Upload
atika-lailana-qomarianty
View
397
Download
13
Embed Size (px)
DESCRIPTION
mikro
Citation preview
PEWARNAAN KUMAN
Dian Widiyanti, SSi., MSi., Ph.D
Bagian Mikrobiologi
Fakultas Kedokteran Universitas YARSI
Pemeriksaan mikroskopik kuman
pewarnaan sediaan
Tujuan pemeriksaan mikroskopik adalah :
• melihat bentuk/morfologi kuman
• melihat struktur sel kuman
• mengetahui sifat kuman terhadap zat warna
Zat warna basa, asam dan netral
Zat warna basa (positif/kation berwarna) asam nukleat kuman kuman terwarnai
Zat warna asam mewarnai latar belakang sel kuman disebut pewarnaan negatif
Hasil pewarnaan baik harus memperhatikan
hal berikut :
1. preparat/sediaan kuman baik
2. zat warna harus baik/baru
3. waktu harus tepat
Syarat memperoleh sediaan kuman yang baik:
1. kaca/gelas objek bersih & bebas lemak
2. biakan kuman muda (18-24 jam), kecuali
M. tuberculosis.
3. preparat tipis & rata kuman tersebar &
zat warna merata
Sediaan fiksasi dgn api atau etil alkohol
perekatan kuman, kuman mati/kurang berbahaya,
zat warna mudah meresap, sediaan dpt disimpan
Jenis Pewarnaan
Positif Negatif
1.Sederhana
2.Diferensial (Gram &
tahan asam)
3.Khusus
1.Pewarnaan
negatif
JENIS PEWARNAAN :
1. PEWARNAAN NEGATIF
• Yang diwarnai latar belakang
kuman (back ground) karena
kuman sukar mengikat zat
warna
• Contoh : kuman Spirochaeta dan
simpai/ kapsul kuman
2. PEWARNAAN SEDERHANA
• Satu macam zat warna
• Hasilnya sesuai dgn zat warna yang digunakan,
biru metilen (kuman berwarna biru), air fuchsin
(merah), ungu gentian (ungu)
Bacillus sp (pew. biru metilen) Bacillus sp (pew. karbol fuchsin)
3. PEWARNAAN DIFERENSIAL
• Dua macam zat warna diferensiasi sifat kuman
terhadap zat warna
• Ada 2 (dua) jenis pewarnaan diferensial :
a. pewarnaan Gram
b. pewarnaan Tahan Asam
a. Pewarnaan Gram
• Membedakan kuman Gram positif (ungu) dgn kuman
Gram negatif (merah)
• Pewarnaan paling penting untuk identifikasi spesies
kuman langkah pertama
• Perbedaan sifat Gram karena perbedaan komposisi dinding sel kuman
Skema dinding sel bakteri Gram negatif & positif
Preparat difiksasi
Dituang zat warna UKK
(5 menit)
Lugol (45 – 60 detik)
Alkohol (30 detik)
Air fuchsin (1 – 2 menit)
Kuman berwarna ungu
Terbentuk kompleks
UKK-lugol
Dekolorisasi (Gram neg
tdk berwarna, Gram
pos tetap ungu)
Warna pembanding
(Gram neg berwarna
merah)
Perbedaaan sifat pewarnaan Gram :
1. Teori Salton
2. Permeabilitas dinding sel
• Kuman kokus umumnya bersifat Gram
positif,kecuali Neisseriaceae
• Kuman batang/basil umumnya bersifat Gram
negatif, kecuali genus Bacillus, Clostridium,
Corynebacterium, Listeria, Mycobacterium
Kuman Gram negatif Kuman Gram positif
b. Pewarnaan Tahan Asam
• Diferensiasi kuman bersifat tahan asam dgn tidak
tahan asam
• Dinding sel kuman tahan asam disusun terutama
oleh asam mikolat
• Ada 3 jenis pewarnaan tahan asam :
1. pewarnaan Ziehl-Neelsen
2. pewarnaan Kinyoun-Gabbett
3. pewarnaan Tan Thian Hok
Pewarnaan tahan asam
• Hasil : kuman tahan asam berwarna merah,
kuman tdk tahan asam berwarna biru
• Contoh kuman tahan asam : Mycobacterium
tuberculosis dan M. leprae.
4. PEWARNAAN KHUSUS
• Pewarnaan bagian tertentu sel kuman atau kuman yang
tidak dapat diwarnai dgn cara biasa
Jenis pewarnaan khusus, antara lain :
1. Pewarnaan flagel ( Gray, Novel, Zettnow dan Fontana-
Tribondeau)
2. Pewarnaan simpai/kapsul (Muir, Hiss,Gins-Burri)
3. Pewarnaan spora (Klein)
4. Pewarnaan nucleus/inti (Feulgen)
5. Pewarnaan Neisser untuk kuman C. diphtheriae
6. Pewarnaan kuman Spirochaeta (Becker-Krantz dan
Fontana-Tribondeau)
Pewarnaan kapsul Pewarnaan spora
Pewarnaan Neisser Pewarnaan flagel
ISOLASI & KOLONI KUMAN
CARA MELAKUKAN ISOLASI (MEMBIAK/MENANAM) KUMAN
Tujuan melihat/identifikasi koloni kuman untuk identifikasi
spesies kuman, memperbanyak jumlah kuman
serta mendapatkan biakan murni (pure culture)
Pada media cair : • mencelupkan 1 öse/sengkelit (inoculating loop) berisi kuman dalam spesimen/suspensi • dengan pipet tetes, diteteskan beberapa tetes (2-5 tetes) spesimen/suspensi kuman
Pada media padat :
1. Streak culture (metode goresan) dengan membuat goresan-goresan pada permukaan
media padat (plat) memakai öse yang berisi kuman (biakan lempeng/plat) Goresan-goresan dibuat sejajar tdk bersentuhan
supaya terjadi penipisan jumlah kuman, sehingga diperoleh koloni-koloni terpisah (tdk berhimpitan) untuk memudahkan identifikasi koloni kuman
2. Slant culture dengan membuat goresan-goresan pada permukaan
media padat di tabung (permukaannya dibuat miring) biakan miring
3. Stab culture (biakan tusuk) dengan cara menusukkan öse berisi kuman secara
tegak lurus pada media padat dalam tabung (misalnya media “agar tegak”)
4. Pour culture (biakan tuang)
biakan kuman yg dibuat dengan cara mencampurkan
kuman yang akan dibiak ke dalam media agar yang belum membeku (suhunya tidak terlalu panas sehingga kuman tidak mati), kemudian campuran tersebut dituang ke dalam plat dan dibiarkan membeku (dingin)
• Setelah melakukan inokulasi (penanaman) dilanjutkan dgn inkubasi (pengeraman) dalam alat inkubator pada suhu yg sesuai (biasanya 37C) selama 18-24 jam (kuman aerob) • Untuk kuman anaerob sebelum dimasukkan ke dalam inkubator, dimasukkan dahulu ke dalam “anaerob jar” (sungkup anaerob) untuk menciptakan suasana anaerob, karena kuman anaerob tdk dpt hidup pada suasana aerob (suasana yg terdpt oksigen)
KOLONI KUMAN
• Kuman pada media padat membentuk koloni
• Koloni kuman
sekelompok/kumpulan kuman sebagai hasil pertumbuhan dan perkembangbiakan suatu kuman • Koloni kuman dapat dilihat dan diamati berbeda bentuk dan sifatnya, tergantung jenis kumannya maka
koloni kuman dapat digunakan untuk membantu identifikasi spesies kuman (langkah kedua)
• Untuk identifikasi koloni kuman, diperlukan pengamatan suatu koloni yang terpisah tidak saling berhimpitan koloni terpisah diperoleh dengan cara
inokulasi penipisan goresan yang sejajar tidak saling bersentuhan
Hal-hal yang diperhatikan dalam identifikasi koloni kuman : 1. ukuran/diameter koloni kuman dlm. mm
2. bentuk koloni (bulat/menjalar/bersulam /tidak teratur) 3. penampang permukaan koloni (cekung/cembung/datar) 4. permukaan & tepi halus (Smooth = S) atau kasar
(Rough = R) 5. mengkilap/buram (glossy/opaque) 6. warna koloni (pigmen : putih/kekuningan /kuning emas/ kehijauan/ ungu/merah) 7. jernih atau keruh 8. viskositas koloni : lunak seperti mentega, kering, keras, berlendir/mukoid = M (koloni kuman yg punya kapsul)
9. bila kuman tumbuh pd media agar darah zona
hemolisis.
Jenis zona hemolisis :
> hemolisis (ada zona kehijauan di sekitar koloni) > hemolisis (ada zona hemolisis jernih transparan di sekitar koloni)
> hemolisis gamma (tidak ada zona hemolisis di sekitar koloni)
• kadang-kadang dijumpai koloni yang kerdil (koloni D = dwarf) • Beberapa contoh koloni berpigmen : > koloni pigmen merah mis. Serratia marcesens > koloni pigmen ungu mis. Chromobacterium violaceum > koloni hijau mis. Pseudomonas aeruginosa > koloni kuning emas mis. Staphylococcus aureus > koloni putih mis. Staphylococcus epidermidis > koloni kuning kering mis. M. tuberculosis
Serratia
marcescens colony
Chromobacterium
violaceum colony
Pseudomonas
aeruginosa colony
Staphylococcus
aureus colony
Staphylococcus
epidermidis colony
Mycobacterium
tuberculosis colony
• Beberapa contoh bentuk koloni kuman :
> koloni menjalar mis. kuman Proteus vulgaris > koloni bersulam mis. kuman Bacillus mycoides > koloni mukoid mis. kuman Klebsiella pneumoniae > koloni jernih seperti titik-titik air, dgn zona hemolisis beta mis. Streptococcus pyogenes > koloni jernih dengan zona hemolisis alpha, mis. Streptococcus viridans
Koloni mukoid Koloni menjalar Koloni rough
Koloni smooth
(Staphylococcus)
Koloni smooth
(Streptococcus) Koloni bersulam
PERBENIHAN/MEDIA KUMAN
Manfaat membiak/ isolasi kuman
Tujuan mempelajari koloni kuman guna
mengidentifikasi spesies kuman
Syarat perbenihan/media kuman :
1.mengandung bahan nutrisi, garam, air
yang diperlukan kuman (dalam jumlah
cukup)
2.bebas bahan kimia,dll. yang menghambat
pertumbuhan kuman
3.pH sesuai dengan sifat kuman
4.steril
JENIS-JENIS PERBENIHAN
KONSISTENSI NUTRISI MANFAAT
1.Cair
2.Semisolid
3.Padat
1.Sederhana
2.Diperkaya
1. Transport
2. Persemaian
3. Diferensial
4. Selektif
5. Eksklusif
6. Khusus
Jenis media berdasarkan konsistensi :
1. Perbenihan cair
Tempat : botol/tabung
Contoh : air pepton, kaldu nutrient, kaldu darah, kaldu
BHI (brain heart infusion), kaldu thioglikolat.
Bentuk pertumbuhan:
• keruh (turbidity)
• pellicle mis. Vibrio, Pseudomonas
• sedimen mis. Kuman anaerob
• granulasi mis. Yersinia
Granulasi
2. Perbenihan semisolid (1/2 padat)
Tempat : tabung
Mengandung 0.5% agar-agar
Contoh : Media untuk melihat gerak kuman dan
media transport
3. Perbenihan padat/solid Tempat : tabung / cawan Petri (plat)
Bahan pemadat mengggunakan
a. agar-agar 1.5-2.0% (agar-agar murni)
b. serum sapi, kelinci, kuda (mis. Perbenihan
Loeffler untuk kuman C. diphtheriae)
c. telur, mis. Perbenihan Loewenstein Jensen
(mengandung telur bebek) utk kuman
M. tuberculosis
• Kuman tumbuh koloni
• Koloni berbeda bentuk dan macamnya
membantu identifikasi (langkah ke-dua)
Jenis media berdasarkan nutrisi
1. Perbenihan/media sederhana
Mengandung bahan nutrisi pokok
saja
Contoh : media agar nutrient ( isi :
agar-agar + pepton)
2. Perbenihan/media diperkaya (enriched)
Penambahan bahan tertentu
Contoh :
• Darah (agar darah),
• Serum (Loeffler)
• Telur, cairan ascites, as.Amino esensial,
vitamin, yeast dsb.
Jenis media berdasarkan guna/manfaat :
1. Media transport • Fungsi transport spesimen ke lab.
• Bentuk semisolid dalam tabung tertutup (prop
plastik)
• Mengandung cukup nutrisi utk kuman kuman tdk
mati
Contoh media Charcoal, Carry-Blair, Stuart, Amies.
2. Media persemaian
• Bentuk cair, dalam tabung/botol
• Fungsi memperbanyak jumlah kuman ttt
dlm spesimen dgn menyingkirkan
faktor-faktor penghambat
pertumbuhan kuman tsb.
Contoh :
• media empedu (Gal/bile) S. typhosa
• media air pepton alkalik Vibrio (pH 8.0)
• media selenit dan Kauffman kuman enteric
3. Media diferensial • Fungsi untuk membedakan sifat
pertumbuhan kuman, karena mengandung bahan tertentu
Contoh :
• media Agar Darah diferensiasi kuman berdasarkan sifat
hemolisanya thdp eritrosit • media agar Endo diferensiasi kuman peragi laktosa
dgn non peragi laktosa
Agar darah Agar Endo
4. Media selektif
• Fungsi membiak kuman yang diinginkan
• Mengandung bahan yg menghambat
pertumbuhan kuman yg tdk diinginkan
Contoh
• media untuk kuman enteric, mis. Media
SS (Salmonella-Shigella); media WB
(Wilson-Blair)
5. Media eksklusif
Media yang daya seleksinya lebih baik
Contoh :
- media TCBS (thiosulphate citrate bile
sucrose) utk Vibrio
6. Media khusus
Mis. untuk kuman anaerob, kuman Gonococcus,
Leptospira dsb.
Media utk kuman anaerob, a.l. :
a. media thioglikolat mengandung Na-thioglikolat
(reduktor O2) dan rezasurin (indikator O2)
b. media Tarozzi mengandung potongan jaringan
segar, mis. hati (sumber enzim katalase,peroksidase &
superoksid-dismutase)
Media untuk Gonococcus Thayer Martin (mengandung
antibiotik vancomicin, colistin, nistatin)
Media untuk Leptospira EMJH & Korthof (mengandung
albumin serum)
• Kuman anaerob tdk memiliki enzim
yg mengubah H2O2 (bersifat toksis)
sehingga akan mati, karena itu perlu
media khusus dan suasana khusus
(anaerob)