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080380739 UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS
EFECTO DEL AMINOACIDO L- PROLINA, EN LA :fMSRIOGENESIS
SOMA TICA EN 3 VARIEDADES Y UNA LINEA EXPERIMfNTAL
DE ALFALFA ( Medícago satíva. L)
TESIS PROFESIONAL QUE PARA OBTENER El TITULO DE
LICENCIADO tN BIOLOGIA
PRESENTA
GLORIA FLORES ARAMSULA
GUADALAJARA, JAL MARZO DE 1993
TITULO
EFECTO DEL AMINOACIDO L-PROLINA, EN LA EMBRIOGENESIS
SOMATICA EN 3 VARIEDADES Y UNA LINEA EXPERIMENTAL DE
ALFALFA <Medicago sativa. Ll
DEDICATORIA.
Con todo mi cariño a mi madre a quién admiro y agradezco el
apoyo y confianza que depositó en mi.
A mi esposo e hija por mc•t ivarme a seguir adelante.
Gracias por creer en mi.
AGRADECIMIENTOS.
Quiero expresar mi gratitud.
A mi director de tesis Dr. Eulogio Pimienta Barrios, por el
apoyo y guia que me brindó. Asi mismo al Dr. Benjamín Rodríguez
Garay jefe del Departamento de Cultivos Vegetales, mi
reconocimiento por su valiosa asesoría y apoyo. Al Dr. Gonzalo
Flores Mar-tinez por sus sugerencias para la realización
tr-abajo.
de este
Al Centr-o de Investigación y Asistencia en Tecnologia y
Dise~o del Estado de Jalisco, A.C. por la ayuda brindada
para el desarr-ollo de esta tesis en sus instalaciones.
A las personas que de alguna forma colabor-aron en la
realización de esta tesis.
INDICE
! . I NTF:ODUCC ION.
II. ANTECEDENTES.
!II. HIPOTESIS.
!V. OBJETIVO.
V. M~TEP!ALES Y METODOS.
'JI.
1' -. '• a ..
V.3
\/.4
~aterial biológico
Medios de cultivo
Dise~o 2~perimental
VI. RES~~T~DOS.
VI.l Atcyac
VI.2 Meei!!2.
VI.3 Fl<Jrida
VI.4 Linea e~perimental
l fT T -...J..
\.'! I I.
IX.
x.
7-S-92
DISCUSION.
CONCLUSIONES.
AFEr.!DICE.
PAG.
1 - 2
3 - 7
8
9
14
:."8 - 32
33 - 37
38 - 41
42 - 44
45
4é - 4'3
I. INTRODUCCION
La biotecn•:.logia es un Area de la biologia que ha
tenido un desarrollo importante en los úl ti mc•s Esta
área tiene que ver con cualquier proceso de tipo productivo
que se efectue atraves de la acción de un organismo vivo,
desde las bacterias hasta los animales super i•:.res. El
ámb i t•:• de acción de la
vemos diariamente en
b i c•tecnol •:•g í a
a•: ti v idades
es grande y lo
relacionadas con la
al imentacit.•n, sa1Ltd 1 agriCLtltura etc. 1'385;
San•: he.::, 1'385; ÜLI in ter o, 1'385;
(Rc•bert
Strach, 1989; Rodrigue.::-
Garay y Rubluc•, 1'3.':12). Algunas de las aplicaciones prácticas
en la agricultura destacan la preservación de ger m•:•p 1 asma,
obtenr: i~·n de ~etabolitos secundarios, obtención de plantas
libres de microorganismos patógenos, mejoramiento genét i•:•:•,
masiva de plantas entre otros. Algunas de estas
aplicaciones se han logrado a partir de la clonación, el cultivo
de células haploides, el cultivo y fusión de protoplasto,
forma•: i•'•n de embr i•:•nes s•:•mát i•:os et•:. (Binwell, 1'383¡ 0Ll i nter•:•,
1'384; Fobert y Lc•yol a, 1'385; Hartmann y Kester 1 1989l.
La formación de embriones somáticos ofrece la P•:OSibilidad
de obtener variaciones genéticas deseables y poder
genotipos que reunan características necesarias para afr•:•ntar
problemas que en la actLtal idad a fe.: tan las a.:tividades
agr•:•pecuar ias, como el estrés, la sequía, heladas,enfermedades,
plagas y salinidad entre otras. Es por esto, que se propuso un
l
estudio de embriogénesis somética con una especie forrajera
como alfalfa, como una alternativa para tratar de obtener
alguna l{nea con caracteristicas deseables y solucionar
algunos problemas de salinidad.
2
II. ANTECEDENTES
La variación genética constituye la materia prima de los
organismos vivos sobre los cuales ha influido la evolución
natural y/o la evolución dirigida de los ~egeta!es que el hombre
ha reali=ado para su beneficio CRodriguez-Garay y Rubluo, 1992).
La variación somaclonal se ha constituido en una alternativ~
que puede ser aprovechada en el mejoramiento Este
fenómeno ha sido estudiado en un gran nómero de es~ecies
cu!tiv3~!es y dependiando del tejido de origen,
som.:3.C l or: a 1 (células
('-.Jil1a1obos, 1385¡ Hartmann y Kester, 1989¡ Rodriguez-Garay y
PL:bl'_to, 1392).
a 1 a
embriones somáticos, requieren una e~presión ordenada de dive~sos
estimulas morfogenético. Estos event~s incluyen la inducción y
activación de células totip~tentes, en un proceso de de~arrollo
en el cual se produce un embrión a partir de una célula, el cual
guarda bipolaridad como ocurre en la embricgénesis y
produce una planta completa, (Tisserat et al. 1"379;
~~es ter, 198'3).
3
finel:nente
Hartmann y
al
b)
'~=~~r genotipic~, el '~a! es ~ecis!~o en much~s
la embriogéresis somAtic~, como oc~rre en la
«! fal fa <Saunders et ~· 197S; Fh i l l i ps, 1'383; Br ''"'" y
1'32S; ~eijer y Srvwn, 1'385>, en mai:: y otros
CE'reales
Condiciones ambientales y de cultivo,
:~grar este tipo de regeneraci~n.
La embri0génesis somática pasa por
indispensab1es para
tres estadios de
des.~,·c·ll<:· bi"'n definidos: Glc-bular, f.;•Yma de coYa:·~·n, tc·rped·::o y
fi~~l~e~te una planta crigura 5.2).
a)
l~ embriogénesis so~ática si~ue dos rutas embYiogé~icas.
la e~brio~énesis directa, los embr i .:mes in i e i an
dir~ctamente de tejidos en ausenc!a de c~llo <!ograndose
la embriogénesis indirecta, Si? presenta
pr,~l i ~erac ión de célL.!as (ccollo) y ¡::;·:•s ter i C·r mente
f,:.rmao.:i6n del embri6n <Tisserat et &· 197'3; Ammirat.::-,
~.:drigu¡:-::-Garay y Rubluc•, 1'3'?2).
la
1'383;
El ren~·men-::. de embr iogénesis somática se obser v~ ¡::<:·r primera
v~~ en cultivos de ~&nahoria (Daucus carota). De tejidos de
4
zanahoria se tomaron explantes que fueron colocados en un medio
suplementado con agua de coco, lo cual indujo la diferenciación
celular, a partir de la cual se generó una masa de células
desorganizadas <callos), El tejidc• de calle• fué posteriormente a
un segundo medio de cultivo para la iniciación de embriones,
CTisserat et sl_. 1979; Hartmann y l<ester, 1329).
La inducción de embriones somáticos generalmente ocurre en
medios con altas concentraciones de auxinas y la ausencia o baja
cconcentración de estas permite el desarrollo y germinaci6n de
(l-:2.1 ker
1'384a;
_, E.:..• 137'?; Amr.,i r at C•, 19S2;
Nolan et al. 198'9¡ Rodriguez-Gc.ray y F.:c.lbli.K•, 19'92>.
Stuar-t y
1385¡
La observación de embriogénesis somáticas en cultivo de
tejidos vegetales es un ~enómeno relativamente reciente. Se han
proporcionado evidencias de !a formación de embriones somáticos
suspensión celular
de distintas especies de m~nocotiledoneas y dicotiledoneas.
Como ejemplc' destacan el mai:- Zea m~vs \L.u ~ §ll.
1982), el g ir as·:·l
138'3).
Se reporta la regenersci6n de plantas por embriogénesis
somática en diferentes especies de leguminosas
CMedicagn sativa, Trifolium pratense, Stylosanthes guvanensis).
5
El nivel de nitrógeno reducido adicionado al cultivo es uno
de los importantes en el cont ;'o!
embriogénesis somática. Segan revisi~n de Walker y Sato ( 1981) 1
Halpe~in y weetherell fueron los primeros en reconocer la
importancia del amonio en el desarrollo de cultivo de zanahoria,
el iOn amonio y varios aminoácidos, particularmente la alanina y
glutamina inducen la formación de embriones somáticos en cultivos
en suspensión de zanahoria.
Se ha establecido que la al~nina y la glutamina son
superiores a amonio en presencia de nitrato y glutamina es meJor
como ~nico ~i~rógeno suplementado. En cultivos de alfalfa la
~crmacl~n dE embriones somáticos es óptima a 12.5 mM de amonio
1'?81; Sb::.kut gl_ & . • .-.-c-'1. ! _,.c-,,_1 .1 •
La embriogénesis somática en alf~lfa ocurre bajo el estricto
control del iOn amonio en células inducidas para formar ~mbrione~
CStuart y Stl .. ic!dand, 1'384b; Skokut et aL 1985).
Se ha obser~ado que los aminoácidos ejercen dos efectos
sobre la embriogénesis:
!.- La estimulación en el nómero de embriones somáticos
2.- Mejorar la calidad estructural de esos embriones CStuart y
st~ícklané, 1984a).
L•:•s amin·:<ác idc•s son compuestos orgánicc•5 que o:.:.nt ienen u;;
grupo amino <NH1 l y un grupo carboxilo CCOOHl.
A la fecha el papel de los compuestos de nitrógeno reducido
en la formaci~·n de embriones sc•máticos no se conoce.
6
Stuart y Strickland reportaron la respuesta de cultivos
celulares de ~etiye a adiciones de el medie• de
regeneración, utilizando un genotipo altamente regenerante como
es el clon RA-2 El tamaño:. y conve¡r~i~·n de embrio::ones a plantas
se incrementa por la utilización de aminc•ác idos.
aminc•ác idos, alanina, gl ~:tarr:ina, aY"ginina, 1 isir:=.,
ser ina, aspara;ina y ortinina e~timulan el número de embriones
somáticos formajos en cultivos de alfalfa (Stuart y Strickland,
1S84a).
La fué el aminoácido que más estimul~· la
embriogénesis s~mát~ca en cultivos de alfalfa en re!eci6n a otros
~~ pa~~icular, la estim~:aciGn de embriogénesis
somática por pr~lina muestra une inte~acci6n sinergistica con el
amoni-=: ... Lo~ embriones pueden ser incrementados con L-prolina en
el medio de cu!~~vo Schenk e ~ildebYant fSHl, como Yesullado de
optimizac~ón d2 la concentraci5n de amo~i~ y simwlt~neamente de
1~ p~olina CStua~~ y Stric~land, 1984t~.
7
111. HIPOTESIS
EL AMINOACIDO L-PROLINA ESTIMULA LA DIFERENCIACION
DE EMBRIONES SOMATICOS EN DIFERENTES ESPECIES
VEGETALES POR LO TANTO, ES DE ESPERARSE ESTIMULO
EN LA CANTIDAD Y CALIDAD DE EMBRIONES QUE SE
FORMEN EN TEJIDOS SOMATICOS ~ vitro DE
Medicago sativa.
8
IV. OBJETIVO
EVALUAR EL EFECTO CUALITATIVO Y CUANTITATIVO DE LA
ADICION DE L-PROLINA EN LA EMBRIOGENESIS SOMATICA DE 3
VARIEDADES Y UNA LINEA EXPERIMENTAL DE Medicago sativa
L. ADAPTADAS A DIFERENTES CONDICIONES CLIMATOLOGICAS.
9
'J. METODOLOGIA
V. 1 Ha ter i al 8iol o!>gic•::.
Se u t i 1 i :: .;; r C•n ~emillas de
sativa) C:e las variedades: n Me5illa", "F"lorida",
y la linea e~~erimental
y la linea e~perimental
7-S-9:. Las primeras
pr c·v i er.en de los Estados Unid~s C:e
que la vetriedad Atoyac proviene, de
V.2 Medios de Cultivo
Se utili:6 el medio de cultivo basal SH desarrollado por
Schenk y Hi!debrant (1972) modificado por Walker y Sato (1391)
con B g/lt de agar y pH aJustado a 5.8 t 0.05
C•:•n NaOH y HCI 1N. En la tabla 5.1 se H:mari:an lc•s medi.::·s de
cultivo utilizados.
Los medios de cultivo
frasc•:•s, papel, etcétera fuer•:.n esterilizados en autoclave
C'IL•t·:·m.t.tica a 121•c, a 15 libras de presión, durante 15
minutos. Los medios de cultivo esterilizados se vaciaron en caJas
p~tri de pl~stico de 90 x 15 mm. en una campana de flujo
laminar horizontal marc~ VEKO.
10
TABLA 5.1.- Concentraciones de los reguladores de de crecimiento en los medios de cultivo.
Medio de cultivo Reguladores de crecimiento
<mg\lt.)
SH G Germinación Sin reguladores de cree imiento
SH A Produce i6n de 0.06 Pie. + 0.1 Ba. (Phillips, calle•
SH B Inducción e m- ,., ... , 2,4-d +2 ANA + <Phillíps,
briogénica 2 K in.
SH e Inducción e m- 0.01 2,4-d + 2 Ade. <Phillips, briogénica
SH D Expresión de Sin reguladores <Phíllips, embriones de cree imient.:• Stuart y
1'383)
1'383)
1'383)
1'383; Strick-
1 a.nd, 1'984)
SH DP E~;presi6n de ----- + 50 mM de <Ph ill ips, 1'383; embrieones L-prc•l ina Stuart y Strick-
land, 1984)
2,4-d Acido 2,4- Diclorofenoxiacético
Pie. Pi el c•ram
Ba. = 6-Benziladenina
Ade. Adenina
K in. Cinet ina
ANA. Acido-naftalenacético
= Sin reguladores de crecimiento
u.
V.3 Dise~o Experimen~al
El presente trabajo se pl~ne6 partiendo de las siguientes
hip·~·tesis:
b '1 H·:•: ).1SH8
Hl:psp'fpo::p
H 1: J..'SHBf ).lSHC
En donde la hip&tesis nula signifio::a , que e: nOmero medio de
embrion~s en cultivo sin el aminoácido L-Pro!ina es igu~l al
nómero medio de en
inducció~ S~iP es igwal al
ba! an·:e.:~d·:• y
·=·=·n e feo: to::•s El análisis se reali:6 utili:ando el
análisis de varian:a en un eqLI ip•:• !9!"1-c·:•mpat ible mediante
el program3 Statg•afics 1.0, en el que se ..:.:•nsiderar•:•n lc•s
~~gL:ientes elementos de análisis:
NOmero de fao::tores~ 2
Nún.ero de ré¡:-.1 leas p·:·r tratamier.~o::·: 15
En la Figura 5.1 se e~presa la intera~ci6n entre los "medios
de e~p~esi6n'' y ''los medi~·s de inducción''.
SHB
Me·dios de
SHC
el medi·:·
emplear
Me~ios de expYesión
S.F'
* * * * * * * * * *
* * * * *
* ;;( * * ~
* -)t * -~- .:..:. ~ .... -f.: 1:'·
C. F·
* * * * * * * * * *
* ""' * * * ~- * :,:. ~- ~-
* * * * *
e, .. e e
-. ,..::_, ~
;:¡t ·-
tiempo de respuest~ de estos genot~pos es confiable en es~a
l3
f:3se
'/ .. 4. 1 De~ i ,-, f i? r: e ::. .~. n •
::!t..:- e:-:~1.::-·.ntes
Flo·rida. 11,"
- . :::. ,::.._~ Y -~ :¡í E ·-, ~: -3.1
2.sépt i·=·~.s ¿i, l. 2
~ssinfecci~n, sumergien~c las semillas en alcohol et:Iico durante
de
..:. ;:' -- -~. a la si;:2mb¡·-c
V.4.2 Siembra •
.10 s2millas poY cada ca.ja petr·i de plástico~
1/10 de los ,:omponentes orgánicos e inorgánicos
medio de cultivo SH modificado por Walker y Sato (1981),
~:n reguladol-es de crecimiento. Cada caja de petri fué rotulada
y sellada c•:•n pelicula plástica autoadherible.
Posteriormente se incubaron en una cámara de incubación en
1 a ~,e mantLtvo un fotoperiodo de 16 hr luz y una temperatura de
27°C ± 2 por un lapso de 7 dias.
La manipulación de las semillas y explantes, se realizó
con pinzas y bisturi, que fueron esterilizados exponiendolos a
la flama de un mechero antes de cada par-a eliminar
microorganismos indeseables en los instrumentos de traba.jo.
V.5 Producción y Mantenimiento de Callos
La de las resiembras se realiz·~· le.s
condiciones antes mencionadas.
A 1 as pl ántul as qerminadas iD._ vi tl'o. se les disectó el
hipocotilo (Figura 5.2 ), los que fueron sembrandos en medio de
cultivo SHA (Tabla 5.1), con el fin de inducir la
callo. Se realizaron 3 resiembras cada 30 dias a medio de cultivo
par2. inducir la proliferación de callos. En este medio
se conser~aron durante el t~empo de observaci~n. Se tuvo especial
cuidado de marcar cada callo, para ident i f i•:ar el genotipo del
15
t-' 0'\
( o
SEMILLA DESINFECTADA
10
INOCULO ORIGINAL
2
@,~ PROOUCCION DE CALLO
~ . .
'@ INDUCCION
4 o EMBRIOGENICA
~ EXPRESION ~ EMBRIOGENIC: ~
o ) PLANTU(A .' ~ /!) p 4--() \) 7 ~ o
o ESTADO GLOBULAR
ESTADO DE ESTADO 6 TORPEDO 8 DE CORAZOrJ
fl6.5.l- SECUENCIA DE EVENTOS EN LA EMBRIOGENESIS SOMATICA DE ALFALFA
V.5.1 Fase de inducción 1
Cada uno de los callos fué dividido en cinco se•:c ic•nes,
las que fueron seleccionados al azar para su p•:•ster ic•r
tratamiento. La primera sección del callo se colocó en medio SHA,
cc•n el fin de manteneY la l :inea •:elular durante todo el
experimento; las secciones 2 y 3 se •:olc•caYc•n en medio SHB;
las secciones 4 y 5 se colocaron en medio SHC, estos últimos dos
para inducción embriogénica y se incubaron por 30 dias
CFigLn-a 5. 3).
V.5.2 Fase de expresión 1
A1 térmi:--,.:. del t iemp•:• de inducción embriogénica, los.
callo~. se transf ir ierc•n medio de cultivo SHD para
expresión de embriones en a1..tsenc ia total de reguladores de
•:Yecimiento; lo mismc. se hizo para las secciones destinadas
a tratamiento con L-pro1ina CSHDPl, FigLtra 5.3 l.
p·rop6si t~· de intentar una ve:: más el proceso
de embriogénesis somática e incrementar el número de embriones, se
procedió a una segunda inducción y expresión,asi como a una
tercera y cuarta expresión para permitir 1a mani festa•: i .:.n
completa del proceso embriogénico.
17
FIGURA 5.3. ESQUEMA DE FLUJO UTILIZADO PARA
LA OBTENCION EMBRIONES SDMATICOS
DE ALFALFA
Atoyac, Semillas
Mesill •
1 Flodda
Des in re e ión
Germinación
y 7-S-92
en 1/10 de medio SH
t Obtención de explantes asépticos ChipocotilosJ
l producción de callo
t División de callo
en 5 secciones
l Tratamientos
Medio de ind~J ~edio de embciogénicolSHB embcl'génico SHC mantenimiento
de lallo SHA
Medio de expresión Medio de expresión Mantenimiento
SHD Y SHDP ~~callo en
An~lisis de resultados
18
V.5.3 rase de inducción 2
los callos provenientes de la fase de expresión 1,
se transfirieron a los medios de cultivo para inducción SHB y SHC
de 1 C•S cual es pY"ovenian inicialmente <Figura 5.3) y se
mantuvieron en estos medi·:•s de •:Ltltivo durante 30 dias.
V.5.4 Fase de expresi6n 2
los callos que es~uvieror1 en la segunda fase de' inducci&n,
fuerc•n tram;feridc•s a le·= mer:!;c•= rlo;:· expresi·~·n SHD y SHDP <Tabla
!'j.I:1• Lr:-..E. Ct3llc•s que (:>n !a p;-fmeJ-CI. e:'l:presi·~·n e~tuvier•:'n en SHD
se voJ·· ... ·i!?l-on a r·~?sembl'"ar en el ntt:'dic• SHD igual sucedí~· •=c•n los
•:all·:·s que estuvieron"'" SHDP <rigura 5.3).
V.5.5 y V.5.6 Fase de expresión 3 y 4
Se continu6 con las fases de expresión 3 y 4, transfiriendose
merlit::o SHD en aLI~encia total
fin de evitar- la o~·;iclacil•n p•:•Y fenoles del tejid.-:-.. Asi mi smc•, se
transfirieron callos al medio de cultivo SHDP con adición de
50 mM de l-prolina y 15 g/lt de
carb~·n a•:t ivad•::>; f!ostc• p•::or un 1 af:IS•:• de E,O di as en amb·::>s medic•s de
cultive•. Se efectuar-c•n dc·s r-esit~mhr-as de 30 di~s en este lapsc•.
(F'igurc-. 5.3).
El tamaKo de los callos resembrados fué similar en todas
las fa5es d~l proceso embriogénico ~cuando el callo tuvo un tama~o
mayor ~~ resto, se procedió a eliminar al a=ar el exceso de masa
celular, mediante cortes con la ayuda de un bisturi).
20
Vl RESULTADOS
Las semillas de las variedades "Atoyac", "Mes i 1 1 a",
"Florida" y la linea experimental "7-S-92", presentaron alto
porcentaje de germinación. Se obtuvieron plántulas de
aproximadamente 4.5 cm de longitud en un lapso de 7 dias.
El tiempo para la formación de callos de aproximadamente
3 cm de diámetro fué de 90 dias, siendo de buen aspecto y
manejables (friables), presentando ur. color paja y verde claro.
En las primeras tres fases del experiment•:·, lc•s callc•s
mantuvieron su color inicial, sin embargo, a partir de 1 a
fase dQs cambiaron el color verde paja y verde claro al color
amarillo mosta=a. En la fase tres y cuatro este color se
incrementó adquiriendo un color negruzco, que se
por muerte celular <senescencia). Este proceso de senescen.::ia no
fué posible detenerlo con la adición de carbón activado. El
estadio de desarrollo de los embrioides fué globular y corazón.
El crecimiento celular se incrementó notablemente durante
las prim~ras tres fases del experimento, por lo que fué
necesario eliminar al azar parte del exceso de callo, eliminando
en esta porción ~lgunos embrioides. En las fases tres y cuatro
el creci~iento de los callos fué disminuyendo g~adua,mente.
21
Los genotipos que se mantuvieron en el medio de cultivo
SHA al final del experimente• presentaron embric•ides en las tres
variedades y la linea experimental "7-S-92", el estadio de estos
fué glc•bular. El cc·lor de los callos fué amarillo mostaza.
presenta 1 a respuesta embriogénica A cont inuac i l•n se
observada en las tres
experimental de alfalfa.
variedades comerciales y la linea
VI.l Varjedad "Atoyac".
En la primera fase de inducci6n (fase A) embric·génica se
c•bservaron pequeñas formaciones globulares no bien definidas,
en ambos medios de induce i t•n de embriones. Algunas de estas
formaciones globulares observadas en la fase A se transformaron
a embrioides en la primera fase de expresión.
El an~.l isis de varianza realizado en la primera fase de
expresión reveló diferencia est~disticamente significativa entre
los medios de inducción, hecho que no ocurri6 entre los medios
de expresión <Tablas 6.1 y A-1). SHC presentó mayor respuesta
embriogénica, que el medio SHB (rigura A-1>. Sin embargo,
entre los medios de expresión nc• existe diferencia
estadísticamente significativa (rigura A-2).
En el segundo intento de inducción embriogénica se
presentaron estructuras globulares en el medio.de cultivo SHC y
estructuras de tipo globular y pubescentes en el medio de cultivo
Resouesta emb~iogénica en 3 variedades y un,;., 1 í n e2. e_·,; p t:?r i m en t .:3 ~ de a 1 f ¿.¡, l f.: ..
Medio E~pYesi6n Expresión E~presión d~
CL~: ti v~:• 2 3
Induc,:ión * * X E:-.·;p:.- es i ~~~n X X X
11 l'"!e~illa•• Induc~:i·:~n ·*- * * r::.,~pr e;:; i :~1n X X X
1) F :;. -:~·( :: e a" I :-: d•_tc>:: i \~Ir; X * . ., C>.:p;--esi ón X X X
X * X X
-1-
X X
;t
V
"-X
X
i ... ___________________________________ .. ______________ !
X.- No e~ista difeYencia signi~icativa (p < 0.051
*·- E~iste diferencia signif~cativa Cp 0.05)
23
SHB. En la segunda fase de expresión algunas
globulares se transformaron a embrioides.
estructuras
El análisis de vari¿nza realizado en la segunda fase de
expresión de expresión, reveló diferencias estadísticamente
significativas entre los medios de inducción. Entre los medios de
expresión no se encontró diferencia estadística significativa
<Tablas 6. 1 y A-2). SHC presentó mayor respuesta embriogénica
comparado con el medie• SHB <Figura A-3); Sin embargo entre 1 o;:
medios de expresión no se registró diferencia est.~.d:íst ica
significativa con y sin prolina (Figura A-4). En la tercera fase
de expresión se presentaron estructLtras globulares y pubescentes.
en la mayoría de los genotipos en ambos medios de inducción. En
esta fase el aspecto visual de los embrioides fué mejor con
respecto a color y estructura en presencia de prolina. Algunos
embrioides pubescentes y pocos globulares diferenciaron rad~cula
en ambos medios de expresión. Esta tendencia se observó en
mayor proporcH•n en callos provenientes del medio de índuccUon
SHB.
El análisis de varianza realizado reveló que no existe
diferencia estadística significativa entre los medic•s de
inducción, esto mismo se presentó para los medios de expresión
<Tablas 6.1 y 6.2). SHC presento mayor respuesta embriogénica
con respecto al medio SHB <Figura 6.1) y numéricamente el mejor
medie· de expresión se presentó en ausencia de prolina
(rigura 6.2>. Sin embargo, estadísticamente esta diferencia no
es significativa <Tabla 6.1).
TABLA 6.2. Tabla de análisis de varianza para la respuesta embriogénica en la fase de expresión 3 en la variedad "Atoyac".
FUENTE VAF:IACION s.s. g. l. ""~ ';.~ F F' C F)
PROVENIENCIA 15.000 1 15.000 3.863 .054 EXPRESION 3.266 1 3.26 .841 .372
ERROR 217.466 56 3.88
TOTAL <CORR.> 245.333 59
25
* **
tJ·jr:,ero p r orned i o •Je embrioides
"
1.6
1.2
1 .e
• 4
.o
... I· ..... ... ·····
.........
.... <· ...
51-lD S~DP tJi,..el del fac.tor induce:: i·~·n.
ti\,IL<ra 6.1. Interve~l-:•s de difP.renc::ia nli•d•h• !;ignific:,¡,tiva pa,.a el f.¡;c.tor- inJl)C.Ción en la f~sQ. .Z e11 li.' variede~d "Atoyac" •
r.!z:~mer o pro mee! i ,., eJe embr i·:>ides
1.1 . ; ..... : ..... : .. ;...
1 o. 7 ... ¡.. . .... ¡.
o. 3 .... ¡.... . ... ¡ ......... ¡ ... .
. i .i .i i o. 11..l.l..l...ULJ...l.U-J..L.l...I..LLJL..L.L--.,...,...~L...U.J SHD SHDP
•• Nivel del fe>•:t•:•r de e·,:presi·~n
F"igura 6.2. Int-er-ve~l.:•s de diferencia mínima sig 11 ifio:e~tiva para el f.;;ct.:·r de e.>~presi~·n en la fase 3 en la variedad "Atoyac".
Medio de cultivo SHB y SHC ~edio de cultivo SHD y SHDP
26
(ver Tollb) a S, 1)
<Tab!.;~ 5. J)
El análisis de varianza realizado en la cuarta fase de
expresión, reveló que no existe diferencia estadística
significativa entre los medios de inducción y expresión
<Tablas 6.1 y A-3). En las riguras A-5 y A-6 se presenta el
número promedio de embrioides que se diferenciaron en los dos
medios de inducción <SHB y SHC), lo cual revela que no existe
diferencia estadística significativa entre ambos medios.
Tendencia similar se c•bserv~· entre los medic•s de expresi~·n
con y sin la suplementaciór. de prolina.
27
VJ.2. Variedad •Mesilla"
En la primera fase de inducción se presentó formaciones de
tipo glob~lar en los genotipos que estuvieron en el medio de
cultivo SHC. En la primera fase de expresión el análisis
de varian=a muestra que existe diferencia significativa en los
medios de inducción, no asi entre los medios de expresión.
Esto puede Cobser V ar Se en las Tablas 6.1 y A-4. Entre los
med Í•:•s de inducción SHB presenta mayor respuesta
embr i ogér, i ·=a con respe~to al medio SHC <Figura A-7). Entre
mediQs de e:<presil•n tanto en ausencia com•:t
en presencia de prolina no se presentan diferencia esta~~stic¿s
sig.-,ificativa <Figura A-3). En el segundo intento de inducci¿n
de embr- i•::ones se presentar·::on estr-ucturas glob~lares y
pubescentes en los genoti~os en ambos medios de
c~;HE• y SHC>. f'•• al~•loKrS g.~no::·tipos las e'iolru•:turas globulares
~rioid~s en los dos medios de inducción.
En la segunda fase de e~presión de embriones se observó la
trar.sformaci6n de algunas estructuras pubescentes en raíces las
cuales provenian de ambos medios de indu~ción S~B y SHC.
Asi mismo, algunas estr-ucturas globulares se transformaron a
emb r i coi des .
2f
El análisis de varianza realizado en la segunda fase de
expresión de embrioides, reveló diferencias estadísticas
significativas entre los medios de inducción. Entre los medios
de expresión no se encontró diferencia estadística <Tablas 6.1 y
A- 5). SHC presentó mayor respuesta embriogénica, que el medio
SHB <Figura A-'9). Sin embargo, entre los medic•s de expresi~·n
no existe diferencia estadística significativa <Figura A-10).
En la tercera fase de expresión embriogénica álgunas estructuras
globulares y pubescentes se transformaron a embr-ic·ides y otras
mas emitieron raíces; esto en mayor proporción en los genotipos
pr-ovenientes del medio de inducción SHB. Los resultados del
análisis de var-ianza muentran 1 a influencia estadística
significativa del medio de inducción en la expresión de los
embr ic·i des esto se obser-va en las tablas 6.1 y 6.3.
' 1
TABLA 6.3. Tabla de análisis de varianza para la res~uesta embriogénica en la fase de expresión 3 en la variedad "Mesilla".
é"UENTE DE VPF:~c: .. SS. g. 1 MS F F'(F)
INDUCCION 138.016 1 138.0!€, 5.148 .027 EXPRESION 10.415 1 10.415 .38'9 .542
ERROR 1528.150 55 26.809
TOTAL CCDRR.) 1576.'583 5'9
29
El promPdio del n~mero de embrioides registrados en los medios
d~ inducción emb~iog~níca, revelan que el medio SHC
con respecto al medio SHB <~igura 6.3). Entre los
fué mejc.r
medios de
e•~resi~n no se presentó diferencia estad{stica significativa
<F"igura 5.4).
30
N~merc
promedic• de E>mbr i e• i des 0.7
0.3
····:····<·····
..... · .....
SHB SHC Nivel del factor indu.cci•!•n
Figura E..3. Intervalo de diferencia minima significativa para el fa.:t•:•r indw:•:U.n E?li la fase 2 en la variedad "Mesilla".
Númerc• promedi·:• de embr icoides
3, 8 m-...,,_ 1 ,......,.....,1~.,-.T"' !. ,.,.,..,_,. ! . .,..,.....,..!rrrn, -·
. . 2.8 .... ; .......... ; ..... ; ..... ; ... .
~ ~ -t- ~ . . . . . . ~.B . .
······:··········)···· . . . . . . . . . . . . . . 0.8 .... ~ ... ·.: ...... ~ .......... ~ ... .
. . . . . . . . . o._ 2_u u...u•...L ,· .L.J..L.J..Jiu...u..L1J..J • ...LLJ..I.I...Ju...uu..uu..¡
SHD SIIDP ** Nivel del factor e~presio!•n.
Figura 6.4. Intervalos de diferencia mlnima significativa para el factor de expresión en la fase 3 en la variedad "Mesilla".
* Medio de cultivo SHB y SHC <ver Tabla 5.1) ** Medio de cultivo SHD y SHDP (Tabla 5.1)
31
El aspecto visual de los embrioides fué ligerame~te mejor en
cuanto a estructura en el medio con prolina, ya que en
algunos embriones se observó un mayor tama~o.
El an~lisis de varianza reali:ado en la cuarta fase de
expresión, reveló que no existe diferencia. esta~istica
significativa entre los medios de inducción y expresión <Tablas
6.1 y A-E.l. En las ~iguras A-11 y A-12 se presenta el número
"promedio de embrioides que se diferenciaron en los dos medios de
inducción <SY8 y SHCl, lo cual rev~la que no e~iste diferencia
estadística si~nifi~ati~a entre ambos medios. Tendencia simila• , se observó entre los medios de expresión con y sin la
sup1ementaci6n de prolina.
También se manifest~ gran crecimi~nto de raices expresadas
en fases anteriores. El aspecto de los em~rioides fué de
adelga;:amiento.
VI.3 Variedad "Florida"
En la primera fase de inducción se presentaron fc•rmaciones
de tipo globular en ambos medios de inducción <SHB y SHC). En
la primera fase de expresión se manifestaron ademé.s de estructuras
globulares, estructuras de tipo pubescentes principalmente de
genotipcos provenientes del medio SHC. El aspecto de los
embrioides globulares se observó vigoroso mientras que, el de los
pubescentes fué delgado y alargados.
El análisis de varianza realizado en la primera fase de
expresión reveló que no existe diferencia estadist ica
significativa entre los medios de inducción y expresión <Tablas
5.1 y A-7). En las Figuras A-13 y A-14 se presenta el n~mero
promedio de embrioides que se diferenciaron en los dos medios de
inducción <SHB y SHC), lo cual revela que no existe diferencia
estadística significativa entre ambos medios. Tendencia similar
se observó entre los medios de expresión con y sin la
suplementación de prolina. En el segundo intento de inducción
de embriones se incrementaron las estructuras globulares y
pubescentes principalmente en el medio de cultivo SHC. Algunas
estructuras globulares se diferenciaron a embrioides en esta fase
en ambos medios de inducción • En la segunda f&se de expresión
algunas estructuras pubescentes manifestadas en la fase anterior,
se dife~enciaron en radiculas, en el medio sin prolina.
33
El anAiisis de varian=a reali:ado en la seg~nda fase de
expresiGn reveló diferencia estadistica sig~ificativa entre los
~edios de inducción, no asi entre los medios de expresión <Tablas
6.1 y A-8). SHC prese,nt& mayor respuesta embriog~ni·:a, que el
medio SHB CFigura A-15). Sin embargo, entre los medios de
e~presiOn no existe diferencia •stadistica significativa (~igura
A-16). En la tercera fase de e~presión se presentaron
e;:tyuc~ur-as glo:·bulaYes y pubescentes en la mayoria de genc·tipos
en ambos medios de inducción. Algunas estructuras globulares se
ciferenciar•:•n a embrioides mientras que algunas pubescentes se
diferen•:iar-::·n a radiculas, esta tenden-::ia se c·bseYvó en mayor
./ ' ; pro¡::eorci'.;-¡ en ca1los prc•venientes del medie• de inducci6n SHB.
El anAlisis de varian:a reli:ado en la tercera fase de
e~presi6n revelO la diferencia estadistica significativa entre
l0s medios de inducciOn, no asi entre les medios de e~presión
•Ta~l?s 6.1 y 5.4). SHC presentó m•ycr respuesta em~riogénica
respecto al medio SHB (~igura 6.5). Sin embargo, entre los
medios de e;;presi ~.n no e);iste diferencia estadistica
significativa <FiguYa 6.5).
TABLA 6.4. Tabla de ~nálisis de varian=a p~r• 1• respuest~ embriogénica en la fase de expresión 3 en le variedad "Florida".
FUENTE VARIAC. SS g.l MS F P(F) 1
F'ROVENIENCIA 48.GO 1 48.60 4.33 .04 EXPF:ESION 2.40 1 2.40 .214 .65
EF:F:OR (.38.73 ::i7 11.20
TOTAL ((:OF:R.) c;·;¡s. 73 :::;:¡
Númer•:• pr omed i •::> de embrioides
* SHB SHC
Nivel del factor inducción
FIGURA 6.5. Intervalos de diferencia rnírlima signi fio:ativa para el fa•:tc•r ind1.1•:•:i6n en la fase 2 en la variedad "Fl•:•rida".
Númet·o p.-eome!Ji,:o de embY ic·ides
2 .... :· ... •.: .... ·: .. . . . . . .
11.6 : ... ¡o •• o .• o .. o¡ o. o o. o .. o o¡ o o. o
1.2 o o o o: o o o ... o o .. '. o o o. o o o o o' o o o o
0.8 . o o. ;o o o ....... , o o ... o o o o' o o. o
0.4
SHD
·-:·····=·····:···· . . . . . . . . .
SHDP
FIGURA 5.6. Intervalos de diferencia mínima signifi•;ativa para el fa•:t•:•r e:-:presU.n en la fase 3 en la variedad "Florida".
* Medio de cultivo SHB y SHC (ver Tabla S.!) ** Medio de cultiv·::> SHD y Sf-IDP <.T.,bla 5.1)
.36
Las raices expresadas anter ic•rmente cont ínuaron
desarrollandose en la cuarta fase de e•presi6n.
El análisis de varianza realizado en la cuarta fase de
expresión, revel6 que n•=• existe diferencia estadísti•:a
significativa entre los medios de inducci6n y expresión CTabl as
6. 1 y A-9). En las Figuras A-17 y A-18 se presenta el nQmero
promedio de embrioides que se diferenciaron en los dos medios de
inducción <SHB y SHCll, lo cu¿l revela que no existe diferencia
estadistica signifi~ativa ent~e ambos medios. Tendencia similar
se observó entre los medios de expresión con y sin suplementaci6n
de prol ina.
37
VI.4 Línea expe~imental "7-S-92"
En la primera fase de indu~ción de emb~iones, los callos
p~ese:-.taron formaciones globosas únicamente en el medio de
indu~ción SHB. En la primera fase de expresión se
formaciones globularess y pubescentes en amb~s
indu~ción CSHB y SHC1.
manifestaron
med i c•s de
El an~lisis de varian=a reali=ado en la primera fase de
e~presión reveló que e~iste diferencia estadística significativa
en':: re
E~tre
los medios de inducción y expresión (Tablas E.l y A-:0>.
los medio~ de inducción SHB preseGtó ffiayor respuesta
embriogénica con respecto al medio SHC CFi9ura A-131. Entre los
medios de expresión SHD presentó mayor respuesta ~mbriogénica con
respecto al medio SHDP <Figura A-20). En la segunda fase de
se incremerta~on las estructuras globulares y
pubes~entes en mayor proporción en el medio SHC. Algunas
estru~'::uras glo~ulares se diferencia~on a embrioides en esta fase.
El an~l isis de varian=a reali=ado en la seg~nda fase de
e>:pres i (•n de emb~ iones, revel~· que no existe diferen•:ia
estadistica entre los medios de inducción y e~presión (Tablas 6.1
y A-!1>. En las Figuras A-21 y A-22 se presenta el número
promed~o de embrio(dcs que se diferenciaron en los do§ medios de
induc.:i~·n (5H8 y SYCl, lo cual revela que no
eKiste diferencia estadistica significativa entr~ ambos medios.
Tendencia similar se observO entre los medios de expresión con Y
sin la suplementaci6n de prolina.
El análisis de varianza realizado en la tercera fase de
expresilon de embriones reveló la estadística
significativa entre los medios de inducción, no asi entre los
medios de expresión (Tablas 6.1 y 6.5).
TABLA 6.5.- Tabla de análisis de varianza de respuesta embriogénica en la fase de expresión 3 en la l.inea experimental "7-S-92",
FUENTE VARIAC. SS g.l MS F P<F>
INOUC:CION 10'?.350 1 109.350 E..E.E.5 .012 EXPRES!ON :.750 1 3.750 .229 .639
INTEPACC!ON 3.750 1 3.750 .229 .639 INDUCC. X EXPRES. 3.750 1 3.75(1 .229 .63'3
ERROR '918.800 56 16.4(17
TOTAL <CORR.) 1035.E.50 59
El promedio del número de embrioides registrados en los medios de
inducción embriogénica, revelan q1.1e el medie• SHC fué meJor con
respecto al medio SHB <Figura 6.7). Entre los medios de eY-presi6n
no se presentó diferencia estadistica significativa (rigura 6.8).
En esta f~se el aspecto visual fué ligeramente meJor en cu~nto ~
estructura en el medio con prolina, ya que en algunos embrioides
se observó mayor tama~o y grosor.
39
Númer•:• prc.med ío de embr 1 <:· í des 0.9 ....... .
' {'.1
51-19 SHC • Nivel del fa•:t•:•r de indu..:·: io!.n
~IGURA 6.7. lnterv~los de dif~re~cia minima
.Número pr.;:.med io de embriC.ide¡;
si9nifi..:ativ• para el fa..:t0r inducción .,.en la· f;;ose 2 en la linea e·.~¡Jerimenté\1
7-S-·1:::.·
3. O .......-.... ,-.-'· ,..,..,...,..,., !-.-...... -r, !n-rTT.-r !. rrrn. !TTICT"l
2.5
2.0
•,' 5
t. O
-r-......... ·,·· .................. .
.... ¡ .......... , .... ..... ¡ .. .. . . . . . . ····!···· ..... ·)···· .... ·:· ....
' . '5 .... i ......... '~ ... ·"':· .... ! . ' ..
. . . • Q_w~·~··~Ln~~·~··~~Í~u·~··~~
SHD SHDP •• Nh•el del factor expreosH•n
FIGURA 6.8. 'Interválos de diferenci• mínima significativa para el fact.:•r ev.presU•n en la fase 3 en la
·linea e•perJmenta1"7-S-32:
• Medio de cultivo SHB y SHC <ver Tabla ~.1) • • Medio de e u 1 t i vo SHO y SHDP C T ab 1 a 5. t )
40
El análisis de varianza realizado en la cuarta fase de expresión,
reveló que no existe diferencia estadística significativa entre
los medios de inducción y expresión <Tablas 6.1 y A-12). El
número promedio de embricddes que se diferen·:iaron en los
medios de inducción SHB y SHC, reveló que no existe diferencia
estadística significativa entre ambos medios <Figura A-23l.
Tendencia similar se c•bserv6 entre los medios de expresión con y
sin la suplementaci6n de prolina <Figura A-24l. En esta fase los
embrioides murieron.
41
VII. DlSCUSlON
Un fe.cteor· impc•rtante para eol inicie· de cultivc•s ce-lularE?s e-s
la selE?•:•:U·n deo la fuente de e.>:plante (Ammiratc•, 1989).
Sé<unders et tl• <1975) y Meijer y Brc·wn <1985), mencic•n?.n qL<e el
hipocotilo es una buena fuente de- explante para el inicie• de
cultivos celulares en alfalfa, le• c~•al e c•nc uer da e c•n ] C•S
resultados obtenidos en este trabajo. Asi mismo, el medio de
C Lt 1 tÍ VC• Shenck e Hildebrant con adici6n de pi el c•r a m y
e u al coincide con los resultados obtenidos por Phill ips <l983l,
quien utili:6 este medio de cultivo para la fo•maci6n de callo.
La respuesta más favor.;<b]e para inducir embriones somáticos
ocurre en un medio de cultivo con concentración baJa de auxinas.
Sin embargo, esto no concuerda con lo encontrado para alfalfa
pc•r SaLtnéers <1975): Walker et &· (1":178); Walker et fl_. <1979'>;
Phillips, (1983); MeiJer y Brown (1985) y Podrigueoz -Garay y
Rubluo <1992). Estos autores encontraron que la fase de inducción
generalme-!"tte se c·bt i ene cuando se adi e i C•nan al medio
concentraciones reolativamente alt•s de ~u~in~s. Este• puede
atribuirse al hecho de la presencia de una mayor sensibilidad
fisiol6gica del teJido a ser inducido, lo cual puede atribuirse a
que los niveles end6genos en los tejidos de alfalfa e-mplEados son
al tc•s.
42
Generalmente la e~presión de embriones somáticos ocurre en
medic•s basales libres de reguladores de crecimient•:l <Walker ll.
(1979l; Walker y Sato (1981)¡ Ammirato C1983l; Phillips
(1983l; Stuart y Strid:land (1984al; Skokut et §]__. (1':185l; FL\jii;
!ll_ cl_. 098':0; Kamada, tl al. (1989) y RodrigL\ez- Garay y RLtblLto
( 1'392)).
trabajo.
Esto coincide con los resultados obtenidos en este
La e~presión de embrioides somáticos dependió del
tratamiento de inducción y al haber efecto acumulativo en las
fases de expresión no se presentó diferencia significativa en el
medio de expresión. Los embrioides expresados alcanzaron los
es.tadios de desarrolle• tempranc•s en for·ma gl c•bul al' y
pubescentes, aunque la respuesta obtenida es variable y presenta
un efecto genotipico importante, lo cual fué evidente por los
resultados obtenidos en las diferentes especies de Medicago.
La adición de L-prolina al med i•:• de sin
regwladol'es de crecimiento no estimuló la embriogénesis somática
en la;:o. variedades "Atoyac", "Mesilla", "Florida" y la linea
experimental ''7-S-92'' como se ~portó para la linea RA-3 CStuart
y Strickland (1984b) y Skc•kLit et &· (1985ll, en la cual 10>ste
aminoácido estimuló un 40 X el númel'o de embriones somáticos.
Esto puede explicarse a que se utilizó un genotipo con alto
potencial o sensibilidad embriogénica y l'egenerante para su
estudio • Otros genotipios altamente embl'iogénicos y regenerantes
son "Falcata" y 11 F.:A-:24". En los genotipos utilizados en este
43
trabajo no se reportan estudios previos utilizando
para incrementar el n~mero de embriones somáticos además
generalmente existe variación entre y dentro de las variedades
CMei.jer y Brc•wn, 1'385).
La embriogénesis somática depende también del genotipo de
alfalfa y de la fuente de nitrogeno CSkokut et al. 1985), a su
vez el aminoácido L- prolina es altamente dependiente de amonio
para la respuesta embriogénica; esto puede atribuirse a la
respuesta sinergista que se presenta cuando ambos se combinan
(Stuart y Strickland, 1984b). En este estudio la concentración
del ión amonio fué menor al que se empleó en este trabajo,
cual puede ayudar, en parte a explicar los resultados obtenidos.
La calidad estructural de los embrioides se incrementa con
adición de L-prolina en la variedad "Mesilla" y la 1 inea
e>:per imen tal "7-S-'32"; sin embargo, el tama~o y conversión a
plátulas no se incrementa con L-prolina. En los trabajos
reportados para alfalfa por Stuart y Strickland ( 1'384a), se
encontró que la adición de L-prolina y otros Aminoácidos básicos
Cglutamina y arginina) y alanina, incrementan el efe•: t.:•
embr iogéni•:•::<. La muerte de la mayoria de los genotipos en las
últimas fases del experimento, puede atribuirse al tiempo de
exposición a L-prolina, o bien a la cantidad de carbón utilizado.
44
VIII. CONCLUSIONES
El medio de proveniencia influye en la
embr i •:•gén i •: a
El a.a L-prolina no incrementa la embriogénesis en las
v,;..r iedades "Atoyao:", "Flo:•rida", "Mes.illa" y la línec-.
"7-S-92 11•
La embriogénesis depende del antecesor genético del
material biológico.
La sensibilidad fisiológica del tejido es importante
para la respuesta embriogénica.
45
IX. LITERATURA CITADA
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P. V. Ammirato and Yamada (eds). Handbook of Plant Cell
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- Ammirato, P.V. 1989. R~cent progress in somatic embryogenesis.
Newsletter 57: 2-14.
Binwell, F:. G. S. 1983. Fisiologia vegetal. Agt editor S.A,
Kingston, Ontario Cana~a. 762 p.
- Brown, D.C.W. and A.AtBnassov. 1985. Rols of genetic background
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49
TABLA A-1• Tabla de análisis de varianza de respuesta embriogénica en la fase de expresión 1 en la variedad "Atoyac".
FUENTE DE VARIACION s.s g.l MS F p(F")
INDUCCION 3E..81E. 1 36.816 4.438 .03'3 EXF'PESION ::::::.816 1 22.816 2.751 . 102
INTERAC:CION 2.016 2.016 .243 .629 INOt.K.C. X EXPF~ES. 2.016 2.01G .243 • 62'3
EPF:OR 464.533 56 8. 2'35
TOTAL 52€..188 !3')
51
Númerc· promedio de embr i·:·ides
FIGURA A·-1•
Nt:tmer~.
3.6----------~~~~--~
.2.9
l o.~ I _0.4·~------=---------..J
SIIB SHC * tlivel cJer fa·:t•:•r indu•:•: U·n
lnterv.rol •:•5 de di fel'ti:n•: ia mínima signi f .i ••• ¡t i va para el fa·:t•:•r indu•:•:U·n en la fase 1 en la variedad "Atoyac".
2.8
2 . .)
1·8
~.3 promedio de
I I
embl" ic·ides o.s
. 0.3
0.1
SHD SHDP
** Nivel del f a•: tor e:,;pr es i ~~·n
FIGURA A-2· Intervalos de diferencia mínima significativa para el factor expresión en la fase 1 en la variedad "Atoyac".
* Medio de cultivo SHB y SI-IC (ver Tabla 5.1) •• Medio de cultivo SHD y SHDP <Tabla 5.1)
52
1.2
0.9
I 0.6 Número:• 1
Promedio de 0.3 embr it::•ides
I o
0.3
SI-lB SHC Nivel del fa•:to:ot- indLI•:•:i•!•n
FIGURA A-3. Interv~los de diferenci~ minima significativa
Número;:. promedio de embr ic·ides
pa¡·a el fa.:t•:•r induo:o:i•!•n en la fase 2 en la var ied~d "Atc•)IOI·~ ".
o. 9·.----...,.----,..~----,
0.6
b.4-
0-2
SHD SHDP ** nivel del fa·:t•:•r e:'.presi~·n
F"IGURA A-4, Intervalos de di fereJJo: ia minin.a signi í .io:c.t i ,-.:. pa.·a el fc••-L•:·t- e:·:presi·!•rt en 1.:.; fase;: en l,;, ,,;,riedc.d "Atoyac".
* Medio de cultivo SHB y SHC rver T~bla S.l) iHI, Medio de c'ul ti ve. SHD y SHOP <TatJl a 5. 1)
53
TAE<LA A-2. l<~bla de análisis de varian::a de la respuesta embriog~nica en la fase de expresi6n ~ en la var-iedad "At•:•y<:~•:".
FUENTE DE VARIACION S. S g.l MS F P(F)
INDUCCION b.66G 1 C.G66 5.'357 .017 EXPF:ESION • (H)(J 1 .000 .000 1.000
INTEPACCIDN .000 1 .000 .000 1 • (l(l(l INDUCC. EXPRES. • (H)(l 1 .000 .000 1 . 000
EG:r:::OR 6;:.666 56 1.11'3
TOTAL <COF.:F:.) 6"3. 333 5'3
TABLA A-3, Tabla ~e an~lisis da varian::a en la r-espuesta Elmbr i•:•géni•:a e11 1 a fase de e:,;presi·~·n 4 en la variedad "Atoyao::".
FUENTE DE VARIACION S. S g.l MS F PCF>
INDUCCION .06G 1 .066 • 05'3 .011 EXF'F:ES ION .266 1 .266 .236 .634
INTEF:ACCION 5.400 1 5.40(1 4.785 .032 INDUCC. X EXPF.:ES. 5.400 1 5.400 4.785 .032
EF.:F:OR 63. 2(H) 56 1.128
TOTAL CCORR.) 68. '333 5'3 --.--...
54
* **
Númerc• promedie· de embr ic·ides
'0.6
\ 0.4-
'0,2
-r
..... -:~ .... ¡ ....
SIID SIIC * Nivel del fa•:t•:•r indu·:·:i~·n
FIGURA A-5, Interválos de dif~rencia minima significativa p<11·a el fa•:t•:•l' indu·~·~ i•!•n en 1 a fase 2
NúmeT·:• prc•medic· de embr ic·ides
e,;n la variedad "At•:•ya.;:".
o.~
0.4
0.2
oL-------~----~·~·~·~·~·-··~·~·~·-·~
FIGURA A-6,
SHD SHDP
** Nivel del factor expresi6n
Interv~los de diferencia factor de e~presi6n en variedad "Atoyac".
significativa la fase 4
Medio de cultivo SHB y SHC (ver Tabla 5.1J Medio de cultivo SHD y SHDP <Tabla 5.1)
55
para en
el la
TABLA A-4, T~bla de ~n~lisis de embriogénica en la variedad "Mesilla".
varian=a de fase de expresión
respllesta 1 en la
----··-------------·-· ______________ ._ .. ___________ _ FUENTE DE VARIACION
INDUCCION EXF'PESION
I NTEF:ACC ION INDUCC. X EXPRES.
s.s g.l
35.266 1 ·:J. 699 1
·-·-·-··-----15.00(1 15.0(11)
MS
35.266 ·:J. 699
15.000 15.000
F p <n
6.215 • (H)3
2.6[,0 • 108
4. 15E. .046 4.156 .046
-----------------------------------EF.:F:OR 20:2.133 56 3.6(13
--------------·--· TOTAL ( COF:P. 262.000 5'3
---·-·-------------.. ·-·--··---·---··-·--.. --.-------------------
TABLA A-5, Tabla de análisis de embriogénica en la variedad "Mesilla" .
varían=a de fase de ex~resi6n
·res pues La 2 en 1 a
.--------·----.. ---·-·---------··---...... ·--.. -------..... ' ..... - ................. _ ... __ .. ________ , .. FUENTE DE VARIACION
INDUCCION EXPF:ESION
INTEF:ACCION INDUCC. X EXPRES.
1 EF:F:OF:
~- TOTAL CORR.
s.s g.l
':11. 266 3.266
3.26E· 3.266
1 1
804.0G6 :i7
8'J8. 600 5'::1
56
MS
':11. 266 3.266
3.265 3.266
14.106
F
6.470
p (¡:-)
.013 ,(.87
• 228 • 63'3 • 228 • 63':1
* **
4
3 I t Númer.:• prc•medio de 1
I embt· ioides
o
-1
SHB SHC
* Nivel del factor induc:c:ión
FIGURA A-7· Intervalos de diferencia mínima significativa para el factor de inducción en la fase 1 en la variedad "Mesilla"
3.0
1. • .5
1.0 -1
Númerc• 1.5 promedie- de embr ic•ides 1.0.
.s -
.o
SHD SHPP Nivel doz f~ctor expre&ión
FIGURA A-8. Intervalos de diferencia mínima significativa para el factor expresión en la fase 1 en la variedad "Mesilla".
Medio de cultivo SHB y SHC Medio de cultivo SHD y SHDP
(ve,.. Tabla S.l) nabla 5.})
57
No:omet··::o pr eomed i ·=- de embr i·:·ides
Z.7
2..2
I 1.7
0.7
0.2 1 o. 3·'-------------------' SIJB
Nivel del Silo:: f a•: t •:•r'"
FIGURA A-'3, lnterval•:•s de dife.-en•:ia mininoa sigroifi·:ativa para el .fa·::tor incJLtcci·~·n en la rase 2 er1
Númerc· Prc.medio:• de embr icoides
F'IGURA A-10,
}¿, variF.·c.lad "t1esillc.".
t.. o
1.6 I 1.2 1
I .s
.4
.o~----------------· SHD SHDP
** Nivel del factor expresión
Inter~alos de diferencia minima significativa para el fa•:tor e);presi~·n en la fase 2 en la variedad "Mesilla".
* Medio de •:ultivo SHB y SHC (ver Tabla 5.1) •* Medio de cultivo SHD y SHDP (Tabla 5.1)
TABLA A7G• Tabla de anélisi& de embriogénica en la variedad "Mesilla".
varianza de fase de expresión
respuesta 4 en 1 a
--------------------··-·-· -···--· FUENTE DE VARIACION
I NDUC:C: ION EXF'F:ESIDN
INTERACCION INDUCC. X EXPRES.
EF:F:OF:
TOTAL < CORF:.
s.s g.l
38. 4•)0 3.~c.c
'L 2f.E. 4 . .::e.e.
1032.400 55
1078. GG 7 5·3
'----··---------------
59
MS F p (F)
---- ·-------- -- -··-·-· ---····--38.4(10
3.266
4.2E.E. 4.266
18.435
2. 111 .180
.231
.231
• 151 .677
,. ~ ... -.tJ..:,../
.G37
1. 9'r------,-..,-~--_----,
•\hÍmco.rO b. 9 · F'r •:·med i •:• de f.?n,b~ i·:·nes
0-t
1-ll_----'---=-------:-:--
SHB SHC Nivel del f.sc.t=aor induc.c. ión
FIGUF:A A-,·11, Ir.h;¡·vál·=·~ el~ diferencia mlni,¡-,a para ..-1 factor di? ir.d~c.c.i~n en 2: en l.;, V<•;· i i?Jdd "~le,; ¡ll ü •
-1.9
-1.~
k);ml!..rO b.9 F'l'" ':•liii2d i •:r de embr i•:•n€:s · 0.4-
FIGURA l'l-12,
0.1
0.6 -' . ..:::. ·_i__· .1. . 1.
SHD SHDP Nivel del factor expresion
Interválos de dife~encia mínima pa;·a el fa.:t·:·l- e~·:pn~su.n en la la variedad "Mesill~".
s i •:l n i f i •: a:.. l ,/ c.1
J. .,, - f ¿;,,¡:· de
signifi·:<.tí·.,.--a fase 4 -=••
TABLA A-7. Tabla de análisis de varianza de la respuesta embriogénica en la fase de expresión 1 en la variedad "Florida".
FUENTE DE VARIACION s.s g.l. MS F" PCF">
INDUCCION 2.016 1 2.016 3.322 .073 EXPRESION .150 1 .150 .247 .626
I NTEF:ACC ION .OlG 1 .016 .027 .870 INDUCC. X EXPF:ES. .016 1 .016 .027 .870
ERROR 34.000 56 .607
TOTAL CCORR.) 36.183 59
TABLA A-8. Tabla de análisis de varianza de la respuesta embriogénica en la fase de expresión 2 en la variedad "Florida".
FUENTE DE VARIACION s.s g.l MS F" P<F">
INDUCCION 68.266 1 68.266 8.871 .004 EXPRESION 4.266 1 4.266 .554 .467
INTERACCION 4.266 1 4.266 .554 .467 INDUCC. X EXPRES. 4.266 1 4.266 .554 .467
EF:ROR 430.'333 55 7.6'35
TOTAL CCORR.) 507.733 5'3
61
,lJ
·43 I N•:tm'?r er ' . .u pr •::omed i •:O de -
embr i.:·ides
.o.J
.¡7
SHB SHC
* Nivel del factor inducción
FIGURA A-13, Intervalos de diferencia minima significativa para el factor de inducción en la fase 1 en la variedad "Florida" •
• 46
• 36
Número ~U promedie• de embrioides .u
·r ...
..........
SHO SHDP ** Nivel del factor expresión
FIGURA A-14, Intervalos de diferencia mínima significativa para el factor expresión en la fase 1 en la variedad "Florida".
* Medio de o::ul ti v•::> SHB y SHC ** Medio de cultivo SHO y SHDP
62
(ver Tabla 5. 1) <Tabla 5. 1)
* **
Número promedio de embrioides
FI 13URA ,;-15.
N•Jmerc. promedie. de embrioides
T~·
2.2 I 1 1.-1
1 o.z
Q,&
SHB GIIC
.. Nivel dc:;l f a•: t ·=·~" i ndu,: •: i .~,n
Intervalos de diferencia m¡nima sionificativa p¿u·a el fa•:t.:•r indLI•~·=i·~·•~ en la fase 2 en la ·.ariedad "Flo:orida" •
:...6
l 1.2
o.s
O.+
. -
L..
SIID SHDF' •* Niv~l del fa·~tor expresi·~·n
F"IGUF:A A-16. Intervalc•s de diferen•:ia minima significativa para el fa·:tcor de e:,:presi~·n en la fase 2 en 1,;. varied<:.d "Flc·rida".
Medio de cultivo SHP y SHC Cver Tabla 5.1) Medio de cultivo SHD y SHDP (Tabla 5.1)
63
TABLA A-9, l~bla de ~nálisis de varianza de la respuesta embriogénica en la fase de e~·;p¡· es U·n 4 en 1 a variedad "Fl ·:o¡· ida".
FUENTE DE VARIACION S. S g.l MS F PCF)
INDUCCION 13.06G 1 13.066 3.6'38 .05'3 EXPF.:ESION 1. 6GG 1 1. G66 .472 .502
INTEPAC:CION :: • <)(H) 1 2.400 .679 . i~22 INDUCC. X EXPF:ES. -.::.400 1 2.400 .67'3 4.-, .. -, . ~ ...
EF.:F:OR 1'37. 866 !56 3.533
TOTAL <COF:R.) 215.000 5'3
64
t·!:Jmer C•
promedio de efllbr i coi des
1 . .5~r· 1
2 .. 1
0.7 1
I 0.3
o~L-----~-----------J
SHB SHC ~ 'Hvel del fa·:to:or indL1•:•:i611
FIGURA A-17. Interva:·:·E de di fe;c· €!1••: ia nt:ínima s i 9 n i f i ·: a t i v <• para el ! c?n: t•:•t· indLtt:r:; i •~•n en en la v,;c·iedad "Fl·:•r-ida".
1 e> f,;, se 2
1.3
-1
-Nú .. mer·:~ P·1 pr :·medio de er.:.!:Jrioides 0.4
FI Gü.=:A A-18.
• O.j -
0.2 ... SHD SHDP
** Nivel de e .. >.p1·esi6n
Intervalos de diferenc~a mínima para el factor de expresi6n en la variedad "Fl~·rida".
• Medio de cultive• SHB y SHC Cver Te~l:tla 5.1) ** Medio de cultivo SHD y SHOP fTabla 5.1'
65
significativa la fe~se 4 en
T~BLA A-10. Tabla de .;~nálisis de vario.n=a de re!::puesta embt·i·:·géni·;a en 1.3 iase de e:,;presi·~·n 1 en 1 a 1 ir•e-a e-~~r~,.. imer.tc-tl ''7-S--·3.:.:"'.
·-F~-EN_TE --~E_v_A_P._I_A_c_I_D_N ___ s_. _s ··-- ~---~ ____ M_s ___ -_F ___ --_P_<_F• -c~,-,_-,-.:J~-1 INDUCCIOrJ 86. 40(1 2S. 4(10 7 • 27·l l EXPRESION 123.266 123.266 10.377 .002
I t-/TEF:I-'tCC ION INDUCC. i EXPRES.
123.2CG 123. 26t;-
677.066 57
123.266 10.377 • 00'3 1 .00? 1 10.::}77
11.878
TO·T--A-L-,_-c-o-.r-:F-: .-) -------éiSG~l-;;--5-'3 -·---------·----.. ----------·¡ --···--------------------------------------'
T~BLA A-11· Tabla de análisis do= varian=a de respuesta embriogénica en la fase de expresión 2 en 1 a 1 inea e:-;¡er iment.;;l "7-S-'32ff.
F'UENTE DE VARIACION s.s g.l MS F' p ( F') -------, 1 -------¡
3.237 .1)77 1
. 07: . 7:·1. 1 1. 18, .. <.!3•.>
-----'--''-'--'-'-----------------~----1-·-1-8~--~~8') --l
1
INDUCCION 84.016 84.016 EXPF;ESION 2.016 2.016
I NTEF:ACC ION 31).816 ::::•:>. 816 INDUC:C. X EXF'RES. 3(1.816 3•:>. 81G
Er::ROF: 1453.333 56 25 .. ·352
TOTAL (CORR.) 1570.183 5'3
66
* .0:*
Nú.;;.et··:· prc•medi~· de embr ic·ides
F I GUF:A A-1 '3,
Númer•:• pr c•med i •:< de et:Jbr io:ddes
~;!"t,...,o'T'1i irTIT!i-rl ni iTj Mi 1-r1 Tji "ri irTI...-;1 jr"TI'T'11 irTIT'·"T"l"TJ
[ ~ 3. 3r... . .. . 1. . . . . ::.: ~: .... tl···· ·········· :x o. 7~ 11 1: "'""''
T 1 1 1 h: 1 1 1 1
SHB SHC nivel del fao:!;•:or indu•:·:i~·n
Ir~tervalc•s rJe diferen·:ia mínim.;; signifi·:;;.tiv<~ par.:, el fa•:to:or induo:·:i·~.,-, en 1.1 fase 1 en le• línea e):perimeJ.ta1'7-S·-·3:::~
4.1f-. 11111111111 1111111 1. n-rr~
:::ti··.... ... . l E · "1
11.1¡· . r 1 0.1 .... ~ .. ) .. ... ~ .... r· .... ~ .... i
~ ~ ~ ~ 1 0.9 . 1 1 1 11 1 1 1 11 '1 11 1 1 1 ,, 1 1 1 1 1 11 1,
SHD SHDP ** Nivel del fa•:tc•l' e~:pre:;i·~·n
FIGURA A-20,, Intervalc•s de diferencia mínima significativa para el facto~ expresi6n en la fase 1 en la línea experimenlal•7-S-92!
Medio:· de cultiv•::. SHB y SHC (ver Tabla 5.1) Medieo de cu!ti-.1o::• SHD y SHDP (Tabla 5.1)
67
N(tmerc. promedio de efllbr i ·:· i des
FIGURA A-21.
Númer•:• prc•medio de embr ic·ides
4.
3
t
S¡..jB SHC * Nivel del fa·: t.:•r indu•:•: i·~·n
Interv~l·:·::. ~l! diferen~:ia ~~~~nima s:gnificativa para el factor dH indLt,:•:i·~·r• en la fase 2 en la. linea e'Cper Lnentc..1l ·7--S--·;;:::
'!:z-·
.f • .t
1 3.2 l 2.2
l 1.2
0.2
o.e r,
SHD SHDP
** Nivel de expresi·~·n
FIGURA A-22, Interval.:•s de diferencia mínima significativa para el factor expresión en la fase 2 en la linea experimental"7-S-92~
* Medio de cultivo SHB y SHC <ver Tabla 5.1) ** Medio de cultivo SHD y SHDP (Tabla 5.1)
68
TABLA A-12, Tabla de análisis de varianza de respuesia embriogénica en la fase de expresi6n 4- en la línea experimental "7-S-92".
¡-----------------------------------------· FUENTE DE VARIACION S. S g .l HS F
--------------------------------------------INDUCCIDN EXPRESIDN
I NTEFéACC ION INDUCC. X EXPRES.
EF.:ROR
TOTAL <CDF:F:.)
. 151)
2.016 .150
2.016 • 05'3 . 811 .798 .3052
-----------------------8.01G 8.81E.
241.600
152.583
1 1
8.816 8.487 .057 8.816 3.487 .057
55 2.528
'---------------------------~------------
69
lllúmero ~t-o~·.::-d io de
J
1 0.6
Q~ri oi des o.<~o
FIGURA A-23.
Número
0-2.
SHB SHC Nivel del factor inducción
Interválos de diferencia mínima significativa para el factor inducción en la fase 2 en la linea experimental "7-S-92".
l-1
;::···o.1H::'io dQ o.s embr i ·=· i de !O 1
o.s
o.z
SHD SHDP v• Nivel del factor expresión
FIGURA A-24. Interválos de diferencia significativa p~ra el factor de e~presión en la fase 4 en 1~ linea experimental "7-S-92".
M~~io de ,u:tivo 5~8 y S~C ~0cio ~E' 'ultivo SH~ y SHOP
Cver Íabla 5-l) Cía.bl a 5.1)
70
~1VERSIDAD DE GUADALAJARA FACULTAD DE CIENCIAS
SRITA. GLORIA FLORES ARAMBULA PRESENTE.-
Expediente ............... .
Número .. J q?H.~~ ..... .
Ma.n.t.nu.tamo-6 a ~Ulted que c.on uta nec.ha ha ú.do apJtobado e.t .tema. de Tu.i.-6 "EFECTOS VE L-PROLINA, EN LA EMBR.IOGENESIS SOMATICA VE -
CUATRO POBLACIONES VE ALFALFA (Mecüc.ago .!>a.ti.va L)" pMa ob.teneJt .f.a. U_
c.enúa..tuJLa. en &i.o.tog.úl.
A.t mi6mo tiempo le .in6C!l.rnamo.6 a U.!>te.d que ha .!>.ido ac.e.p.tado
c.omo V.iJtec..toJt de cüc.ha Tui.!> e.t VJt. Eu.tog.io P.im.ie.n.ta BaM.io.!>.
A T f N T A •~v.l/"1 "P1E.'JSA- T
Guada.f.a.jaJta, Ja.l., S' 9&9
fACULTAD DE CIEM
Jt. Eu.tog.<.o P.im.ienta. &vu-...io-6, V.iJtec.toJt de T u.i-6. -pte. El expecüente de .f.a. af.u.mna.
'mi.!>d _ Boulévard a Tlaquepaque y Corregidora, :s. R. Teléfonos 19-80-M y 19-82-92
GuadalaJara, JaL
1'-l.C. Juan Luis Cifuentes Lemus
Director de la Facultad de Ciencias
Presente
Por medio de la presente le informo que la pasante en Biología
Gloria Flores Pxá:r.bula, con ~. de Reg. 080380739 a terminado satisfactoria
mente el trabajo ce tesis titulado EFECI'O DEL AMINOACIDO L-PROLINA, ~ LA EM
BRICGENESIS SOMATICA EN 3 VARIEDADES Y UNA LINEA EXPERIMENTAL DE ALFP.LFA (~
~ sativa. L). Estudio efectuado en el Centro de Investigacion y Asistencia
en Tecnología y D~seño del Estado de Jalisco, A.C.
Así mismo informo que he revisado el manuscrito de la tesis y
considero que cumple con los requisitos esta.blecidos por la Fac. de Ciencias
a su digno cargo.
Sin mas por el momento aprovecho la ocasión para enviarle un
cordial saludo.
C.c.p.- Interesado c.c.p.- Pxchivo
ATENTAMENTE,
~ ~PIMIENrA B. Director de Tesis
Guadalajara, Jal., 26 de Febrero de 1993.
