ANALITIČKE METODE

PODJELA ANALITIČKH METODA• Fizikalne metode analize.• Kemijske metode analize-potrebna kemijska reakcija da bi nastao signal.

• Stehiometrijske metode (gravimetrija, volumetrija)

Stehiometrija je područje kemije koje proučava odnose količina kod kemijskih reakcija.

Potrebno je poznavati kvantitativne (mjerljive) odnose između reaktanata i produkata u izjednačenim kemijskim rekcijama.

• Nestehiometrijske metode (instrumentalne metode).

Matrica/analit

• Matrica su sve komponente uzorka koji ispitujemo na određeni analit. Analit je ono što određujemo.

Specifično/selektivno

• Tehnike ili reakcije koje se mogu primijeniti za određivanje samo jednog analita su specifične.

• Tehnike ili reakcije koje se mogu primijeniti za određivanje skupine (najčešće srodnih) analita su selektivne.

Postupci pri kvantitativnoj analizi

1. Izbor analitičke metode2. Uzimanje uzorka3. Priprema laboratorijskog uzorka4. Određivanje istovjetnih uzoraka (“paralelna ispitivanja”)5. Uklanjanje interferencija (specifičnost, selektivnost

metode, matrica)6. Umjeravanje (baždarenje/kalibracija-instrumentalne

metode, slijepa proba) i mjerenje7. Izračunavanje rezultata8. Vrednovanje rezultata i procjena njihove pouzanosti

Izbor analitičke metode

• Pri izboru analitičke metode moramo paziti da je metoda:

• Osjetljiva -mala promjena u količini analita dovodi do značajne promjene mjerene vrijednosti.

• Precizna -bliskost rezultata više neovisnih analiza pod istim uvjetima.Intermediate precision-izražava preciznost unutar laboratorija kada se ista analiza provodi od strane više analitičara, u određenom vremenskom razmaku

• Točna (rezultat analize mora biti što bliži referentnoj vrijednosti)

Izbor analitičke metodeLinearno dinamičko područje

• S poznatim granicama dokazivanja (Limit of Detection) xLOD = 3sO + xBl i određivanja (Limit of Quantitiation , Limit of Quantification, Limit of reporting, ) xLOQ = 3xLOD

Granica dokazivanja i određivanja kod GC ili HPLC kromatografije

Izbor analitičke metode 2• Sa što širim linearnim

područjem (razrijeđenje uzorka koji prelaze granice linearnog područja, 6 točaka)

• Robusna (da male slučajne promjene ne utječu na rezultate analize, što ukazuje na njenu pouzdanost tijekom rada)

• S nižom cijenom

• www.eurachem.org

Standardne metode

• Ove sve prethodne uvjete ćemo ispuniti ako koristimo tzv. standardne metode

• Određivanje peroksidnog broja International Organization for Standardization, »Animal and vegetable fats and oils-Determination of peroxid value» (HRN EN ISO 3960: 2007).

• Određivanje sastava i količine sterola kapilarnom plinskom kromatografijomInternational Olive Oil Council, »Determination of the composition and content of sterols by capillary column gas chromatography« (COI/T.20/Doc.no.10/Rev.1, 2001; HRN EN ISO 12228:2004).

Validacija metode

• Validacija je postupak u kojem utvrđujemo svojstva provođenja i ograničenja analitičke metode, na način da utvrdimo utjecaj koji mogu i u kojoj mjeri promijeniti ta svojstva (mjerna nesigurnost) .

• Na koje sve načine možemo validirati-provjeriti valjanost analitičke metode:1. Slijepa proba- slijepa proba reagensa- slijepa proba uzorka -matrica bez analita

Validacija metode 1

• 2. Uzorci- Uzorci s dodanim analitom (fortified materials)- Uzorci s dodanim bilo kojim elementom uzorka (spiked materials)

• 3. Referentni materijali• 4. Certificirani referentni materijali• 5. Statistika/ kontrolne kartice

Certificirani referentni materijali3. NIST traceable weights are

used to verify balance calibration with preparation of each lot.- Utezi koji su korišteni za kalibraciju vage kojom je pripremljena svaka pojedinačna otopina imaju sljedivost do NIST standarda.

Validacija metode 2Kontrolne kartice

Upper/Lower Action Limits (granica djelovanja) MV+-3xsd Upper/Lower Warning Limits (granica upozorenja) MV+-2xsd

Akreditacija laboratorija

• Akreditacija ispitnih laboratorija po normi HRN EN ISO/IEC 17025.

• Proficiency testing (ring test) To je povremena (obično jednom godišnje) provjera pojedinog laboratorija/grupe laboratorija koji su specijalizirani za pojedino područje od strane nezavisnog tijela.

• Hrvatska akreditacijska agencija (HAA) primljena je u društvo članica potpisnica Multilateralnih sporazuma o priznavanju akreditacije u Europskoj organizaciji za akreditaciju (EA) (travanj 2010.).

Postupci pri kvantitativnoj analizi

1. Izbor analitičke metode

2. Uzimanje uzorka3. Priprema laboratorijskog uzorka4. Određivanje istovjetnih uzoraka (“paralelna ispitivanja”)5. Uklanjanje interferencija (specifičnost, selektivnost

metode)6. Umjeravanje (baždarenje-instrumentalne metode,

slijepa proba) i mjerenje7. Izračunavanje rezultata8. Vrednovanje rezultata i procjena njezine pouzanosti

Uzorak

• Uzorak je dio materijala kojeg analiziramo, a koji vjerno odražava sastav materijala od kojeg je uzet.

• Uzorak sadrži measurand (analit)-ono što određujemo (jednog ili više njih) + matrica (hrani - sadržaj pesticida ili teških metala)

• measurand (analit)- može biti:-atom-ion-radikal-funkcionalna grupa-molekula-makromolekula

Uzorkovanje• Veličina (količina) uzorka ovisi o veličini (količini)

materijala iz koje se uzima uzorak. – Brod (brodski tovar) ili uzorak slikanog sloja sa slike

koja je došla na restauraciju• Način uzorkovanja ovisi o fizikalnom stanju materijala

koji se uzorkuje.- plinovito, tekuće, kruto,

• Uzorkovanje obično ne provodi laboratorij koji provodi analizu, nego neka druga nezavisna ustanova. Uzorak koji pristigne u laboratorij obično se dijeli na tri dijela.

• Jedan služi laboratoriju za analizu, drugi za ponovljenu analizu, a treći za superanalizu.

Uzorkovanje plinovaPri uzorkovanju plinova treba biti posebno oprezan pogotovo, ako uzorkujemo spremnike pod tlakom. U tom slučaju tlak treba najprije sniziti/reducirati i tek oda uzimati uzorak.

Posude za uzorkovanje plinova

Plinske birete-da bi bili sigurni da je uzorak napunio biretu, ako ne smeta pri analizi najbolje ju je napuniti vodom. Pražnjenjem vode usisava se uzorak plina.

Uzorkovanje tekućina• Uzorkovanje plinova i tekućina

je jednostavnije od uzorkovanja krutina, jer su po svojoj prirodi u većini slučajeva dobro izmiješani (homogenizrani).

• Tekućine je najlakše uzorkovati prilikom pražnjenja (iz tanka) u prethodno planiranim vremenskim/volumnim razmacima (norma).

• Pri uzorkovanju iz tankova potrebno uzimati uzorka po visini.

Četvrtanje-kruti uzorci• Krutine je zbog njihove nehomogenosti najteže uzorkovati i ti

uzorci su po masi obično veći u odnosu na uzorke plinova i tekućina. Postupak smanjivanja mase krutih uzorka (na 0,5-1 kg) naziva se četvrtanje.

1. Miješanje, drobljenje, usitnjavanje - homogeniziranje uzorka.2. Oblikuje se krnji stožac ili piramida jednakomjerne debljine3. Četvrtanje (samo dva nasuprotna dijela ostaju).Uzorkovanje može biti ručno ili automatski (pokretne trake).

• Uzorkovanje/mjerenja u realnom vremenu daju stalnu informaciju o promjenama mjerenih parametara.Emisije industrijskih dimnjaka (CO, CO2, NO2,

SO2)Nadzor (monitoring) radnih prostora -izloženost

parama otapala/zračenja Detektori dima/vatre Praćenje kvalitete vode

Uzorkovanje je propisano normama i pravilnicima

• MINISTARSTVO ZDRAVSTVA • PRAVILNIK O NAČINU UZIMANJA UZORAKA ODNOSNO O

METODAMA ZA OBAVLJANJE ANALIZA I SUPERANALIZA NAMIRNICA I PREDMETA OPĆE UPORABE

• Članak 6. Kod namirnica i predmeta opće uporabe koji se nalaze u rasutom stanju, a koji nisu homogeni, uzorci se uzimaju s više mjesta miješanjem (postupkom četvrtanja) tako da se dobe prosječni uzorci za obavljanje analize, odnosno superanalize. Postupak četvrtanja iz stavka 1. ovoga članka provodi se tako da se izdvojena količina namirnica, odnosno predmeta opće uporabe rasporedi u obliku kvadrata na ravnoj i čistoj površini, dijagonalno razdijeli na četiri jednaka dijela, te se od svakog dijela uzimaju uzorci sa suprotnih strana. Četvrtanje se ponavlja sve dok se ne dobije najmanja količina uzorka za obavljanje analiza, odnosno superanaliza utvrđenih ovim Pravilnikom.

Laboratorijski uzorak-paralelna ispitivanja

• Uzorak koji stigne u laboratorij obično je veći od potrebnog za analizu. Dio uzorka se obično ostavlja kao pričuva za ponavljanje analize.

• Od ovog trenutka se provode paralelna ispitivanja.• Prema količini uzorka tehnika rada može biti:

- makro tehnika >100 mg- Semi-mikro tehnika 100 mg –10 mg- Mikro tehnika 10 mg –1 mg- Sub-mikro ili ultra-mikro tehnika <1 mg

• Komponente koje su u uzorku u količini od:- 100–5% su glavni sastojci- 5–0.01% su sporedni sastojci- <0.01% su sastojci u tragovima

Laboratorijski uzorak-priprava

• Uzorci plinova i para se najčešće bez priprave odmah

analiziraju-najčešće plinskom kromatografijom.

• Krute uzorke je najčešće potrebno samljeti u što finiji prah da

bi daljnja obrada (otapanje) bila što brža i jednostavnija

(tarionik, laboratorijski mlin).

• Izuzetak je granulometrijska analiza (uzorak žbuke pri

konzervaciji)

• Sušenje (na zraku suh)

Laboratorijski uzorak-otapanje

• Otapanje (odgovarajuće otapalo /ultrazvuk, zagrijavanje, miješanje)

• Obrada kiselinama jake i/ili oksidirajuće kiseline (klorovodična,dušična, sumporna, perklorna, fluorovodična, zlatotopka HCL/HNO3 = 3:1 i zagrijavanje).

• Tehnike taljenja– Dodavanje sredstva za taljenje (kruti natrijev

karbonat 1000oC, kalijev pirosufat 400oC npr.) i zagrijavanje, pomaže otapanje• Skupa i dugotrajna tehnika

Laboratorijski uzorak-otapanje1

• Suho spaljivanje i žarenje u porculanskom posuđu• Mokro spaljivanje

Određivanje dušika po Kjeldal-u digestija uzorka u konc. sumpornoj kiselini

• Visokotlačno spaljivanje u autoklavu (posuda pod pritiskom).• Mikrovalno mokro spaljivanje

Pri temperaturama oko 150-250oC u vremenu od 40-60 min uz dodatak kiselina /vodikova peroksida prema prirodi uzorka koji se razara.Otapanje/digestija se provodi u odvojenim teflonskim reaktorima.

• Količina uzorka 500-1000 mg.

Uređaj za mikrovalnu digestiju

Postupci pri kvantitativnoj analizi

1. Izbor analitičke metode2. Uzimanje uzorka3. Priprema laboratorijskog uzorka4. Određivanje istovjetnih uzoraka (“paralelna ispitivanja”)5. Uklanjanje interferencija (specifičnost, selektivnost

metode)6. Umjeravanje (baždarenje-instrumentalne metode,

slijepa proba) i mjerenje7. Izračunavanje rezultata8. Vrednovanje rezultata i procjena njezine pouzdanosti

Uklanjanje interferencija

• Veoma su rijetke analize u kojima matrica ne utječe ili ne ometa signal analita. Zbog toga je tijekom analize potrebno ukloniti kemijske vrste koje ometaju signal analita.

• Raspodjela sastojaka uzorka kojeg analiziramo između dviju faza je u osnovi svih postupaka kojima se služimo da bi uklonili/odvojili sastojci koji ometaju signal analita.

Uklanjanje interferencija-kromatografija

• Najčešće korištena metoda za odjeljivanja analita od spojeva koji stvaraju interferenciju je kromatografija.

• GC-plinsko/tekuća-čvrsta faza• Kolonska kromatografija tekuće/čvrsto• Tankoslojna kromatografija tekuće/čvrsto• HPLC tekuće/čvrsto

Uklanjanje interferencija

• Odjeljivanje taloženjem:- anorganski reagensi- organski reagensi

• Ekstrakcijske metode- Temelj ovih metoda je činjenica da se otopljene tvari (organske i anorganske) različito raspodjeljuju između dva otapala koja se ne miješaju.

• Odjeljivanje jonskom izmjenom na ionskim izmjenjivačima.

• Odjeljivanje destilacijom.

Uklanjanje interferencija-SPE• SPE je kratica od Solid Phase

Extraction• U plastičnim kolonicama nalazi se

adsorbens sličnih karakteristika kao onaj u HPLC kolonama.

• Princip rada je veoma jednostavan:- Prvo se kolonica aktivira jednom vrstom otapala- Zatim se nanese uzorak otopljen u odgovarajućem otapalu- Naneseni uzorak se zatim ispire s drugim otapalom, a u ovisnosti što se određuje eluat se baca ili hvata.

Uklanjanje interferencija-SPME

• Princip rada Solid Phase Micro-Extraction se zasniva na sposobnosti specijalnih polimera da adsorbiraju, a zatim pri povišenim temperaturama desorbiraju hlapive spojeve.

• Tehnika se primjenjuje isključivo u kombinaciji s plinskom kromatografijom.

• Postoje konfiguracije GC uređaja s SPME tehnikom kao dijelom tzv. autosamplera (broj uzoraka).

Uklanjanje interferencija-SPME

Analitičke metode• Postupci pri kvantitativnoj analizi• Izbor analitičke metode

- Granica dokazivanja i određivanja, linearno područje- Validacija metode

• Uzimanje uzorka- Plinova, tekućina i krutina

• Priprema laboratorijskog uzorka-usitnjavanje i otapanje

• Određivanje istovjetnih uzoraka (“paralelna ispitivanja”)• Uklanjanje interferencija

-kromatografija, taloženje, destilacija, ekstrakcija, SPE, SPME