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Ana Mara Garca Cepero, Yamel Lpez Forero, Nestor Miguel Riao HerreraAplicacin de una tcnica de Cromatografa de Exclusin molecular para la purificacin de ADN en plantas deCoffea sp.Revista Facultad Nacional de Agronoma - Medelln, vol. 59, nm. 2, 2006, pp. 3499-3507, Universidad Nacional de ColombiaColombia

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Revista Facultad Nacional de Agronoma - Medelln,ISSN (Versin impresa): 0304-2847 rfnagron_med@unal.edu.co Universidad Nacional de ColombiaColombia

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APLICACIN DE UNA TCNICA DE CROMATOGRAFADE EXCLUSIN MOLECULAR PARA LA PURIFICACIN DE ADN EN PLANTAS DE Coffea sp.

Ana Mara Garca Cepero1; Yamel Lpez Forero2 yNestor Miguel Riao Herrera3___________________________________________________________________

RESUMEN

Uno de los mayores inconvenientes en la extraccin y purificacin de biomolculas a partir de plantas del gnero Coffea, es un alto contenido de polifenoles y compuestos tnicos. En el presente artculo se describe una metodologa que permite obtener ADN de alta pureza. La extraccin del ADN del homogeneizado de tejido foliar en siete genotipos de Coffea sp., se realiz mediante la tcnica citada por Chaparro (1993) y su purificacin se logr mediante cromatografa de exclusin molecular sobre una fase estacionaria de Sephacryl S-1000. Los resultados muestran que la alta eficiencia de separacin de ARN degradado, protenas, pigmentos y compuestos que absorben entre 220 y 300 nm, permiten obtener un ADN de alta pureza a juzgar por los datos espectrofotomtricos y electroforticos.

Palabras clave: Coffea arabica L., caf, ADN, cromatografa de exclusin molecular.____________________________________________________________________________________

ABSTRACT

APPLICATION OF A TECHNIQUE OF MOLECULAR EXCLUSION CHROMATOGRAPHY FOR THE PURIFICATION OF DNA FROM Coffea sp. PLANTS

One of the greatest difficulties in extracting and purifying biomolecules from plants in the genus Coffea is the high polyphenol and tannin contents. In this study a methodology is described that allows obtaining high purity DNA from leaf tissues of seven genotypes of Coffea sp. by means of the technique desribed by Chaparro (1993) and its further purification was achieved by molecular exclusion chromatography on Sephacryl S-1000 (Pharmacia). The results showed that the high separation efficiency of degraded RNA, proteins, pigments, and other compounds that absorb between 220 and 300 nm allowed obtaining high purity DNA as judged by the spectophometric and electroforetic data.

Key Words: Coffea arabica L., coffee, DNA, molecular exclusion chromatography.

1 Microbiloga. Clnica Cardiovascular Santa Mara. Calle 8B No. 75-21, Medelln, Colombia. 2 Profesor Asociado. Universidad Nacional de Colombia, Sede Palmira. Facultad de Ciencias Agropecuarias. A.A.0237, Palmira, Colombia. 3 Investigador Cientfico II. Fisiologa Vegetal. Centro Nacional de Investigaciones de Caf. CENICAF, Chinchin, Caldas, Colombia.

Recibido: Junio 1 de 2005; aceptado: Febrero 6 de 2006.

Rev.Fac.Nal.Agr.Vol.59,No.2.p.3499-3507. 2006.

Aplicacin de una tcnica.....

Por las caractersticas bioqumicas del caf y otras plantas relacionadas, en el momento de la homogenizacin de tejido foliar, se liberan metabolitos secundarios presentes en vacuolas, tales como complejos fenlicos que sirven de sustrato polifenloxidasas (PPO), adems de liberar clorofilas y taninos que se encuentran en los organelos de las clulas del mesfilo. Estos componentes son indeseables en los procesos de extraccin de ADN y producen oxidaciones rpidas y de gran magnitud, en comparacin con las de otras especies como Pisum sativum, cuyas caractersticas bioqumi- cas y metablicas hacen que posea un contenido ms bajo de tales meta- bolitos y menores tasas oxidativas (Guillemaut y Drovard 1992, Kanazawa y Tsutsumi 1992).

La utilizacin de PVP (Polivinipirroli- dona), PVPP (Polivinilpolipirrolidona) y DIECA (Diotiocarbamato de sodio), in- hiben la actividad de PPO facilitando la extraccin de las biomolculas de los tejidos (Couch y Fritz 1990).

En caf a pesar de la utilizacin en altas concentraciones de los com- puestos antes mencionados, no hay inhibicin total de la actividad oxi- dativa, esto conlleva a utilizar mto- dos adicionales que permitan obtener muestras de ADN altamente purifica- das para lograr realizar exitosamente los diferentes procesos enzimticos indispensables en el desarrollo de la mayora de las tcnicas de biologa molecular.

En caf no se logra una inhibicin total de PPO y otras oxidasas a pesar del uso

de PVP, PVPP y DIECA en altas concen- traciones, lo cual exige la modificacin de las metodologa para obtener mues- tras de ADN altamente purificadas, tiles en trabajos de biologa molecular (Fuchs y Blakesley 1983).

MATERIALES Y MTODOS

Material vegetal. Se utilizaron hojas jvenes del segundo par de ramas de plantas de 1 ao de edad, de la especie Coffea arabica cv. Caturra, Coffea arabica cv. Colombia, Coffea canephora, Coffea congensis, Coffea eugenioides y el Hbrido de Timor.

Aislamiento de ADN total. Se tom tejido foliar (1-3 g) y se pulveriz en presencia de nitrgeno lquido. Al macerar se adicionaron 60 mg de PVPP y 90 mg de DIECA por cada gramo de tejido. Luego se agregaron 2 volme- nes de buffer de homogeneizacin (SDS 1 %, sacarosa 0,25 M, NaCl 50 mM, EDTA 20 mM, Tris-HCl 50 mM, pH8,0), se agit en vortex por 3 min y se llev a incubacin por 30 min a tem- peratura ambiente. La muestra fue extrada dos veces con fenol saturado en Tris-HCl 0,1 mM, pH 8,0 y cloroformo-alcohol isoamilico (24:1) y una vez con cloroformo-alcohol iso- amlico (24:1). Se precipit con etanol absoluto, se lav con etanol al 70 %, y se resuspendi en agua destilada estril (Chaparro 1993).

Purificacin del ADN por columna de exclusin molecular. Se empac una columna Econo-column (Biorad) de 1 cm de dimetro y 30 cm de longitud con 15,7 ml de Sephacryl S-1000

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superfine (Pharmacia-Biotech). La colum- na se equilibr con 100 ml buffer (Tris- HCl 10 mM, pH 8,0, NaCl 200 mM, EDTA 0.5 mM) con flujo de 0,5 ml/min., para eliminar contaminantes e impu- rezas del soporte. En la columna se inyectaron entre 400-600 l de la muestra y la cromatografa se corri

cianol 0,25 %). La electroforesis se corri a 60 voltios durante 2h y las bandas se visualizaron en un transilu- minador (Sambroock, Fritsch y Maniatis1989).

Anlisis por espectrofotometra. Se determinaron las absorbancias a A260 ycon un flujo de 1 ml min-1, utilizando el

A280

nm., la relacin A260/280

y se realizmismo buffer de cromatografa. Se recolectaron 23 fracciones de 2 ml cada una (50 ml en total), a partir del ml 4-5 (Bookjans, Stumman y Henningsen 1984).

Evaluacin de las fracciones. Cada una de las fracciones fue evaluada por espectrofotometra haciendo un barri- do entre 220-320 nm y se determin la relacin A260/280 de cada fraccin. Las fracciones que presentaron picos de absorbancia alrededor de A260 y rela- ciones A260/280 mayor de 1,8 se precipitaron con etanol absoluto y acetato de sodio 3M, resuspendidas en50 l de agua desionizada estril y corridas en una electroforesis en gel de agarosa al 0,8 % para determinar integridad y presencia de ARN. Las fracciones con mayor contenido de ADN, que no revelaron presencia de ARN y con relacin A260/280 mayor de 1,8 se reunieron y fueron utilizadas para continuar el proceso (Sambroock, Fritsch y Maniatis 1989).

Anlisis por electroforesis en gel de agarosa. El ADN se analiz por electroforesis horizontal en gel de agarosa al 0,8 % con bromuro de etidio (0,2 mg ml-1) y se utiliz como buffer TBE 1X (Tris-HCl 45 mM, pH 8,0, EDTA 10 mM, cido brico 45 mM) y 1 ml de buffer de carga 6X (Glicerol 30%, azul de bromofenol 0,25 %, xileno-

un barrido entre 220 y 320 nm(Sambroock, Fritsch y Maniatis 1989).

Anlisis de restriccin. Se realiz anlisis de restriccin del ADN con la enzima EcoRI, siguiendo los protocolos descritos por Sambrook (1989). La muestra fue evaluada a travs de una electroforesis horizontal en gel de agarosa al 0,8 % teido con bromuro de etidio (Frischauf1987, Palmer y Shields 1984, Sambroock, Fritsch y Maniatis 1989).

Evaluacin de la concentracin de ADN. Se evalo por electroforesis horizontal en gel de agarosa al 0,8 % con bromuro de etidio y se utiliz el marcador de tamao molecular y concentracin Low DNA Mass Ladder de BRL-Gibco.

RESULTADOS Y DISCUSIN

Extraccin inicial de ADN total. Se obtuvo una concentracin de 320 g de ADN por gramo de tejido, evaluada por espectrofotometra, con una buena inte- gridad evidenciada por las bandas de alto peso molecular en la electroforesis. La relacin A260/280 (1,28) y la inhibicin en elcorte con EcoRI mostraron una bajapureza de la muestra, por la presencia de productos fenlicos, pigmentos y/o protenas no eliminados en el proceso de extraccin (Figura1).

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A. B.

1 2 3

23.130 pb9.416 pb 6.557 pb4.361 pb

260+

280+

2.322 pb2.027 pb

Figura 1. A. Electroforesis en gel de agarosa del ADN C. arabica cv. Caturra extrado con la tcnica descrita por Chaparro (1993), en gel de 0,8 % con bromuro de etidio. Carril 1: ADN total. Carril 2: ADN total cortado con EcoRI. Carril 3, Marcador de peso molecular HindIII. B. Curva espectrofotomtrica del ADN. La flecha muestra el pico mximo de obsorcin hacia 270 nm.

Anlisis de la cromatografa de exclusin molecular. Se obtuvieron tres grupos de fracciones a, b y c, cada una

de ellas con molculas diferentes evidenciadas por espectrofotometra y electroforesis (Tabla 1, Figura 2).

Tabla 1. Evaluacin por espectrofotometra de las fracciones obtenidas de la cromatografa de exclusin molecular de C. arabica cv. Caturra.

FRACCINml[] g/mlA260A280Rel, A260/280

01-5-00-

16-00-

28-00-

3100,9450,0140,0052,80

41212,250,2450,1301,88

51418,000,3600,1891,90a

61615,650,3130,1671,87

71813,000,2600,1351,92

82018,250,3650,1742,09

92228,950,5790,2692,15

102446,750,9350,4422,11

112665,551,3110,6452,03b

122880,51,6100,8451,90

133088,571,7740,9761,81

143294,151,8831,0801,74

153492,91,8581,1401,62

163690,51,8101,2041,50

173885,61,7121,2721,34c

184088,51,7701,4811,19

194287,051,7411,5171,14

20*44----

21*46----

22*48----

23* 50 - - - -

*De esta fraccin en adelante no se tomaron datos de absorbancia ya que se obtuvo un perfil tpico de fenoles. (Ver Figura 3)

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El componente de mayor tamao molecular de la muestra a purificar fue el ADN total, el cual comenz a eluir en la fraccin 3, continuando su elucin hasta la fraccin 7, a este se le denomin grupo a. Su calidad deter- minada por la relacin A260/280 fue muy buena (1,88-1,92) con un promedio de1,89. La curva del espectro de absorcin entre 220-320 nm, tuvo el comportamiento tpico para cidos nucleicos, con un pico mximo cerca a260 nm, el cual aumenta en magnitud a medida que se incrementa el volumen de elucin (Tabla 1). Este grupo fue elegido como muestra

ptima para continuar el trabajo. La electroforesis del grupo b de fracciones correspondientes a las fracciones 8 a13, muestra bandas de alto peso molecular y barridos a lo largo de los carriles, posiblemente debido a la presencia de ARN degradado. Las relaciones A260/280 mostraron valores aparentemente normales (entre 1,81 y2,15), con un promedio de 1,96 y la curva del espectro de absorcin entre220-320 nm fue normal. Aunque la pureza de la muestra fue buena y aun haba ADN total ntegro, estas fracciones fueron rechazadas por la presencia de ARN.

Figura 2. Comportamiento electrofortico y espectrofotomtrico de las muestras de ADN de C. arabica cv. Colombia, extrado por la tcnica de Chaparro (1993) y purificado a travs de columna de exclusin molecular Sephacryl S1000. A. Gel de agarosa al 0,8 % con bromuro de etidio de las fracciones eluidas de la columna de exclusin molecular. B. Relaciones 260/280 nm promedio de los grupos de fracciones a, b y c.

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En el grupo c correspondiente a las fracciones 14 a 18, la relacin A260/280 comienza a bajar a medida que aumen- ta el volumen de elucin, obtenindose valores entre 1,14 y 1,7, con un promedio de 1,45. Hay deformacin de la curva del espectro de absorbancia entre 220-320 nm, con aparicin de picos de absorbancia hacia 270 nm que

corresponden probablemente a fenoles y en algunos casos a 280 nm corres- pondientes a protenas (Figura 3). Adems en la electroforesis desaparece casi totalmente la presencia de bandas y barridos lo que muestra ausencia de cidos nucleicos pero presencia de otras molculas que absorben en este rango de longitud de onda.

A.

B.

C.

Figura 3. Espectros de absorcin. A. ADN total puro B. ADN total contaminado con fenoles. C. ADN total contaminado con protenas. Las flechas muestran la ubicacin de los picos de absorcin predominantes.

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Mas all de la fraccin 19, la curva toma el aspecto de los productos fenlicos y los valores de absorbancia disminuyen hasta llegar casi a cero.

Anlisis del ADN purificado. La electroforesis del ADN total de todos

los genotipos extrados y purificados, muestra bandas de alto peso mole- cular sin degradacin que al ser tratadas con la enzima de restriccin EcoRI producen barridos de mediano peso molecular, tpicos de la accin de esta enzima (Figura 4 A).

A.1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

23.130 pb6557 pb2.322 pb

564 pb

B.1 2 3 4 5 6 7

100 ng40 ng20 ng

[ ] ng/l 40 40 50 40 60 40

Figura 4. Anlisis del ADN extrado y purificado de todos los genotipos. A. Anlisis del ADN sin cortar y cortado con EcoRI en gel de agarosa al 0.8% con bromuro de etidio. Carril 1: HindIII. Carril 2: C. arabica cv. Caturra. Carril 3: C. arabica cv. Caturra EcoRI. Carril 4: C. arabica cv. Colombia. Carril 5: C. arabica cv. Colombia EcoRI. Carril 6: Hibrido de Timor. Carril7: Hibrido de Timor EcoRI. Carril 8: C. canephora EcoRI. Carril 9: C. canephora. Carril 10: C. congensis. Carril 11: C. congensis EcoRI Carril 12: C. eugenioides Carril 13: C. eugenioides EcoRI B. Evaluacin de la concentracin de las muestras por electroforesis en gel de agarosa al 0.8% con bromuro de etidio.Carril 1: DNA Mass Ladder. Carril2: C. arabica cv. Caturra. Carril 3: C. arabica cv. Colombia. Carril 4: Hibrido de Timor. Carril 5: C. canephora. Carril 6: C. congensis. Carril 7: C. eugenioides.

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Con el marcador de tamao molecular se encontr que la concentracin de ADN obtenido de cada genotipo estaba entre20-80 ng l-1, concentracin aparente- mente baja (Figura 4 B). Sin embargo, el volumen de dilucin del ADN nunca fue menor de 200 l, lo cual proporciona ma-

terial suficiente para realizar ms de 200 reacciones de PCR por muestra. Al eva- luar la calidad de los materiales aislados por espectrofotometra, se encontr que las relaciones A260/280 fueron ptimas mostrando la alta pureza del material obtenido de la columna (Tabla 2).

Tabla 2. Anlisis espectrofotomtrico del ADN en los diferentes genotipos de caf aislados.

GENOTIPO A260 A280 Rel. A260/280 C. arabica cv. Caturra0,25090,13391,87

C. arabica cv. Colombia0,10230,04792,14

Hbrido de Timor0,27410,13312,05

C. canephora0,10230,05572,33

C. congensis0,14220,06232,28

C. eugenioides0,24830,10932,25

De estos resultados se pude concluir que la cromatografa de exclusin molecular utilizando Sephacryl S-1000, es una buena alternativa para la puri- ficacin de ADN originado de geno- tipos con alto contenido de metabo- litos secundarios como es el caso del gnero Coffea, ya que las molculas presentes en la muestra se separan en fracciones discriminantes, obteniendo un ADN de excelente calidad.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue cofinanciado por Colciencias y la Federacin Nacional de Cafeteros de Colombia, dentro del marco del proyecto Estudio de la Actividad Fotosinttica de Hojas y Frutos de diferentes Especies de Caf Coffea sp, cdigo:2251-07-002-93.

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