09 GENETICA Pba 2

CAPTULO IX

Los roedores de laboratorio como modelos de enfermedades humanas

9.1 El ratn como modelo en medicina experimentalDesde que Sir Archibald Garrod descubri (1902) que la alcaptonuria era consecuencia de un desorden metablico que se heredaba en forma mendeliana simple, muchas otras patologas humanas fueron reconocidas como el resultado de un defecto en la constitucin gentica de los individuos afectados. En forma paralela a este desarrollo del conocimiento sobre la patologa humana, se identificaron (o crearon) modelos animales de distintas enfermedades humanas. Estos modelos ayudan a la comprensin de la patognesis de muchas enfermedades y pueden ayudar en el desarrollo de terapias que sustituyan la funcin defectiva de un gen determinado. Recordemos que, para la medicina experimental, el ratn es un organismo modelo que ofrece muchas ventajas con respecto a otros modelos genticos como la mosca Drosophila, el nematode Caenorhabditis elegans e inclusive la rata. Estas ventajas son: Al tratarse de un mamfero, una gran parte de sus procesos bioqumicos son similares al hombre, aunque no hay que perder de vista que no se trata de un humano en miniatura. Tienen un tiempo generacional muy corto, son muy prolficos y se adaptan fcilmente a la vida en los animalarios (bioterios), lo que permite controlar las variables ambientales en las experimentaciones. Comparte con el hombre el privilegio de ser las especies de mamfero mejor estudiadas desde el punto de vista gentico. Existe una gran cantidad de lneas genticamente definidas, como las consanguneas y congnicas, adems de cientos de mutaciones y un gran nmero de rearreglos cromosmicos disponibles. Es el nico animal que posee sistemas eficientes de cultivo de clulas embrionarias pluripotenciales (clulas ES), lo que permite la realizacin de mutaciones dirigidas (ratones KO constitutivos y condicionales). Finalmente, el trabajo acumulado durante un siglo de investigaciones ha resultado en una inmensa cantidad de documentacin sobre los fenotipos mutantes, las caractersticas de las lneas, los mapas genticos y la secuencia completa del genoma. Los modelos murinos disponibles los podemos clasificar segn su origen en: (i) modelos provenientes de mutaciones espontneas o inducidas, (ii) modelos generados por transgnesis y (iii) modelos generados in vitro por manipulacin de clulas ES.

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MANUAL DE GENTICA DE ROEDORES DE LABORATORIO

9.1.1 Modelos provenientes de mutaciones espontneas o inducidas Los diversos mecanismos que generan las mutaciones espontneas y los mtodos para producirlas experimentalmente ya fueron vistos en el Captulo VII y VIII, respectivamente. Las mutaciones del ratn se encuentran listadas, con descripcin y bibliografa, en el libro Genetic Variants and Strains of the Laboratory Mouse (1996). Estas listas son actualizadas peridicamente y pueden encontrarse en la pgina de Internet del Mouse Genome Informatics (http://www.informatics.jax.org/searches/marker_form.shtml) o puede consultarse revistas especializadas1. Muchas de estas mutaciones han demostrado ser modelos muy interesantes para el entendimiento de los procesos del desarrollo de los mamferos y algunas de ellas, alrededor de 100, han sido clasificadas como modelos homlogos de enfermedades humanas, lo que significa que la homologa se extiende al nivel molecular. Algunos ejemplos de este tipo de mutaciones son: alkaptonuria (Hgdaku), modelo de la alcaptonuria humana, hyperphenylalaninemia 1(hph1), modelo de la fenilcetonuria y la mutacin X-linked muscular dystrophy (Dmdmdx), modelo de la distrofia muscular de Duchene/Becker, entre otras.

9.1.2 Modelos generados por transgnesis 9.1.2.1 Modelos producidos a travs de la eliminacin de un determinado tipo celular Estos ratones transgnicos son diseados usando secuencias reguladoras especficas de tejido asociadas a secuencias que codifican para protenas citotxicas (o potencialmente citotxicas) con el fin de programar la ablacin de un tipo celular especfico. Esta eliminacin selectiva nos provee de un mtodo directo para generar animales a los cuales les falta un tipo celular especfico e inclusive hasta un linaje celular completo. La estrategia ms comn hace uso de secuencias que codifican para protenas txicas como la cadena A de la toxina diftrica o de la ricina (ambas bloquean la sntesis de protenas por parte de la clula). En este caso, el efecto citotxico se produce inmediatamente despus de la activacin del transgn en el tejido blanco (debido a los promotores especficos de tejido). Otra estrategia se basa en la expresin intracelular de la enzima timidina quinasa derivada del virus del herpes (HSV-tk). Esta enzima no es directamente txica para las clulas pero, a diferencia de la timidina quinasa de los mamferos, puede fosforilar ciertos anlogos de nuclesidos como el acyclovir y el gancyclovir, convirtindolos en sustancias txicas para las clulas. De esta manera, el efecto letal para las clulas est condicionado al tipo de tejido seleccionado para la expresin de la timidina quinasa viral (debido a un promotor especfico de tejido) y al agregado de los anlogos de nuclesido. Algunos modelos de enfermedades humanas han sido creados por esta metodologa, por ejemplo ratones con inmunodeficiencia de linfocitos B y ratones deficientes en mielina, estos ltimos a travs de la eliminacin selectiva de la poblacin de oligodendrocitos. Actualmente,1

Las revistas Mammalian Genome, Nature Genetics, Genomics, Genome Research, Genetics, Trends in Genetics, Human Molecular Genetics, Immunogenetics y Comparative Medicine proveen una excelente cobertura de las novedades sobre la gentica del ratn y la rata.

LOS ROEDORES DE LABORATORIO COMO MODELO DE ENFERMEDADES HUMANAS

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la disponibilidad de recombinasas sitio-especficas (como Cre o Flp) ha provocado un vuelco hacia el uso de la transgnesis condicional (ver Captulo VIII). 9.1.2.2 Modelos producidos a travs de una regulacin anormal del gen Uno de los mejores ejemplos de este tipo de animal transgnico es el clsico ratn gigante producido en 1982 por la sobre expresin de la hormona de crecimiento de la rata. En este caso, la expresin del transgn fue dirigida por el promotor del gen de la metalotionina, lo que llev a la expresin constitutiva de la hormona de crecimiento con el dramtico efecto en el tamao del ratn. Otro ejemplo es la asociacin, en la construccin de un animal transgnico, de un oncogn con un promotor ubicuo, lo que lleva al desarrollo de una alta frecuencia de neoplasias. En cambio, cuando el promotor utilizado es especfico de tejido, los tumores aparecen slo en el tejido blanco. Por ejemplo, Heisterkamp y colaboradores (1990) produjeron un modelo de ratn transgnico para la leucemia aguda humana por medio de la introduccin de un segmento quimrico de ADN conteniendo un exn del gen Bcr con un exn del oncogn Abl1 (c-Abelson). Esta misma fusin se produce en los pacientes leucmicos como resultante de una translocacin recproca 9q34-22q11, denominada cromosoma Filadelfia. El modelo transgnico sirvi para comprobar la causa de la leucemia humana pero, lamentablemente, no es demasiado til para el estudio de la evolucin de la enfermedad porque los ratones mueren a una edad muy temprana. (Para ms detalles sobre modelos transgnicos del cncer ver el punto 9.2.2.1.) 9.1.2.3 Modelos producidos por la incorporacin de genes humanos Existen muchos ejemplos de esta clase de transgnicos, entre los ms destacados podemos nombrar el ratn transgnico sensible al virus de la polio y los modelos murinos para la osteognesis imperfecta tipo II y la anemia falciforme (en ingls, sickle-cell anemia). En el primer caso, se produjeron ratones susceptibles para todas las lneas de virus de la poliomielitis, incorporando en el genoma murino el gen humano que codifica para el receptor celular del virus. Al ser inoculados con el virus, estos ratones transgnicos reproducen algunos de los sntomas clnicos observados en humanos y primates; por lo tanto representan un modelo excelente para los estudios moleculares de la patognesis de la poliomielitis, as como para la evaluacin de nuevas vacunas. Otros ejemplos de modelos producidos por la incorporacin de genes humanos sern tratados en detalle en el punto 9.2.1 y 9.2.2. 9.1.2.4 Modelos transgnicos producidos por la incorporacin de grandes fragmentos de ADN Se han descripto varias tcnicas capaces de llevar a cabo la incorporacin de grandes segmentos de ADN (hasta 900 kb) a la lnea germinal de los ratones utilizando vectores YAC o BAC. Entre esas tcnicas, la microinyeccin directa de estos vectores en el proncleo de un ovocito fertilizado aparece como la ms utilizada. Este tipo de transgnicos son de gran utilidad cuando el defecto gentico resulta de una alteracin cuya causa molecular es poco conocida o desconocida. Utilizando este sistema, se han creado modelos originales de enfermedades humanas muy complejas como el sndrome de Down.

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El sndrome de Down, resultante de la trisoma del cromosoma 21, est asociado a una cantidad de defectos que son consecuencia directa de la dosis anormal de varios genes ubicados en una regin particular del cromosoma (21q22.2). Para lograr avances sobre el conocimiento de la relevancia funcional de esta regin del cromosoma 21, Smith y colaboradores han construido un panel de ratones transgnicos que portan (cada cual) un vector YAC individual (conteniendo fragmentos de ADN del cromosoma 21 humano). En total, este panel de ratones abarca una regin contigua de aproximadamente 2 Mb, comprendiendo toda la regin 21q22.2 del cromosoma humano. Es interesante el hallazgo de dos lneas de ratones conteniendo YACs diferentes (no superpuestos) que presentaban fallas en el aprendizaje. Esto estara indicando que por lo menos dos genes estn implicados en el dficit de aprendizaje cuando estn presentes en ms de dos copias (lo que sucede en la trisoma del cromosoma 21). Trabajos similares se estn llevado a cabo para la enfermedad de Huntington (autosmica dominante), causada por la expansin de una secuencia de ADN (triplete CAG) en el exn 1 del gen que codifica para la huntingtina (cuyo tamao es de 200 kb). Como un primer paso hacia el desarrollo de un modelo murino de esta enfermedad se introdujo un YAC de 600 kb comprendiendo el gen huntingtina (humano), en este caso un alelo normal con 18 repeticiones CAG. Estos ratones fueron cruzados con otra lnea de ratones cuyo gen endgeno huntingtina haba sido anulado por tcnicas de mutagnesis dirigida (KO). Es llamativo ver que el gen humano (alelo normal) puede rescatar el fenotipo letal de los embriones nulos para el gen huntingtina, indicando que el gen humano es funcional en el ratn. Es razonable pensar que la introduccin de alelos humanos patognicos pueda llevar a un buen modelo murino de la enfermedad de Huntington. (Para ms informacin sobre los mtodos de transgnesis en el ratn remitirse al Captulo VIII.)

9.1.3 Modelos generados in vitro por manipulacin de clulas ES Como ya hemos visto en el captulo anterior, la disponibilidad de cultivos de clulas pluripotenciales ES ha ampliado enormemente el espectro de las posibilidades de manipulacin del genoma murino, en particular las mutaciones dirigidas. Con las clulas ES es posible crear modelos murinos a partir de (i) clulas ES mutantes seleccionadas in vitro, (ii) por transgnesis in vitro de las clulas ES (haciendo uso de una batera de tcnicas de transfeccin de ADN) y (iii) por medio de la utilizacin del fenmeno de recombinacin homloga in vitro. Por ejemplo, existe un modelo del sndrome de Lesch-Nyhan (ver seccin 9.2.1.8) que fue producido seleccionando in vitro clulas ES mutadas (sin actividad de la enzima HPRT). Los modelos generados por recombinacin homloga in vitro son muy numerosos y se encuentran detallados en el punto 9.2. Existen ratones KO que son excelentes modelos para la fibrosis qustica, la enfermedad de Gaucher, la anemia falciforme y las talasemias, entre muchos otros.


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9.1.4 Modelos generados por transgnesis condicional (sistemas Cre/loxP y Flp/frt) La estrategia de creacin de transgnicos condicionales, ya sean stos temporales o espaciales, por medio del uso de recombinasas sitio-especficas ha sido descripta en detalle en el Captulo VIII. Las posibilidades de crear modelos es inmensa ya que podemos provocar la falta de expresin de un gen, o la expresin de un alelo mutado, en un tejido especfico y en un momento del desarrollo determinado. Por lo tanto, esta estrategia es muy eficiente para el estudio de la inactivacin de genes que son esenciales para el desarrollo. Una de las tantas posibilidades que ofrecen estos sistemas es la de generar deleciones, inversiones y translocaciones de grandes segmentos cromosmicos. Un ejemplo interesante es la translocacin entre el oncogn Myc y los genes de cadena pesada de las inmunoglobulinas, en los cromosomas 15 y 12 respectivamente, reportada por Smith y colaboradores en 1995. Esta translocacin generada por el sistema Cre/loxP reproduce aquellos rearreglos que son producidos en los plasmocitomas.

9.2 Modelos murinos para el estudio de enfermedades humanasComo ya hemos visto en el Captulo VII, el descubrimiento de mutaciones con patologas similares a enfermedades humanas es una situacin frecuente en los animalarios que cran roedores. A lo largo de los ltimos 90 aos se han descripto ms de 1.500 mutaciones en el ratn de laboratorio entre espontneas e inducidas, muchas de ellas de gran valor en medicina experimental (ver Mouse Locus Catalog, http://www.informatics.jax.org/searches/marker_form.shtml, Mutant Mouse Regional Resource Centers (MMRRC), http://www.mmrrc.org/index.html y Mouse Knockout and Mutation Database (MKMD), http://research.bmn.com/mkmd). En trminos didcticos, podemos decir que los modelos animales en medicina experimental pueden ser tiles fundamentalmente para tres propsitos: (i) identificar la base molecular de la enfermedad, (ii) estudiar la fisiopatologa de la enfermedad y, (iii) ensayar nuevas terapias para la misma.

9.2.1 Modelos murinos de enfermedades hereditarias simples (mendelianas) 9.2.1.1 Enfermedades que involucran clulas derivadas de la cresta neural Las clulas que derivan de la cresta neural se diferencian en diversos tipos celulares, entre los cuales encontramos a los melanocitos de la piel y el odo interno, las neuronas y clulas de la gla del sistema nervioso perifrico, clulas neuroendcrinas de las glndulas adrenales y tiroides, e inclusive componentes de los huesos cartilaginosos y membranosos de la cabeza. En la Tabla 9.1 podemos observar una lista de genes en los cuales se han identificado mutaciones, tanto en el ratn como en los genes homlogos humanos, y que causan deficiencia de clulas

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derivadas de la cresta neural. Todos estos modelos tienen aspectos comunes entre el fenotipo mutante y la correspondiente enfermedad humana. Nos limitaremos a presentar brevemente tres de esas enfermedades:Nombre del gen Endothelin 3 Smbolo Edn3ls

Modelos disponibles Mutacin espontnea lethal spotting y ratones KO Mutacin espontnea piebald, mutaciones inducidas y ratones KO Mutacin espontnea dominant spotting y mutaciones inducidas Mutacin espontnea micropthalmia y mutaciones inducidas Mutacin espontnea pink-eyed dilution y mutaciones inducidas Mutacin espontnea splotch y mutaciones inducidas Mutacin espontnea albino y mutaciones inducidas

Enfermedad humana Sndrome de Waardenburg-Shah Enfermedad de Hirschsprung; Sndrome de Waardenburg-Shah Piebaldismo

Endothelin receptor

Ednrbs

Kit oncogen

Kitw

Micropthalmia-associated transcription factor Pink-eyed dilution

Mitfmi

Sndrome de Waardenburg tipo 2 Albinismo oculocutneo tipo 2 Sndrome de Waardenburg tipo 1; Sndrome de KleinWaardenburg Albinismo oculocutneo tipo 1

p

Paired box protein-3

Pax3Sp

Tyrosinase

Tyrc

Tabla 9.1 Desrdenes de clulas derivadas de la cresta neural.

Enfermedad de Hirschsprung (HSCR) Las personas afectadas por este desorden tienen deficiencias en los ganglios nerviosos entricos, lo que resulta en megacolon, bloqueos intestinales y constipacin crnica. Existen formas dominantes y recesivas de la enfermedad. Diversas mutaciones en el proto-oncogn RET son la causa de la forma dominante de esta enfermedad hereditaria humana, mientras que las formas recesivas se deben a mutaciones en la endotelina 3 (gen EDN3) y su receptor tipo B (gen EDNRB). Para los tres genes mencionados se han desarrollado ratones KO que han aportado valiosa informacin respecto a la patogenia de la enfermedad, aunque existen algunas diferencias fenotpicas con la enfermedad humana. Esto demuestra que muchas veces los tejidos murinos y humanos


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responden de manera diferente a la falta de funcin de un determinado gen. Existen dos mutaciones espontneas en el ratn que resultaron ser allicas de los genes murinos Edn3 (cromosoma 2) y Ednrb (cromosoma 14), se trata de lethal spotting (ls) y piebald (s), respectivamente (alelos Edn3ls y Ednrbs). Otra mutacin que ha sido propuesta como modelo de HSCR es dominant megacolon (Dom), una mutacin dominante del gen Sox10 (SRY-box containing gene 10) en el cromosoma 15 del ratn. La mutacin Dom es muy sensible al fondo gentico y se observa, por ejemplo, que los ratones C3H/He-Dom/+ presentan sntomas severos, mientras que los ratones C57BL/6-Dom/+ son aparentemente normales. Piebaldismo El piebaldismo (en ingls, piebald trait o PT), presenta una deficiencia en la migracin de los melanocitos hacia la piel y el odo interno, originando defectos en la pigmentacin del pelo e hipopigmentacin en la piel de la frente, pecho y abdomen. Adems, son frecuentes los epiteliomas, las sorderas ocasionales y la heterocroma del iris. Numerosas mutaciones en el oncogn KIT son las responsables del piebaldismo en los humanos y del dominant white spotting (W) en el ratn. La mutacin W fue descripta en 1908 y ha sido ampliamente estudiada a lo largo del siglo XX, ya que se trata de un locus muy sensible a la aparicin de mutaciones. El locus W (ahora KitW) se localiza en el cromosoma 5 del genoma murino y se han identificado alrededor de 100 alelos diferentes. Los ratones heterocigotas exhiben manchas blancas en la cabeza y el vientre, un fenotipo muy similar al del piebaldismo humano. Los ratones homocigotas (KitW/KitW), en su inmensa mayora, mueren durante el desarrollo embrionario. Slo algunos alelos, denominados viables, permiten la sobrevida de los ratones homocigotas (KitW-v/KitW-v), aunque stos son anmicos, estriles y de pelaje blanco; pero, a diferencia de los albinos, tienen ojos negros, ya que no est afectada la migracin de los melanocitos hacia la retina. No obstante, tambin se han descripto algunos alelos que resultan viables y frtiles en estado de homocigosis (alelo KitW-f). Es interesante notar que todas las mutaciones, tanto en el hombre como en el ratn, afectan el dominio tirosina quinasa de la protena. Por otro lado, el fenotipo que estamos describiendo es idntico al que muestran los ratones afectados por la mutacin steel (Sl). El locus Sl (ahora KitlSl) se localiza en el cromosoma 10 del ratn y codifica para el ligando natural del receptor Kit (gen Kitl, kit ligand). Sorprendentemente, no se han identificado mutaciones en este gen en personas con piebaldismo. Sndrome de Waardenburg (WS) El sndrome de Waardenburg es una enfermedad dominante y ha sido clasificada por los clnicos en tres tipos: WS1, WS2 y WS3. Este sndrome presenta anomalas en la migracin de los melanocitos hacia la piel y el odo interno, llevando a defectos en la pigmentacin del pelo y los ojos, adems de sordera. Al igual que HSCR, WS es genticamente heterognea, comprendiendo mutaciones en dos factores de transcripcin, PAX3 (paired box gene-3) y MITF (microphthalmia transcription factor). A su vez, existen ms de 30 mutaciones del gen PAX3, afectado virtualmente cada dominio de la protena. En el ratn, Pax3 y Splotch (Sp) son allicos (cromosoma 1), siendo el ltimo un alelo mutante (su nueva nomenclatura es Pax3Sp). Splotch es una mutacin semi-dominante que presenta varios alelos (Sp, Spd, Sp2H, entre otros) que cau-

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san manchas blancas en el abdomen, cola y pies en el estado heterocigota. Los ratones homocigotas suelen morir durante la gestacin por severos defectos en el tubo neural y los ganglios espinales. Una vez ms, existen diferencias entre el modelo de ratn mutante y la enfermedad humana, en este caso los ratones afectados por las mutaciones en el gen Pax3 nunca presentan sordera ni defectos en el odo interno. El gen murino Mitf result ser codificado por un gen previamente conocido por la mutacin microphthalmia (mi), ahora Mitfmi (cromosoma 6). El locus mi es particularmente fascinante porque presenta muchos alelos disponibles para el estudio y, adems, estos alelos despliegan una pltora de fenotipos y un patrn de herencia complejo. Todos los alelos de mi causan anomalas en los melanocitos, lo que produce patologas oculares, defectos en la pigmentacin y a veces sordera. En general, los alelos ms severos se comportan en forma semi-dominante y los menos severos son recesivos, estando localizadas las mutaciones, para cada clase, en dominios especficos de la protena. 9.2.1.2 Desrdenes en la visin El odo y los ojos del ratn son anatmicamente y funcionalmente muy similares a los del hombre (y a los de los mamferos en general), convirtiendo al ratn en un modelo muy til para el estudio de estos rganos. Adems, existe una provisin de mas de 150 loci mutantes que afectan el odo y los ojos del ratn. En la Tabla 9.2 podemos observar algunos de estos mutantes que han resultado ser excelentes modelos de enfermedades humanas, ya que comparten sorprendentes similitudes en el fenotipo.

Nombre del gen Myosin VIIA

Smbolo Myo7ash1

Modelos disponibles Mutacin espontnea shaker 1 y mutaciones inducidas Mutaciones inducidas ratones KO Mutacin espontnea small eye y mutaciones inducidas Mutacin espontnea retinal degeneration 1 Mutacin espontnea retinal degeneration 2 Ratones transgnicos

Enfermedad humana Sndrome de Ushers tipo 1B Coloboma de nervio ptico con enfermedad renal Aniridia tipo 2

Paired box homeotic gene 2 Paired box homeotic gene 6 Phosphodiesterase 6B, cGMP, rod Peripherin 2 Rhodopsin

Pax2

Pax6Sey

Pde6brd1 Prph2Rd2 Rho

Retinitis pigmentosa Degeneracin de retina Retinitis pigmentosa tipo 4

Tabla 9.2 Desrdenes de la visin y el odo


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Dentro de las anomalas hereditarias de la visin podemos diferenciar a aquellas que afectan el desarrollo de la retina y a las que involucran procesos degenerativos de la misma. Dentro del primer grupo se encuentra la aniridia, enfermedad que resulta en la hipoplasia del iris. El gen humano para la aniridia es el PAX6, un factor de transcripcin de la familia paired box genes. El homlogo murino es la mutacin small eye (Sey), cuyo locus se encuentra en el cromosoma 2 (Pax6Sey). La dosis gnica parece ser crtica en la funcin del gen Pax6, tanto en el ratn como en el hombre, ya que el desarrollo del ojo es sensible al aumento, o la disminucin, de la expresin del gen. En el tipo de anormalidades degenerativas encontramos la retinitis pigmentosa (RP). Se trata en realidad de un grupo de enfermedades que representan una de las causas ms comunes de ceguera en individuos de mediana edad. Se han descripto formas autosmicas recesivas, autosmicas dominantes y ligadas al cromosoma X. Una de las mutaciones asociadas a la RP es la del gen de la rodopsina (RHO), un fotoreceptor asociado a protenas G que interviene en los procesos de la visin con baja luz, es por eso que los individuos afectados sufren especialmente de ceguera nocturna. Existen varios modelos de ratones transgnicos que expresan formas mutantes del gen Rho, con procesos degenerativos de los fotoreceptores similares a los hallados en la enfermedad humana. Otro modelo importante para el estudio de RP es la mutacin retinal degeneration-1 (rd1), descripta en la dcada de 1920 y ubicada en el cromosoma 5 del genoma murino. Los animales homocigotas exhiben degeneracin de todos los fotoreceptores de la retina al mes de vida. Es interesante decir que muchas de las lneas consanguneas clsicas (como C3H, CBA, SJL y SWR) son homocigotas para la mutacin rd1, y por lo tanto los animales son ciegos a edad temprana. El gen mutado en este caso es phosphodiesterase, cGMP, rod receptor, b-subunit (Pdebrd1). Un tratamiento potencialmente eficaz para la RP fue evaluado en ratones Pdebrd1/Pdebrd1: se trata de la introduccin de adenovirus recombinantes que llevan copias del alelo normal (wild type) del gen Pdeb, antes del inicio de los procesos degenerativos. Se ha encontrado que despus de este tratamiento hay un retraso muy marcado de la muerte de las clulas fotoreceptoras. 9.2.1.3 Desrdenes en la audicin Pese a que las sorderas pueden agruparse en varias categoras segn el sitio del sistema auditivo que est fallado, en el humano, la forma ms comn de sordera es aquella que afecta al rgano de Corti, responsable de las transducciones auditivas. Debido a la gran cantidad de genes envueltos en las sorderas hereditarias, los anlisis de ligamiento fueron siempre muy difciles de realizar en humanos. Una vez ms, el ratn jug un papel fundamental para lograr uno de los hitos en el estudio de las sorderas de origen gentico: el clonaje del primer gen vinculado a las transducciones auditivas. Hasta el momento, dos genes perteneciente al grupo de las miosinas no convencionales, Myo7a (cromosoma7) y Myo6 (cromosoma 9), fueron aislados en el ratn. El gen homlogo humano (MYO7A) fue identificado posteriormente en pacientes con el sndrome de Ushers tipo 1B, la forma ms comn de sordera con ceguera asociada. Las similitudes fenotpicas (ambos comparten la degeneracin del rgano de Corti) y los mapeos comparativos dieron los primeros indicios de que la mutacin murina shaker1

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(sh1), asociada a sordera, era homloga al sndrome de Ushers tipo 1B. Actualmente se sabe que la mutacin sh1 es un alelo mutado del gen Myo7a, por lo tanto su nueva nomenclatura es Myo7ash1. Recientemente, se demostr que el gen Myo6 es allico a la mutacin recesiva Snells waltzer (ahora Myo6sv) y que los ratones homocigotas presentan defectos en el neuroepitelio del odo interno. Gracias a los proyectos conjuntos de mutagnesis qumica por ENU, se han descripto nuevos mutantes con sordera que sern tiles como modelo animal de sordera, por ejemplo la mutacin dominante Beethoven (Bth), descubierta en Alemania. 9.2.1.4 Enfermedades de los huesos y cartlagos Dentro de los mecanismos implicados en los desrdenes esquelticos podemos encontrar: (i) las alteraciones que afectan la composicin bioqumica del hueso, (ii) las fallas en el patrn de desarrollo seo durante la embriognesis y (iii) la imposibilidad de establecer las proporciones correctas en el crecimiento de los huesos. En el ratn se han descripto ms de 100 loci y modelos transgnicos que afectan el desarrollo del esqueleto. En la Tabla 9.3 se muestra una lista de genes murinos involucrados en diversos trastornos seos y sus respectivas enfermedades homlogas humanas.Nombre del gen Procollagen type 1, alpha 1 Procollagen type 1, alpha 2 Procollagen type 2, alpha 1 Procollagen type 5, alpha 2 Procollagen type 9, alpha I Procollagen type 11, alpha I Fibroblast growth factor receptor 1 Fibroblast growth factor receptor 3 GLI-Kruppel family member Homeo box D13 Smbolo Col1a1Mov13

Modelos disponibles Mutacin Moloney leukemia virus 13, y ratones KO Mutacin espontnea osteogenesis imperfecta Ratones transgnicos y KO Ratones KO Ratones transgnicos y KO Mutacin espontnea chondrodysplasia Ratones KO Ratones KO Mutacin espontnea extra toes y mutaciones inducidas Ratones KO

Enfermedad humana Osteognesis imperfecta; Ehlers-Danlos tipoVII Osteognesis imperfecta; Ehlers-Danlos tipoVII Acondrognesis tipo 2; Displacia metafisiaria Enfermedad de EhlersDanlos Displacia epifisaria mltiple Sndrome de Stickler tipo II Sndrome de acrocefalosindactilia tipo V Acondroplasia; Enanismo tanatofrico Sndrome de Greig

Col1a2oim Col2a1 Col5a2 Col9a1 Col11a1cho Fgfr1 Fgfr3 Gli3Xt

Hoxd13

Sindactilia tipo II

Tabla 9.3. Enfermedades de los huesos y el tejido conectivo.


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Las mutaciones dirigidas (KO) de los genes Hoxd13 y Gli3, miembros de las familias de factores de transcripcin homeodomain y zinc-finger, respectivamente, causan anormalidades esquelticas, fusiones seas y prdida de falanges en los ratones homocigotas. En el ser humano, gracias a la tcnica del gen candidato, se logr identificar el gen HOXD13, y se sabe que el mismo se encuentra mutado en pacientes con sindactilia tipo II. A diferencia del modelo murino transgnico, la enfermedad hereditaria humana es autosmica dominante y est caracterizada por la presencia de dedos fusionados y membranas interdigitales. Recientemente se ha demostrado que las seales intercelulares mediadas por el factor de crecimiento de los fibroblastos (FGF) juega un papel importante en la coordinacin del crecimiento del hueso endocondral y membranoso. La prdida del crecimiento proporcional entre los ejes longitudinal y radial de los huesos resulta frecuentemente en displasias del esqueleto. Gracias a estudios realizados en familias con sndromes autosmicos dominantes asociados a problemas seos, ha sido posible identificar mutaciones puntuales en los genes que codifican para los receptores de FGF (genes FGFR1 y FGFR2). Estos dos genes afectan el crecimiento del hueso intramembranoso, mientras que el FGFR3 generalmente afecta el hueso endocondral. Se conocen tres enfermedades dominantes asociadas a mutaciones en el gen FGFR3. Una de las ms severas es la displasia tanatofrica, la cual causa enanismo y mortalidad perinatal en los heterocigotas. Es notable que, por otro lado, los ratones heterocigotas para una mutacin nula del gen Fgfr3 son fenotpicamente normales y que los homocigotas presentan un fenotipo casi opuesto al humano, con crecimiento exagerado de los huesos largos y sordera. Finalmente, hablaremos brevemente de los colgenos, los cuales constituyen las principales fibras del tejido conectivo y son las protenas ms abundantes de la matriz extracelular. Existen, por lo menos, 19 genes de colgeno, cuyos productos interaccionan (en forma de hlices triples) para formar las distintas fibras de colgeno. Por lo tanto, las mutaciones en diferentes genes del colgeno pueden afectar la misma fibra de colgeno. En humanos, se han identificado mutaciones en 13 genes de colgeno, y las mismas han sido siempre relacionadas a fenotipos patolgicos. Es ms, se sabe que distintas mutaciones del mismo gen de colgeno pueden resultar en enfermedades diferentes. Por ejemplo, se conocen por lo menos cinco formas diferentes de condrodisplasia y degeneracin de cartlagos, todas resultantes de mutaciones en el mismo gen (COL2A1). En el ratn, la mutacin chondrodysplasia (cho) ha permitido el aislamiento, por la tcnica del gen candidato, del gen Col11a1 y su respectivo gen homlogo humano (COL11A1), responsable de una forma de condrodisplasia presente en el sndrome de Stickler. Adems del ratn cho, existen otras mutaciones del ratn que afectan los genes del colgeno, algunas de ellas espontneas [osteogenesis imperfecta (Col1a2oim)], y otras transgnicas y/o KO (Col1a1, Col2a1, Col5a2, Col9a1 y Col10a1). 9.2.1.5 Desrdenes neurolgicos y neuromusculares Existen alrededor de 150 mutaciones en el ratn que causan defectos neurolgicos, neuromusculares o comportamentales. Entre ellas, hay unas 20 que pueden ser consideradas como modelos de enfermedades humanas, fundamentalmente aquellas que comparten un fenotipo neuromuscular o neurolgico con el correspondiente desorden humano (Tabla 9.4).

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Nombre del gen Apolipoprotein E Amyloid beta precursor protein Ataxia telangiectasia Dystrophin myotonica kinase, B15 Dystrophia, muscular dystrophy Fragile X mental retardation syndrome I Huntington disease gene homolog Laminin, alpha 2

Smbolo Apoe App Atm Dm15 Dmdmdx

Modelos disponibles Ratones KO Ratones transgnicos y KO Ratones KO Ratones transgnicos y KO

Enfermedad humana Alzheimer tipo 2 Alzheimer Ataxia-telangiectasia Distrofia miotnica

Mutacin espontnea Distrofia muscular X-linked muscular dystrophy de Duchenne y Becker y ratones KO Ratones KO Ratones KO Mutacin espontnea dystrophia muscularis y ratones KO Ratones transgnicos Ratones Transgnicos y KO Sndrome X Frgil Enfermedad de Huntington Distrofia muscular congnita Ataxia espinocerebelosa tipo 1 Esclerosis lateral amiotrfica

Fmr1 Hdh Lama2dy

Spinocerebellar ataxia 1 Superoxide dismutase-1, soluble

Sca1 Sod1

Tabla 9. 4. Desrdenes neurolgicos y neuromusculares

Enfermedad de Alzheimer (EA) Este desorden neurodegenerativo es la cuarta causa de muerte en los pases desarrollados. Se trata de una demencia progresiva en la que ciertas zonas especficas del cerebro sufren degeneracin neuronal, lo que lleva a la prdida de la memoria y de las capacidades cognitivas. En los ltimos aos, diversos laboratorios han producido ratones transgnicos que exhiben algunos de los cambios patolgicos asociados a EA. Esto ha ocurrido, por ejemplo, con los transgnicos que expresan niveles muy altos de la protena amiloide humana (gen APP, amyloid precursor protein) en su forma wildtype o una forma mutante (particularmente una mutacin puntual encontrada en pacientes con EA). Ambos modelos comparten grandes similitudes con los casos humanos; sin embargo, las placas seniles (uno de los rasgos histopatolgicos caractersticos de EA) se encuentran slo en los ratones transgnicos para el gen mutado. Ninguno de los dos tipos de transgnicos para el gen APP desarrolla ovillos neurofibrilares (en ingls, tangles), la otra lesin histopatolgica caracterstica de EA. Cabe destacar que estos ra-


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tones transgnicos exhiben defectos en el aprendizaje, as como alteraciones cerebrales al envejecer. Adems, se ha demostrado que el fondo gentico de los ratones tiene un efecto muy fuerte sobre el fenotipo. Siendo que la funcin del gen APP es muy poco conocida (ms all de ser requerida para el funcionamiento neuronal), estos ratones son un modelo muy til para comprender el papel del gen APP en pacientes con EA. Otro gen involucrado en EA es el gen de la apolipoprotena E (APOE). Pese a que, originalmente, los ratones homocigotas para formas mutadas del gen Apoe fueron reportados como neurolgicamente normales, estudios ms recientes demostraron que existen alteraciones de la sinapsis y cierto nivel de neurodegeneracin del SNC en ratones nulos para el gen Apoe (Apoe /). Tambin existen ratones transgnicos que sobreexpresan formas wildtype o mutadas de los genes humanos PS1 y PS2 (presenilin-1 y presenilin-2). Si bien ninguno de los modelos transgnicos de EA recapitula todos los rasgos de la enfermedad humana, estos modelos han aportado datos valiosos para entender la patognesis de la enfermedad y pensar en el desarrollo de terapias. Desrdenes neuromusculares Bsicamente, las anormalidades neuromusculares pueden resultar de (i) fallas en la excitacincontraccin del msculo esqueltico, (ii) defectos en el metabolismo muscular y (iii) degeneracin y/o debilidad muscular. Como ejemplos de modelos pertenecientes a la primera categora tenemos la mutacin Cchl1a3 y los ratones KO para el gen Ryr1; un ejemplo del segundo tipo de defecto es la mutacin Phk. Existen modelos murinos muy interesantes para la ltima categora de enfermedad neuromuscular, los cuales describiremos ms detalladamente. En el hombre, se han descripto dos enfermedades neuromusculares ligadas al cromosoma X: la distrofia muscular de Duchene (DMD) y la distrofia muscular de Becker (DMB). Ambas enfermedades han sido atribuidas a mutaciones en el enorme gen de la distrofina, una gran protena citoesqueltica localizada en el sarcolema del msculo esqueltico. El gen responsable de la DMD fue el primer gen relacionado a una enfermedad humana de gran importancia que fuera descubierto a travs de un clonaje posicional. Los mapeos comparativos y las similitudes en el fenotipo llevaron a descubrir que el homlogo de DMD en el ratn era la mutacin mdx (X-linked muscular dystrophy). En el ao 1989, Sicinski y colaboradores informaron de la presencia de una mutacin puntual del gen Dmd en los ratones mutantes mdx (ahora Dmdmdx). Varias formas allicas de este gen fueron generadas por Verne Chapman y colaboradores utilizando mutagnesis qumica (ver Captulo VII). Fundamentalmente, los pacientes con DMD y los ratones mdx/mdx presentan una necrosis extensiva de las fibras musculares esquelticas, siendo este tejido muchas veces reemplazado por tejido fibrtico y adipocitos. Sin embargo, en los ratones mdx existe un alto grado de regeneracin muscular lo que permite a los animales permanecer casi sin sntomas hasta el ao de vida. A pesar de esta diferencia, varios laboratorios han usado esta mutacin como modelo de DMD y DMB, en especial para el estudio de posibles terapias gnicas. Recientemente (1996), se ha creado un modelo murino que se acerca ms a la patologa muscular presente en DMD, especialmente por la falta de regeneracin muscular. Se trata de un doble mutante que porta mutaciones en los genes mdx y Myod (gen que codifica para un factor de transcripcin miognico).

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Existe otra distrofia muscular en humanos, en este caso autosmica, denominada distrofia miotnica (DM), la cual se caracteriza por disturbios neuromusculares que afectan el msculo esqueltico, el msculo liso en varios rganos y otros rasgos extra musculares. Luego de varios aos de mapeos y clonaje posicional, en el ao 1992 se descubri que el gen responsable de DM codificaba para una quinasa de protenas llamada DM15. La causa del fenotipo mutante en los humanos est dada por la inestabilidad de un microsatlite de ADN (motivo tri-nucletido) presente en una regin del gen no traducida a protena. Recientemente se han creado ratones KO para el gen Dm15 y los mismos manifiestan una miopata esqueltica progresiva. Adems de los modelos mencionados, existen por lo menos 10 mutaciones murinas que inducen degeneracin de neuronas motoras, entre ellas, wobbler (wr, cromosoma 11), motor neuron degeneration (mnd, cromosoma 8), wasted (wst, cromosoma 2) y progressive motor neuropathy (pmn, cromosoma 13). 9.2.1.6 Enfermedades de la piel y el pelo En la mayora de las enfermedades no infecciosas que afectan la piel y el pelo se desconoce an su fisiopatologa, y en este sentido, los modelos animales podran proveer de buenos indicios sobre las causas de dichas enfermedades. El objetivo ltimo de la investigacin dermatolgica es entender los fundamentos moleculares de estos procesos para disear nuevos mtodos de diagnstico, prevencin y terapia. En particular, las anomalas de la piel y el pelo son rasgos anatmicos muy evidentes, por lo que los animales mutantes son descubiertos rpidamente por los tcnicos del animalario2. Como resultado, existen en la actualidad ms de 100 mutaciones en el ratn que causan anormalidades morfolgicas en la piel y el pelo, de las cuales slo unas pocas tienen una base molecular definida. Existen varias mutaciones que presentan defectos en el crecimiento del pelo de las cuales se conocen las fallas bioqumicas especficas que las producen. Cuando esas fallas afectan a alguna citoquina de importancia en la biologa de la piel, el modelo toma an ms relevancia para la biomedicina. Ejemplos de esto son las mutaciones tabby (EdaTa), crinkled (Edaraddcr) y downless (Edardl) las cuales carecen de clulas productoras del factor de crecimiento EGF (ephitelial growth factor). Estos mutantes carecen de pelos en la piel de la cola y la zona posterior de las orejas, adems de la ausencia de algunas glndulas drmicas. Los defectos evidentes en los ciclos del crecimiento del pelo son potencialmente tiles para el estudio del control molecular y bioqumico de los mismos, tanto en el hombre como en los animales. Por otro lado, las enfermedades inflamatorias de la piel y los folculos pilosos, como las evidenciadas por las mutaciones flaky skin (fsn) y alopecia areata (polignica), nos proveen de nuevas herramientas para poder identificar protenas especficas de importancia en el ciclo del pelo. La mutacin waved 1 (wa1), imitada por el ratn KO para el gen Tgfa (transforming growth factor alpha), es un buen ejemplo de una mutacin que pudo ser asocia-

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El primer informe de un ratn mutante sin pelo y con piel arrugada (llamado ratn rinoceronte) data del ao 1820 en la ciudad de Londres.


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da con un defecto especfico en el pelo. Los experimentos de mapeos genticos y las cruzas de prueba determinaron que los genes mutados en ambos tipos de ratones eran en realidad un mismo locus (Tgfawa1). Las mutaciones recesivas espontneas hairless (hr) y hairless rhino (hrrh) son allicas y fueron localizadas en el cromosoma 14. Los ratones homocigotas tienen un primer ciclo de crecimiento de pelo normal pero, alrededor del da 10 de vida, empiezan a perder definitivamente el pelo. El fenotipo de rhino es una manifestacin ms severa del fenotipo hairless. En el caso de hr se trata de un defecto molecular causado por la insercin de un retrovirus (un provirus endgeno de la leucemia murina) en un intrn del gen hr (un factor de transcripcin de la familia zinc finger), lo que provoca un splicing aberrante del ARN mensajero. En el caso de rhino se trata de una substitucin de 2 pb en el exn 4 del gen, lo que resulta en un KO funcional del gen hr. Junto con la mutacin nude, la mutacin hairless es la mutacin ms estudiada dentro del grupo de mutaciones que causan prdida del pelo o alopecia y ha sido indicada como modelo de la enfermedad hereditaria humana alopecia universalis. Esta enfermedad dermatolgica que afecta a ms de dos millones de personas slo en los Estados Unidos fue asociada a una mutacin en el gen homlogo hairless. Existen muchas mutaciones que causan alopecia parcial entre las que podemos mencionar la mutacin balding, en el cromosoma 18, que afecta el gen Dsg3 (desmoglein 3) y la mutacin espontnea recesiva nackt (cromosoma13), un alelo nulo del gen Ctsl (catepsina L). Esta ltima presenta, adems de una marcada deficiencia de linfocitos T CD4+, alopecia parcial asociada a defectos en la diferenciacin de la epidermis y la morfognesis de los folculos pilosos. Utilizando estos modelos murinos, se podra estudiar la efectividad de nuevos tratamientos, an desconociendo los defectos bioqumicos exactos en el ratn. 9.2.1.7 Enfermedades hematolgicas e inmunodeficiencias Los desrdenes sanguneos forman parte de las enfermedades hereditarias humanas que primero se descubrieron, como ser la hemofilia ligada al X, las anemias por defectos en los genes de las globinas y algunas inmunodeficiencias. Para todas ellas existen modelos experimentales en el ratn, con grandes similitudes fenotpicas con la contraparte humana. Algunos de estos modelos, transgnicos o espontneos, se encuentran listados en la Tabla 9.5. Teniendo en cuenta que los tejidos hematopoyticos son de fcil acceso (aptos para aislar clulas primordiales) y sabiendo de la disponibilidad de lneas consanguneas (isognicas) de ratones, muchos laboratorios han redoblado sus esfuerzos en realizar trabajos en el rea de la terapia gnica.

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Nombre del gen Adenosine deaminase CD40 ligand Coagulation factor VIII Cytochrome b-245, beta polypeptide Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 6 Hemoglobin alpha gene cluster Hemoglobin beta gene cluster Hemoglobin beta gene cluster Lysosomal trafficking regulator Recombination activating gene-1

Smbolo Ada Cd40l F8 Cybb Tnfrsf6lpr

Modelos disponibles Ratones KO Ratones KO Ratones KO Ratones KO Mutacin espontnea lymphoproliferation y ratones KO Mutaciones inducidas y ratones KO Mutaciones inducida y ratones KO Mutaciones inducidas y ratones transgnicos Mutacin espontnea beige Ratones KO

Enfermedad humana Inmunodeficiencia combinada severa (SCID) Inmunodeficiencia con altos niveles de IgM Hemofilia A Enfermedad crnica granulomatosa Sndrome Linfoproliferativo Autoinmune Alfa Talasemia Beta Talasemia Anemia Falciforme Sndrome ChediakHigashi Inmunodeficiencia combinada severa (SCID)

Hba Hbb Hbb Lystbg Rag1

Tabla 9.5 Enfermedades inmunolgicas y hematolgicas

Anemias La anemia falciforme, enfermedad crnica que afecta principalmente a individuos con antepasados provenientes de Africa y de la cuenca del mediterrneo, fue una de las primeras enfermedades en asociarse con un defecto molecular al comprobarse que su herencia estaba ligada a una mutacin en el gen de la globina. Es interesante describir como se cre un modelo murino para esta enfermedad. Durante el desarrollo del modelo, se encontr que el ratn transgnico que co-expresaba los genes humanos de la globina y un gen mutado de la globina tena el inconveniente de no desarrollar el fenotipo anmico porque la globina endgena (murina) interfera con la polimerizacin de las dos cadenas humanas. Este problema fue resuelto introduciendo los transgenes y globina humanos en ratones que portan una mutacin (inducida qumicamente) en el gen de la globina murino. De esta manera, y con el agregado de otros transgenes humanos responsables de la anemia falciforme, se cuenta actualmente con varios modelos experimentales en el ratn, exhibiendo una gama de fenotipos que abarca desde los ms suaves a los ms severos.


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Inmunodeficiencias Los modelos murinos de inmunodeficiencia son variados y en general muestran una buena correlacin con la enfermedad humana que se quiere estudiar. Adems, estos modelos han sido muy tiles para los estudios de muchos procesos fundamentales de la respuesta inmune como ser la adhesin celular, la comunicacin entre linfocitos T y B, la presentacin de las molculas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH), la transduccin de seales por tirosina quinasa etc. En muchos casos, la identificacin de un gen mutado en una enfermedad humana fue seguida de la creacin de un ratn KO para ese gen. La cantidad de ratones transgnicos y KO generados a partir de genes relacionados al sistema inmune es enorme y presentarlos excede el propsito de este captulo, por lo tanto slo comentaremos algunas mutaciones clsicas. Muchas mutaciones clsicas (espontneas) sirvieron como punto de partida para el descubrimiento de genes implicados en enfermedades humanas. Este es el caso de beige (bg), una mutacin espontnea localizada en el cromosoma 13 del ratn que fue descripta en el ao 1963 como una alteracin del color del pelaje. Los animales homocigotas bg/bg poseen un pelaje ms claro y una inmunodeficiencia homloga al sndrome de Chdiak-Higashi (CSH) en humanos. Fundamentalmente, ambos presentan una actividad reducida de las clulas NK (asociada a defectos en el funcionamiento de los lisosomas), sangrados anormales e inmunodeficiencia. El gen responsable ya fue aislado por clonaje posicional en los ratones beige y se llama Lyst (lysosomal trafficking regulator). Posteriormente, se comprob que el gen homlogo LYST se encuentra mutado en los pacientes afectados de CHS. Otra mutacin clsica del ratn de laboratorio con fenotipo inmunodeficiente es la mutacin nude (nu). La misma mutacin surgi en dos eventos aislados, la primera vez en 1966 en una colonia exocriada y la segunda en la lnea AKR/J en 1976 (streaker), ambas son allicas y mapean en el cromosoma 11. Tambin encontramos la misma mutacin en la rata: se trata de las mutaciones Rowett nude (rnuN) y New Zealand nude (nznu). En el ratn, es una de las mutaciones recesivas ms difundida comercialmente y se encuentra disponible en varios fondos consanguneos y no consanguneos, siendo tambin conocidos como ratones atmicos. Debido a la ausencia de rechazo de injertos, estos animales han sido de gran utilidad en los transplantes de tumores xenogeneicos (especialmente de origen humano) y alogeneicos. Los dos defectos ms notorios en los ratones homocigotas son la falla en el crecimiento del pelo y la disgnesis del epitelio tmico debido a una mutacin puntual en el gen winged helix, una protena de pegado (del ingls binding) al ADN, cuyos transcriptos se expresan solamente en la piel y en el timo. Los ratones nu/nu poseen un timo rudimentario que permanece pequeo y qustico durante toda la vida, lo que lleva a una reduccin severa en el nmero de clulas T funcionales por fallas en la maduracin. Su uso como modelo de enfermedad humana est muy limitado y slo se encontraron semejanzas con un grupo de enfermedades asociadas a defectos en el compartimento epitelial del timo (displasia tmica). La nueva nomenclatura para esta familia de factores de transcripcin establece que el nombre correcto del gen es Foxn1, por lo tanto la mutacin nude debe anotarse como Foxn1nu.

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La mutacin scid (severe combined immunodeficiency) es autosmica recesiva y apareci espontneamente en el ao 1980 en el Fox Chase Cancer Center de Filadelfia (Estados Unidos) en una lnea congnica de BALB/c. El locus scid pudo ser mapeado en el ao 1989 en el cromosoma 16 y actualmente se ha identificado al gen responsable. Se trata de un gen de reparacin del ADN llamado Prkdc (protein kinase, DNA activated, catalytic polypeptide) cuya disfuncin produce la falta de recombinacin somtica en los genes V(D)J de las inmunoglobulinas y los receptores TCR de los linfocitos T, lo que bloquea la diferenciacin temprana de los linfocitos B y T. Los ratones homocigotas scid/scid (ratones SCID), cuya apariencia externa es normal, poseen niveles muy bajos, o directamente carecen de inmunoglobulinas en suero. Los ganglios linfticos, el bazo y el timo son anormalmente pequeos, presentando este ltimo una mdula rudimentaria y ausencia de corteza. Todos estos rganos carecen adems de linfocitos y clulas plasmticas. La ausencia de clulas T y B maduras explica la incapacidad de estos animales de generar una respuesta inmune, tanto humoral como celular. No obstante, la mutacin parece no afectar las lneas mieloides y eritroides y los ratones presentan niveles de actividad NK normales. Al igual que en otras inmunodeficiencias, los animales afectados pueden recuperarse con transplantes de mdula sea singeneica o con repoblacin celular. De estos ensayos surgi el modelo ms interesante de esta mutacin: la repoblacin de los ratones SCID con clulas inmunes humanas. A partir de clulas hematopoyticas fetales de hgado, timo y ganglio en un caso y de clulas de sangre perifrica adulta en otro, en el ao 1988 se logr reconstruir un sistema inmunolgico humano en el ratn, crendose el denominado ratn SCID-hu. Este modelo presenta, entre otras caractersticas, linfocitos humanos CD4+ y CD8+ e inclusive inmunoglobulinas humanas (Ig G) en sangre perifrica. El hecho de que estos ratones fueran muy susceptibles a la infeccin por HIV-1 posibilit mltiples estudios sobre SIDA experimental. Otros campos de aplicacin de los ratones SCID son los transplantes de tumores humanos (con un porcentaje de xito superior al ratn nude) y los estudios referentes a la inmunodeficiencia combinada severa en nios. La mutacin xid (X linked immune deficiency) est ligada al cromosoma X y apareci en la lnea CBA en 1972. Las hembras homocigotas y los machos hemicigotas se ven impedidos de generar respuestas a antgenos timo-independientes como los lipopolisacridos y el dextrn. Estos animales presentan tambin bajos niveles de inmunoglobulinas circulantes junto a un nmero de clulas B reducido a menos de la mitad de los valores normales. Como la funcin T es normal, tambin lo son la citotoxicidad, el rechazo de injertos y la hipersensibilidad retardada. El gen afectado se denomina Bruton agammaglobulinemia tyrosine kinase (Btk), una enzima esencial para el desarrollo de los linfocitos B, por lo tanto la nomenclatura correcta de la mutacin es Btkxid. Muchas de estas mutaciones con fenotipo inmunolgico han sido puestas juntas en un mismo fondo gentico formando dobles y hasta triples mutantes. Algunos ejemplos son las lneas especiales desarrolladas por el Veterinary Resources Program de los Institutos Nacionales de la Salud de los Estados Unidos (NIH). Ente ellas podemos citar los ratones N:NIH-bg-xid, con defectos en clulas NK y linfocitos B; los ratones N:NIH-nu-xid, los cuales carecen de linfocitos T y B; y el triple mutante N:NIH-bg-nu-xid (ratn BNX), que carece de clulas NK, linfocitos T y B.


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Fenmenos autoinmunes y linfoproliferativos Muchas enfermedades humanas, como la diabetes, el lupus, la artritis y la glomerulonefritis poseen un componente autoinmune. Existen dos mutaciones espontneas del ratn que han sido esenciales en el descubrimiento del rol de la apoptosis en el mantenimiento de la autotolerancia dentro del sistema inmune. Estas son las mutaciones lymphoproliferation (lpr) y generalized lymphadenopathy (gld). Son dos mutaciones autosmicas recesivas surgidas independientemente en las lneas MRL/Mp y C3H/HeJ, respectivamente, y ambas coinciden en su fenotipo semejante a procesos autoinmunes en humanos. En su corta vida, estos ratones desarrollan agrandamiento masivo de ganglios linfticos, esplenomegalia pronunciada, desarrollo de glomerulonefritis por complejos inmunes, poliarteritis degenerativa y lesiones articulares que se asemejan a la artritis reumatoidea. A nivel serolgico, en los animales lpr/lpr se detecta un nivel de globulinas cinco veces mayor al normal con presencia de anticuerpos antinucleares. La causa molecular de la mutacin lpr es un defecto en el gen Fas, ahora llamado Tnfrsf6 (tumor necrosis factor receptor superfamily, member 6), gen que codifica para un antgeno perteneciente a la familia de los receptores de TNF (del ingls tumor necrosis factor), mediador de la apoptosis. Recientemente se identificaron mutaciones en el gen homlogo humano FAS en pacientes con sndrome linfoproliferativo autoinmune. Por otro lado, se comprob que la mutacin gld involucra al gen Fasl, que codifica para el ligando del antgeno Fas. Como sucede con muchas enfermedades hereditarias y mutaciones murinas, los genes modificadores (segn el fondo gentico) juegan un papel muy importante en el desarrollo de los fenotipos descriptos. El grupo de ratones NZM (New Zealand mixed) ha sido propuesto como modelo de Lupus Eritematoso Sistmico (LES), enfermedad autoimmune que cursa con produccin de auto-anticuerpos contra el ADN de doble cadena y depsito de complejos inmunes en tejidos blanco como el rin, la piel, y el cerebro. Se sabe que la gentica de esta enfermedad es compleja y que adems los factores ambientales influyen en su induccin y agravamiento. Los ratones NZM fueron derivados de cruzas entre las lneas consanguneas NZB y NZW, las lneas progenitoras del modelo clsico de LES que usaba hembras (NZB x NZW)F1. Estas lneas recombinantes consanguneas son llamadas en su conjunto lneas NZM y fueron usadas para localizar varios loci de susceptibilidad al desarrollo de LES. 9.2.1.8 Enfermedades metablicas En la Tabla 9.6 se describen mutaciones en varios genes murinos que sirven como modelo experimental en enfermedades metablicas y hormonales. Entre ellos, hay tres modelos (HexA, Hprt y Uox) que ilustran muy bien el hecho de que el ratn y el hombre, si bien son muy parecidos para muchas vas metablicas, presentan a veces diferencias importantes.

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Nombre del gen Apolipoprotein B Apopolipoprotein E Cystic Fibrosis transmembrane conductance regulator homolog Ferrochelatase

Smbolo Apob Apoe Cftr

Modelos disponibles Ratones transgnicos y KO Ratones transgnicos y KO Ratones KO

Enfermedad humana Hipolipoproteinemia Hiperlipoproteinemia tipo III Fibrosis Qustica

FechmlPas

Mutacin inducida ferrochelatase deficiency, mutation 1 Ratones KO Ratones KO Ratones KO

Porfiria Eritropoytica

Hexokinase A Hexokinase B Hypoxanthine guanine phophoribosyl transferase

Hexa Hexb Hprt

Enfermedad de Tay-Sachs Enfermedad de Sandhoff Sndrome de Lesch-Nyhan

Tabla 9.6 Enfermedades metablicas y hormonales

Desrdenes en el metabolismo de la purina Los nucletidos pricos (purinas) son reciclados a partir de las bases pricas por la accin de dos enzimas: APRT (adenine phosphoribosyl transferase) y HPRT (hypoxantine guanine phosphoribosyl transferase). Ante la ausencia de APRT la adenina es convertida en un producto insoluble que se deposita en los riones formando clculos y, a la larga, generando deficiencia renal. La deficiencia de HPRT en humanos causa el sndrome de Lesch-Nyhan, una enfermedad ligada al cromosoma X caracterizada por retardo mental y automutilacin compulsiva. Recientemente, se crearon ratones KO para estos genes. El ratn KO del gen Aprt exhibe un fenotipo idntico al de la deficiencia humana pero, contrariamente, los ratones KO para el gen Hprt no ostentan ninguna patologa. Existen dos explicaciones para este fenmeno: una es que en el ratn, a diferencia del hombre, el gen Aprt es ms importante que el Hprt para el reciclado de las purinas, la otra explicacin es que el cido rico no se acumulara gracias a la actividad de la enzima urato oxidasa (UOX), enzima no funcional en los humanos. Coincidiendo con esta teora, los ratones KO para el gen Uox presentan nefropatas que se asemejan al desorden humano. Fibrosis Qustica (FQ) La fibrosis qustica es la enfermedad hereditaria letal ms comn entre la gente de raza caucsica y se caracteriza por un transporte defectuoso de los iones de cloro a travs de las membranas y por una produccin excesiva de moco por parte de las clulas epiteliales. A pesar de que la causa de mortalidad de los pacientes con FQ es, fundamentalmente, la presencia de infecciones pulmonares, otras afecciones como las obstrucciones pulmonares, la infla-


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macin del pncreas, del conducto biliar y los vasos deferentes son tambin parte de la sintomatologa. El gen responsable de esta enfermedad (CFTR, cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) se aisl en 1989 y desde ese momento han sido descriptas una gran cantidad de mutaciones en los pacientes afectados. El primer modelo de FQ fue creado apenas tres aos despus de la identificacin del gen humano. Hoy en da existen 11 modelos diferentes en el ratn, algunos con la disrupcin total del gen (alelos nulos) y otros con cambios especficos que imitan las mutaciones halladas en la clnica humana. En algunos casos, los ratones mantienen bajos niveles del ARNm normal para el gen Cftr, concomitantemente con las formas mutadas. Las variaciones fenotpicas descriptas debido a los distintos fondos genticos, las diferentes mutaciones del gen Cftr y las influencias ambientales sern muy importantes a la hora de definir las bases de la enfermedad. Los ratones homocigotas nulos (KO) para el gen Cftr tienen una alta mortalidad neonatal como resultado de obstrucciones intestinales, sntoma que ocurre slo en una minora de los pacientes con FQ. Aparentemente, los defectos intestinales hacen que estos ratones vivan poco tiempo y por lo tanto la enfermedad pulmonar no llega a manifestarse (seguramente debido a la presencia de genes modificadores). Por otro lado, una variante de ratn transgnico en el cual se permite una expresin residual del gen Cftr ha permitido alargar la vida de los ratones y lograr un modelo experimental que se acerca ms al humano, incluida la enfermedad pulmonar. Arteriosclerosis Las enfermedades cardiovasculares que genera la arteriosclerosis son una de las principales causa de muerte en todo el mundo. La patognesis de la arteriosclerosis es compleja e incluye una combinacin de factores ambientales y genticos. Entre los primeros se encuentran la dieta y el nivel de lpidos en la sangre. La hipercolesterolemia familiar fue una de las primeras enfermedades genticas relacionadas al metabolismo del colesterol y comprende mutaciones en el receptor de la lipoprotena de baja densidad (LDLR). Otro factor de riesgo para la arteriosclerosis es la hiperlipoproteinemia tipo III asociada a diferentes formas allicas del gen APOE. Entre los modelos murinos de esta enfermedad encontramos los ratones KO para los genes Apoe y Ldlr. El primero desarrolla hipercolesterolemia y lesiones arteriosclerticas a temprana edad, inclusive si se los alimenta con dietas de bajo contenido graso; los ratones Ldlr / presentan un fenotipo similar pero bastante ms atenuado. Estos dos modelos murinos son muy tiles para el estudio de los mecanismos del desarrollo de las lesiones arteriosclerticas y tambin para el ensayo de posibles terapias gnicas. De todas formas, se sugiri que la arteriosclerosis en el ratn estara afectada por otros genes involucrados en el metabolismo de los lpidos.

9.2.2 Modelos murinos de enfermedades hereditarias complejas (multignicas) 9.2.2.1 Cncer A principios del siglo XX, cuando se comenz a experimentar con las primeras lneas consanguneas de ratones, se demostr claramente que la susceptibilidad a ciertos tipos de cncer se

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comportaba como un rasgo hereditario y que tena una gran influencia de parte del fondo gentico de los ratones estudiados. Posteriormente se descubri que, efectivamente, la susceptibilidad al cncer era tambin un rasgo hereditario en los humanos y que existan cnceres familiares en los cuales los individuos afectados desarrollaban un espectro definido de tumores. Hoy sabemos que muchos de esos cnceres familiares estn representados por mutaciones germinales en genes supresores de tumores, genes de reparacin del ADN y oncogenes, muchas veces acompaado por fenmenos de inestabilidad genmica. Es importante aclarar que el cncer familiar es slo una parte mnima de los casos de cncer en humanos, siendo la mayora espontneos o no hereditarios. En este ltimo caso las causas genticas son muy diversas, incluyendo interacciones complejas entre muchos genes, y los fenmenos de carcinognesis se presentan en pasos mltiples. Existe un abanico enorme de modelos murinos para el estudio experimental del cncer, abarcando distintas lneas consanguneas, mutaciones espontneas, ratones transgnicos y KO. Las ventajas ms importantes que ofrecen estos modelos, en contraposicin a las lneas celulares tumorales (humanas), son (i) la posibilidad de estudiar el efecto de las mutaciones que predisponen al cncer en un fondo gentico uniforme y (ii) la posibilidad de llevar a cabo todo tipo de estudios bsicos y ensayos teraputicos in vivo. La tecnologa transgnica ha sido de particular importancia para el estudio de la expresin de oncogenes en animales, especialmente para evaluar aquellos procesos que no pueden ser abordados desde los cultivos celulares, como ser el espectro de tejidos susceptible a la actividad transformante del oncogn o sus efectos sobre el crecimiento y la diferenciacin de tejidos. Por ejemplo, cuando se usan diferentes promotores para dirigir la expresin de los oncogenes Myc o Hras1 en diversos tejidos, en la mayora de los casos el resultado es el crecimiento tumoral. Sin embargo, muchos tejidos que expresan el oncogn nunca desarrollan tumores. Diversos laboratorios han demostrado que la expresin alterada del oncogn Myc predispone fuertemente a las clulas a la transformacin maligna. Cuando Myc es ligado al promotor del virus de tumor mamario murino (MMTV) causa cncer de mama, pero cuando es unido a la regin estimuladora (enhancer) de la cadena pesada de inmunoglobulinas, la malignidad observada es de origen linfoide. Por lo tanto, la regulacin alterada del Myc aumenta notablemente la posibilidad de crecimiento tumoral sin ser necesaria la mutacin del gen. Muchos de los ratones transgnicos que portan oncogenes han sido centro de grandes controversias en la comunidad cientfica. Este es el caso del OncoMouseTM (o ratn TG.AC, que porta el gen v-Ha-ras), quien fuera la primera patente autorizada sobre un animal transgnico dada a la Universidad de Harvard en 1988. La licencia sobre su comercializacin fue otorgada a la empresa DuPont pero, a partir del ao 2000, los Institutos Nacionales de la Salud de Estados Unidos (NIH) lograron un acuerdo para que puedan acceder a estos ratones (sin pagar los derechos de autor) todos los investigadores que trabajan en organismos acadmicos sin fines de lucro. Otra posibilidad es la creacin de ratones nulos para genes supresores de tumores como Trp53 (p53), Nf1 y Rb. En el ltimo caso, la delecin de las dos copias del gen no lleva a la aparicin de retinoblastomas (como ocurre en los humanos). Esto slo sucede si se anula otro gen llamado Rbl1 (p107); lo que demuestra una vez ms las diferencias entre los mecanismos oncognicos entre ratones y humanos. Una alternativa interesante a los ratones KO


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para genes supresores de tumores es el uso de las tcnicas de knock in para introducir formas mutantes de estos genes, como ha sido realizado con una serie de alelos del gen supresor de tumores Brca1. Como los ratones homocigotas KO (Brca1/) mueren in utero (entre los das embrionarios 9 y 14), la utilizacin del sistema Cre/loxP fue esencial para crear un modelo especfico de tumorigenesis mamaria. Finalmente, la introduccin de genes virales en ratones transgnicos es un modelo ideal para el estudio del poder oncognico de estos virus. Quizs el ejemplo ms notable sea el experimento en el cual se introdujeron en un ratn genes del HTLV-1 (del ingls human T-lymphotrophic virus) cuyas infecciones son asociadas con leucemias de clulas T. Cuando el gen tat del HTLV-1 fue introducido en el ratn, su poder oncognico qued demostrado por la formacin de mltiples tumores mesenquimatosos. En la Tabla 9.7 podemos observar las mutaciones y los ratones transgnicos ms importantes para el estudio del cncer familiar.Nombre del gen Adenomatosis polyposis coli Breast cancer 1 MutL (E. coli) homolog 1 Smbolo ApcMin Modelos disponibles Mutacin inducida multiple intestinal neoplasia y ratones KO Ratones KO (incluido condicionales) Ratones KO Enfermedad humana Poliposis familiar

Brca1 Mlh1

Cncer de mama tipo 1 Cncer del colon no relacionado con poliposis (HNPCC) tipo 2 Cncer del colon no relacionado con poliposis (HNPCC) tipo 1 Neurofibromatosis tipo1 Retinoblastoma familiar Sndrome de Li-Fraumeni Tumor de Wilm; Sndrome de Denys-Drash

MutS (E. coli) homolog 2

Msh2

Ratones KO

Neurofibromatosis Retinoblastoma 1 Transformation-related protein 53 Wilms tumor homolog

Nfl Rb1 Trp53 Wt1

Ratones KO Ratones KO Ratones transgnicos y KO (incluido condicionales) Ratones KO

Tabla 9.7 Cncer hereditario

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Cncer colorectal En el ao 1993 se publicaron una serie de artculos que revolucionaron la visin que se tena sobre el cncer hereditario. Estos estudios demostraron, por primera vez, que los genes de reparacin del ADN (aislados originalmente de levaduras) jugaban un papel crucial en el cncer de colon familiar. Brevemente, la predisposicin gentica a desarrollar este tipo de cncer resulta de mutaciones germinales en los genes de reparacin del ADN. Por ejemplo, los individuos heterocigotas para una mutacin en el gen MSH2 (MutS homolog 2 homlogo del gen de la levadura MutS) desarrollan cncer de colon familiar no relacionado con poliposis tipo 1. Se ha comprobado que este tipo de mutaciones provoca inestabilidad genmica generalizada y que la misma puede medirse por la presencia de cambios en el tamao de los microsatlites de ADN (ver Captulo VI), fenmeno denominado inestabilidad de los microsatlites MSI (microsatellite instability). De la misma forma, otras mutaciones de genes de reparacin del ADN, el MLH1 (MutL homolog 1 homlogo del gen de la levadura MutL) y el PMS2 (postmeiotic segregation increased 2), son responsables del cncer de colon familiar no-poliposo tipo 2 y 3, respectivamente. Efectivamente, los ratones deficientes para los genes Msh2 y Pms2 son viables y frtiles, pero, a partir de los dos meses de vida, empiezan a desarrollar linfomas y sarcomas que muestran MSI como indicio de que existen fallas en el sistema de reparacin del ADN. Otro ejemplo de cncer intestinal hereditario es la adenomatosis poliposa del colon, en el cual el gen mutado es un gen supresor de tumores denominado APC (adenomatous polyposis coli). En el ratn, existe una mutacin, que fue inducida qumicamente con ENU, que afecta al gen homlogo murino Apc. Se trata de la mutacin dominante multiple intestinal neoplasia (Min), ahora ApcMin, cuyos portadores desarrollan adenomas y adenocarcinomas intestinales. Tambin se han desarrollado ratones KO para el gen Apc, algunos muy interesantes por ser viables al estado homocigota, como la mutacin ApcTm1638T. El nmero de adenomas intestinales depende enormemente de un gen modificador denominado Mom1 (modifier of Min) presente en varias lneas consanguneas. Todas las lneas con alto nmero de tumores (por ejemplo C57BL/6J) expresan bajos niveles del alelo resistente. Una mutacin de marco del gen Pla2g2a (phospholipase A2, group IIA) es el alelo responsable de la resistencia, ahora Pla2g2aMom1-r. Tambin se identific un alelo del mismo gen que confiere susceptibilidad (Pla2g2aMom1-s). Sndrome de Li-Fraumeni Esta rara enfermedad, del tipo autosmica recesiva, es uno de los cnceres familiares mejor estudiados. Los pacientes afectados desarrollan una serie de tumores, entre los que se encuentran carcinomas de mama y de cerebro, osteosarcomas y leucemias, entre otros. La mutacin germinal asociada a este sndrome afecta al gen supresor de tumores TRP53 (cromosoma17q), ms conocido como p53. Este gen supresor de tumores es adems uno de los genes ms afectados en las formas espordicas (no familiares) de muchos tipos de cncer, hallndose mutaciones espontneas en la mitad de todos los tumores primarios. Como en el caso de los pacientes afectados por el sndrome de Li-Fraumeni, los ratones heterocigotas para un alelo nulo del gen Trp53 (cromosoma11) desarrollan tumores, pero con un perodo de latencia mucho ms largo que los ratones homocigotas. Es interesante resaltar que, dependiendo del


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fondo gentico de la lnea, se desarrollan distintos tipos de tumores. Esta caracterstica es muy til para poder aislar posibles genes modificadores de la incidencia tumoral. 9.2.2.2 Obesidad y diabetes La mutacin espontnea obese (ob, cromosoma 6) fue descripta en The Jackson Laboratory en el ao 1949 en la lnea C57BL/6. La identificacin del gen responsable, Lep (leptin), una hormona que regula el control del peso, fue lograda hace algunos aos y es un ejemplo clsico de clonaje posicional. La presencia del gen mutado produce una marcada obesidad asociada con hiperfagia e hiperinsulinemia. La ganancia de peso en los ratones Lepob/Lepob puede alcanzar dos a tres veces los valores de un ratn normal y muchas de las perturbaciones inmunolgicas presentes podran ser secundarias al desbalance metablico de estos animales. Las anomalas observadas son una reduccin en la masa de los rganos linfticos y una disminucin en el nmero de linfocitos y monocitos circulantes con respecto a los valores normales. La inmunidad mediada por clulas T se ve comprometida con la edad, lo que se refleja en la dificultad de generar respuestas de hipersensibilidad retardada y en rechazar aloinjertos. Los estudios sobre obesidad en los ratones ob fueron complementados con estudios similares en otra mutacin clsica del ratn de laboratorio que imita el fenotipo de los ratones obesos: la mutacin diabetes (db) en el cromosoma 4. Existen varias mutaciones independientes de esta mutacin, aparecidas espontneamente en The Jackson Laboratory y en el Institut Pasteur en Pars. Finalmente se descubri que se trataba del gen que codificaba para el receptor de la leptina (Leprdb). Vale la pena mencionar que estas dos mutaciones son otro ejemplo del efecto del fondo gentico sobre el fenotipo. Ambas mutaciones causan obesidad y diabetes leve en fondo C57BL/6J pero la diabetes es muy severa cuando el fondo es C57BLKS/J. Las mutaciones obese y diabetes son modelos de la diabetes tipo II (no dependiente de insulina). Otros modelos de obesidad y diabetes tipo II lo constituyen las lneas consanguneas KK (algunas sublneas portan el gen de obesidad yellow, Ay), PBB y NZO. La diabetes mellitus dependiente de la insulina (diabetes tipo I), cuya sigla en ingls es IDDM, se desarrolla en un escenario en el cual el ambiente y los factores genticos juegan un papel preponderante. En esta afeccin autoinmune, el sistema inmune del individuo infiltra el pncreas y destruye las clulas productoras de la insulina (clula de los islotes de Langerhans). Existe una lnea consangunea de ratones llamada NOD (non obese diabetes) que desarrolla en forma espontnea una patologa muy similar a la diabetes tipo I humana. Uno de los loci involucrados en esta susceptibilidad es el locus Idd1, ubicado en el CMH. Por intermedio del uso de cruzas experimentales con lneas resistentes a la diabetes (como C57BL/6 y NON), se pudo identificar otros loci de susceptibilidad a la diabetes (no ligados al CMH), llamados Idd2Idd15. Para que se desarrollen los sntomas diabticos, deben estar presentes varios alelos susceptibles de los loci mencionados, ya que estos alelos se comportan en forma aditiva. Actualmente, gracias al desarrollo de lneas congnicas portando regiones cromosmicas de lneas susceptibles, se est trabajando en la identificacin de los genes de susceptibilidad. Para ms informacin sobre modelos de diabetes tipo I, consultar el Type 1 Diabetes Repository (http://www.jax.org/t1dr/).

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9.3 Otros roedores utilizados como modelo experimentalSi bien las mutaciones del ratn de laboratorio son las ms utilizadas como modelo de enfermedades humanas, consideramos importante mencionar brevemente otros roedores usados como modelo en medicina experimental. La rata es utilizada como animal de experimentacin en la investigacin biomdica especialmente en cuatro reas: inmunogentica de transplantes, enfermedades cardiovasculares, comportamiento y carcinognesis. En este ltimo caso, existen dos lneas consanguneas de rata que han sido muy importantes en los estudios genticos en cncer mamario. Las lneas WKY (Wistar Kyoto) y COP (Copenhague) son resistentes al desarrollo de neoplasias mamarias luego de la administracin experimental del carcingeno qumico DMBA (7-12 Dimetil Benzantraceno). Contrariamente, la lnea WF (Wistar Furth) es suscpetible al DMBA y desarrolla carcinoma de mama. Utilizando retrocruzas entre estas lneas consanguneas, se pudo identificar varios loci de resistencia y susceptibilidad al cncer de mama inducido por DMBA. Otro modelo gentico de rata usado en cncer experimental es la rata Eker. Este modelo presenta un carcinoma renal hereditario que est ligado a una mutacin dominante en el gen Tsc2 (tuberous sclerosis 2) y es por lo tanto un modelo importante de cncer hereditario. El descubrimiento de mutaciones espontneas con patologas similares a enfermedades humanas es tambin una situacin frecuente en los animalarios que cran ratas. Se han descripto por lo menos 100 mutaciones espontneas entre las cuales existen varias con fenotipos homlogos a las mutaciones murinas. La rata nude constituye un ejemplo de rata inmunodeficiente que goza de una popularidad medianamente extendida. La primera mutacin recesiva, Rowett nude (rnu), apareci en forma espontnea en el Rowett Research Institute, Aberdeen, Escocia, en 1953. Aos ms tarde, en Victoria University, Wellington, Nueva Zelandia, ocurri, en forma independiente, la mutacin rnunz (o rnuN). Ambas mutaciones son allicas y afectan el gen homlogo de la mutacin nude del ratn (factor de transcripcin Foxn1). El fenotipo tambin es similar, con defectos en el crecimiento del pelo y ausencia de timo; esto ltimo es la causa de la falta de linfocitos T maduros y la consiguiente inmunodeficiencia. Actualmente, la mutacin rnu se encuentra en varias lneas congnicas, entre ellas CBH-rnu; DA-rnu; F344-rnu; LEW-rnu; LOU-rnu; y WAG-rnu. Dentro de los modelos inmunolgicos, existen varios modelos de autoinmunidad en la rata que se encuentran disponibles en el NIH Autoimmune Rat Model Repository and Development Center (http://www.ors.od.nih.gov/dirs/vrp/ratcenter/f_project.html). La realizacin de ratas KO por medio de mutagnesis dirigida no es posible an debido a que, como se vio, las tcnicas de cultivos de clulas ES son, por el momento, slo factibles en el ratn. En cambio, la tcnica de microinyeccin directa de ADN en el proncleo de huevos fertilizados es tambin utilizada en la rata y ha permitido el desarrollo de lneas transgnicas que son usadas en diversas reas de la biomedicina experimental. Gracias a la disponibilidad de lneas consanguneas, mutantes, y en menor medida, transgnicas, las ratas de laboratorio representan tambin una fuente interesante de modelos de enfermedades humanas, en particular las conocidas como enfermedades complejas o multignicas (ver Rat Resource and Rese-


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arch Center http://www.radil.missouri.edu/rrrc/). Las ratas han contribuido histricamente al entendimiento de tres de estas enfermedades (en forma asociada): la obesidad, la diabetes y la hipertensin.

9.3.1 La rata como modelo de diabetes dependiente de insulina (diabetes tipo I). La lnea BB (Bio-Breeding) fue desarrollada a partir de una colonia de ratas Wistar que presentaba diabetes mellitus espontnea en los laboratorios Bio-Breeding, Ontario, Canad (1974). A partir de este grupo de ratas exocriadas se desarrollaron dos lneas consanguneas, una propensa a la diabetes (BBDP, diabetes-prone) y la otra resistente (BBDR, diabetes-resistant). La lnea diabtica presenta sntomas de diabetes dependiente de insulina y cetosis entre los 60 y 120 das de edad, con fenmenos autoinmunes que destruyen las clulas del pncreas. En forma paralela, estas ratas muestran linfopenia, tiroiditis linfoctica y, en algunos casos, lceras gstricas y falla renal. La diabetes autoinmune presente en la lnea BBDP es un rasgo polignico y hasta el momento se han identificado algunos loci ligados al CMH y otros fuera del mismo. La lnea consangunea LETL (Long Evans Tokushima Lean) fue desarrollada en Japn a partir de ratas exocriadas Long Evans y alcanz las 20 generaciones de endocra en 1989. Estas ratas comienzan a mostrar sntomas de diabetes (con niveles muy elevados de glucemia) a las 15 semanas de vida y, si no se les administra insulina, mueren en muy corto plazo (alrededor de 30 das). Por lo tanto, son un buen modelo de diabetes tipo I, con la ventaja sobre otras lneas de rata (como la BBDP), de no presentar linfopenia asociada. Los mismos investigadores desarrollaron una sublnea de LETL con alta tendencia a presentar diabetes, denominada Komeda Diabetes Prone (KDP). El 100% de las ratas pertenecientes a esta sublnea desarrolla insulitis (reaccin inflamatoria alrededor de la clulas del pncreas) en forma espontnea antes de los 220 das de edad. La lnea LETO (Long Evans Tokushima Otsuka) fue desarrollada paralelamente a partir del mismo grupo parental (Long Evans) para ser utilizada como control (ratas no diabticas).

9.3.2 La rata como modelo de obesidad y diabetes tipo II En la rata, las dos mutaciones recesivas ms populares que causan obesidad asociada con diabetes son fatty (fa) y corpulent (cp), esta ltima luego conocida como fak, ya que se descubri que era un alelo de fa. Ambas son espontneas, aparecieron en grupos de ratas exocriadas, y fueron introducidas en fondos consanguneos por retrocruza. La mutacin fa fue descubierta por L.M. Zucker y T.F. Zucker a principios de la dcada de 1960 y fue mantenida en un grupo de ratas exocriadas bautizadas como ratas Zucker. La lnea consangunea ZDF fue establecida en 1985 a partir de esas ratas Zucker fatty (fa/fa). La obesidad comienza a manifestarse a las tres a cinco semanas de vida y cursa con hipertrofia e hiperplasia de adipocitos, hiperlipemia,

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hipercolesterolemia e hiperinsulinemia. Las ratas corpulentas, o ratas Koletsky (fak/fak), aparecieron a fines de 1960 en el laboratorio del Dr. Simon Koletsky en Estados Unidos. La mutacin fak tiene un fenotipo variable segn el fondo gentico en la que se encuentre. Por ejemplo, la lnea congnica LA-fak no desarrolla diabetes, pero s obesidad; la lnea congnica SHR/N-fak (con hipertensin espontnea) es un buen modelo para el estudio de las complicaciones de la obesidad asociada con diabetes tipo II. Hoy en da se sabe que las mutaciones fa y fak son alelos nulos (knock-out naturales) del gen Lepr (leptin receptor); el mismo gen (homlogo) que se encuentra afectado en la mutacin murina diabetes (Leprdb). Estas ratas son fundamentalmente un modelo de la obesidad gentica (en particular, la obesidad hipertrfica temprana) y en segundo lugar de la diabetes tipo II (al igual que las mutaciones murinas ob y db). Este tipo de diabetes asociado a obesidad e hipertensin constituye ms del 80% de los casos de diabetes en los humanos. La lnea consangunea OLETF (Otsuka Long Evans Tokushima Fatty) constituye otro modelo de diabetes tipo II asociada a obesidad en la rata de laboratorio. Esta lnea fue desarrollada por cruzas con seleccin a partir de un grupo de ratas exocriadas Long-Evans por Kazuya Kawano y colaboradores (1992) y se mantiene actualmente en el Tokushima Research Institute, Otsuka Pharmaceutical, Tokushima, Japn (http://ratmap.ims.u-tokyo.ac.jp/). Los principales rasgos fenotpicos de la lnea son hiperinsulinemia, hiperglucemia, resistencia a la insulina, hipertriglicemia y obesidad moderada. Estos sntomas se presentan en forma tarda y principalmente en machos, con una incidencia del 100% a las 25 semanas de vida. Una vez ms, la diabetes en esta lnea es un carcter polignico y ya se han identificado varios loci (QTLs) implicados en el desarrollo de la enfermedad.

9.3.3 La rata como modelo de hipertensin y obesidad La lnea consangunea de ratas SHR (spontaneous hypertensive rat) es sin dudas la ms popular como modelo de hipertensin espontnea y enfermedad cardiovascular. La lnea SHR fue desarrollada en la dcada de 1960 en Japn (Kyoto University) a partir de un grupo de ratas exocriadas Wistar, aplicando seleccin para animales de alta presin (presin sistlica mayor a 150 mm Hg.). En forma similar a lo que se observa en los humanos, los machos de la lnea SHR desarrollan la enfermedad en forma ms severa y prematura y por lo tanto son el modelo de eleccin. Adems de ser utilizada como modelo experimental, la lnea SHR ha sido utilizada por ms de 30 aos para probar nuevos medicamentos que bajen la presin sangunea. La lnea WKY es comnmente usada como control normal (presin normal) de SHR, aunque su uso est cuestionado por las diferencias genticas entre estas lneas. La lnea consangunea SHRSP (SHR stroke prone) fue desarrollada como una sublnea de la lnea SHR con presin sangunea muy alta (ms de 250 mm Hg.) y tendencia a los accidentes cerebro vasculares. Las ratas SHRSP viven apenas un ao, mientras que los animales de la lnea SHR viven dos aos y las ratas WKY llegan a los tres aos de vida. Si bien estas lneas consanguneas de rata son modelos extendidos para la hipertensin, las mismas tienen algunas diferencias con la enfermedad en los humanos. Por ejemplo, la arteriosclerosis es muy comn entre los pacientes hi-


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pertensos pero no se observa en estas lneas de ratas; adems, la edad relativa de aparicin de la hipertensin es mucho ms temprana en las ratas SHR. La lnea SHROB es un interesante modelo de hipertensin espontnea asociada a obesidad. La lnea es el resultado de la cruza de hembras obesas (ratas Koletsky mutantes fak/fak), con ratas hipertensas de la lnea SHR. Estas ratas presentan hipertensin, hiperlipemia, hiperinsulinemia y fallas renales; por estos sntomas, son un buen modelo de la afeccin humana conocida como sndrome X (o sndrome metablico). En forma paralela, se realiz la retrocruza de ratas Koletsky con ratas SHR/N, seguido de endocra con seleccin para la mutacin fak, lo que gener la nueva lnea consangunea SHHF (parcialmente congnica). Estas ratas son modelo de hipertensin, obesidad, diabetes tipo II (en los machos obesos) y falla cardiaca congestiva. La gran ventaja de esta lnea es que el desarrollo de la afeccin cardaca procede en forma lenta, acercndose ms a lo que se observa en las personas. Las lneas consanguneas ZDF, SHROB y SHHF son comercializada por Charles River Laboratories. Otro modelo de hipertensin no asociado a obesidad lo constituyen las ratas Dahl SS (salt-sensitive) y SR (salt-resistant), seleccionadas por L. K. Dahl a partir de ratas Sprague-Dawley en Brookhaven National Laboratories, New York, Estados Unidos. En las ratas SR (normotensas), el elevado consumo de sal (dietas con 8% de ClNa) durante 3-4 semanas no provoca cambios significativos en la presin arterial; en cambio, las ratas sensibles a la sal (SS) muestran un incremento significativo de la presin arterial con lesiones renales y vasculares asociadas, lo que les provoca la muerte dentro de las ocho semanas de empezada la dieta. No obstante, las ratas SS mantenidas con dietas bajas en sal (0,3% ClNa) sobreviven por mucho ms tiempo, aunque evidencian hipertensin. Se sospecha que una de las causas de esta diferencia estara localizada en los riones, ya que las ratas SS tienen menos glomrulos (alrededor de 15%) que las ratas SR. Finalmente, un ejemplo de rata transgnica usado en estudios de hipertensin es la lnea que sobre expresa el gen Ren2 (renin 2), aunque su valor como modelo de la hipertensin humana se ve limitado por el hecho de ser un fenotipo monognico, y no polignico como en los humanos.

9.3.4 La rata como modelo de Epilepsia En la dcada de 1980, el investigador japons Tadao Serikawa y sus colaboradores propusieron a la rata SER (spontaneously epileptic rat) como un posible modelo de epilepsia humana. Esta lnea de ratas es homocigota para dos mutaciones recesivas llamadas zitter (zi) y tremor (tm), lo que causa (adems de vibrisas enruladas) convulsiones epileptiformes (tremor) que ocurren en forma espontnea a partir de los dos meses de edad. Los hallazgos patolgicos evidenciaron una encefalopata espongiforme (debido a la presencia de vacuolas en el sistema nervioso central) e hipomielinizacin. Por medio de estudios de ligamiento gentico, se pudo determinar que las mutaciones tm y zi se localizaban en el cromosoma 10 y 3 de la rata, respectivamente.

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Recientemente, el mismo laboratorio identific a la mutacin zi como una delecin de 8 pb en el sitio de splicing del gen attractin (Atrn), un gen involucrado en la interaccin entre clulas inmunes y el control de la homeostasis de la energa corporal. El mismo gen se encuentra afectado en la mutacin espontnea (recesiva) del ratn llamada mahogany (Atrnmg) y en la mutacin recesiva del hmster Sirio black tremor (bt). Siendo que este gen tambin interviene en ciertos proceso de la pigmentacin del pelo en los animales de color agut, cuando la mutacin zi es introducida en ratas agut, se obtiene un oscurecimiento del pelaje, como ya fuera descripto en los ratones mg/mg. Experimentos de rescate de fenotipo por medio de ratas transgnicas demostraron que la forma de membrana del gen attractin complementa los fenotipos neurolgicos y de pigmentacin, y no as la forma secretada.

9.3.5 El hmster como modelo experimental Si bien tienen muy baja distribucin, o a veces nula, se han descripto alrededor de 50 mutaciones en el hmster Sirio (Mesocricetus auratus), la mayora con efecto sobre el pelaje. Entre ellas, se destacan piebald (s), cardiomyopathy (cm), Lethal grey (Lg), hairless (hr), anophtalmic white (Wh), y seizure (sz). La mutacin recesiva cm se encuentra mantenida en homocigosis en la lnea consangunea BIO14.6 (conocidos como hmsters CM) y es muy usada en cardiologa experimental, ya que su fenotipo se asemeja a ciertas formas de cardiomiopatas humanas con falla cardaca progresiva. Recientemente, se supo que los hmster CM portan una mutacin nula en el gen sarcoglicano (del ingls sarcoglycan). Adems de las mutaciones mencionadas, el hmster Sirio es usado como modelo de enfermedades infecciosas, trombosis, amiloidosis y caries dentales. Por su lado, el hmster Chino (Cricetulus griseus), originalmente criado para ser usado en estudios del protozoo Leishmania donovani, ha sido propuesto como modelo de diabetes tipo I, debido a su predisposicin gentica; lo que se ve favorecido por la existencia de lneas consanguneas no diabticas. Adems,

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