Upload
others
View
1
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
新規細胞接着ペプチドを用いた創傷治療への応用
大分大学 医学部講師 岡本 修
研究背景
細胞外マトリックスの未知の蛋白質の生物学的な役割を解明することにより、不都合な生物現象の改変を目指す。
細胞外マトリックスにおける未知の蛋白質の分離精製。
細胞外マトリックス(細胞外基質)とは
組織で細胞の周囲を埋める物質
いずれの組織でも認められる。組織によって量の違いがある。
表皮
真皮
細胞外マトリックスに乏しい
細胞外マトリックスが豊富
真皮の細胞外マトリックスにおける未知の蛋白質の分離精製。
理由
細胞外マトリックスが豊富である。難溶性で一般的に研究が進んでいない。
競争相手が少ない。
出発材料:ウシ真皮2kg
グアニジン塩酸溶液で可溶化(約10リットル)
脱塩後、尿素存在下でゲルろ過
PyrE Y G D Y G Y S Y H Q Y H D YSDD
GWVNLNRQG F S Y Q C P H G Q V V V A V R S
IFNKKEGSDRQWNY
ACMPTPQSLGE P T E C W W E E I N R A
GMEWYQTC
SN N G L V A G F
QSRYFESVLD
REWQFYCCRYSKR
CPYSCWL
TT E Y P G H Y G E E M DMISYNYD
YYMRGATTTFSAV
ERD
RQWKFIMCRM
TDYD CEF
ANV
1 10
20
3040
5060
70 80
90
100
110
120
130 140
150160
170
180
22 kDa proteindermatopontin(デルマトポンチン)
183個のアミノ酸
疎水性、酸性蛋白質4個のループ構造繰り返し配列3ヶ所
DP
線維芽細胞接着 (1991)心筋梗塞巣周辺で強発現 (2002)
創傷治癒に関係か?
表皮細胞では?
DPについてわかっていたこと
1.線維芽細胞接着能を有する2.コラーゲンの構造を変化させる
真皮に比較的豊富に存在するが、機能がほとんどわかっていない
DPの機能解明
Abs
orba
nce
at 5
95 n
m
dermatopontin (μg/ml)
0
0.4
0.8
1.2
0 4 8 12 16 20
1 h
30 min
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0 10 20 30 40 50
D
B
A
C
0
0.625
1.25
2.5
F
E
G
5
10
20(μg/ml)
Fb
HaCaT
HaCaTはDPに接着する
DPはHaCaTのスプレッディング
を誘導する
HaCaT-DP の細胞接着はEDTAで抑制されるが、
ヘパリンによる抑制効果は弱い
heparin (μg/ml)
B
0
0.4
0.8
1.2
0 2 4 6 8 10
Abs
orba
nce
at 5
95 n
m
EDTA (mM)
A
0
0.4
0.8
1.2
0 2 4 6 8 10
anti-α1
anti-α2
anti-α3
anti-α6
anti-ß1PBS
background
Abs
orba
nce
at 5
95 n
m
0
0.2
0.4
0.6
0.8
*
*
DPのレセプターの1つはα3β1インテグリンである
0
0.4
0.8
1.2
dermatopontin
DP-1DP-2DP-3DP-4DP-5DP-6DP-7DP-8DP-9DP-10DP-11DP-12DP-13DP-14DP-15DP-16
background
B
Abs
orba
nce
at 5
95 n
m
*
DP-1DP-2DP-3DP-4DP-5DP-6DP-7DP-8DP-9DP-10DP-11DP-12DP-13DP-14DP-15DP-16
background
Abs
orba
nce
at 5
95 n
mPBS
0
0.4
0.8
1.2
A
*
DP-4 ペプチドで HaCaT-DP 細胞接着が阻害される
DP-4 ペプチドにHaCaT は接着する
PyrE Y G D Y G Y S Y H Q Y H D Y SDDGWVNLN
RQG F S Y Q C P H G Q V V V A V R S I F
NK
KEGSDRQWNYACMPTPQSLG E P T E C W W E E I N R A
GMEWYQTC
SN N G L V A G F
QSRYFESVLDR
EWQFYCCRYSKR
CPYSCW
LTTE Y P G H Y G E E M D
MISYNYD
YYMRGATTTFSAV
ERDR
QWKFIMCRM
TDYD CEFANV
1 10
20
3040
5060
70 80
90
100
110
120
130 140
150
160
170
180
DP-4 peptide
Abs
orba
nce
at 5
95 n
m
Peptide (μg/ml)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
0 10 20 30 40 50
DP-4
DP-5
D
B F
E
G
A
0
1.56
C
3.13
6.25
12.5
25
50(μ g/ml)
HaCaTはDP-4に接着する
DP-4はHaCaTのスプレッディング
を弱く誘導する
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
DP-44a 4b 4c 4d 4e 4f 4g 4h 4ibackground
PBS
A
Abs
orba
nce
at 5
95 n
mpeptide
* *
peptide
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
background
DP-44a 4b 4c 4d 4e 4f 4g 4h 4idermatopontin
Abs
orba
nce
at 5
95 n
m
B
**
*
* **
HaCaT-DP-4 細胞接着阻害
HaCaT-欠損ペプチド接着
PHGQVVVAVRS
-HGQVVVAVRS--GQVVVAVRS----VVVAVRS-----VVAVRS
DP4
DP4aDP4bDP4cDP4d
DP4eDP4fDP4gDP4hDP4i
PHGQVVVAVR-PHGQVVVAV--PHGQVVVA---PHGQVVV----PHGQVV-----
DP4 欠損ペプチド
PyrE Y G D Y G Y S Y H Q Y H D Y SDDGWVNLN
RQG F S Y Q C P H G Q V V V A V R S I F
NK
KEGSDRQWNYACMPTPQSLG E P T E C W W E E I N R A
GMEWYQTC
SN N G L V A G F
QSRYFESVLDR
EWQFYCCRYSKR
CPYSCW
LTTE Y P G H Y G E E M D
MISYNYD
YYMRGATTTFSAV
ERDR
QWKFIMCRM
TDYD CEFANV
1 10
20
3040
5060
70 80
90
100
110
120
130 140
150
160
170
180
DP-4 peptide
Abs
orba
nce
at 5
95 n
m
EDTA (mM)
A
0
0.4
0.8
1.2
1.6
0 2 4 6 8 10heparin (μg/ml)
B
0
0.4
0.8
1.2
1.6
0 1 2 3 4
HaCaT-DP の細胞接着はヘパリンにより強く抑制されるが、EDTAによる抑制はやや弱い
Heparitinase I
Chondroitinase ABC
PBSblank
0
0.5
1
1.5
2
*
Abs
orba
nce
at 5
95 n
m
DP-4のレセプターはヘパラン
硫酸プロテオグリカンである。
0
0.4
0.8
1.2
1.6
DP-4DP-4SDP-4TDP-5DP-8blank
Abs
orba
nce
at 4
05 n
m
*
* * *
DP-4はヘパリンに
結合する
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
Syn-1 Syn-1
DP-4 DP-5
*
control control1 2 3 4
Abs
orba
nce
at 5
95 n
m
DP-4のレセプターの1つはシンデカンである。
Day 4 Day 6
Day 10Day 15
DPは皮膚の創傷治癒過程で発現する
生体ではDPは真皮に発現して新生表皮の
接着や遊走を助けていると思われる。
ではDPの細胞接着部位であるDP-4を創傷に
投与すれば表皮の接着、遊走が誘導されるか=創傷治癒は促進されるのか
A B
C D
6d
DP-4PBS
DP-4PBS
0
0.5
1
コントロール DP-4 投与
P=0.0038
新生
上皮
延長
距離
(mm
)
**
DP-4投与により創傷治癒が促進する
DP-4 投与 トラフェルミン 投与
新生
上皮
延長
距離
(mm
)
0
0.5
1
1.5
2
2.5P=0.0228
*
DP-4はトラフェルミンと同等以上の
創傷治癒促進効果を示す
まとめ
1.DPは強力な表皮細胞接着能を有する。
2.接着に関わるレセプターはインテグリンとシンデカンである。
3.シンデカン結合部位はDP-4ペプチドだが、
インテグリン結合部位は不明である。4.DP-4も強力な表皮細胞接着活性を持つ。5.DP-4は既存の製品と同等以上の創傷治癒
促進活性を持つ。
想定される用途
急性の創傷の治療(熱傷など)
胃潰瘍の治癒促進?
実用化に向けた課題
創傷へのペプチドの接着性の向上
新技術の特徴・従来技術との比較
1.合成の容易な単純なペプチドである。
2.化学的に大量生産が可能。
本技術に関する知的財産権
• 発明の名称 :ペプチド製創傷治療剤
• 出願番号 :特願2008-13600• 出願人 :大分大学
• 発明者 :岡本 修
• 大分大学
• 知的財産本部 福永将司
• TEL 097-554 -7430
• FAX 097-554 -7982
• E-mail chizai@cc.oita-u.ac.jp
お問い合わせ先