. - N 2. - С.36-37.
21. Гаврилин, М.В. Фенольные соединения надземной части шалфея
мускатного (Salvia sclarea L.), культивируемого в Ставропольском крае //
М.В. Гаврилин, О.И. Попова, Е.А. Губанова // Химия раст. сырья. - 2010. -
№ 4. - С. 99-104.
22. Галушко, А.И. Флора Северного Кавказа / А.И. Галушко; под ред. С.К.
Черепанова. - Ростов: Изд-во Ростовского ун-та, 1980. - Т. 2.- 350с.
23. Гейссман, Т.А. Цветные реакции на флавоноидные соединения / Т.А.
Гейссман // Химические методы анализа растений. Сб. статей. - М.: Изд-во
ИП, 1960. - 469с.
24. Гладкова, В.Н. Порядок розовые, или розоцветные (Rosales) // Жизнь
растений. Т. 5.4.2. Цветковые растения. М.: Просвещение, 1981. - С.175-
188.
25. Горячкина, Е.Г. Фармакогностическое исследование некоторых
представителей рода лапчатка, произрастающих на территории Восточной
Сибири: автореф. дис. . канд. фарм. наук: 15.00.02 // Горячкина Елена
Геннадьевна. - Уфа, 1994. - 23 с.
110
26. Государственная фармакопея Российской Федерации. - 12-е изд. - М.:
Научный центр экспертизы средств медицинского применения, 2008. - Ч.
1. - 704с.
27. Государственная фармакопея СССР: в 2-х вып. / МЗ СССР. - 11-е изд., -
доп. - М.: Медицина, 1987-1989. - Вып. 1,2.
28. Гринько, Е.Н. Исследования по стандартизации лекарственного
растительного сырья, содержащего дубильные вещества: автореф. дис.
...канд. фарм. наук: 14.04.02 // Гринько Елена Николаевна. - Москва, 2011.
- 23 с.
29. Гринько, Е.Н. Требования российской и европейской фармакопей к
методикам определения содержания дубильных веществ в лекарственном
растительном сырье / Е.Н. Гринько // Фармация. - 2010. - № 5. - С. 49 - 53.
30. Гусева, А.И. Действие водных вытяжек из некоторых лекарственных
растений в отношении Candidaspp. / А.И. Гусева, А.В. Алешукина, О.Ю.
Ермолаева // Проблемы медицинской микологии. - 2008. - Т. 10, № 2. - С.
38.
31. Данилюк, О.А. Фитотерапия кашля у детей / О.А. Данилюк // Вопросы
современной педиатрии. - 2008. - Т.7, № 4. - С. 120-125.
32. Дикорастущие полезные растения России / Под ред. А.Л. Буданцева,
Е.Е. Лесновской. - СПб.: Изд-во СПХФА. - 2001. - 663 с.
33. Ефремов, А.А. Проблемы здорового питания населения отдельных
регионов России / А.А. Ефремов // Успехи современного естествознания. -
2012. - № 9. - С. 7-9.
34. Иващенко, Т.А. Биоморфологические особенности Potentilla fruticosa L.
при интродукции на Северо-Западном Кавказе: автореф. дис. . канд. биол.
наук: 03.00.32 // Иващенко Татьяна Александровна. - Майкоп, 2007. - 22 с.
35. Изучение состава крови, молока и кормов (Методические указания) /
Всесоюзный НИИ разведения и генетики сельскохозяйственных
животных. - Л.:, 1974. - С.77-104.
111
36. Кваченюк, А.Н. Использование фитотерапии при лечении заболеваний
щитовидной железы / А.Н. Кваченюк, Е.Л. Кваченюк // Врачебное дело. -
2012. - № 3. - С. 1-4.
37. Королюк, Е.А. Красильные растения Алтая и сопредельных территорий /
Е.А. Королюк // Химия раст. сырья. - 2003. - № 1. - С. 101-135.
38. Костеша, Н.Я. Пути повышения резистентности организма при
действии ионизирующего излучения: автореф. дис. ...докт. биол. наук:
03.00.01 // Костеша Николай Яковлевич. - Томск, 2000. - 48 с.
39. 38.Курбатский, В.И. К внутриродовой систематике Potentilla L. и
Comarum L. s.l. / В.И. Курбатский // Систематические заметки по
материалам гербария им. П.Н. Крылова при Томском государственном
университете. - 2008. - № 99. - С. 1-8.
40. Курбатский, В.И. Род Potentilla L. в горах Южной Сибири: автореф. дис.
.к ан д . биол. наук: 03.00.05 // Курбатский Владимир Иванович. - Томск,
1984. - 24 с.
41. Кухарева, Л.В. Ассортимент лекарственных растений, перспективных
для выращивания в условиях Беларуси / Л.В. Кухарева // Вестник
фармации. - 2007. - № 1. - С. 1-4.
42. Лобанова, И.Е. Элементный состав Astragalus glycyphyllus / И.Е.
Лобанова, О.В. Чанкина // Химия растительного сырья. - 2012. - № 2. -
С.93-99.
43. Матвеев, Л.Ю. Противовоспалительные свойства некоторых видов
лапчатки / М.Ю. Матвеев, Л.А. Сибилева, Т.П. Прищеп // Новые
лекарственные препараты из растений Сибири и Дальнего Востока. -
1989. - Т. 2. - С. 104-105.
44. Мелик-Гусейнов, В.В. Атлас растений. Растения в народной медицине
России и сопредельных государств / В.В. Мелик-Гусейнов. - Пятигорск:
СНЕГ, 2011. - 607 с.
112
45. Мелик-Гусейнов, В.В. Идентификация фенольных соединений в
подземных органах лапчатки белой, интродуцированной на Северном
Кавказе / В.В. Мелик-Гусейнов, Ф.К. Тхамокова // Вестник МГОУ. - 2012.
- № 1. - С. 49-52.
46. 44.Мелик-Гусейнов, В.В. Оценка элементного состава некоторых
полезных растений Северного Кавказа / В.В. Мелик-Гусейнов, Ф.К.
Тхамокова, С.В. Герасименко // Медицинский вестник Башкортостана. -
2012. - Том 7, № 5. - С.90-91.
47. Мелик-Гусейнов, В.В. Перспективы выращивания лапчатки белой
(Potentilla alba L.) на Северном Кавказе / В.В. Мелик-Гусейнов, Ф.К.
Тхамокова, Д.С. Шильников // Вестник МГОУ. - 2013. - № 2. - С. 49-52.
48. Мелик-Гусейнов, В.В. Фитотерапия. Справочник по применению
лекарственных растений в традиционной и нетрадиционной медицине /
В.В. Мелик-Гусейнов, С.А. Реккандт. - Пятигорск: РИА на КМВ, 2012. -
604 с.
49. Методика исследования при интродукции лекарственных растений /
Майсурадзе Н.И. [и др.] // Лекарственное растениеводство: обзорная
информация. - М., 1984. - № 3. - 51с.
50. Методы биохимического анализа растений / под ред. В.В. Полевого, Г.Б.
Максимова. - Л.: Изд-во Ленинград. ун-та, 1978. - 192с.
51. Методы биохимического исследования растений / А.И. Ермаков [и др.].-
Л.: Колос, 1972. - 112с.
52. Минеральные вещества - основа снижения антропогенного воздействия
окружающей среды на организм человека / А.А. Ефремов [и др.] // Химия
раст. сырья. - 2002. - № 3. - С. 65-68.
53. Новиков, В.С. Лапчатка Белая (Potentilla alba L.) [Электронный ресурс] /
В.С. Новиков, В.Н. Тихомиров// Красная книга Московской области. -
Режим доступа: http: //kkmo 1 .verhovye.ru/rb/plants/potentilla_alba.html
113
54. Острикова, О.В. Исследование адаптивности и репродукционного
потенциала ценных декоративных растений / О.В. Острикова // Ученые
записки Орловского государственного университета. - 2010. - № 2. - С.
274-279.
55. Перспективы внедрения в медицинскую практику некоторых видов
лекарственных растений Прибайкалья / А.П. Федосеев [и др.] // Сибирский
медицинский журнал. - 2001. - № 1. - С. 70-75.
56. Позняк, С.С. Содержание некоторых тяжелых металлов в
растительности полевых и луговых агрофитоценозов в условиях
техногенного загрязнения почвенного покрова / С.С. Позняк // Вестник
Томского государственного университета. - 2011. - № 1. - С. 123-137.
57. Попов, П.Л. Виды растений, применявшиеся при вирусных болезнях
человека и животных: закономерности распределения в филогенетической
и классификационной системе / П.Л. Попов // Журнал стресс-физиологии и
биохимии. - 2008. - Т. 4, № 3-4. - С. 17-64.
58. Правила доклинической оценки безопасности фармакологических
средств (GLP). РД 64-126-91. - М.: МЗ РФ, 1992. - 78с.
59. Разаренова, К.Н. Сравнительная оценка содержания дубильных веществ
в некоторых видах рода Geranium L. флоры Северо-Запада / К.Н.
Разаренова, Е.В. Жохова // Химия раст. сырья. - 2011. - № 4. - С. 187-192.
60. Растительные ресурсы России и сопредельных государств. - СПб.: Мир
и семья-95, 1996. - 571 с.
61. Растительные ресурсы СССР. Цветковые растения. Вып. 3. Л.: Наука. -
1987. - 326 с.
62. Редкие растения и грибы: материалы для ведения Красной книги
Республики Мордовия за 2007 год / Т.Б. Силаева [и др.]; под общ. ред. Т.Б.
Силаевой. Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 2007. - 92 с.
63. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых
фармакологических веществ / под ред. В.П. Фисенко. - М.: Ремедиум,
114
2000. - 398с.
64. СанПиН 2.3.2.560-96. Продовольственное сырье и пищевые продукты.
Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного
сырья и пищевых продуктов. - М.: Госкомсанэпиднадзор России, 1997. -
270 с.
65. Сборник методических рекомендаций по стандартизации лекарственных
средств. Научный центр экспертизы средств медицинского применения. -
М.: Пеликан, 2006. - 392с.
66. Семенова, Е.Ф. Химический состав лапчатки белой и применение ее с
лечебной целью / Е.Ф. Семенова, Е.В. Преснякова // Химия и
компьютерное моделирование. Бутлеровские чтения. - 2001. - № 5. - С.
67. Семина, С.В. Влияние водорастворимых полисахаридов растений рода
лапчатка семейства розоцветные на физиологическое состояние животных:
автореф. дис. .к ан д . биол. наук: 03.00.13 // Семина Светлана
Вячеславовна. - Рязань, 2002. - 24 с.
68. Скрябина, Е.Н. Аминокислоты растений рода Melampyrum L. / Е.Н.
Скрябина, Е.Е. Галишевская, В.Д. Белоногова // Медицинский альманах. -
2012. - № 5. - С. 206-208.
69. Смык, Г.К. Использование лапчатки белой как нового
лекарственного растения, восстановление запасов её в природе и
возможности культуры / Г.К. Смык // Новые культуры в народном
хозяйстве и медицине: В 2 ч. - 1976. - Ч.1. - С.41-42.
70. Соколенко, О.А. Биология цветения и плодоношения кустарниковых
видов рода Potentilla L., интродуцированных на Северо-Западном Кавказе:
автореф. дис. .к ан д . биол. наук: 03.00.32 // Соколенко Ольга Алексеевна.
- Майкоп, 2004. - 22 с.
71. Сокольская, Т.А. Требования к стандартизации лекарственного
растительного сырья и фитопрепаратов на его основе / Т.А. Сокольская,
Т.Д. Даргаева, Т.Б. Шемерянкина // Вопр. биологич., мед. и фармац.
115
химии. - 2010. - № 3. - С. 9-12.
72. Справочник Видаль. Лекарственные препараты в России /под ред. Т.
Ващенко, Е. Языниной. - М.: ЮБМ Медика Рус, 2013. - 1640 с.
73. Сравнительная оценка накоплений фенольных соединений в надземных
органах лапчатки в условиях Белоруси / Ж.А. Рупасова [и др.] //
Бюллетень Главного ботанического сада. - 2002.- Вып.183.- С.34-36.
74. Старостенко, Н.Т. Лечебное действие серебристой лапчатки при
циррозах печени в отечно-асцитической стадии / Н.Т. Старостенко, В.Н.
Старостенко // Здравоохранение. - 1971. - Т. 14. - № 16. - С. 15-19.
75. Степаненко, Б.Н. Химия и биохимия углеводов (полисахариды): учеб.
пособие для вузов / Б.Н. Степаненко. - М.: Высш. шк., 1978. - 256с.
76. Тактика ведения беременности у женщин с пиелонефритом / В.Н.
Радутный [и др.] // Медицинский альманах. - 2008. - N 5. - С.74-77.
77. Турова, А.Д. Лекарственные растения СССР и их применение / А. Д.
Турова, Э.Н. Сапожникова // М.: Медицина, 1984. - 304 с.
78. Тхамокова, Ф.К. К вопросу интродукции лапчатки белой на Северном
Кавказе / Ф.К. Тхамокова, В.В. Мелик-Гусейнов, Д.С. Шильников / 71
Всеукраин. науч.-практ. конф. молодых ученых и студентов с
международным участием, посвящённая Дню науки «Сучасш аспекти
медицини i фармации - 2011» // Тез. докл 12-13 мая 2011. - Запорiжжя,
2011. - С.171.
79. Тхамокова, Ф.К. Идентификация органических кислот в подземных
органах лапчатки белой, культивируемой на Северном Кавказе / Ф.К.
Тхамокова, В.В. Мелик-Гусейнов // Актуальные научные вопросы:
реальность и перспективы: сборник научных трудов по материалам
Международной заочной научно-практической конф. 26 декабря 2011 г.
Тамбов: ТРОО «Бизнес-Наука-Общество»: в 7 частях. Часть 5. - 2012. - С.
143-144.
116
80. Тхамокова, Ф.К. Макро- и микроэлементный состав подземных органов
лапчатки белой, интродуцированной на Северном Кавказе / Ф.К.
Тхамокова, В.В. Мелик-Гусейнов // Разработка, исследование и маркетинг
новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2013. -
Вып. 68. - С. 110-111.
81. Тхамокова, Ф.К. Морфолого-анатомическое исследование подземных
органов лапчатки белой, интродуцированной на Северном Кавказе / Ф.К.
Тхамокова, В.В. Мелик-Гусейнов, Ф.К. Серебряная // Разработка,
исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч.
тр. - Пятигорск, 2012. - Вып. 67. - С. 126-128.
82. Тхамокова, Ф.К. Морфолого-анатомическое исследование травы
лапчатки белой Potentilla alba L., интродуцированной на Северном Кавказе
/ Ф.К. Тхамокова, В.В. Мелик-Гусейнов // Материалы 14 междунар. научн.
конф. «Биологическое разнообразие Кавказа и Юга России», посвящ. 70-
летию со дня рождения Г.Б. Абдурахманова. - Махачкала, 5-7 ноября 2012.
- С. 353-354.
83. Федосеева, Л.М. Изучение дубильных веществ подземных и надземных
вегетативных органов бадана толстолистного (Bergenia сrassifolia (L.)
Fitsch.), произрастающего на Алтае / Л.М. Федосеева // Химия раст. сырья.
- 2005. - № 3. - С. 45-50.
84. Федулова, Э.Н. Терапия воспалительных заболеваний толстой кишки у
детей / Э.Н. Федулова // Педиатрическая фармакология. - 2008. - Т. 5, № 2.
- С. 38-44.
85. Фитотерапия синдрома раздраженного кишечника / И.П. Убеева [и др.] //
Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2010. - N 2. - С.109-112.
86. Фитохимическая оценка некоторых дикорастущих видов флоры
Ингушетии и Кабардино-Балкарии / Ф.К. Тхамокова, Мелик-Гусейнов
В.В. // Материалы XI международной научной конференции
«Биологическое разнообразие Кавказа», посвященной 70-летию Точиева
117
Тугана Юнусовича, Магас, 16-18 октября 2009 г., Назрань - 2009. - С. 165
169.
87. Фитохимические исследования лапчатки белой, интродуцированной на
Северном Кавказе / Ф.К. Тхамокова // Фундаментальные науки и практика.
Сборник научных трудов с материалами 1 -ой международной
телеконференции «Фундаментальные медико-биологические науки и
практическое здравоохранение», Томск. Том 1. - 2010. - С. 124.
88. Флора Восточной Европы. Т. 10. СПб.: Мир и семья; Изд-во СПХФА,
2001. С.С. 393, 410.
89. Химический анализ лекарственных растений / под ред. Н.И. Гринкевич,
Л.Н. Сафронич. - М.: Высш. шк., 1984.-176 с.
90. Хобракова, В.Б. Влияние сухого экстракта лапчатки белой на состояние
клеточного и гуморального звеньев иммунного ответа / В.Б. Хобракова,
Э.В. Архипова, А.М. Водопьянова // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2011.
- № 1 (77). - С. 195-197.
91. Хобракова, В.Б. Иммунокорригирующее действие сухого экстракта
лапчатки белой и комплексного средства «Тиреотон» / В.Б. Хобракова,
Э.В. Архипова // Сибирский медицинский журнал. - 2011. - № 7. - С. 121
123.
92. Чучалин B.C. Влияние лапчатки гусиной на секрецию желчи / В.С.
Чучалин, Л.С. Идрисова, Т.П.Прищеп // Новые лекарственные препараты
из растений Сибири и Дальнего Востока. Томск, 1969. - Т. 2. - С.45-47.
93. Шимко, О.М. Оценка качества травы лапчатки белой / О.М. Шимко,
О.М. Хишова // Вестник фармации. - 2010. - № 1(47). - С. 17-23.
94. Шимко, О.М. Поиск новых видов сырья лапчатки / О.М. Шимко, О.М.
Хишова, Л.В. Кухарева // Вестник фармации. - 2008. - №4. - С. 1-3.
95. Шкроботько, П.Ю. Аминокислотный состав корневищ с корнями
валерианы Фори и валерианы бузинолистной / П.Ю. Шкроботько, Д.М.
Попов, Н.С. Фурса // Фармация. - 2009. - № 7. - С.19-23.
118
96. Шталь, Э. Хроматография в тонких слоях: пер. с нем. - М.: Мир, 1965.
- 508с.
97. Юзепчук С. В., Род Лапчатка — Potentilla L., в кн.: флора СССР, т. 10,
М. — Л., 1941.
98. A botulinum neurotoxin-like function of Potentilla chinensis extract that
inhibits neuronal SNARE complex formation, membrane fusion,
neuroexocytosis, and muscle contraction / С.Н. Jung ^ t al] // Pharm Biol. -
2012. - Vol. 50, № 9. - Р. 1157-1167.
99. Antidiabetic and antioxidant effects of extracts from Potentilla discolor Bunge
on diabetic rats induced by high fat diet and streptozotocin / L. Zhang ^ t al] // J
Ethnopharmacol. - 2010. - Vol. 132, № 2. - Р.518-524.
100. Anti-hepatitis B virus activities of triterpenoid saponin compound from
Potentilla anserine L. / Y.L. Zhao ^ t al] // Phytomedicine. - 2008. - Vol. 15, №
4. - Р.253-258.
101. Antihypercholesterolaemic and antioxidant activity assessment of some plants
used as remedy in Turkish folk medicine / G. Avci ^ t al] // J Ethnopharmacol. -
2006. - Vol. 107, № 3. - Р.418-423.
102. Anti-hyperglycemic effect of Potentilla discolor decoction on obese-diabetic
(Ob-db) mice and its chemical composition / С. Song ^ t al] // Fitoterapia. -
2012. - Vol. 83, № 8. - Р. 1474-1483.
103. Antioxidant and pro-oxidant evaluation of a Potentilla alba L. rhizome extract
/ H.J. Damien Dorman ^ t al] // Chem Biodivers. - 2011. -Vol. 8. - Issue 7. -P.
1344-1356.
104. Effect of oral administration of tormentil root extract (Potentilla tormentilla)
on rotavirus diarrhea in children: a randomized, double blind, controlled trial /
М ^ . Subbotina ^ t al] // Pediatr Infect Dis J. - 2003. - Vol. 22, № 8. - Р.706-
711.
105. Flavonol glycosides and monoterpenoids from Potentilla anserina / J. F. Xu
fct al] // J Asian Nat Prod Res. - 2010. - Vol. 12, № 6. - Р.529-534.
119
106. Gastroprotective activity of ethanolic root extract of Potentilla fulgens Wall.
ex Hook / D. Laloo ^ t al] // J Ethnopharmacol. - 2013. - Vol. 146, №2. - Р.
505-514.
107. Identification of trans-tiliroside as active principle with anti-hyperglycemic,
anti-hyperlipidemic and antioxidant effects from Potentilla chinesis / W. Qiao
^ t al] // J Ethnopharmacol. - 2011. - Vol. 135, № 2. - Р.515-521.
108. Immunomodulatory activity in vitro and in vivo of polysaccharide from
Potentilla anserina / J.R. Chen ^ t al] // Fitoterapia. - 2010. - Vol. 81, № 8. -
Р.1117-1124.
109. Inhibitory action of Potentilla anserine polysaccharide fraction on H2O2-
induced apoptosis of murine splenic lymphocytes / Х. Н. Shuai ^ t al] // Yao
Xue Xue Bao. - 2009. - Vol. 44, № 9. - Р.987-993.
110. Investigation of the antimicrobial activity of Rhaponticum (Rhaponticum
carthamoides D.C.) and shrubby cinquefoil (Potentilla fruticosa L.) / V.
Jurkstiene ^ t al] // Medicina (Kaunas). - 2011. - Vol. 47, № 3. - Р.174-179.
111. In vitro antioxidant and anti-inflammatory activities of extracts from
Potentilla recta and its main ellagitannin, agrimoniin / А.Bazylko |et al] // J.
Ethnopharmacol. - 2013. - Vol. 13. - Р. 446-447.
112. Kaul, K. Review of pharmaceutical properties and conservation measures of
Potentilla fulgens Wall. ex. Hook. - A medical endangered herb of higher
Himalaya / K. Kaul, V. Jaitak, V. Kaul // Indian J of Nat. Products and
Resources. - 2011. - Vol. 2. - Р.298-306.
113. Pharmacological evaluation of Potentilla alba L. in mice: adaptogenic and
central nervous system effects / A.N. Shikov ^ t al] // Pharm Biol.- 2011. -Vol.
49. - Issue 10. - P. 1023-1028.
114. Phytochemical composition of Potentilla anserina L. analyzed by an
integrative GC-MS and LC-MS metabolomics platform M..Mari [et al] //
Metabolomics. - 2013. - Vol. 3. - Р. 599-607.
115. Potentilla fulgens (Family Rosaceae), a medicinal plant of north-east India: a
120
natural anthelmintic / В. Roy ^ t al] // J Parasit Dis. - 2010. - Vol. 34, № 2. -
Р.83-88.
116. Pregnane derivatives from Potentilla evestita / R. Khan ^ t al] // Nat Prod
Commun. - 2011. - Vol. 6, № 8. - Р.1083-1084.
117. Radhika, М. Comparison of effectiveness in antitumor activity between
flavonoids and polyphenols of the methanolic extract of roots of Potentilla
fulgens in breast cancer cells / M. Radhika, N. Ghoshal, A. Chatterjee // J
Complement Integr Med. - 2012. - Vol. 9. - Р.1515-1535.
118. Schimmer, О. Tannins with antimutagenic properties in the herb of
Alchemilla species and Potentilla anserina / О. Schimmer, М. Lindenbaum //
Planta Med. - 1995. - Vol. 61, № 2. - Р.141-145.
119. Selenylation modification can enhance antioxidant activity of Potentilla
anserina L. polysaccharide / В. Zhao ^ t al] // Int. J. Biol. Macromol. - 2013. -
Vol. 58. - Р. 320-328.
120. Study on protective effect of alcohol extract of Potentilla anserinea against
acute myocardial ischemia/reperfusion-induced myocardial apoptosis in rats / Х.
Qin ^ t al] // Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. - 2012. - Vol. 37, № 9. - Р. 1279
1284.
121. The influence of aqueous extracts of selected Potentilla species on normal
human colon cells / М. Tomczyk ^ t al] // Acta Pol Pharm. - 2013. - Vol. 70, №
3. - Р. 523-531.
122. Tomczyk, М. Antimicrobial activity of Potentilla species / M. Tomczyk, К.
Leszczynska, Р. Jakoniuk // Fitoterapia. - 2008. - Vol. 79, № 8. - Р.592-594.
123. Tomczyk, М. Determination of polyphenolics in extracts of Potentilla species
by high-performance thin-layer chromatography photodensitometry method / M.
Tomczyk, A. Bazylko, А. Staszewska // Phytochem Anal. - 2010. - Vol. 21, №
2. - Р.174-179.
124. Tomczyk, М. In vitro anticariogenic effects of aerial parts of Potentilla recta
and its phytochemical profile / M. Tomczyk, A. Wiater, М. Pleszczynska //
121
Phytother Res. - 2011. - Vol. 25, № 3. - Р.343-350.
125. Tomczyk, М. Method development and validation for optimized separation of
quercetin derivatives in selected Potentilla species using high-performance thin-
layer chromatography photodensitometry method / M. Tomczyk, A. Bazylko, J.
Bonarewicz // J Pharm Biomed Anal. - 2012. - Vol. 61. - Р. 265-270.
126. Tomczyk, M. Potentilla — а review of its phytochemical and
pharmacological profile / М. Tomczyk, К Р ^ й е // J. of Ethnopharmacology. -
2009. - Vol. 122, N 2. - Р. 184-204.
127. Wolf, Т. Monographia der Gattung Potentilla / Т. Wolf // Bibl. Botanika. -
1908. - ХУТ. - 700 р.
![Звук [ е ]. Позначення його буквою Е,е](https://img.pdfslide.net/doc/110x75/587eea031a28ab17388b6867/-587eea031a28ab17388b6867.jpg)
