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27/03/2014
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Microbiologia
Aula 4
Meios de Cultura
Prof. Dr. Agenor Messias Silvestre Jr
Meios de Cultura – Semeadura e
Crescimento Bacteriano
Meios de Cultura (cultivo) são materiais nutritivos preparados em
laboratório que permitem o crescimento (aumento em quantidade)
de microrganismos.
Quando microrganismos são colocados em um meio de cultura
para iniciar seu crescimento, são chamados de INÓCULO. E, ao
crescer, formam COLÔNIAS (agrupamentos bacterianos) visíveis.
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Até cerca de 1880 os microrganismos eram mantidos em
laboratório em extratos (caldos nutritivos), até que Robert Koch e
colaboradores introduziram os meios de cultura sólidos, os quais
permitiram o estudo de espécies isoladas (culturas puras) de
bactérias, separando-as de espécies contaminantes.
Quando se deseja o crescimento de bactérias em um meio
sólido, um agente solidificante denominado AGAR (polissacarídeo
extraído de algas marinhas) é adicionado ao meio que será
posteriormente distribuído em tubos de ensaio ou placas de Petri.
Meios Sólidos, Semi-Sólidos e Líquidos
Agar- Agar
desidratado algas marinhas
:
SÓLIDOS, quando contêm agentes solidificantes como o
AGAR, sendo utilizados para visualização de colônias;
[ ] maior que15g/1000ml.
SEMI-SÓLIDOS, quando a quantidade de AGAR é
pequena, dando uma consistência intermediária de modo a
permitir o crescimento de microrganismos em concentrações
variadas de oxigênio ou para verificação da motilidade
(presença de flagelos); [ ] menor que 15g/1000ml;
LÍQUIDOS (CALDOS), quando não possuem agente
solidificantes, apresentando-se de forma líquida, utilizados
para o enriquecimento das culturas, repiques de
microrganismos, entre outros.
Meios Sólidos, Semi-Sólidos e Líquidos
Os meios de cultura são classificados então, quanto ao seu estado físico, em
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MEIO QUIMICAMENTE DEFINIDO
Um meio quimicamente definido é aquele em que a procedência
dos constituintes é conhecida e a composição química exata é
conhecida.
MEIO DE CULTURA COMPLEXO.
Muitas bactérias desenvolvem-se em meios complexos, cuja
composição química não é definida, compostos de nutrientes
como extratos de levedura, de carne, de vegetais, produtos de
digestão protéica, sangue e outros. A composição química exata
pode conter pequenas variações em diferentes culturas do
produto.
Composição dos meios de cultura
MEIO DE CULTIVO SELETIVO
Os meios seletivos contêm substâncias que inibem o
desenvolvimento de determinados grupos de microrganismos,
permitindo o crescimento de outros. São elaborados com o
objetivo de favorecer o crescimento da bactéria de interesse e
impedir o crescimento das outras bactérias;
MEIO DE CULTIVO DIFERENCIAL
Meio diferencial é aquele que contém substâncias que
permitem estabelecer diferenças entre bactérias parecidas,
sendo utilizado para a fácil identificação da colônia da bactéria
de interesse quando existem outras bactérias crescendo
na mesma placa de meio de cultura.
Composição dos meios de cultura
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Meios de cultura
ÁGAR SANGUE
A conservação dos eritrócitos íntegros favorecem a
formação de halos de hemólise nítidos, úteis para a
diferenciação de Streptococcus spp. E Staphylococcus
spp.
PRINCÍPIO:
Usado para o isolamento de
microrganismos não fastidiosos.
Verificação de hemólise dos
Streptococcus spp. e
Staphylococcus spp.
Cor original do meio: vermelho
Meios de cultura
ÁGAR SANGUE : Cor original do meio: vermelho.
Beta hemólise: presença de halo
transparente ao redor das colônias
semeadas (lise total dos eritrócitos).
Alfa hemólise: presença de halo
esverdeado ao redor das colônias
semeadas (lise parcial dos
eritrócitos).
Gama hemólise (sem hemólise):
ausência de halo ao redor das colônias
(eritrócitos permanecem
íntegros).
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Meios de cultura
ÁGAR MAC CONKEY
PRINCÍPIO
O cristal violeta inibe o crescimento de microrganismos Gram
positivos especialmente enterococos e estafilococos.
A concentração de sais de bile é relativamente baixa em
comparação com outros meios, por isso não é tão seletivo
para Gram negativos como, por exemplo, o ágar SS.
FUNÇÂO: Isolar bacilos Gram negativos
Meios de cultura
ÁGAR MAC CONKEY
INTERPRETAÇÃO
Cor original do meio: rosa avermelhado.
Crescimento de bacilos Gram negativos.
Colônias cor de rosa: fermentadoras de lactose.
Colônias incolores: não fermentadoras de lactose.
Não há crescimento de cocos Gram positivos.
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Meios de cultura
ÁGAR MAC CONKEY
Lac+ Lac-
Meios de cultura
ÁGAR CLED –
CYSTINE LACTOSE ELECTROLYTE DEFICIENT
PRINCÍPIO
Usado para isolamento e quantificação de microrganismos
presentes em amostras urina. A deficiência de eletrólitos
inibe o véu de cepas de Proteus.
FUNÇÂO:
Isolar e quantificar microrganismos Gram positivos, Gram
negativos e leveduras.
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Meios de cultura
ÁGAR CLED – CYSTINE LACTOSE ELECTROLYTE
DEFICIENT
INTERPRETAÇÃO:
Cor original do meio: azul claro.
Colônias lactose positiva: cor amarela.
Colônias lactose negativa: cor azul.
Meios de cultura
CALDO BHI – BRAIN HEART INFUSION
PRINCÍPIO
É um meio derivado de nutrientes de cérebro e
coração, peptona e dextrose.
A peptona e a infusão são fontes de nitrogênio,
carbono, enxofre e vitaminas.
A dextose é um carboidrato que os microrganismos
utilizam para fermentação.
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Meios de cultura
CALDO BHI – BRAIN HEART INFUSION
PRINCÍPIO
Função:
Meio para cultivo de estreptococcos, pneumococos,
meningococos, enterobactérias, não fermentadores,
leveduras e fungos.
Pode ser utilizado na preparação do inóculo para teste de
susceptibilidade aos antimicrobianos, para realização de teste
de coagulase em tubo, para teste de crescimento bacteriano
a 42 e 44°C e para teste de motilidade em lâmina.
Meios de cultura
CALDO BHI – BRAIN HEART INFUSION
PRINCÍPIO
INTERPRETAÇÃO
Cor original do meio:
amarelo claro, límpido.
Positivo: presença de
turvação = crescimento
bacteriano.
Negativo: ausência de
turvação.
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Meios de cultura
LÖWENSTEIN JENSEN
PRINCÍPIO:
A base do meio é constituída por ovos integrais, o
que permite amplo crescimento das micobactérias e
o crescimento é satisfatório para o teste de niacina
(que é positivo para Mycobacterium tuberculosis).
Função:
Isolamento primário das micobactérias.
Meios de cultura
LÖWENSTEIN JENSEN
INTERPRETAÇÃO:
Cor original do meio: verde claro
Positivo: Crescimento de colônias
amarelas
Negativo: ausência de crescimento.
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Meios de cultura
LÖWENSTEIN JENSEN
Controle de Qualidade
Uma amostra do lote deve ser inoculada e observada para testar viabilidade dos nutrientes e certeza de resultados.
Ex: Estreptococos grupo A em ágar sangue – observar bom crescimento e beta-hemólise.
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Medidas Assépticas para a
Inoculação do Meio de Cultura
Alças flambadas antes e depois;
Deve-se esperar o resfriamento;
Os recipientes contendo meios deverão ser abertos somente na zona de esterilidade gerada pelo Bico de Bunsen;
A boca do tubo de ensaio deve ser aquecida antes e depois de ser retirada a tampa,
A rolha nunca deve ser apoiada na bancada;
Inoculação
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As cabines de fluxo laminar são unidades
projetadas para criar áreas de trabalho estéreis
para a manipulação, com segurança, de materiais
biológicos ou estéreis que não possam sofrer
contaminação do meio ambiente. Utilizam um
filtros de alta eficiência – filtro HEPA.
Nos fluxos da classe II que o manipulado não
contamine o operador e o meio ambiente.
Cabinas de fluxo laminar
Inoculação pour-plate
• O objetivo é obter colônias isoladas (estudo
qualitativo) para realizar a contagem de colônias
(estudo quantitativo)
Espécime 0,1 ml
+ 9,9 ml
= 1:100
0,1 ml
+ 9,9 ml
= :10.000
0,1 ml
+ 9,9 ml
= 1:1.000.000
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Plaqueamento - pour-plate
Espécime 0,1 ml
+ 9,9 ml
= 1:100
0,1 ml
+ 9,9 ml
= :10.000
0,1 ml
+ 9,9 ml
= 1:1.000.000
1 ml 1 ml 1 ml
ágar + incubação