KULTURA BILJNIH ĆELIJA I TKIVA IN VITRO

In vitro kultura?

• In vitro kultura biljnih ćelija, tkiva i organa je posebna grana biotehnologije biljaka koja predstavlja skup tehnika za aseptično (sterilno) gajenje i vegetativno razmnožavanje biljaka, biljnih organa, tkiva i ćelija, u hranljivom medijumu definisanog sastava i pod kontrolisanim uslovima sredine.

• Biljne ćelije i tkiva imaju sposobnost da rastu i da se razvijaju kada se izoluju iz organizma i gaje na sintetičkoj podlozi.

• Totipotencija - Sposobnost biljnih ćelija da se in vitro dediferenciraju, dele i da regenerišu pojedine organe, embrione ili celu biljku

• Plastičnost – sposobnost biljke da menja svoj program rasta, razvića i metabolizma, u zavisnosti od uslova i signala iz spoljašnje sredine.

• Postoje različiti tipovi biljnih kultura in vitro.

• Prema tipu eksplantata – za pokretanje kulture in vitro se mogu koristiti gotovo svi delovi biljke tj. različiti eksplantati, počev od embriona, preko delova klijanaca - korena, kotiledona, epikotila i hipokotila (kod dikotila), odnosno mezokotila i koleoptila (kod monokotila) i svih delova odrasle biljke, uključujući listove, lisne peteljke i delove cveta.

• Prema nameni, kulture se klasifikuju kao kulture haploida, kulture korenova, kulture za mikropropagaciju, in vitro propagacija, somatska embriogeneza, somaklonalno variranje,...

• Prema toma kakav je rast: organizovan, neorganizovan i mešovit rast

Vegetativno razmnožavanje biljaka u kulturi in vitro

Gde se vrši vegetativno razmnožavanje biljaka in vitro

Ase

ptič

ki u

slov

i

kontaminacija

Laminarna komora

Mikropropagacija u užem i širem smislu

Sl. Mikropropagacija u užem i širem smislu 1а sakupljanje bočnih I vršnih pupoljaka; 2а – uvođenje pupoljaka u kulturu; 3а rast izdanaka; 4а – multiplikacija izdanaka; 6 – ožiljavanje izdanaka; 7 – adaptacija u staklari. Desno su osnovni koraci razmnožavanja in vitro putem regeneracije izdanka iz kalusa: 1б izolovanje delova listova i stabla kao primarnih eksplantata; 2б – uvođenje eksplantata u kulturu; 3б – indukcija kalusa na eksplantatima; 4б – kultura nediferenciranih kalusa; 5б indukcija izdanaka u kalusu; 6 – ožiljavanje izdanaka; 7 –

adaptacija u staklari.

Organogeneza iz kalusa

Organogeneza iz kalusa

Izdanak u kulturi Umnožavanje izdanaka

Direktna organogeneza

Prednosti vegetativnog razmnožavanja u uslovima in vitro

• 1. In vitro razmnožavanje mnogo je brže od in vivo razmnožavanja• 2. Moguće je umnožiti i one biljke koje nije moguće umnožiti u in vivo

uslovima• 3. Mikroklonirane biljke često rastu bolje i brže od biljaka koje rastu u

in vivo uslovima (oslobođene su od patogena i infekcija bakterijama i gljivama)

• 4. U in vitro kulturi se razmnožavaju samo zdrave biljke• 5. Vegetativno razmnožavanje u in vitro uslovima može početi sa vrlo

malo biljnog materijala kao početnog eksplantata • 6. Zahvaljujući kontrolisanim uslovima moguće je predvideti vremenski

proizvodnju određenih kultura• 7. Veliki značaj ovaj vid razmnožavanja našao je u ex situ zaštiti

ugroženih i retkih biljnih vrsta (npr. Nepeta rtanjensis)

Nedostaci vegetativnog razmnožavanja u uslovima in vitro

• 1. U nekim kulturama koje se razmnožavaju na ovaj način genetička stabilnost je niska

• 2. Kod drvenastih vrsta teško je uspostaviti formiranje korenovog sistema in vitro

• 3. Prenos biljaka iz uslova in vitro u uslove in vivo nekada je jako težak i mukotrpan posao

• 4. Regenerativna sposobnost se može izgubiti nakon nekoliko subkultura kalusnog tkiva

• 5. U nekim slučajevima sterilizacija eksplantata koji se uvode u kulturu in vitro je izuzetno teška

Komercijalizacija mikropropagacije 1970s & 1980-tih Murashige 1974 Broad commercial application

Šta je organogeneza?• Organogeneza u

najosnovnijem obliku značenja predstavlja proces obrazovanja jedinki.

• U in vitro uslovima kontrolisanje organogeneze se vrši dodavanje određenih komponenti, a najbitnije među komponentama jesu FITOHORMONI.

Skoog i Miller hipoteza

• Prekretnica, 1957. balans citokinina i auksina reguliše organogenezu kalusa -Skoog i Miller

• Ova hipoteza govori o odnosu koncentracija auksina i citokinina u hranljivom medijumu i kako zapravo date koncentracije utiču na morfogenezu u uslovima in vitro

Dokazi Milerove hipoteze

• Ako se kalusno tkivo prenese na hranljivu podlogu koja sadrži veću koncentraciju auksina nego citokinina, pojaviće se korenovi. Ako je koncentracija citokinina veća od koncentracije auksina, pojaviće se pupoljci.

• Dejstvo citokinina i auksina na organogenezu može se pokazati sledećim primerom. Ako se izoluje deo tkiva stabla duvana i gaji na hranljivoj podlozi koja sadrži potrebne nutritivne sastojke, a od hormona se dodaju auksin (indol-sirćetna kiselina) i citokinin (kinetin) u istim koncentracijama, doći će do deobe ćelija i njihovog uvećavanja. Na ovakvom medijumu stvara se kalus koji se sastoji od mase nediferenciranih ćelija.

Kod Gloxinie

BA 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3(mg/L)NAA 0 0.1 0.3 1.0 3.0

Kultura kalusa• Kultura tkiva odnosno kultura kalusa je tehnika kojom

se tkivo može održavati u nediferenciranom stanju neograničeno dugo.

• Kultura kalusa se može dobiti iz bilo kog vegetativnog tkiva dediferencijacijom, tako da kalusna tkiva najčešće nisu fotosintetička.

• Kalusi se često gaje u mraku jer svetlost može podstaći diferencijaciju.

• Kalusi se, generalno, mogu podeliti na dva tipa:

kompaktne i rastresite.

SOMATSKA EMBRIOGENEZA

• Somatska embriogeneza je proces u kome haploidne ili diploidne somatske ćelije prolaze kroz karakteristične embrionalne stadijume bez fuzije gameta i mogu stvarati kompletne biljke

• Prvi somatski embrioni dobijeni su u kulturi ćelija šargarepe

• 1. Direktna (neposredna) embriogeneza - embrioni se stvaraju neposredno iz pojedinačnih ćelija, što može smanjiti stepen varijabilnosti u kulturi. Na razvoj ovih embriona utiče sastav hranljive podloge i izbor eksplantata.

Direktna somatska embriogeneza

• 2. Indirektna (posredna) embriogeneza - ovom metodom se prvo stvara kalusno tkivo u kome se kasnije zameću embrioni

Indirektna somatska embriogeneza

“Prirodna” somatska embriogeneza, kao alternativna strategija reprodukcije biljaka

Kultura protoplasta

Šta je protoplast• Protoplasti su gole biljne ćelije, bez ćelijskog

zida, tako da su zaštićene jedino plazmalemom. • Protoplasti mogu iznova da regenerišu ćelijski

zid, da rastu i da se dele• Kultura protoplasta, „ogoljenih“ ćelija bez

ćelijskog zida, se može dobiti bilo iz ćelijske suspenzije, bilo direktno iz mezofila lista. Ćelijski zid se obično uklanja enzimskim tretmanom, dejstvom celulaza i pektinaza u rastvoru visokog osmolariteta.

• Uklanjanje ćelijskog zida omogućava i fuziju protoplasta i dobijanje intra- ili interspecijskih somatskih hibrida.

• Protoplasti su idealan materijal za transformaciju pomoću različitih tehnika, kao što su elektroporacija, mikroinjektiranje ili hemijska transformacija

• Prebacivanjem protoplasta na čvrst medijum se dobijaju kalusi, iz kojih se mogu regenerisati cele biljke bilo organogenezom, bilo somatskom embriogenezom.

Principi gajenja biljaka u kulturi in vitro• Gajenje in vitro kultura podrazumeva kontrolu svih

relevantnih činilaca (faktora), počev od izbora eksplantata i uspostavljanja aseptičnih (sterilnih) uslova, preko manipulacie razvića u kulturi putem definisanja sastava medijuma, prvenstveno balansa hormona, do kontrole spoljašnjih faktora sredine kao što su svetlost, vlažnost i temperatura.

• Kultura in vitro se uvek uspostavlja u aseptičnim uslovima, kako ne bi došlo do razvoja gljiva i bakterija, koje sprečavaju rastenje i razviće biljaka.

• Rad sa in vitro kulturom podrazumeva i neke od vidiva sterilizacije kao što su:

• 1. Sterilizacija autoklaviranjemSterilizacija autoklaviranjem (na ovaj način se sterilišu medijumi za gajenje biljaka, kao i posude u kojima se biljke gaje npr. teglice, erlenmajeri, boce, tegle, epruvete, petri kutije,...)

• 2. Sterilizacija iskuvavanjemSterilizacija iskuvavanjem ( na ovaj način najčešće se sterilišu instrumenti za rad koji su neophodni pri manipulativnim tehnikama u laminaru)

• 3. Sterilizacija biljnog materijala Sterilizacija biljnog materijala ( koja je još označena i kao dezinfestacija). Za ovu sterilizaciju se najčešće koristi razblažena NaClO (varikina ili domestos).

• 4. Sterilizacija filtriranjemSterilizacija filtriranjem, gde se pomoću specijalnih filter papira vrši sterilizacija nestabilnih jedinjenja kao što je npr. ABA, GA3, antibiotici ili neki vitamini. Ove komponente se naknadno dodaju u prohlađeni medijum.

Autoklav

• Medijumi za gajenje biljaka mogu biti čvrsti, polučvrsti ili tečni.

• Za većinu kultura optimalan pH podloge je 5.8 ± 0.2. Tečni medijum za razliku od čvrstog ne sadrži agar. Vrlo bitna komponenta svakog medijuma jesu i makro i mikro soli, kao i vitamini.

Medijum koji je razliven u erlenmajere

Prostor za gajenje biljaka

Posebne prostorije sa optimalnim uslovima za gajenje biljaka