Microscopía y Microscopía y Técnica histológicaTécnica histológica

Docente Jonatan KasjanMédico en Medicina Estética

Jefe de trabajos prácticos de Histología UBAAyudante de Anatomía Patológica UBAJefe de trabajos prácticos de Histología

Fundación Barceló

Instrumentos de la Biología CelularInstrumentos de la Biología Celular

Métodos de laboratorio: Cultivos, separación subcelular, etc.

Microscopia: Microscopios Ópticos

Microscopios Electrónicos

Unidad de medida Valos de la unidad Método de estudioEstructura visualizada

Milímetros

(mm)10-3 m

Ojo Órganos, Tejidos,

Lupa Células grandes

Micrómetro

(µm)10-6 m Microscopías ópticas

Tejidos, Células

Organoides grandes

Nanómetro

(nm)10-9 m

Microscopía Electrónica

Componentes subcelulares

Microscopía de Polarización

Virus

Macromoléculas

Amstrong

(Å)10-10 m Microscopía

ElectrónicaEstructura Moléculas

1mm = 1.000 µm = 1.000.000 nm = 10.000.000 Å

MicroscopioMicroscopio“Es un instrumento que sirve para visualizar diversas estructuras que escapan al límite de

resolución del ojo humano a través del aumento de los objetos observados”

SIMPLESCOMPUESTOS

Una sola lenteSistemas ópticos centrados

FOTÓNICOS ELECTRÓNICOS

• Microscopio Óptico

• Microscopio de Campo Oscuro

• Microscopio de Fluorescencia

• Microscopio de Polarización

• Microscopio de Contraste de Fases

• Microscopio de Interferencia

• Microscopio de Luz UV

• M.E.T.

• M.E.B.

• Lupa

MICROSCOPIO ÓPTICOMICROSCOPIO ÓPTICO

Parte Mecánica Parte Óptica

• Pie

• Columna

• Tubo

• Platina

•Subplatina

• Aparato de Iluminación

- Condensador

- Espejo

- Diafragma Iris• Objetivo

• Ocular

- Tornillo micro y macrométrico

- Soporta ocular y revolver

- Da soporte al aparato de iluminación

Formación de la imagenFormación de la imagen

IMAGEN FINAL: VIRTUAL, MAYOR e INVERTIDA

ObjetivosObjetivos

4X 10X 40X

CLASIFICACIÓN:

Objetivos secos: el aire se interpone directamente entre el objeto y el objetivo. Según el aumento: - Seco débil (10X);

- Seco fuerte (40X)

Objetivos de inmersión: entre el objeto y el objetivo se interpone un líquido de índice de refracción superior al aire (agua, aceite de cedro, etc.)

100X

APERTURA NUMÉRICA: es la cantidad de rayos luminosos emergentes del preparado que son captados por el objetivo

A.N.A.N.= N . Sen α

Índice de refracción del medio

interpuesto.

Ej.: Aire: 1

Vidrios: 1,52

Agua: 1,33

Aceite: 1,51

Seno del semiángulo de apertura

(valor máximo = 0,1)

Semiángulo de Apertura: Es el semiángulo formado por los rayos mas periféricos, que partiendo de la fuente luminosa penetran en el objetivo

PODER DE RESOLUCIÓN: es la capacidad de un sistema óptico para mostrar separados dos puntos situados a muy pequeña distancia entre sí.

PR = 1

LR = 0,61 X λ

AN

LÍMITE DE RESOLUCIÓN: es la distancia mínima que separa dos puntos para poder discriminarlos como tales.

Longitud de onda de la luz empleada

Ej.: Blanca: 5550 Å

UV: 2500 Å

Electrón: 0,056 Å

Distancia entre los puntos que se resuelven

Ojo humano 0,2 mm

M.O. de campo claro 0,2 µm

MEB 2,5 nm

MET

En Teoría 0,05 nm

En Práctica 1,0 nm

Microscopía de fuerza atómica 50 pm

Resolución del ojo en comparación Resolución del ojo en comparación con microscopioscon microscopios

““Cuanto menor sea el LR de un microscopio, Cuanto menor sea el LR de un microscopio, nos dará mejores datos sobre la estructura nos dará mejores datos sobre la estructura

del objeto que queremos observar”del objeto que queremos observar”

El LR puede disminuir:

• λ : Utilizando luz UV

• AN : Cambiando el medio interpuesto entre el objeto y el objetivo

A.N.A.N.= N . Sen α

Con Aceite de cedro:

A.N.A.N. LR = 0,61 X λ

AN

LRUtilizando Luz UV:

LR = 0,61 X λ

ANλ

Ocular Tiene como función aumentar la imagen dada por el objetivo, actúa igual a una lupa.

PARA CALCULAR EL AUMENTO TOTAL, MULTIPLICAMOS EL AUMENTO DEL OBJETIVO POR EL DEL OCULAR

40 X 10 = 400XEj.:

Microscopio electrónico de barridoMicroscopio electrónico de barrido

M.O. M.E.

FUENTE DE ENERGÍA Luz solar o artificial Filamentos de Tungsteno

TUBO Al aire Al vacío

LENTESOcular-Objetivo-

CondensadorBobinas

electromagnéticas

CAPTACIÓN DE LA IMAGEN

Ojo- cámara fotográficaPantalla Fluoroscópica o

placa fotográfica

MONTAJE Vidrio (portaobjetos) Grilla de cobre

CÉLULAS Vivas o muertas Muertas

IMAGEN Color o B/N B/N

AUMENTO TOTAL 100X-450X-1000X-2000X 1.000.000X

MECANISMO DE FORMACIÓN DE LA

IMAGEN

Absorción desigual de la luz por el preparado

Dispersión de electrones

NIVEL DE ESTUDIO Estructural Ultraestructural

Electromicrografía correspondiente a un macrófago. Se puede observar la presencia de prolongaciones citoplasmáticas abundantes (flechas) y un centríolo (C) en la parte central, rodeado por vesículas del complejo de Golgi (G). En el citoplasma aparecen dispersos numerosos lisosomas

secundarios (L). 15.000 X.

M.

E.

T.

Electromicrografía de barrido de eritrocitos humanosnormales. Obsérvese la forma bicóncava de estos corpúsculos. 6.500 X.

M.

E.

B.

Técnica histológica Técnica histológica

Se basa en un conjunto de procedimientos que nos permiten estudiar y ver los tejidos y las células con mayor claridad cuando estamos frente el microscopio óptico.

Este conjunto de procedimientos se puede realizar mediante la manipulación de tejidos vivos o de tejidos muertos.

Cultivo celularCultivo celular

Es una importante herramienta para el estudio de poblaciones celulares vivas fuera del organismo.

Se denomina cultivo in vitro (ya que se realiza en frascos de vidrio), y se puede clasificar en tres categorías, una es el cultivo de células, otra es el cultivo de tejidos y la otra es el cultivo de órganos.

Examen inmediato o in vivoExamen inmediato o in vivo

Se utilizan colorantes no tóxicos y los microscopios que nos permiten ver células vivas (contraste de fase, interferencia y campo oscuro).

Se denomina tinción vital cuando el colorante se le inyecta a un animal vivo, mientras que la tinción suprarvital se realiza cuando la tinción se aplica al tejido o células que están vivas, pero ya fueron extraídas del animal.

Preparación de tejidos muertosPreparación de tejidos muertos

Obtención de la muestra (biopsia o necropsia) Fijación: El objetivo de la fijación es detener los

procesos celulares dinámicos con la mayor rapidez posible y mantener la estructura con las mínimas modificaciones posibles.

Químicos: Formol – glutaraldehido – tetróxido de osmio.

Físicos: Desecación – calor seco – frío.

Inclusión: - Deshidratación (con alcohol). - Aclaración (con xilol). - Inclusión propiamente dicha (parafina).

Corte: De 5 a 15 micrones con micrótomo.

Coloración: Se coloca el preparado en portaobjetos. - Se hidrata con pasos contrarios a inclusión. - Se colorea con hematoxilina y eosina.

Montaje final: Se coloca cubreobjetos con pegamento.

Métodos HistoquímicosMétodos Histoquímicos Mediante la histoquímica podremos obtener la

localización de estructuras a nivel celular y se basa en utilizar distintas sustancias que tendrán una afinidad específica para la estructura que queramos localizar.

Hematoxilina y Eosina: - Componentes basófilos: ADN (cromatina o

cromosoma), ARN (nucléolo y REG) y cartílago (por GAGs).

- Componentes acidófilos: el citoplasma celular (por las proteínas) y las mitocondrias (proteínas en la MMI).

Metacromasia: Este fenómeno sucede

cuando en un tejido se encuentran muchas cargas negativas

muy cercanas entre sí, esto hace que

ciertos colorantes básicos (azul de

toluidina) se agrupen formando polímeros

y de esta manera cambia el espectro de

absorción de la luz cambiando la

coloración azul por una púrpura o roja.

- Cartílago- Gránulos de mastocitos- Nucleoproteínas

Reacción de P.A.S: La sigla P.A.S. representa la reacción del ácido peryódico de Schiff.

Mediante esta técnica podremos poner al descubierto hidratos de carbono (glucógeno), glucoproteínas, fibras reticulares, membranas basales y GAGs.

Primero se coloca al preparado con ácido peryódico, que lo que hace es romper los grupos oxidrilo y amino para formar aldehídos.

Una vez que tenemos los grupos aldehídos, lo que se hace es colocar el reactivo de Schiff (leucofucsina), que se une a los grupos aldehídos formados previamente y le otorga al tejido un color rojo magenta.

Reacción de Feulgen: técnica es específica para el ADN, ya que la reacción se da con la desoxirribosa que se encuentra sólo en esta macromolécula.

Radioautografía: la técnica se basa en utilizar una marca radiactiva que podrá ser ubicada en cualquier tejido en el cual se encuentre, esta marca radiactiva está representada por un isótopo radiactivo (con diferente número de neutrones).

RadioautografíaRadioautografía

Coloración de grasas: Se usan sustancias coloreadas y solubles en grasa que se disuelven en lípidos.

- Los colorantes más utilizados se denominan sudanes y hay varios tipos, el sudán rojo tiñe a los triacilgliceroles de los adipocitos, el sudán negro se usa para teñir las vainas de mielina de las fibras nerviosas, otros Sudanes son el Black y el amarillo, también se utiliza el aceite rojo O (no es un sudán).

- Es importante aclarar que cuando queramos ver lípidos fijemos las muestras en formol y luego se realicen cortes por congelación.

Inmunomarcación: Esta técnica se basa en la especificidad de la unión de un antígeno con un anticuerpo, un antígeno es una sustancia que puede ser reconocida como extraña y un anticuerpo es una inmuno-globulina (proteína) que reconoce al antígeno (sustancia extraña).

- Se puede realizar inmunomarcación de tejidos y se denomina inmunohisto-química, esta se realiza en los cortes de la técnica histológica, mientras que la inmunomarcación de las células se denomina inmunocitoquímica.

Muchas graciasMuchas gracias