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MEIO DE CULTURA
DEFINIÇÃO
- São preparados especiais com finalidade de cultura e isolamento de microrganismos.
- Uma grande variedade de processo e de preparações nutrientes é utilizada para induzir o crescimento e as reproduções de microorganismos.
MEIOS DE CULTURA
- Não existe um meio de cultura universal para o crescimento de todos os microrganismos.
Ex: não existe meio de cultura para microrganismos como Treponema pallidum e Micobacterium leprae.
- Estes microrganismos só podem ser cultivados em animais de laboratório.
MEIOS DE CULTURA
NATURAIS
- Lagos
- Oceanos
- Solo
ARTIFICIAIS OU SINTÉTICOS
- São nutrientes preparados no laboratório para o crescimento de microrganismos.
MEIOS DE CULTURA
PREPARAÇÃO
- De acordo com o fabricante.
- Técnica de preparação vem especificada no rótulo dos frascos.
- Pesar e hidratar o meio conforme as instruções do fabricante.
MEIOS DE CULTURA
MÉTODOS DE ESTERILIZAÇÃO
1 - Autoclave (calor úmido) 121ºC por 15 a 20 minutos.
- Vapor fluente
MEIOS DE CULTURA
MÉTODOS DE ESTERILIZAÇÃO
2 – FILTRAGEM
- Produtos termo sensíveis
- Membranas de acetato de celulose (0,22 μm).
CONSTITUINTES DO MEIO DE CULTURA
- Água: Principal solvente dos nutrientes.
- Fontes de Carbono: pode ser do CO2 ou de nutrientes orgânicos (carboidratos, lipídeos e proteínas).
- Fonte de energia: Carboidratos como amido, glicogênio, monossacarídeos
CONSTITUINTES DO MEIO DE CULTURA
• - Fonte de Nitrogênio “base amino-proteína”: peptidase: Aminoácidos, peptídeos, proteínas complexas e peptona.
• - Fontes de oxigênio, hidrogênio, fósforo (fosfatos) e enxofre (sulfatos)
- Vitaminas: Complexo B ( biotina e ácido pantotênico).
CONSTITUINTES DO MEIO DE CULTURA
- Sais tamponados: Fósforo (fosfatos), enxofre (sulfato) e citrato.
- Sais minerais: Cálcio, Ferro, Magnésio
- Fatores de crescimento: sangue, soro e extrato de levedura.
MEIOS DE CULTURA
- Agentes seletivos: Químicos, Corantes, e Antimicrobianos
- Indicadores de pH: feno vermelho
- Agentes de gelificação para meios sólidos: Ágar
1 – DE ACORDO COM A CONSISTÊNCIA
SÓLIDOS
- Usa ágar, um polímero de galactose como agente solidificante na concentração de 1,35 a 2,0%.
- Funde-se à 100ºC, Líquido à 40ºC e sólido à 37ºC.
- São feitos em frascos, placas de petri e tubos de ensaio.
1 – DE ACORDO COM A CONSISTÊNCIA
SEMI-SÓLIDOS
- Usa ágar, como agente solidificante na concentração de 0,2 à 0,75%.
- Funde-se à 100ºC, Líquido à 40ºC e Semi-sólido à 37ºC.
- São feitos em tubos de ensaio
1 – DE ACORDO COM A CONSISTÊNCIA
LÍQUIDOS
- São os meios isentos de ágar.
- São sempre líquidos mesmo até a 37ºC e em temperaturas inferiores.
- São feitos em tubos de ensaio
CRESCIMENTO MICROBIANO
MEIO SÓLIDO: o crescimento de bactérias é visualizado pela formação de colônias.
MEIO SEMI-SÓLIDO: o crescimento de bactérias é visualizado pela turvação. Meio muito utilizado para verificar a motilidade (movimento) da bactéria.
MEIO LÍQUIDO: o crescimento de bactérias é visualizado pela turvação do meio.
CRESCIMENTO MICROBIANO
MEIO SÓLIDO
COLÔNIAS: são milhares de células bacterianas derivadas de uma única célula bacteriana semeada na superfície do ágar.
TEMPO PARA VISUALIZAÇÃO DAS COLÔNIAS:
- Maioria dos microrganismos cresce de 12 à 48 horas.
- Outros exigem semanas e até mêses.
CRESCIMENTO MICROBIANO
MEIO SÓLIDO
Exemplos: Ágar Sangue, Ágar chocolate, Ágar MacConkey, Ágar SS (Salmonela, Shigella), Ágar VB (Verde-Brilhante), Ágar CLED (Cisteína Lactose Eletrólitos Deficientes), Ágar Base, Ágar Citrato de Simmons, Ágar Nutriente, Ágar TSI (Triplice Açúcar e Ferro), Ágar Müller Hinton), etc....
CRESCIMENTO MICROBIANO
MEIO SEMI-SÓLIDO
Exemplos: Ágar SIM (Motilidade Indol Sulfeto) etc....
MEIO LÍQUIDO:
Exemplos: BHI (Infusão de cérebro e coração), Tetrationato, Selenito, Uréia, etc...
CRESCIMENTO MICROBIANO
MEIO SÓLIDO X MEIO LÍQUIDO
- Meio líquido é impossível afirmar a existência de mais de uma espécie de bactérias ou até mesmo quantificar.
- Meio sólido pode-se afirmar a presença de várias espécies bacterianas.
CLASSIFICAÇÃO DO MEIO DE CULTURA
2 – TIPOS ou FUNÇÃO
MEIOS COMPLEXOS
- São meios quimicamente indefinidos, mas tem como função similar ao ambiente natural da bactéria.
Ex: Ágar sangue, Ágar chocolate.
CLASSIFICAÇÃO DO MEIO DE CULTURA
2 – TIPOS
MEIOS SINTÉTICOS
- São meios de composição química conhecida. São utilizados para estudo de necessidades nutricionais de determinadas bactérias.
Ex: Meio para micobactérias.
CLASSIFICAÇÃO DO MEIO DE CULTURA
2 – TIPOS
MEIOS DIFERENCIAIS
- São meios que permitem a distinção (diferenciação) entre dois ou mais tipos de bactérias pelas simples observação das características apresentadas pelas suas colônias que neles se desenvolvem.
- Os meios diferenciais permitem o crescimento de várias espécies ao mesmo tempo, que facilita a discriminação entre os diferentes microrganismos.
CLASSIFICAÇÃO DO MEIO DE CULTURA
2 – TIPOS
MEIOS DIFERENCIAIS
Ex: Mac Conkey
- Permite a distinção entre bactérias fermentadoras da lactose (lactose positiva – apresenta colônias rosa) e bactérias não fermentadora da lactose (lactose negativa – apresenta colônias incolores).
CLASSIFICAÇÃO DO MEIO DE CULTURA
2 – TIPOS
MEIOS SELETIVOS
- São meios cuja composição promovem e/ou inibem o crescimento de um determinado microrganismo ou grupo de microrganismos.
- Os meios seletivos proporcionam o meio pelo qual podemos isolar uma determinada espécie ou categoria de bactérias.
CLASSIFICAÇÃO DO MEIO DE CULTURA
2 – TIPOS
MEIOS SELETIVOS
- São usadas substâncias seletivas como os corantes tais como cristal violeta, azul de metileno, eosina e verde brilhante.
Ex. Mac Conkey além de seus nutrientes contém cristal violeta e sais biliares que inibe o crescimento de bactérias Gram- positivas e permitindo o crescimento de Gram-negativas.
CLASSIFICAÇÃO DO MEIO DE CULTURA
2 – TIPOS
OSERVAÇÃO
- ALGUNS MEIOS SÃO TANTO DIFERENCIAIS COMO SELETIVOS.
Ex: Ágar Mac Conkey
CLASSIFICAÇÃO DO MEIO DE CULTURA
2 – TIPOS
MEIOS DE ENRIQUECIMENTO
- São meios utilizados para isolar um microrganismo de um meio em que está presente em pequena quantidade.
- São meios enriquecidos com sangue, soro ou outros nutrientes.
Ex: Ágar sangue, Ágar chocolate.
CLASSIFICAÇÃO DO MEIO DE CULTURA
2 – TIPOS
MEIOS DE ENRIQUECIMENTO
Ex: Tetrationato e Selenito
- São meios usados para amostras fecais (coprocultura) inibindo o crescimento da microbiota (bactérias normais das fezes) e permitindo o crescimento de Salmonella e Shigella que são patogênicas.
CLASSIFICAÇÃO DO MEIO DE CULTURA
2 – TIPOS
MEIOS DE TRANSPORTE
- São meios utilizados para o transporte e manutenção de amostras biológicas como fezes e secreções.
- São meios inertes, pois, permitem a viabilidade da maioria dos patógenos sem alterar a sua concentração.
CLASSIFICAÇÃO DO MEIO DE CULTURA
2 – TIPOS
MEIOS DE TRANSPORTE
Ex: Meio de Stuart ou Amies usado para o transporte com swabs.
Ex: Meio Cary-Blair e salina glicerinada tamponada útil no transporte de fezes para o isolamento de shigella e Salmonella.
CLASSIFICAÇÃO DO MEIO DE CULTURA
2 – TIPOS
MEIOS DE MANUTENÇÃO
- São meios utilizados para a preservação das bactérias para a realização de exames complementares para estudos futuros como pesquisa clínica, epidemiológica ou educacional.
Ex: Caldo TSB, caldo nutriente, água destilada.
MEIOS DE MANUTENÇÃO
Métodos de preservação:
Curto período de tempo: temperaturas de 2 a 8 ºC ou de 4 à 10ºC (refrigerador): duração por semanas. Fazer subculturas em caldo TSB ou caldo nutriente.
Longo período de tempo: temperaturas de-70 à -196ºC. Duração por anos (1 até 10 anos).
- Nitrogênio líquido: (-196ºC)- Freezers: (-70 à -120ºC) temperatura
ultra baixa.- Liofilização: congelamento à seco.
CLASSIFICAÇÃO DO MEIO DE CULTURA
2 – TIPOS
MEIOS DE IDENTIFICAÇÃO
- São meios utilizados na identificação das bactérias Gram-positivas e Gram-negativas.
Ex: EPM e MILI para identificação de Enterobactérias (Gram-negativas) e Rugai
Ágar Bile esculina. Identificação de Gram-positivas.
CONDIÇÕES FÍSICAS PARA A CULTURA DAS BACTÉRIAS
- TEMPERATURA
- pH
- ATMOSFERA GASOSA
- PRESSÃO OSMÓTICA
- PRESSÃO HIDROSTÁTICA
- LUZ
CONDIÇÕES FÍSICAS PARA A CULTURA DAS BACTÉRIAS
PRESSÃO OSMÓTICA
- Meios hipertônicos: as bactérias perdem água e sofrem plasmólise ou enrugamento da célula.
- Meios isotônicos: concentrações iguais, é o mais recomendado.
- Meios hipotônicos: as células ganham água e sofrem lise.
CONDIÇOES FÍSICAS PARA CRESCIMENTO.
TEMPERATURA
- Psicotróficos: 0 à 7ºC
- Psicrófilos: 0 à 20ºC.
- Mesófilos: 20 à 45°C.
- Termófilos: 45 à 90°C.
A maioria são mesófilas.
- Temperatura ótima: 36,5 a 37°C em estufa bacteriológica.
CRESCIMENTOS DAS BACTÉRIAS
pH
- Acidófilos: pH 0,1 à 5,4
- Neutrófilos: pH 5,4 à 8,5
- Alcalófilas: ph 7,0 à 11,5
A maioria na faixa de 4,0 a 9,0.
- Ideal: próximo da neutralidade 6,8 a 7,2.
- pH próximo do neutro (7,0) para a maioria das bactérias.
CRESCIMENTO DAS BACTÉRIAS
PRESSÃO HIDROSTÁTICA
- Água dos oceanos e lagos exercem pressão hidrostática.
- Bactérias barófilas: vivem em alta pressão “profundidade”.
CRESCIMENTOS DAS BACTÉRIAS
ATMOSFERA GASOSA
- Microrganismos aeróbios: 21% de oxigênio.
- Jarra de microaerofilia para microrganismos que necessitam de CO2.
CRESCIMENTOS DAS BACTÉRIAS
ATMOSFERA GASOSA
- Microrganimos anaeróbios facultativos: crescem na presença de ar ou anaeróbiose.
- Microrganimos microaerófilos: Não resistem á níveis de oxigênio (1-15%).
CRESCIMENTOS DAS BACTÉRIAS
ATMOSFERA GASOSA
- Microrganismos anaeróbios: Morrem em presença de oxigênio, não crescem em presença de ar e não utilizam oxigênio para reações de produção de energia.
- Jarra de anaerobiose.
CRESCIMENTOS DAS BACTÉRIAS
TEMPO
- Aumento no número da população na cultura: 1→2→4→8→16→……
Progressão geométrica?
1→21→22→23→24….→2n
n = número de gerações
2n = número total de células em uma cultura.
CRESCIMENTOS DAS BACTÉRIAS
TEMPO DE GERAÇÃO DAS BACTÉRIAS.
- De 30 em 30 minutos.
- PERÍODO DE INCUBAÇÃO
- 24 a 48 horas em estufa bacterilógica.
MEIOS DE CULTURA MAIS UTILIZADOS.
Ágar sangue de carneiro a 5,0%
- Meio não seletivo e diferencial que permite o crescimento de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, além de permitir a visualização de hemólise.
MEIOS DE CULTURA MAIS UTILIZADOS.
Ágar Mac Conkey
- Meio seletivo e diferencial que permite o crescimento de bactérias (bacilos) Gram-negativas, diferenciando as bactérias em lactose positiva e lactose negativa. Inibe o crescimento de bacctérias Gram-positivas.
MEIOS DE CULTURA MAISUTILIZADOS.
Ágar Mac Conkey
• - É utilizado para o isolamento de
Enterobactérias (Escherichia coli,
Proteus sp, etc.. e bacilos entéricos não
fermentadores (Shigella e Salmonella).• - Amostras utilizadas: fezes, urina,
água de esgoto, alimentos , etc...
MEIOS DE CULTURA MAIS UTILIZADOS.
Ágar Mac Conkey
- Sua composição contém cristal violeta e sais biliares que inibe o crescimento de bactérias Gram-positivas.
- Utiliza a lactose como único carboidrato como fonte de energia e carbono.
MEIOS DE CULTURA MAIS UTILIZADOS.
Ágar Mac Conkey
- Bactérias fermentadoras de lactose produzem enzimas como a beta-galactosidase e lactose permease que produzem ácido diminuindo o pH e produzem colônias rosas chamadas de colônias lactose positiva.
Ex: Escherichia coli
MEIOS DE CULTURA MAIS UTILIZADOS.
Ágar Mac Conkey
- Bactérias não fermentadoras de lactose não produzem enzimas portanto não produzem ácidos, aumenta o pH do meio, produzindo colônias incolores, transparentes ou ambar chamadas de colônias lactose negativa.
Ex: Salmonella typhi, Shigella dysenteriae.
IDENTIFICAÇÃO DAS COLÔNIAS
1 - CARACTERÍSTICAS DAS COLÔNIAS
TAMANHO (mm)
- Grande: maior que 1 mm de tamanho
- Média: 1 mm de diâmetro
- Pequena: menor que 1 mm de diâmetro.
IDENTIFICAÇÃO DAS COLÔNIAS
COR
- Amarela, Branca, Branca- acinzentada, Cinza, Rosa, Esverdeada, Preta, Alaranjada, Creme, Incolor, etc...
ODOR
- Uva, Água sanitária, Fermento de pão, Vinagre, Queijo, Terra molhada, Peixe, Caramelo, etc...
IDENTIFICAÇÃO DAS COLÔNIAS
DENSIDADE
- Opaca, Translúcida, Transparente
CONSISTÊNCIA
- Brilhante, Cremosa, Seca, Mucóide
PIGMENTO
- Amarelo, Vermelho, Mostarda
IDENTIFICAÇÃO DAS COLÔNIAS
BORDA OU FORMA
- Circular (redonda), irregular, puntiforme, ondulada
ELEVAÇÃO
- Convexa, Achatada, Elevada, Umbilicada, centro elevado
IDENTIFICAÇÃO DAS COLÔNIAS
HEMÓLISE: é a lise (quebra, rompimento) da hemácia.
Total (beta- hemólise): zona clara ao redor das colônias.
Parcial (alfa-hemólise): há formação de um halo esverdeado em volta da colônia, indicando hemólise parcial das hemácias.
Ausência de hemólise (gama-hemólise): o meio permanece íntegro em volta das colônias.
MEIOS DE CULTURA
Inoculação dos meios de cultura.
- INÓCULO: é quando os microrganismos são colocados em um meio de cultura para iniciar o crescimento.
Inocular primeiramente os meios menos seletivos para evitar que substâncias inibidoras sejam transferidas de um meio para o outro.
Ex: semear primeiro no ágar sangue ou ágar chocolate em seguida no mac Conkey.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICASBARBOSA, H. R.; TORRES, B. B. Microbiologia básica. São Paulo: Atheneu, 2005. BLACK, J. G. Microbiologia – fundamentos e aplicações. 4. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2002.KONEMAN, E. W.; ALLEN, S. D.; JANDA, W. M.; SCHRECKENBERGER, P. C.; WINN JÚNIOR, W. C. Diagnóstico microbiológico. Texto e atlas colorido. 5. ed. Rio de Janeiro: MEDSI Ed. Médica e Científica, 2001.LEVINSON, W.; JAWETZ, E. Microbiologia médica e imunologia. 7. ed. Porto Alegre: Artmed, 2005. MINS, C.; PLAYFAIR, J.; RITT, I. WAKELIN, D.; WILLIAMS. R. Microbiologia médica. 2. ed. São Paulo: Manole, 1999. PELCZAR Jr., M. J.; CHAN, E. C. S. KRIEG, N. R. Microbiologia – conceitos e aplicações. 2. ed. v. 1 e 2. São Paulo: Makron Books do Brasil, 1997. SPICER, W. J. Bacteriologia, micologia e parasitologia clínicas – um texto ilustrado em cores. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2000. THOMAS, C. L. Dicionário médico enciclopédico – Taber. 17. ed. São Paulo: Manole, 2000. TORTURA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. H. Microbiologia. 8. ed. São Paulo: Artmed, 2005.TRABULSI, L. R.; ALTERTHUM. Microbiologia. 4. ed. São Paulo: Atheneu, 2005.