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Cromatografía
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ROMATOGRAFIA ¿Qué es?
¿Para qué sirve?
La cromatografía es una técnica en donde se lleva a cabo la separación de
compuestos con el propósito de identificar, cuantificar o purificar cada uno de los
componentes de una mezcla de solutos, basándose en las velocidades con las que se
mueve cada soluto a través de un medio poroso arrastrado por un solvente, una mezcla
de solventes o por gas(13)
.
¿Cómo se divide la Cromatografía?
Existen diferentes divisiones en la práctica para la cromatografía como la de
adsorción, reparto, intercambio iónico, exclusión molecular, y por afinidad (8, 10)
.
La cromatografía de adsorción es la forma más antigua de la cromatografía en
la cual se utiliza una fase estacionaría sólida y una fase móvil líquida o gaseosa. El
soluto puede adsorberse en la superficie de las partículas sólidas. El equilibrio entre el
estrado adsorbido y la solución es la causa de la separación de las moléculas del soluto.
La cromatografía de reparto es una técnica en donde una fase estacionaría
forma una película delgada de la superficie de un soporte sólido. El soluto se equilibra
entre este líquido estacionario y una fase móvil líquida o gaseosa.
La cromatografía de intercambio iónico se basa en el equilibrio de los iones de
soluto entre el solvente y los sitios fijos cargados de la fase estacionaría esta cuenta con
intercambiadores aniónicos (grupos con carga positiva unidos covalentemente) los
cuales retienen a los aniones del soluto y con intercambiadores catiónicos (grupos con
carga negativa) retienen a los cationes del soluto.
La cromatografía de exclusión molecular se denomina también cromatografía
de filtración en gel, en esta técnica las moléculas se separan por su tamaño se utiliza
mucho en la bioquímica para separar moléculas grandes como proteínas, carbohidratos e
incluso para separar polímeros y caracterizarlos.
C
Cromatografía
2
La cromatografía por afinidad es una técnica muy selectiva se utilizan
interacciones altamente específicas entre un tipo de moléculas de soluto y otras
moléculas que se unen (inmovilizan) covalentemente a la fase estacionaría.
La cromatografía de líquidos de alta resolución se utiliza para separación de
compuestos que no son lo suficientemente volátiles o no tienen bastante estabilidad
térmica para la cromatografía de gases. Se utilizan columnas empacadas grandes con
fase móvil suministrada por gravedad o por bombeo a baja y alta presión en esta ultima
se utilizan columnas pequeñas que contienen un menor tamaño de partícula de empaque
gel de sílice o alúmina.
La cromatografía de gases se basa en que un líquido volátil o un soluto gaseoso
son arrastrados por una fase móvil gaseosa que circula sobre un líquido estacionario que
recubre un soporte sólido o sobre una superficie sólida absortiva.
Se describen a continuación los principios de la cromatografía de gases y al finalizar se
explicaran los mismos para la cromatografía de líquidos.
Cromatografía
3
CROMATOGRAFÍA DE GASES
La cromatografía de gases se utiliza para separar, identificar y cuantificar
cualquier material que contenga una presión de vapor apreciable (1 a 1000 mm Hg) a
una temperatura de operación de la columna (medio de separación) desde –70° C a
400° C(12)
.
Se basa en la diferencia de velocidades de migración de los componentes de una
mezcla entre dos fases; una estacionaria y una móvil (gas), de tal manera que cada
componente es selectivamente retenido por la fase estacionaria.
En esta cromatografía un soluto gaseoso (vapor de un líquido volátil) es
transportado por una fase móvil gaseosa.
De acuerdo al tipo de fases estacionaria se clasifica en dos:
La fase estacionaría suele ser un líquido no volátil que recubre el interior de la
columna o un soporte sólido de grano fino. Esta forma más común de cromatografía de
gases se llama cromatografía de reparto o de partición gas – líquido.
En ocasiones se utilizan como fase estacionaria partículas sólidas sobre las que
el soluto puede adsorberse.
En este caso la técnica se denomina cromatografía de adsorción gas – sólido.
¿Qué pasa dentro de un cromatógrafo de Gases?
1. Una muestra de líquido volátil es inyectada a través de un septo de goma (un disco
delgado) en un puerto de inyección caliente, recubierto de vidrio o metal, donde se
vaporiza la muestra. La muestra gaseosa puede inyectarse con una jeringa de cierre
hermético o a través de una válvula de muestreo de gas.
2. La muestra es arrastrada rápidamente hacia la columna del gas portador inerte (que
suele ser He, N2 o H2), que actúa como fase móvil. Después de pasar por la
columna que contiene la fase estacionaría, los solutos son separados y fluyen por un
detector, cuya respuesta se visualiza en un registrador o una computadora.
3. No es necesario que la temperatura de la columna sea mayor que el punto de
ebullición de todos los solutos. Sólo debe ser lo bastante elevada para que cada
soluto tenga suficiente presión de vapor a fin de ser eluido en un tiempo razonable.
4. El detector se mantiene a mayor temperatura que la columna, de modo que en esta
todos los solutos están en fase gaseosa. Los solutos que salen del cromatógrafo de
Cromatografía
4
gases pueden colectarse para su identificación o enviarse directamente a un
espectrómetro de infrarrojo o de masas para el análisis inmediato de cada pico
cromatográfico.
5. Para colectar cantidades de soluto del orden de los microlitros, en el puerto de salida
del cromatógrafo se inserta en un tubo de vidrio en U, el fondo de ese tubo se enfría
con hielo seco o nitrógeno líquido para condensar el soluto.
Figura 1. Esquema de un Cromatógrafo de Gases.
¿Cuáles son las partes de un cromatógrafo de Gases?
En general las partes básicas de un cromatógrafo de gases son:
1.- Gas de arrastre (Cilindro).
2. - Regulador de presión y válvulas de control de flujo.
3.- Inyector ( Sistema de muestreo)
4. –Horno de la Columna
5. - Columna.
6. - Detector
7. - Registrador
Cromatografía
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GAS DE ARRASTRE
El Cromatógrafo de Gases emplea gas como fase móvil para este tipo de cromatografía,
las características que este gas debe reunir básicamente son las siguientes:
•Inerte con respecto a la muestra y a la fase estacionaria
•Capaz de minimizar la difusión gaseosa.
•De fácil disponibilidad y con un alto grado de pureza
•Adecuado al tipo de detector que se emplea.
Sobre la base de esto los gases más usados en cromatografía de Gases son el Helio,
Nitrógeno e Hidrógeno, ya que son inertes, tienen baja difusión gaseosa y se encuentran
fácilmente con altos grados de pureza como 99.999%, aunque también se usa la mezcla
Argón-metano (95-5%). La velocidad para un flujo óptimo se puede determinar
experimentalmente empleando la ecuación de Van Deempter(6, 14)
.
La velocidad de flujo más eficiente, es el mínimo de la altura equivalente de un plato
teórico, o bien, al máximo del número de platos (2, 12)
.
Figura 2. Plano de Van Deempter para la selección de la velocidad de flujo óptimo
del gas de arrastre (10)
REGULADOR
Un regulador de presión se emplea para uniformar la entrada del gas en la columna. Es
importante que el regulador sea el adecuado para cada tipo de gas y además que sea
apropiado para gases de alta pureza.
AEPT
Velocidad de flujo
Cromatografía
6
SISTEMAS DE MUESTREO
Es el lugar donde se introduce la muestra al cromatógrafo de gases y en el cual la
muestra debe evaporarse de inmediato y combinarse con el gas de arrastre. Debido a la
composición o estado de las muestras, estas pueden caracterizarse como:
Muestras líquidas.
Se emplea una jeringa con punta, se perfora con ella un septum.
Muestras gaseosas.
Se emplean válvulas muestreadoras especiales con el empleo de circuitos muestreadores
de volúmenes específicos, o bien con jeringas especiales de precisión.
Muestras sólidas.
Se recurre a solventes o se emplean jeringas especiales en forma de espátulas.
SOLVENTES
Las características básicas que un solvente debe tener para ser empleado en
cromatografía de gases son:
•Un buen solvente absoluto para los componentes de la muestra, si la solubilidad es
baja, los componentes eluyen rápidamente y la separación es pobre.
•Ser un buen solvente diferencial para los componentes de la muestra.
•No volátil, la presión de vapor 0.01 a 0.1 mide Hg a la temperatura de operación
razonable para la vida de la columna.
•Térmicamente estable, la inestabilidad puede ser promovida por el soporte con la
influencia de la temperatura.
•Químicamente inerte con respecto a la muestra. (12)
COLUMNAS
Las columnas empacadas de acero inoxidable o vidrio tienen diámetros de 3 a 6
mm y de 1 a 5 m de longitud. La columna se llena con un soporte de grano fino
recubierto de un líquido no volátil como fase estacionaria, aunque el sólido mismo
puede ser la fase estacionaria. Para trabajos preparativos, el espesor de la fase
Cromatografía
7
estacionaria se incrementa para dar más cabida a la muestra y se prefieren las columnas
de mayor diámetro (figura 3).
Las columnas tubulares abiertas son mucho más estrechas y pueden ser mucho
más largas que las columnas empacadas. El diseño tubular abierto proporciona mayor
resolución, menor tiempo de análisis y mayor sensibilidad que las columnas empacadas,
pero con el se maneja una cantidad de muestra considerable menor. El aumento en la
resolución se debe a que la longitud de la columna es mayor por lo cual aumenta el
número de platos teóricos por unidad de longitud. El tiempo de análisis se debe a que la
columna contiene mucho menos fase estacionaria que en el caso de la columna
empacada, de modo que se retiene menos a los solutos. (7, 8, 11)
Figura 3. Diferencia entre columna empacada y capilar.
El menor soluto de la fase estacionaria significa que la columna tubular abierta
puede aplicarse mucho menos muestra que a una columna empacada(14)
.
La sensibilidad es una medida de la relación señal-ruido del detector para una
concentración dada de analito en la solución inyectada. La sensibilidad que se obtiene
con una columna tubular abierta es mayor que la propia de una columna empacada,
debido a que
1) un gas óptimo para el funcionamiento del detector se agrega a la corriente de
la muestra al entrar al detector;
2) los contaminantes provenientes del septo se reduce por purga continua del
sistema de entrada;
3) se reduce el paso de fase estacionaria de la columna hacia el detector, porque
hay menos fase estacionaria;
Fase estacionaria
Silica Fundida
Capa de poliamida
Columna capilar diámetro interno 1/16 in
Fase estacionaria
Silica Fundida
Capa de poliamida
Columna capilar diámetro interno 1/16 in
Cromatografía
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4) las fluctuaciones en el flujo del gas portador, que inducen fluctuaciones en la
respuesta del detector son amortiguadas por la considerable longitud de la
columna capilar.
SOPORTE SÓLIDO
Las columnas empacadas contienen un líquido no volátil depositado en
partículas finas de un soporte sólido “inerte”. El soporte debe ser de un material
resistente en partículas pequeñas en forma constante, con gran área superficial. La
mayoría de los soportes son de diatomita (tierra de diatomeas), consistente en los
esqueletos de sílice de las algas microscópicas denominadas diatomeas. El soporte no
debe interactuar con los solutos, pero ningún soporte es del todo inerte. La silanización
con hexametildisilazina o diclorometilsilano ((CH3)2SiCl2) es una forma ampliamente
utilizada de reducir la interacción de partículas de sílice con solutos polares. Para
solutos muy reactivos el teflón puede ser un soporte útil. (8)
La uniformidad del tamaño de partículas reduce el término de trayectorias
múltiples en la ecuación de Van Deemter*, con lo cual también reduce la altura del
plato e incrementa la resolución. El tamaño reducido de la partícula reduce el tiempo
requerido para el equilibrio de los solutos, lo que mejora la eficiencia de loa columna.
Sin embargo menor tamaño de partícula, más presión se requiere para forzar la fase
móvil a través de la columna. (8)
El tamaño de partícula de los soportes cromatográficos se expresa como tamaño de
malla, el cual se refiere al tamaño de poro de tamices por los cuales las partículas de los
soportes cromatográficos pasan o son retenidas.
Una partícula con tamaño de malla 100/200 pasará por un tamiz número 100 pero no
por otro número 200. El número de tamiz se refiere a la cantidad de dos poros por
pulgada lineal de malla. (8)
Hay 5 formas de Chromosorb A, G, P, W y T; los cuales son disponibles con o
sin tratamiento y en una variedad de rangos de malla. Chromosorb es una marca
registrada para soporte sólido por Jhons Manville. (8)
FASE ESTACIONARIA
Existe una variedad increíble de fases líquidas disponibles para la cromatografía
de reparto gas-líquido. La elección de una fase líquida para un problema dado es
esencialmente empírica. Sé presentan a continuación las diferentes clases de solutos que
son retenidas con frecuencia por cada fase líquida. Una variedad de fases líquidas puede
ser apropiada para resolver un problema dado de separación.
Cromatografía
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Tabla 1. Fases líquidas comunes para columnas cromatográficas (10)
Tabla 2. Fases líquidas comunes usadas en Cromatografía de Gases(10)
SE – 30 350° C máx.
APIEZON (Hidrocarburos mezclados) 275 – 300° C máx.
OV – 17 (Metilfenilsilicona) 300° C máx.
CARBOWAX 20M 250° C máx.
Tetrahidroxietilendiamina EDTA 150° C
La cantidad de fase líquida utilizada se expresa como porcentaje en peso del
soporte líquido. Las cargas más comunes están en el intervalo de 2 a 10%. Por encima
del 30%, la eficiencia de la columna disminuye debido a que se forman algunas de fase
líquida. Abajo del 1% la superficie del soporte puede ser no cubierta por completo(8)
.
I.- Baja Polaridad II.- Polaridad intermedia
III.- Polares IV.- Muy polares
Hidrocarburos saturados
Éteres Alcoholes Polihidroxialcoholes
Hidrocarburos olefínicos
Cetonas Ácidos carboxílicos Aminoalcoholes
Hidrocarburos aromáticos
Aldehídos Fenoles Hidroxiácidos
Halogenuros de alquilo
Ésteres Aminas primarias Ácidos polipróticos
Mercaptanos Aminas terciarias Oximas Polifenoles
Sulfuros Compuestos nitro (sin átomos de hidrógeno
en )
Compuestos nitro (sin átomos de hidrógeno
en )
CS2 Nitrilos (sin átomos de
H en )
Nitrilos (sin átomos de
H en )
(silicones)
CH3
Si OSiO
CH3
CH3CH3 r
HO CH2 CH2 O Hn
Cromatografía
10
En general un gran porcentaje de fase líquida conduce a una mayor capacidad
para el soluto, tiempos de retención mayores, y mayor separación entre picos. Un
porcentaje más bajo da por resultados análisis más rápidos y valores más pequeños de
HETP.
En las columnas tubulares abiertas se utilizan fases líquidas similares, con
modificaciones que minimizan la descarga de fase líquida de la columna
En las columnas empacadas como en las tubulares abiertas se emplean varias
fases estacionarias sólidas. La alúmina (Al2O3) es un material común que puede separar
hidrocarburos en cromatografía de reparto gas-sólido. Los tamices moleculares son una
notable fase sólida ampliamente usada en cromatografía; son materiales inorgánicos o
polímeros orgánicos con grandes cavidades en las cuales pueden entrar moléculas
pequeñas que son parcialmente retenidas.(8, 10)
Es posible separar entre si moléculas pequeñas como H2, O2, N2, CO2, y CH4.
También pueden sacarse gases haciéndolos pasar por trampas que contienen tamices
moleculares, porque estos retienen fuertemente el agua. Los tamices inorgánicos pueden
regenerarse (secarse) calentándolos a 300° C a vacío o a un chorro de N2.
EFICIENCIA DE LA COLUMNA
La eficiencia de la columna se mide por el número de platos teóricos; al comparar la
eficiencia de las columnas, debemos ser específicos al solvente, soluto, temperatura,
velocidad de flujo y tamaño de la muestra.
Cuando una sustancia entra a la columna junto con el gas de arrastre, se disolverá en la
fase liquida hasta que se establezca un equilibrio, de acuerdo con los valores de la
concentración en la fase estacionaria y en la fase m6vil. Durante el paso de la sustancia,
a lo largo de la columna, este equilibrio se rompe por efecto de transporte y debe
restablecerse consecutivamente. Desde el punto de vista teórico, es conveniente
considerar este proceso en varios pasos discontinuos de equilibrio; es como si
dividiéramos la columna en un número de secciones iguales entre si; en cada una de
estas secciones, el equilibrio vapor-liquido debe restablecerse. Se ha denominado a
cada una de estas secciones "Plato Teórico" (2)
El valor del número de platos teóricos puede obtenerse de un cromatograma, a partir de
la expresión siguiente:
N = 16 ( x/y)2
donde "x" es el tiempo de retención del componente y "y" es la amplitud de la base, por
lo que, se tiene:
N =16 ( tr/wb)2
El número efectivo de platos teóricos para una columna equivale a:
N ef =16 Ctlr/wb )2
donde: t’r = tr - tm
Cromatografía
11
A partir del número de platos y conociendo la longitud de la columna, podemos
encontrar el valor de la altura equivalente de un plato teórico (HETP).
HETP =L/N
donde: "L" es la longitud de la columna cromatográfica, usualmente en cm.(12, 13)
EFICIENCIA DEL SOLVENTE
La eficiencia del solvente está relacionada con los siguientes cuatro aspectos.
1. Fuerzas de interacción y coeficiente de partición.
a) Orientación o fuerzas keesom: Fuerzas resultantes de la interacción entre dos dipolos
permanentes. El enlace de hidrógeno es un tipo importante de fuerza de orientación,
que particularmente se encuentra en cromatografía de gases.
b) Dipolo inducido o fuerzas Debye: Fuerzas resultantes de la interacción entre el dipolo
permanente de una molécula y el dipolo inducido de una molécula vecina. Estas fuerzas
son generalmente pequeñas.
c) Dispersión o Fuerzas no-polares (London): Fuerzas acumuladas de las variaciones
sincronizadas en los dipolos instantáneos de l interacción de las especies.
d) Fuerzas de interacción específica: resultado de fuerzas de los enlaces químicos,
formación de complejos entre el soluto y el solvente.(10)
2. Eficiencia del solvente y temperatura.
La eficiencia del solvente se mide por la retención relativa () de 2 componentes
Figura 4. Retención relativa para 2 compuestos.
Inyección To T1 T2
x2 x1
x1’
x2’
Cromatografía
12
Retención relativa:
= x’2/x’1 si =1, no hay separación
es la relación de los tiempos de retención corregidos o coeficientes de partición para 2
picos. La retención relativa difiere del factor de separación (F.S), donde SF es relación
de los tiempos de retención sin corregir. Ver figura 4. (10)
1
2
1
2
tr
tr
x
xSF
3. Resolución (R).
La separación real de dos picos consecutivos se mide por la resolución, R es una medida
de las eficiencias de la columna y el solvente. Ver figura 5. (10)
Figura 5. Medidas para obtener la resolución de dos picos
21
2
ww
dR
o bien
21
122ww
trtrR
El valor de la resolución R dependerá de que tan bien definidos estén los picos. R=1
Significa que los picos están separados al 98% o sea que el 2% de los picos están
traslapados, R=1.5 significa que los picos están completamente separados (99.7%
separados).
4. Número de platos para una separación requerida
J.H. Punell desarrolló una ecuación para determinar el número de platos requeridos, así
como la longitud de la columna requerida, la expresión es la siguiente:
2
2
2
2
2
'
'
116
k
LkRN req
donde
k’2 es el factor de capacidad para el segundo pico (pico más retenido), el factor de
capacidad k, también puede definirse como el tiempo que pasa un compuesto en la fase
liquida de la fase estacionaria.
Cromatografía
13
tm
trk 2
2
''
ot
trk
''
donde
K es el Factor de capacidad
L es la longitud
orig
reg
origreqN
NLL
. (10)
DETECTORES
El detector cromatográfico es un recurso con el cual se identifica y mide la cantidad
de componentes separados por el gas portador.
Una de las clasificaciones digamos clásica de los detectores se divide en:
integrales
diferenciales.
Detector integral.
Es aquel que da una respuesta proporcional a la masa total del componente en la zona
eluída. Cuando el gas portador pasa a través del detector, el registrador muestra una
línea recta (línea base), cuando un componente pasa a través de la zona, la pluma del
registrador se mueve a través de la carta por una distancia proporcional a la masa total
del componente en la zona.
El cromatograma que produce un detector integral consiste en una serie de etapas que
corresponden a cada componente (figura 6). (10, 11)
T1 T2 Tiempo
Figura 6. Cromatograma integral.
R
E S
P
U E
S
T A
Cromatografía
14
Detector diferencial.
Es aquel que da una respuesta proporcional a la concentración o a la masa de velocidad
de flujo del componente eluído. El ejemplo de un detector que responde a la
concentración es el de conductividad térmica, el detector de ionización de flama (FID)
es un ejemplo de un detector que responde a la masa de la velocidad de flujo.
El cromatograma que se obtiene con un detector diferencial consiste en una serie de
picos, cada uno de los cuales corresponde a un componente diferente (figura 7). El área
bajo el pico es proporcional a la masa del componente. . (10, 11)
CARACTERISTICAS PARA UN DETECTOR
Los detectores cromatográficos difieren uno de otros en su principio de operación, por
lo que resulta difícil compararlos; sin embargo, presentan ciertas características que son
indicativas para la utilidad del detector, estas características son:
1. Selectividad.
La selectividad de un detector depende del principio de operación. Un detector de
conductividad térmica responde al cambio en la conductividad térmica entre la muestra
y el gas de arrastre, la conductividad térmica es proporcional al peso molecular, para el
componente.
2. Sensitividad o detectabilidad.
Para los detectores que responden a la concentración, la sensitividad es la respuesta del
detector en milivolts por unidad de concentración de la muestra.
3. Respuesta.
La respuesta de un detector es la Cantidad de una señal generada para una cantidad de
muestra dada.
4. Ruido y mínima cantidad detectable.
Figura 7. Cromatograma de un detector diferencial (11)
mV
Cromatografía
15
Es la señal eléctrica de salida de un detector, la cual se puede incrementar a un valor
deseado por medio de una amplificación electrónica. De esta forma, el ruido eléctrico y
la sensitividad del detector, se pueden agrandar como se desee. La mínima cantidad
detectable es la cantidad para una respuesta del detector igual a dos veces el nivel de
ruido.
5. Rango lineal.
La exactitud de un análisis cuantitativo, depende de la relación lineal entre la
concentración y la respuesta del detector; podemos definirla como la relación de
concentración grande o pequeña con la cual el detector es lineal.
. (10)
Los más comunes detectores empleados en cromatografía de Gases.
Conductividad térmica TCD
Ionización de Flama FID
Captura de electrones ECD
Fotométrico de flama FPD
Termoiónico específico TSD
Det. de Hall de conductividad electrolítica HECD
Espectrómetro de masas MS
Detector de Conductividad Térmica (TCD).
Este detector consiste en una serie de filamentos montados coaxialmente en uno o dos
cilindros metálicos; los filamentos se calientan por medio de una corriente eléctrica,
alcanzando una temperatura deseada. Para los detectores de un cilindro metálico, al
pasar el gas de arrastre por él, la temperatura del filamento dependerá de la naturaleza
del gas de arrastre y de su flujo; al introducir una sustancia diferente al gas de arrastre,
la temperatura del alambre variará si la sustancia introducida tiene un valor de
conductividad térmica diferente al del gas de arrastre.
Para los detectores compuestos de dos cilindros metálicos, se hace pasar gas de
arrastre por uno de ellos, en tanto que, por el otro, se hace pasar el gas de arrastre y la
muestra, por lo que se tendrán dos temperaturas diferentes para los dos filamentos;
como un cambio en la temperatura produce un cambio en la resistencia eléctrica del
filamento, tendremos dos resistencias diferentes; por consiguiente, el cambio de
resistencia del segundo filamento, con relación al primero, se puede registrar haciendo
que los filamentos formen parte de un puente Wheatstone. Como la variación de la
resistencia es debida a la presencia de la muestra, el registro será proporcional a la
cantidad de sustancia que pasa por el detector.
Los detectores de conductividad térmica se denominan a veces detectores universales,
ya que tienen respuesta para todas las substancias con excepción del gas de arrastre, los
análisis que se realizan son generalmente no destructivos, tienen menor sensibilidad que
los detectores de ionizaci6n. Su respuesta es dependiendo de la concentración de la
muestra en el gas de arrastre. (13, 14)
Cromatografía
16
Los parámetros más importantes en la operación de un detector de conductividad
térmica son:
a) Corriente del filamento;
b) Temperatura del bloque del detector (distinta a la temperatura del filamento en sí);
c) muestra;
d) Gas de arrastre
La tabla 3 nos proporciona los valores de conductividad térmica para algunas moléculas
(en unidades c.g.s. y a 0°C), la conductividad térmica disminuye al incrementar el peso
molecular.
Tabla 3 . Conductividad Térmica(10)
Gas x 105 a 0°C Peso molecular
Hidrógeno 41.6 2
Helio 34.8 4
Metano 7.2 16
Nitrógeno 5.8 28
Argón 5.1 40
Pentano 3.1 72
Hexano 3.0 86
Detector de Ionización de Flama (FID)
El detector de ionizaci6n de flama es el detector más importante en
cromatografía, su respuesta es para casi todos los compuestos orgánicos, tiene una
sensitividad relativamente alta y tiene un amplio rango de respuesta lineal. El FID
permite análisis rutinarios de compuestos en el rango de nanogramos (10-9
g).
El mecanismo de la producción de ionizaci6n en el FID consiste en la
combustión de la muestra orgánica a una temperatura alta producto de una flama de
H2/aire. La flama del FID es un ejemplo clásico de una difusión de flama; el efluente de
la columna se mezcla con el H2 y se propaga hacia el centro de un quemador, el aire se
suministra alrededor de la periferia del quemador. El H2 y el aire se mezclan por un
proceso de difusión de tal manera que, por medio de un encendido eléctrico se produce
una flama cuya temperatura es del orden de 2000°C.
La reacción química ocurre en la flama del FID en la conversión de H2 y 02 a
vapor de agua, cuando un compuesto orgánico se quema en la flama se generan iones
positivos y negativos; los iones positivos son colectados sobre un electrodo colector
produciendo una corriente eléctrica en proporción a la cantidad de materia quemada.
Esta corriente se amplifica por un electrómetro, el cual produce una señal de salida
capaz de graficar.(10, 12, 13)
Selectividad del FID: El detector responde a la mayoría de los compuestos con la
excepción de los que se enlistan en la figura 8.
Cromatografía
17
He 02 SO2 CO SiHC13
Ar N2 NO C02 SiCl4
Kr CS2 N2O H20 SiF4
Ne COS NO2 HCHO
Xe H2S NH3 HCOOH
Figura 8. Compuestos que dan un mínimo o no dan respuesta al FID. (10)
Respuesta del FID contra la velocidad de flujo
La respuesta del detector depende de la selección apropiada de las velocidades de flujo
para los gases que requiere para su operación (gas acarreador, hidrógeno y, aire). En
general, una buena sensitividad y estabilidad se pueden obtener con una velocidad de
flujo para: 30 ml/min de gas acarreador, 30 ml/min de H2 y 300 ml/min de aire.
La Figura 9muestra la afinidad entre la sensitividad del detector y la velocidad de Flujo
para el H2, usando un flujo de 30 ml/min de gas portador ), un flujo de 300 ml/min de
aire. La mayor respuesta del detector para propano se alcanza con un flujo de 30
ml/min de H2.
0.02
0.015
0.01
15 20 25 30 35 40 45
Flujo de H2 (ml/min)
Figura 9. Sensitividad del FID contra el flujo de H2. (10)
Como se muestra también en la Figura 10 la velocidad de flujo del aire afecta la
sensitividad del detector, por lo general, una velocidad de flujo de 300 ml/min es
satisfactoria para obtener una buena respuesta.
0 100 200 300 400 500 Flujo de aire (ml/min)
Figura 10. Sensitividad del FID contra el flujo de Aire. (10)
Sensitividad
(Cal/g)
Sensitividad
Cromatografía
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Detector de Captura de electrones (ECD)
•Responde a compuestos que contienen grupos funcionales electronegativos
•Su aplicación más común es para halógenos. También responde al antraceno,
cetoesteroides, nitrobencenos y fenoles; fumaratos, oxalatos, cetonas conjugadas. (12)
Una descripción de su funcionamiento se observa en la figura 11.
Figura 11. Diagrama de bloques del funcionamiento de un detector de captura de
electrones
Detector Fotométrico de Flama. FPD
•Este detector contiene un detector de flama, que realiza su misma función y después
pasa a través de un filtro que lleva la muestra a su estado elemental.
•La ventaja de este detector es que pueden hacerse análisis rápidos de compuestos de
azufre y fósforo atómico.
•Se emplea básicamente en la industria petroquímica. (12)
63Ni
Gas de
arrastre Iones
Grupo
electronegativo
Corriente de fondo estable a través de los electrodos
de la celda
Disminución de la
corriente de la celda
Cromatografía
19
Termoiónico específico TSD
•Trabaja mediante una señal de quimiluminiscencia, es específico para compuestos que
contienen nitrógeno y fósforo.
•Es ~500 veces más sensible a especies orgánicas que contienen P que el FID.
•Es ~50 veces más sensible a especies orgánicas que contiene N que el FID.
•Suprime la respuesta a carbón por 3 ó 4 ordenes de magnitud.
•Una esfera de cerámica ( Sulfato de Rubidio) calentada 600-1000°C suministra E para
la oxidación, cuya superficie actúa como catalizador para formar iones selectivos de N y
P, mientras que provee condiciones pobres para la formación de iones de C. (12)
Cromatografía
20
CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA
RESOLUCIÓN (HPLC)
Tradicionalmente la cromatografía de líquidos (HPLC), se realiza en las técnicas de fase
normal y fase reversa o fase inversa, aunque existen también técnicas como la
cromatografía de partición de intercambio iónico o de apareamiento iónico y
Cromatografía de afinidad. Se explican a continuación brevemente.
CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN EN FASE NORMAL
En este tipo de técnica, los compuestos son retenidos por la fase estacionaria sobre la
cuál éstos son adsorbidos. La fuerza de interacción de la molécula con la superficie
activa de la fase estacionaria determina el tiempo que tardará la molécula en atravesar la
columna. Las fases estacionarias y móviles más utilizadas en cromatografía de
adsorción en fase normal son las siguientes:
Fase estacionaria Fase móvil
SiO2 Hexano
SiO2-(CH2)n-NH2 Heptano
SiO2- (CH2)n-CH2O-CH3O Metanol
(10)
CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN EN FASE INVERSA
En la cromatografía de adsorción en fase inversa (RPC), la retención de los
componentes de una mezcla se lleva a cabo, por medio de fenómenos de adsorción de
éstos a la superficie de la fase estacionaria. La diferencia con la cromatografía de
adsorción en fase normal, radica en las polaridades invertidas de las fases estacionaria y
móviles (ver figura 12), es decir el sistema de fase reversa consiste en una fase
estacionaria apolar y una fase móvil polar. La fase estacionaria está conformada por
silicatos de estructura porosa sobre las cuales se encuentran unidas químicamente
cadenas hidrocarbonadas. Las fases más utilizadas son las cadenas de n-octil (RP8) y n-
octadecil (RP18). Las fases estacionarias y móviles más comunes son:
Fase estacionaria Fase móvil
SiO2- (CH2) 17-CH3 Metanol/Agua
SiO2- (CH2) 17 CH3 Acetonitrilo/Agua
. (10)
Cromatografía
21
En RPC el porcentaje de agua en la fase móvil tiene una enorme influencia, puesto que
un aumento del 10% de agua en la fase móvil puede duplicar el factor de retención.
De esta manera se puede modificar la retención de los componentes haciendo variar la
polaridad de la mezcla eluyente. . (11)
Figura 12. Diferencia entre cromatografía de fase normal y de fase inversa
CROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN
En la cromatografía de partición líquido – líquido, la fase estacionaria es un fluido, es
decir el soporte poroso de sílice se encuentra recubierto de una delgada película de
disolvente. En este sistema es requerido que la fase móvil sea inmiscible con la fase
estacionaria. La separación de la mezcla se debe a la diferencia de solubilidad de los
compuestos a analizar en la fase móvil o estacionaria. Aquí se aplica el coeficiente de
partición de NERNST. Si una sustancia se disuelve más fácilmente en la fase
estacionaria, tendrá una retención mayor que una sustancia soluble en la fase móvil e
insoluble en la fase estacionaria. La cromatografía de partición puede realizarse tanto en
fase normal como en fase inversa. (10, 11)
Polaridad
media
Sup. polar
de la fase
estacionaria
Sup. apolar
de la fase
estacionariaOH
OH
OH
OH
OH
OH
OHOH
OHCH3
CH3CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
Eluyente
apolar Eluyente
polar
Polar ApolarPolaridad
media
Sup. polar
de la fase
estacionaria
Sup. apolar
de la fase
estacionariaOH
OH
OH
OH
OH
OH
OHOH
OHCH3
CH3CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
Eluyente
apolar Eluyente
polar
Polar Apolar
Sup. polar
de la fase
estacionaria
Sup. apolar
de la fase
estacionariaOH
OH
OH
OH
OH
OH
OHOH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OHOH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OHOH
OHCH3
CH3CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3CH3CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
Eluyente
apolar Eluyente
polar
Polar Apolar
Fase normal Fase inversa
Cromatografía
22
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO O DE APAREAMIENTO
IÓNICO
Esta se utiliza para separar moléculas cargadas. La separación se debe a diferencias en
los equilibrios electrostáticos entre la fase estacionaria cuya carga es inversa a la de la
fase móvil.
La fase estacionaria consiste en una resina o un sólido generalmente poroso cuya
superficie está recubierta de grupos ionizados o ionizables. Los iones que aseguran la
electroneutralidad de la estructura son móviles e intercambiables con los de la fase
móvil en contacto con el intercambiador. Los intercambiadores más utilizados son
resinas poliméricas, las cuales normalmente son geles y sílices intercambiadores de
iones. La retención de un compuesto de carga opuesta dependerá de la fuerza de dicha
carga. El apareamiento iónico es una asociación entre el ión problema y un contra-ión.
(agente de apareamiento de carga opuesta añadido a la fase móvil). Ion y contra-ion
forman un complejo neutro hidrófobo, el cual es adsorbido sobre la resina. La retención
se efectúa por medio de un mecanismo de intercambio iónico y de adsorción. (10, 11)
CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
La cromatografía de afinidad es una variante de la cromatografía de adsorción y se
realiza preferentemente para purificar, aislar, concentrar compuestos y para el análisis
de moléculas bioquímicamente activas.
El sistema de fases está compuesto de una fase estacionaria modificada químicamente y
de una fase móvil acuosa. Este fenómeno cromatográfico se apoya en el equilibrio de
intercambio entre los ligandos de la fase estacionaria y la biomolécula complementaria.
(10, 11)
¿Cuáles son las partes de un cromatógrafo de Líquidos?
Figura 16. Esquema de un cromatógrafo de líquidos.
Figura 13 . esquema de un cromatógrafo de líquidos
Cromatografía
23
1. Reservorio de disolventes (fase móvil)
2. Bomba
3. Inyector y Filtros
4. Luv
5. Columna (fase estacionaria)
6. Detector
7. Registrador
Disolventes para cromatografía de líquidos
Los disolventes empleados para la cromatografía de líquidos deben reunir ciertas
características, la calidad de pureza debe ser grado HPLC, ser transparentes al detector
usualmente al UV, la viscosidad debe ser mínima, limpios en el análisis al IR, y la
miscibilidad a la fase estacionaria es de considerarse si no queremos tapar la columna.
Además deben considerarse los siguientes parámetros ya que todos estos
influyen en la separación cromotográfica y en el caso de la toxicidad, es importante
considerar la cantidad de disolventes con que se trabaja y la cantidad de residuos que se
generaran:
(10, 11)
1) Estabilidad (se debe asegurar que el sistema cromatográfico sea lo más estable
posible para hacerlo más repetible y reproducible)
2) Polaridad (es uno de los factores que influyen en la separación cromatográfica.
3) Inflamabilidad. (por la seguridad en el trabajo)
4) Efectos de mezcla (que la solubilidad de todos los analitos sea optima en el
disolvente y que la mezcla sea estable, no toxica)
5) Compatibilidad con la columna empleada
Columnas para cromatografía de líquidos
La Columna
Es el espacio físico donde se produce la separación físicamente debe reunir ciertas
características básicas:
1) resistente: debe resistir altas presiones
2)Químicamente estable.
Cromatografía
24
Usualmente las columnas están empacadas con una base de sílica o de un polímero
poroso con las características listadas en la Tabla 4:
Tabla 4. Características de soportes para columnas de HPLC
Empaque Base sílica Base polimérica
pH de trabajo De 1 a 7 De 1 a 10
Características + comunes,
+ económicas, mejor
resolución
+ delicadas,
+ caras,
- resolución
mejor estabilidad a pH básicos.
(10, 11)
Dado que los análisis en HPLC son más comunes en la industria farmacéutica,
química y alimentária, las columnas más usadas son las de tipo analítico. Con
dimensiones aproximada a 25cm de longitud por 4.6 cm de diámetro interno, son
columnas empacadas con partículas esféricas de 5 a 10 m, en años recientes el
diámetro interno ha disminuido,, el empaque de las columnas se elabora más esférico y
pequeño, pero deben emplearse precolumnas de para asegurar la vida media de las
columnas y eficientar la repetibilidad y reproducibilidad delos resultados.
El empaque de las columnas es usualmente un tipo de silica gel, la cual contiene grupos
silanol (Si-O-H) estos grupos son muy polares por lo que son sustituidos por ligandos
C18 ó C8 típicamente. (11)
Figura 14. Sílica gel muestra el grupo silanol y una sustitución química por un grupo
no polar. (11)
Alguna de las fases con las que son sustituidos estos silanoles son listadas en la tabla 5:
Cromatografía
25
Tabla 5. Fases para cromatografía de líquidos. (11)
Amino, NH3
O Si
R
R
(CH2)3 NH2
Octilo C8
O Si
R
R
(CH2)7CH3
Butilo, C4
O Si
R
R
(CH2)3CH3
ODS C18
O Si
R
R
(CH2)17CH3
Ciano, CN, Nitrilo
O Si
R
R
(CH2)3CN
Fenilo
O Si
R
R
(CH2)3
Hexilo C6
SAX
Si
R
R
(CH2)3 O N+
CH3
CH3
CH3CL-
Metilo, C1
Si
CH3
CH3
CH3 O
SCX
Si
R
R
(CH2)3 SO3H O - +
(10)
Elección de la columna.
Al analizar una muestra, después de resolver el problema de la extracción de los analitos
elegidos de la matriz compleja que representa la muestra como tal, el siguiente
problema es la elección de la columna, esto puede resolverse empleando la siguiente
tabla además hay métodos desarrollados por químicos analíticos especializados que
pueden consultarse en el área de aplicaciones de los catálogos de la EPA, ATSDR, o de
los proveedores de los equipos.
Si
R
R
(CH2)5CH3O
Cromatografía
26
Tabla 6. Guía para selección de fase y tipo de cromatografía. (10)
Muestra
problema
Peso molecular
uma
Solubilidad Carácter Tipo de
cromatografía
Fase estacionaria de la columna
PM<2000
Soluble en
agua
No iónico Fase reversa injertada RP8, RP18, CN,
RP8E, RP18E
Intercambio de
ligandos,
carbohidratos
Poliespher CHPB
CHCA, CHNA
Iónico
Fase reversa, control
de iónes
RP8, RP18, CN,
RP8E, RP18E
Fase reversa,
polimérica
Poliespher C18
Fase reversa
apareamiento iónico
RP selectiva B, RP8,
RP18
Exclusión iónica
Ácidos orgánicos
Poliespher OAKC,
OAHY, AAAC
Cromatografía iónica,
mineral, ácidos,
aminas
ICAN anions
ICCA cationes
Soluble en THF Permeación en gel,
moléculas pequeñas
Lichrogel PSI, PS4,
PS20
Soluble en
disolventes
orgánicos
Soluble en Hexano
Fase normal,
adsorción
Si 60, Si 100
Fase normal injertada CN, Dioles, NH2
Soluble en metanol
y metanol/agua Fase inversa injertada CN, NH2, C8, C18
PM>2000
Soluble en agua
Fase inversa injertada
RP8, RP18, 60
selectiva B, 100,
300, RP8 y RP8E
Permeación en gel
medio acuoso
Lichrospher diol
100ª, 300ª, 1000ª,
4000A
Intercambio iónico Polyspher PEI
Polyspher CM2
Interacción hidrofoba Polyspher butyl
Soluble en disolventes orgánicos
Permeación en gel Serie Lichrogel
Detectores más comunes para LC
En la cromatografía de líquidos de alta resolución no existe un detector universal como
tal, casi siempre es necesario seleccionar un detector con base en el problema que se
quiere resolver, eventualmente se requiere de dos o más detectores esto se debe a que la
fase móvil es un líquido de tal forma que los detectores están limitados en sensibilidad y
selectividad.
Los detectores más comunes en HPLC son los siguientes:
Cromatografía
27
Detector Tipo Selectividad Sensibilidad
Índice de refracción Universal Ninguna 10g/mL
UV/VIS Selectivo Dobles enlaces y aromáticos 1ng
Fluorescencia Selectivo Poliaromáticos 10pg/mL
Infrarrojo Selectivo Moléculas con 0 5 a 10ng/mL
Electroquímico Selectivo Especies oxidables
Masas (acoplado) Universal Iónes característicos ppb
(10, 11)
Detectores Fotométricos
El detector más usado para HPLC es el ultravioleta, su costo de operación es
relativamente bajo, tiene alta sensibilidad e insensibilidad a cambios de temperatura,
velocidad de flujo y composición de la fase móvil. Entre los compuesto que absorben en
la región de ultravioleta, se incluyen todas las que tienen dobles enlaces y los
compuestos con electrones no enlazados y no compartidos como olefinas, y todos los
aromáticos, los que tienen un grupo carbonilo, tiocarbonilo, nitroso y azo. Para emplear
este detector el disolvente de la fase móvil debe no interferir con absorbancia en esta
región del espectro.
Detector de Fluorescencia
Básicamente este detector mide la luz emitida, mas que la absorbida, ciertas moléculas
reemiten la luz que absorben (luz UV) en forma de baja energía y altas longitudes de
onda, mismas que pueden ser utilizadas como una medida de la concentración del
analito en cuestión. Es muy usado para determinar pureza ya que muchos Hidrocarburos
aromáticos policíclicos (HPA´s) son fluorescentes. La ventaja es que solo se genera una
señal cuando un compuesto fluorescente llega al detector. La significativa sensitividad
de este detector a fomentado el desarrollo de pre-columnas y pos-columnas que
realizan una derivación de compuesto que no son fluorescentes en compuestos que si
son fluorescentes para que el llegar al detector genere una señal y aumentar la capacidad
de la técnica.
Detector infrarrojo
Gracias a la presencia de diversos grupos funcionales en los compuestos analizados el
detector de infrarrojo es muy útil. Sin embargo solo pocos disolventes son transparentes
en la porción más útil de esta región del espectro, algunos de estos son tetracloro
metano (CCl4), triclorometano (CHCl3), sulfuro de carbono (CS2), mismos que son
infrecuentes en las separaciones cromatográficas.
Cromatografía
28
Detector electroquímico
Los electrodos empleados en este tipo de detectores suelen contaminarse
frecuentemente, por lo que se desarrollaron sistemas de autolimpieza automáticos. Este
tipo de detector es sensible a compuestos que pueden oxidarse o reducirse rápidamente
como fenoles, mercaptanos, aminas, compuestos nitro aromáticos, halogenados,
aldehídos, cetonas y especialmente benzidinas. La elección correcta del potencial
aplicado a los electrodos realza los límites de selectividad y sensibilidad del análisis.
Detector de masas ( acoplamiento de cromatografía de líquidos con espectrometría de
masas).
Con la espectrometría de masas, la química analítica tuvo un nuevo auge, ya que es una
de las herramientas más poderosas para la identificación de compuestos, los
espectrómetros de masas son relativamente fáciles de acoplar a los cromatógrafos de
gases, él acople a un cromatógrafo de líquidos requiere de una interfase especializada.
Existen las interfases de rayo particulado muy usadas en análisis estructurales y la
interfase de termospray (para análisis cuantitativos). Con un rayo de partículas se
pueden generar espectros de masas de compuestos conocidos y desconocidos así como
por ionización química.
(10, 11)
Cromatografía
29
TERMINOS Y CONCEPTOS BASICOS DE LA CROMATOGRAFIA.
Figura 15. Cromatograma para un pico resuelto (10)
Tiempo de retención
tr = Tiempo de retención absoluto (min.)
tm = Tiempo muerto o tiempo de retención de un componente retenido (min.)
t’r = Tiempo de retención corregido o relativo (min.)
t’r = tr – tm
wb = Ancho del pico medido desde la base (cm)
wh = Ancho del pico medido a la mitad de la altura (cm)
h = Altura total del pico (cm)
L = Longitud de la columna (cm)
N = Número de platos teóricos 2
h
r
2
w
t5.54 16
b
r
w
tN
Plato teórico
HETP o H = Altura equivalente de plato teórico
mt
LHEPTH
u = Velocidad lineal promedio (cm/s)
mt
Lu
= Retención relativa de dos picos adyacentes ó selectividad
1
2
r
r
t
t
R = Resolución de dos picos adyacentes
Cromatografía
30
2121
12 22
ww
d
ww
ttR
bb
rr
K = Relación ó coeficiente de partición
m
mr
m
r
t
tt
t
tk
Ecuación de Purnell
N = Número de platos teóricos requeridos 2
2 12
116
kkR
HEPT
LN r
Lr = Longitud requerida
(1, 2, 3, 4, 10, 11)
DEFINICIONES
Línea base. Es la línea dibujada por el registrador en ausencia de muestra.
Punto de inyección. Es el momento en el que se introduce la muestra al sistema
cromatográfico.
Tiempo muerto (tm). Tiempo que tarda un compuesto que no es retenido por la
columna, desde el punto de inyección hasta su paso por el detector.
Tiempo de retención (tr). Tiempo que transcurre desde la inyección de la muestra,
hasta el punto máximo del pico correspondiente a determinado compuesto de la mezcla.
Tiempo de retención corregido (t’r). Equivale al tiempo de retención., menos el
tiempo muerto del compuesto que no es retenido por la columna.
Altura del pico (h). Es la distancia perpendicular, desde la línea base a la máxima
deflecci6n del pico.
Amplitud de la base (wb). Es la distancia entre las intersecciones de las tangentes a los
puntos de inflexión con la línea base.
Amplitud a la mitad de la altura (wh). Distancia entre las tangentes del pico a la
mitad de su altura.
La resolución de los picos cromatográficos está relacionada con 2 factores: la
eficiencia de la columna y la eficiencia del solvente.
Adsorbente. Fase estacionaria para cromatografía gas – sólido.
Cromatografía
31
Derivación. Reacción química que se hace con la muestra con reactivos específicos,
para dar termo estabilización y volatilidad, facilitando la separación y la detección de
algunos compuestos.
Eficiencia. Grado de ensanchamiento del pico, separación efectiva de picos adyacentes.
Se expresa como número de platos teóricos (n) requeridos para tener una separación
aceptable y también como altura equivalente de plato teórico (HETP).
Integración. Medición del área bajo la curva (pico) en un cromatograma.
Relación de Partición (k). - Es la relación existente entre la cantidad de muestra en la
fase móvil.
Retención relativa de dos picos adyacentes (). Proporcionalidad de las relaciones de
particulación de os componentes de una muestra. También conocida como selectividad.
Salinalización. En la sustitución de los hidrógenos activos en una molécula orgánica
con grupos trimetilsilil (TMS) para incrementar la volatilidad y su estabilidad térmica.
Se utiliza también para hacer inertes los sitios activos de algunos solventes
Ecuación de Van Deemter*. Se refiere a la eficiencia relacionada con el flujo de fase
móvil, expresándola como:
H = A + B /u + C·u
donde:
A. Expresa la contribución de la difusión de Eddy al ancho del pico, esto es
independiente del flujo del gas y es proporcional al diámetro promedio de la partícula y
a las irregularidades del empaque.
B. Expresa la contribución a la difusión molecular en el ancho del pico, la magnitud del
termino es inversamente proporcional al flujo y directamente proporcional a las
tortuosidades de los canales del sistema.
C. Expresa la contribución a la resistencia en la transferencia de masa, en el ancho del
pico y es directamente proporcional al flujo y al cuadrado del espesor de la película de
la fase líquida e inversamente proporcional a la difusión en la fase líquida. (1, 2, 3, 4, 10, 11)
.
Cromatografía
32
CROMATOGRAFÍA DE GASES Y LÍQUIDOS MÉTODOS DE CUANTIFICACIÓN
Análisis cualitativo
Se basa en la diferencia de velocidades de migración de los componentes de una
mezcla entre dos fases; una estacionaria y una móvil (gas), de tal manera que cada
componente es selectivamente retenido por la fase estacionaria y eluye a un cierto
tiempo (tiempo de retención), dependiendo del programa empleado para su análisis.
Análisis cuantitativo
El auge creciente de la cromatografía durante las últimas cuatro décadas se debe
en parte a su rapidez, simplicidad, relativamente bajo costo, y a su gran aplicabilidad
como herramienta de separación. Su uso se ha extendido tanto porque puede también
proporcionar información cuantitativa acerca de las especies separadas. Por lo tanto
debemos tener en cuenta los aspectos cuantitativos aplicados a todos los tipos de
cromatografía.
La cromatografía en columna cuantitativa se basa en la comparación de la altura,
o del área, del pico del analito con la de uno o más estándares. En cromatografía plana,
el área cubierta por las especies separadas sirve como parámetro analítico. Si se
controlan las condiciones adecuadamente, esos parámetros varían linealmente con la
concentración.
Existen diversos métodos de cuantificación en cromatografía los cuales se
describen brevemente a continuación.
Método del % de Área
- Todos los componentes deben ser registrados.
- El factor respuesta para todos es el mismo.
- % de área.
Cromatografía
33
El porcentaje de área se obtiene mediante la fórmula 100%
1
n
i
i
A
AA
Donde
A representa el área bajo la curva de cada uno de los componentes i
*PICO No. Tr (min.) AREA % DE AREA
1 2.71 85,000 37.6931
2 3.48 72,000 31.9283
3 4.23 43,200 19.1570
4 5.78 25,305 11.2215
TOTAL 225,505 100
*Datos de la muestra
Método del % de Normalización.
- Todos los componentes deben ser registrados.
- El factor respuesta para cada componente de la muestra es diferente.
- Se emplea un estándar de cada uno de los componentes de la muestra para
determinar el factor de respuesta.
*PICO No. Tr (min.) AREA % DE AREA
1 2.71 85,000 37.6931
2 3.48 72,000 31.9283
3 4.23 43,200 19.1570
4 5.78 25,305 11.2215
TOTAL 225,505 100
*Datos de la muestra En este caso se conoce la identidad de todos los componentes mediante su tiempo de retención al correr estándares con las mismas condiciones cromatográficas y la misma concentración por lo que se puede obtener una tabla como la siguiente:
Datos de la muestra estándar
*PICO No. tr (min.) AREA CONC (mg)
1 2.71 50.000 15
2 (ref) 3.48 70.000 15
3 4.23 80.000 15
4 5.78 65.000 15
Para homogenizar la respuesta de cada uno de los componentes de la mezcla se debe calcular el factor de respuesta de cada uno de los analitos que aparecen en la muestra. Este factor será multiplicado por el área que corresponde a su analito con lo que se puede obtener una respuesta corregida matemáticamente similar en todos los casos.
¿Cómo se calcula el factor de respuesta?
.
Factor de Respuesta (FR)
FRi = Ci x A ref
Ai C ref
ref = estándar de referencia.
i = Analito
C = Concentración
A = Area
Cromatografía
34
FR 1= __15 x 70.000 = 1.4 FR1= 1.4
50.000 15
FR 2= __15 x 70.000 = 1.0 FR2= 1.0
70.000 15
FR 3= __15 x 70.000 =0.875 FR3= 0.875
80.000 15
FR 4= __15 x 70.000 = 1.076 FR4= 1.076
65.000 15
Ya obtenido el factor de respuesta se aplica la siguiente formula para obtener el
porciento de normalización (% N).
% N = Ai x FR i x 100
n
i=1 Ai x FR i
CALCULOS
% N 1 = _______________(85.000) (1.4)_____________
(85.000) (1.4) + (72.000) (1) + (43.200) (0.875) + (23.305) (1.076)
% N 1 = _________119.000_______
119,000+72,000+37,800+ 25,076.18
% N2 = (72.000) (1) x 100
253,876.18
%N3 = (43,200) (0.875) x 100
253,876.18
%N4 = (23,305) (1.076) X 100
253,876.18
%NT = 99.9998
Método del Estándar Externo.
Se debe inyectar primero la mezcla en el cromatógrafo con cantidades conocidas de
cada uno de sus componentes de interés y determinar el factor de respuesta de cada componente.
La relación de la cantidad de estándar con la respuesta (usualmente el área del pico) es conocida
como factor de calibración para ese componente particular.
% N1 = 46.8732
%N2 = 28.3602
% N 3= 14.8891
%N4 = 9.8773
Cromatografía
35
Cuando se analiza una mezcla de concentración desconocida, la cantidad de cada
componente es obtenida multiplicando
- El factor de respuesta para todos es calculado.
- Se inyecta siempre la misma cantidad.
Hacer cromatograma problema y las áreas halladas dividirlas por el factor de respuesta.
Calibración y Patrones
El método más sencillo para el análisis cromatográfico cuantitativo implica la
preparación de una serie de disoluciones de patrón de composición a la de la muestra. A
continuación se obtienen los cromatogramas de los patrones y se representan las alturas o áreas
de pico en función de la concentración. La representación de los datos debería originar una
línea recta que pasara por el origen de coordenadas; los análisis se basan en esta gráfica. Para
una mayor exactitud es necesario una estandarización frecuente.
Datos de la muestra. i=1
*PICO No. tr (min.) AREA % DE AREA 1 2.71 85,000 37.6931
2 3.48 72,000 31.9283
3 4.23 43,200 19.1570
4 5.78 25,305 11.2215
TOTAL 225,505 100
*Datos de la muestra
Datos de la muestra estándar
*PICO No. tr (min.) AREA CONC (mg)
1 2.71 50.000 15
2 (ref) 3.48 70.000 15
3 4.23 80.000 15
4 5.78 65.000 15
¿Cómo obtener el factor de calibración?.
Factor de Calibración (FC)
ci
cii
A
CFC
FC1 = 15 mg = 3.000x 10
-4 FC1
= 3.000x 10
–4
50,000
FC2 = 15 mg = 2.142 x10 -4
FC2 = 2.142 x10 -4
70,000
Cromatografía
36
FC3 = 15mg = 1.875 x 10-4
FC3 = 1.875 x 10-4
80,000
FC4 = 15 mg = 2.307 x 10-4
FC4 = 2.307 x 10-4
65,000
Al conocer Fci se puede aplicar la formula siguiente para obtener la cantidad del componente
(cx) Cxi = ( A Ci ) ( F Ci )
CALCULOS
C1= (85,000) (3.000x 10 -4
) = 25.5 mg C1= 25.5 mg
C2 = (72,000) (2.142 x10 -4
) = 15.4 mg C2= 15.4 mg
C3 = (43,200) (1.875 x 10-4
) = 8.1 mg C3= 8.1 mg
C4 = ( 25,305) (2.307 x 10-4
)= 5.8 mg C4= 5.8 mg
Al utilizar este método, la fuente más importante de error en los análisis es normalmente
la incertidumbre en el volumen de la muestra; ocasionalmente la velocidad de inyección de la
muestra es también un factor a considerar.
A menudo, las muestras son pequeñas (aproximadamente 1 microlitro) y la
incertidumbre asociada con la inyección de un volumen reproducible de ese tamaño con una
microjeringa puede significar un cierto porcentaje relativo, tal vez de varias unidades.
EXACTITUD DEL VOLUMEN INYECTADO (FV)
IS
im
V
VFV
Vim = Volumen inyectado de muestra
Vis = Volumen inyectado de estándar.
Entonces:
I
VI
FV
FCAC
iCx))((
Cromatografía
37
El método del estándar interno.
En cromatografía cuantitativa la mayor precisión se consigue por el uso de patrones
internos debido a que se evitan las incertidumbres que se introducen en la inyección de
la muestra. En este procedimiento, el estándar interno elegido debe reunir las siguientes
características:
- Proporcionar un pico bien resuelto
- Aparecer en el cromatograma en la mitad del mismo.
- No debe encontrarse en la muestra
- Su composición debe ser similar a la de los componentes de la mezcla
- En caso de haber muchos picos en el cromatograma se pueden emplear más de 2
estándares internos.
1-. Se realiza un cromatograma patrón con todas las sustancias y el estándar interno con
cantidades conocidas. Se calcula el factor de respuesta de cada uno de los analitos con
respecto al estándar interno.
2-. Realizar el cromatograma problema con una cantidad de estándar interno conocida.
(hacer 3 inyecciones y promediar)
3.- En caso de que el sistema no sea conocido se elabora una curva de calibración
incluyendo al estándar interno, con el fin de evaluar la linearidad del sistema.
4.- Conociendo:
área del analito (Ai),
l área del estándar interno (Aref), y
el factor de repuesta de ambos (FRref =1), así como la concentración del estándar
interno realizar el siguiente cálculo para conocer la concentración de i.
ref
iiref
iA
FrACC
(1, 2, 3, 4, 7, 10, 11, 13, 14)
Cromatografía
38
Referencias
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10. Vazquez, Mora, Basterrechea. Diplomado en Instrumentación analítica. Segunda
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Science, Vol. 28 pp. 133-153. March 1990.
13. Zweig and J. Sherma. CRC Handbook of Chromatography, Vol. 1 y 2
14. Manual Práctico de Cromatografía de Gases. Perkin Elmer.1990.
Cromatografía
39
Índice de Figuras Figura Pagina
Índice de tablas Tabla Pagina
1 Fases liquidas comunes para columnas cromatograficas 9
2 Fases liquidas comunes usadas en cromatografía de gases 9
3 Conductividad Térmica 16
4 Características de soportes para columnas de HPLC 24
5 Fases para cromatografía de liquidos 25
6 Guia para selección de fase y tipo de cromatografia 26
1 Esquema De Un Cromatógrafo De Gases
4
2 Plano de Van Deempter para la selección de la velocidad de flujo
óptimo del gas de arrastre (12)
5
3 Diferencia entre columna empacada y capilar. 7
4 Retención relativa para 2 compuestos 11
5 Medidas para obtener la resolución de dos picos 12
6 Cromatograma integral 13
7 Cromatograma de un detector diferencial 14
8 Compuestos que dan un mínimo o no dan respuesta al FID 17
9 Sensitividad del FID contra el flujo de H2 17
10 Sensitividad del FID contra el flujo de Aire 17
11 Diagrama de bloques del funcionamiento de un detector de captura de
electrones
18
12 Diferencia entre cromatografía de fase normal y de fase inversa 21
13 Esquema de un cromatógrafo de Líquidos. 22
14 Sílica gel mestra el grupo silanol y una sustitución química por un
grupo no polar
24
15 Romatograma para un pico resuelto 29
