LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA

VYTAUTAS PETREIKIS

2,5-pakeistų-4-tiazolinono darinių sintezė ir

antimikrobinio aktyvumo įvertinimas

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas:

Prof. dr. Hiliaras Rodovičius

Konsultantas:

Prof. dr. Alvydas Pavilionis

Kaunas, 2014

2

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas Prof. dr. Vitalis Briedis

Data

2,5-pakeistų-4-tiazolinono darinių sintezė ir antimikrobinio

aktyvumo įvertinimas

Magistro baigiamasis darbas

Konsultantas Darbo vadovas

Prof. dr. Alvydas Pavilonis Prof. dr. Hiliaras Rodovičius

Data Data

Recenzentas Darbą atliko

Magistrantas Vytautas Petreikis

Data Data

KAUNAS, 2014

3

Turinys

SANTRAUKA................................................................................................................................ 5

SUMMARY ................................................................................................................................... 6

SANTRUMPOS ............................................................................................................................ 7

SĄVOKOS.................................................................................................................................... 8

PADĖKA....................................................................................................................................... 9

ĮVADAS ...................................................................................................................................... 10

DARBO TIKSLAI IR UŽDAVINIAI............................................................................................... 12

1. LITERATŪROS APŽVALGA ............................................................................................... 13

1.1. Antimikrobinių vaistų poreikis ....................................................................................... 13

1.2. Natūraliais produktais paremtas vaistų kūrimas ........................................................... 14

1.3. Česnako ir jo aktyvių junginių panaudojimas medicinoje.............................................. 17

1.4. Rodaninas ir jo dariniai................................................................................................. 20

1.5. Apibendrinimas............................................................................................................. 21

2. TYRIMO METODIKA........................................................................................................... 22

2.1. Rodanino darinių sintezė.............................................................................................. 22

2.1.1. 5-pakeistų rodanino darinių sintezė .......................................................................... 22

2.1.2. 5-pakeistų-2-alil-rodanino darinių sintezė ................................................................. 22

2.2. Lydymosi temperatūros nustatymas............................................................................. 25

2.3. Junginių strūktūros nustatymas IR spektroskopijos būdu............................................. 26

2.4. Junginių grynumo nustatymas...................................................................................... 26

2.5. Junginių antimikrobinio poveikio tyrimas in silico ......................................................... 27

2.6. Junginių antimikrobinio poveikio tyrimas in vitro........................................................... 28

2.7. Apibendrinimas............................................................................................................. 30

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS....................................................................................... 31

3.1. Rodanino junginių sintezė ............................................................................................ 31

3.1.1. 5-pakeistų-rodanino junginių sintezė ........................................................................ 31

3.1.2. 2-alil-5-pakeistų-rodanino junginių sintezė................................................................ 32

3.1.3. 2-propil-5-nitrofurfuril-rodanino (VIP-48) sintezė....................................................... 34

3.2. Junginių strūktūros nustatymas IR spektroskopijos būdu............................................. 35

3.3. Junginių antimikrobinio aktyvumo tyrimas in silico ....................................................... 35

4

3.4. Junginių antimikrobinio aktyvumo tyrimas in vitro......................................................... 37

3.5. Apibendrinimas............................................................................................................. 42

4. IŠVADOS ............................................................................................................................ 43

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS...................................................................................... 44

6. LITERATŪROS APŽVALGA ............................................................................................... 45

7. PRIEDAI .............................................................................................................................. 52

5

SANTRAUKA

2,5-pakeistų-4-tiazolinono darinių sintezė ir antimikrobinio aktyvumo įvertinimas. V.

Petreikio magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas prof. dr. Hiliaras Rodovičius; Lietuvos

Sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Vaistų chemijos katedra. – Kaunas.

Darbo tikslas. Susintetinti naujus 2,5-pakeistus-4-tiazolinono junginius ir ištirti jų

antimikrobinį aktyvumą.

Darbo uždaviniai:

1. Susintetinti 2,5-pakeistus-4-tiazolinono junginius.

2. Ištirti gautų junginių poveikį tyrimais in silico ir in vitro.

3. Susieti gautų junginių struktūros ryšį su jų aktyvumu.

Metodai. Junginiai buvo sintezuoti mikrobangų metodu. Junginių aktyvumas buvo tiriamas in

silico. Atliktas pirminis mikrobiologinis tyrimas in vitro užnuodytos lekštelės metodu.

Rezultatai. Buvo susintetinti 8-uoni 2,5-pakeisti-4-tiazolinono dariniai. Atlikus tyrimus in

silico, buvo nustatytas preliminarus poveikis S. aureus esančiam baltymui fabI. Atlikus pirminius

tyrimus in vitro buvo pastebėtas trijų junginių su 5-nitrofurano pakaitu (VIP-41), 5-para-

brombenzaldehido pakaitu (VIP-42), 5-dimetilamino (VIP-47) galimas priešmikrobinis poveikis

prieš tirtus mikroorganizmus.

Išvados. Atlikus tyrimus in vitro nustatyta, jog aktyviausi junginiai yra: VIP-41 ir VIP-47.

Rodanino darinių propilo pakaitu 2-oje padėtyje priešmikrobinis aktyvumas mažesnis nei su alilo

pakaitu. Taip pat nustatyta, kad rodanino darinių, su nitrofurolo pakaitu didesniam

antimikrobiniam veikimui reikalinga nitro grupė. Pats alilo pakaitas junginiams reikšmingo

aktyvumo nesuteikia, o svarbesnis aktyvumui aldehido pakaitas 5-oje padėtyje.

6

SUMMARY

Synthesis of 2,5-substituted-4-thiazolinone derivatives and evaluation of

antimicrobial activity. V. Petreikis Master thesis/ Scientific supervisor prof. dr. Hiliaras

Rodovičius, consultant – prof. dr. Alvydas Povilonis; Lithuanian University of Health Sciences,

Faculty of Pharmacy, Department of Drug Chemistry. – Kaunas.

The aim of research. Synthesize new 2,5-substituted-4-thiazolinone derivatives and

evaluate their antimicrobial activity.

Tasks of research:

1. Synthesize new 2,5-substituted-4-thiazolinone derivatives.

2. Evaluate antimicrobial activity of newly synthesized 2,5-substituted-4-thiazolinone

derivatives.

3. Evaluate compounds structure-activity relationship.

Methods. Compounds were synthesized with microwave method. Their activity was

evaluated in silico. Synoptic research in vivo was accomplished by a poisoned plate technique.

Results. 8 2,5-substituted-4-thiazolinone derivatives were synthesized. After in silico

research was evaluated preliminary bactericidic compounds activity against S. aureus, acting on

fabI protein. Synoptic research in vitro has shown antimicrobial activity of three compounds: 5-

nitrofuran substituted (VIP-41), 5-para-brombenzaldehyde substituted (VIP-42), 5-

dimethylaminebenzaldehyde substituted (VIP-47).

Conclusions. Research in vitro has shown that the most active compounds are: VIP-41 and

VIP-47. Evaluated, that 4-thiazolinone derivatives with propyl substituent in a 2-nd position

antimicrobial activity is less than with allyl substituent. For better anctimicrobial activity nitro

group is necessary in 4-thiazolinone derivatives with nitrofurfural substituent. Allyl substituent

does not provide significant antimicrobial activity itself, more important is aldehyde substituent in

5-th position.

7

SANTRUMPOS

BMR - branduolių magnetinio rezonanso spektroskopija

DMSO – dimetilsulfoksidas

ESC – efektyvioji skysčių chromatografija

fabI – už riebiųjų rūgščių sintezę S. aureus bakterijoje atsakingas baltymas

LD50 - dozė, nuo kurios miršta 50% populiacijos narių

MRSA – meticilinui atsparus S. aureus (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)

MSK – minimalioji slopinamoji koncentracija

PBP – peniciliną prijungiantis baltymas (Penicillin-Binding Protein)

PSO – Pasaulio sveikatos organizacija

MS - masių spektrometrija

UV-Vis – ultravioletinės spinduliuotės ir regimosios šviesos spektrofotometrija

µg/ml – mikrogramai mililitre (koncentracijos reiškimo būdas)

mg/l – miligramai litre (koncentracijos reiškimo būdas)

B. cereus – Bacillus cereus

B. subtilis – Bacillus subtilis

C. albicans – Candida albicans

E. coli – Escherichia coli

E. faecalis – Enterococcus faecalis

E. faecium – Enterococcus faecium

H. pylori – Helicobacter pylori

K. pneumoniae – Klebsiella pneumoniae

M. tuberculosis – Mycobacterium tuberculosis

P. aeruginosa – Pseudomonas aeruginosa

P. mirabilis – Proteus mirabilis

S. aureus – Staphylococcus aureus

S. pyogenes – Streptococcus pyogenes

S. pneumoniae – Streptococcus pneumoniae

8

SĄVOKOS

in silico – bandymo metodas, panaudojant sudėtingus kompiuterinius modelius.

in vitro – procesas (bandymas, tyrimas), atliekamas arba stebimas ne organizme, bet dirbtinėje

sistemoje.

Nitrofuranai – antibakterinių vaistinių preparatų grupė, kurių struktūroje yra 5-nitrofurano žiedas.

Rodaninas – cheminis junginys 2-tiokso-1,3-tiazolidin-4-onas.

Softdent – kompiuterinė programa, kurioje fiksuojamas prekių pardavimas iš didmenininko į

vaistines.

9

PADĖKA

Dėkoju darbo vadovui prof. dr. H. Rodovičiui, konsultantui prof. dr. A. Povilioniui už

pagalbą ir konsultacijas vykdant tyrimus ir rašant magistrinį darbą.

Dėkoju prof. habil. dr. E. Tarasevičiui už sudominimą vaistų sinteze ir patarimus

sintezuojant junginius.

Doktorantui L. Šlepikui už pagalbą laboratorijoje, atliekant tyrimus ir rašant magistrinį

darbą.

Doktorantui J. Saliui už pasiūlytą idėją darbo temai ir pagalbą sintezuojant junginius.

L. Akramui už suteiktą galimybę atlikti IR spektroskopijos tyrimus.

Doktorantui M. Marksai už pagalbą tiriant junginių grynumą.

10

ĮVADAS

Temos aktualumas. Antimikrobinių vaistų sukūrimas buvo vienas svarbiausių XX a. pasiekimų

medicinoje. Antimikrobiniai vaistai žymiai sumažino mirtingumą nuo infekcijų, palengvino

infekcijų gydymą [3]. Tačiau bakterijos turi savybę greitai prisitaikyti prie naujų aplinkos sąlygų,

todėl dėl netinkamo antibiotikų vartojimo ir gydytojų neracionalaus antibiotikų išrašymo

pacientams, sparčiai didėja mikroorganizmų atsparumas jiems [31, 76, 2]. Dėl atsparumo didėja

ne tik mirtingumas nuo infekcijų, bet ir patiriami dideli piniginiai nuostoliai. Paskaičiuota, kad

Jungtinėse Amerikos Valstijose nuostoliai siekia nuo 21 mlrd. iki 34 mlrd. dolerių ir apie 1,5 mlrd.

eurų Europoje. [77] Mirštamumas nuo rezistentiškų mikroorganizmų padermių sukeltų infekcijų

yra dvigubai didesnis nei nuo sukeltų ne rezistentiškų mikroorganizmų padermių [76].

Pagal softdent duomenis [75] 2006 metais kiekvienam Lietuvoje gyvenančiam žmogui

vidutiniškai teko po vieną antibiotikų gydymo kursą, o tai yra gana daug. Buvo nustatyta, kad

2005 – 2007 peroralinių rezervinių antibiotikų suvartojimas padidėjo 13 %, palyginus įprastinių-

sumažėjo 15 %. Parenterinių įprastinių antibiotikų suvartojamas kiekis taip pat mažėjo – 17,5 %,

rezervinių didėjo 37,9 % [75]. Tai rodo mažesnį įprastinių antibiotikų veiksmingumą.

Tyrimu Lietuvoje taip pat nustatyta, jog neracionalus antibiotikų vartojimas Lietuvoje

vyksta dideliais mastais ir kas blogiausia, nustatyta, kad gydytojai dažnai neracionaliai parenka

gydymą antibiotikais. Šeimos gydytojai net 9,5 % atvejų paskiria netinkamus antibiotikus. Tik

42,9 % atvejų antibiotikai skiriami pagal tinkamas indikacijas. Dažniausiai netinkami antibiotikai

skiriami gydant šlapimo takų ir akių infekcijas [2].

Norint išvengti mikroorganizmų rezistentiškumo augimo, reikia tinkamai vartoti

antibiotikus. Taip pat gali padėti naujų antimikrobinių vaistų kūrimas.

Daug naujų vaistų yra gaunama ar sintezuojama iš natūralių produktų: iš augalų, gyvūnų,

mikroorganizmų. Augalai jau tūkstančius metų naudojami kaip vaistai. Dažniausiai buvo

naudojamos tinktūros, arbatos, milteliai ar kitos formos, o ne iš augalo išskirtos švarios

medžiagų frakcijos. Medicinai ir technologijoms žengiant pirmyn atsirado galimybės išskirti

junginius iš augalų, ištirti jų cheminę struktūrą ir poveikį.

Pirmoji iš augalo izoliuota medžiaga buvo morfinas - XIX a. pradžioje. Jis buvo išskirtas iš

opiumo, gaunamo iš aguonos. Vaistų paieška natūraliuose produktuose vedė prie kitų vaistinių

11

medžiagų izoliavimo, tokių kaip: kokaino, kodeino, digoksino - visi jie naudojami iki šiol [17].

Vaistų paieška ir gamyba iš natūraliose produktuose esančių medžiagų tęsiasi iki šiol [70].

Vienas iš daugiausiai gydymui naudojamų augalų – česnakas - nuo seno naudojamas

tradicinėje medicinoje. Česnakas pasižymi įvairiu gydomuoju poveikiu [30,57,32], tarp jų ir

antimikrobiniu poveikiu prieš įvairias Gram - teigiamas ir Gram - neigiamas bakterijas ir grybelius

[56].

Rodanino dariniai turi platų antimikrobinį veikimą. Buvo susintetinta ir tirta daug rodanino

darinių. Pastebėtas jų poveikis prieš daug įvairių infekcijų sukėlėjų, nustatytas jų inhibicinis

poveikis biologiniam taikiniam, tokiem kaip: hepatito C viruso NS3 proteazei [59], aldozės

reduktazei [16,27], Beta-laktamazei [28], UDP-N-acetylmuramato/L-alanino lipazei [58],

peniciliną prijungiančiam baltymui [70], katepsinui D [42], ir histidino dekarboksilazei [25].

Pastebėtas rodanino darinių poveikis atspariom S. aureus padermėm [30, 63].

Rodanino junginių sintezė jau daugelį metų vykdoma Lietuvos sveikatos mokslų

universiteto Vaistų chemijos katedroje. Mokslininkai Eduardas Tarasevičius [8], Raimondas

Radžiūnas [7], Vilma Petrikaitė [5] sintetino ir tyrė rodanino junginius.

Teorinė ir praktinė tyrimo reikšmė. Didėjant žmonių sergamumui ir mirštamumui nuo

antibiotikams atsparių mikroorganizmų sukeltų ligų, didėja poreikis naujų antimikrobinių junginių

sintezei. Dėl literatūroje aprašytų rodanino junginių ir česnako ekstraktų antimikrobinių poveikių,

rodanino ir alicino deriniai gali turėti antimikrobinį poveikį.

Temos ryšys su tyrimo metodika ir rezultatais. Pasirinkus tyrimo metodiką buvo susintezuoti

2,5-pakeisti-4-tiazolinono junginiai. Junginių struktūrai patvirtinti buvo nustatyti jų IR spektrai.

Antimikrobiniam poveikiui nustatyti buvo atlikti tyrimai in silico ir in vitro. Rezultatuose aptariami

mikrobiologinių tyrimų rezultatai ir struktūros - aktyvumo ryšys.

Darbo tikslas. Susintetinti naujus 2,5-pakeistus-4-tiazolinono junginius ir ištirti jų antimikrobinį

aktyvumą.

12

DARBO TIKSLAI IR UŽDAVINIAI

Tyrimo kryptis. Vaistų sintezė.

Tyrimo problema. Mikrobų rezistentiškumo antibiotikams didėjimas.

Tyrimo eiga.

1. Mokslinės literatūros apžvalga

2. Susintetinti naujus 2,5-pakeistus-4-tiazolinono junginius.

3. Susintetintų junginių struktūros nustatymas.

4. Susintetintų junginių aktyvumo įvertinimas tyrimais in silico ir in vitro.

5. Gautų rezultatų analizė.

Tyrimo instrumentai. SYBYL-X molekulinio modeliavimo programa (bandomoji versija).

Mikrobiologiniai tyrimai užnuodytos lekštelės standžioje terpėje metodu.

Darbo tikslas. Susintetinti naujus 2,5-pakeistus-4-tiazolinono junginius ir ištirti jų antimikrobinį

aktyvumą.

Darbo uždaviniai

1. Susintetinti 2,5-pakeistus-4-tiazolinono junginius.

2. Ištirti gautų junginių poveikį tyrimais in silico ir in vitro (užnuodytos lėkštelės standžioje

terpėje metodas).

3. Susieti struktūros ryšį su gautų junginių aktyvumu.

13

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Antimikrobinių vaistų poreikis

Antimikrobiniai vaistai – antibiotikai - tai medžiagos žudančios mikroorganizmus, ar

stabdančios jų augimą [74]. Antimikrobiniai vaistai naudojami gydyti bakterijų, grybelių, virusų,

parazitų sukeltas infekcijas. Pirmasis antimikrobinis preparatas buvo išskirtas 1928 metais iš

grybelio Penicillium rubens. Jį išskyręs Aleksandras Flemingas pavadino medžiagą penicilinu

Penicilinas 1942 metais buvo sėkmingai panaudotas streptokoko sukeltai infekcijai gydyti [60].

PSO duomenimis [78] labai opi problema XXI a. tapo bakterijų rezistentiškumas

antimikrobinėms medžiagoms. Bakterijų tapimas rezistentiškomis antibiotikams yra natūralus

fenomenas, kai naudojant antibiotikus įvyksta bakterijos genų mutacija. Rezistentiškumo

atsiradimą pagreitina:

mažai arba jokių antimikrobinio rezistentiškumo priežiūros ir monitoravimo sistemų,

netinkamas antibiotikų vartojimas, įskaitant jų naudojimą gyvulininkystėje,

mažai prevencijos ir kontrolės nuo infekcijų priemonių,

nebaigiamas gydymo antibiotikais kursas,

rezistentiškumas plinta, nes kai kurie mikroorganizmai gali vieni kitiem perduoti

rezistentiškumo bruožus.

Dėl rezistentiškų mikroorganizmų infekcijų:

įprastas gydymas tampa neveiksmingas, dėl ko prailgėja pacientų gyjimas ir padidėja

mirties rizika. Tokių pacientų mirštamumas yra dvigubai dažnesnis,

ilgesnis gyjimas padidina riziką rezistentiškoms infekcijoms plisti,

infekcijos tampa rezistentiškos įprastiems antibiotikams, todėl naudojami kiti, brangesni,

antibiotikai. Taip pat pailgėja žmonių sveikimas, gydymas ligoninėse, dėl to išauga

gydymo kaina – kiekvienam asmeniškai ir valstybei.

joms išplitus taptų pavojinga atlikti chemoterapiją vėžio gydymui, organų transplantaciją,

chirurgines operacijas.

Meticilinui-rezistentiškas Staphylococcus aureus (MRSA) yra viena dažniausiai pasitaikančių

infekcijų, įgautų sveikatos priežiūros įstaigose. MRSA plitimas Europoje dabar stabilizavosi ir

netgi pradėjo mažėti. Šešiose Europos valstybėse pastebėtas ženklus MRSA padermių

mažėjimas (Belgijoje, Prancūzijoje, Vokietijoje, Airijoje, Ispanijoje ir Jungtinėje Karalystėje), ir tik

14

keturiose valstybėse jų skaičius augo (Vengrijoje, Liuksemburge, Lenkijoje ir Rumunijoje). Nors

šie duomenys suteikia optimizmo, MRSA infekcijos vis tiek išlieka gydymo įstaigų prioritetas, nes

MRSA vis tiek sukelia daugiau nei 25% visų infekcijų aštuoniose iš dvidešimt aštuonių tikrintų

šalių, labiausiai pietų ir rytų Europoje [73] (1 pav.).

1 pav. MRSA paplitimas Europoje 2011 metais [73]

1.2. Natūraliais produktais paremtas vaistų kūrimas

Natūralūs produktai, kaip augalai, gyvūnai ir mineralai, yra vaistų gamybos pagrindas

[36, 46]. Istoriškai dauguma naujų vaistų buvo sukurti iš natūralių produktų ar gauti iš medžiagų,

išskirtų iš natūralių produktų [22].

Prieš XX - ajį amžių, neapdirbti ar beveik gryni ekstraktai iš augalų, gyvūnų ar

mineralų buvo vieninteliai galimi vaistai gydyti žmonių ir gyvūnų ligas. Idėja, kad vaistai

organizmuose veikia dėl specifinių sąveikų tarp vaistų molekulių ir biologinių makromolekulių

(dažniausiai baltymų ar nukleorūgščių), o ne tiesiog dėl menamos „gyvenimo galios“, leido

mokslininkams padaryti išvadą, kad augalų ekstraktuose veiksmingi individualūs cheminiai

dariniai. Nuo to prasidėjo nauja farmakologijos era, kai buvo pradėti kurti ir naudoti gryni,

izoliuoti cheminiai dariniai, kurie pakeitė ekstraktus.

15

Klasikinis taip atrasto vaisto pavyzdys yra morfinas, opiumo aktyvusis ingredientas, ir

digoksinas, širdį stimuliuojantis vaistas iš augalo Digitalis lanata. Natūralių produktų paieškos

padeda atrasti naujų veiksmingų struktūrų, kurios vėliau naudojamos kaip modelis, naujų vaistų

kūrimui.

Antibiotikams rezistentiškų mikroorganizmų rūšių plitimas pastūmėjo mokslininkus

ieškoti naujų antimikrobinių medžiagų. Nuo 2000 iki 2008 - ųjų metų buvo užregistruota daugiau

nei 300 natūralių, antimikrobinių savybių turinčių, metabolitų [39]. Tarp jų:

Alkaloidai (pvz.: ksantin-6-onas)

2 pav. Alkaloidas ksantin-6-onas

Acetilenai (pvz.: 6-acetileninės rūgštys)

Kumarinai (pvz.: 7- amino-4-metilkumarinas)

Flavonoidai ir isoflavonoidai (pvz.: apigeninas)

Iridoidai

Lignanai (pvz.: (+)-lyoniresinol-3a-O-b-D-glucopiranozidas)

Makrolidai

Fenoliai (other than flavonoids and lignans) (pvz.: eupomatenoidas-6)

Polipeptidai (pvz.: tripropeptinai)

Chinonai (pvz.: 3,4-Dihidroksi-1-methoxiantrachinon-2-carboksaldehidas)

Steroidiniai saponinai

Terpenoidai (pvz.: seskviterpenas ksantorizolis)

Ksantonai (pvz.: mangostaninas) [52].

Taip pat ir pirmasis antibiotikas penicilinas yra natūralus produktas, išskirtas iš

grybelio Penicillium rubens. Penicilino molekulė buvo chemiškai modifikuojama, norint pagerinti

antibiotiko veikimą, koreguoti poveikio trukmę, stabilumą, sumažinti toksiškumą. Taip sukurta

visa grupė penicilino antibiotikų:

1. Benzilpenicilinai

2. Fenoksipenicilinai

16

Fenoksimetilpenicilinas

3. Izooksazolilpenicilinai (oksacilino grupė)

Oksacilinas

Kloksacilinas

Dikloksacilinas

Flukloksacilinas

4. Aminobenzilpenicilinai

Ampicilinas

Amoksicilinas

5. Karboksipenicilinai

Karbenicilinas

Tikarcilinas

6. Acilaminopenicilinai

Azlocilinas

Mezlocilinas

Piperacilinas

3 pav. Karbenicilinas 4 pav. Ampicilinas

Medžiagų, išskirtų iš natūralių šaltinių, struktūros dažniausiai nustatomos masių

spektrometrijos (MS) ir branduolių magnetinio rezonanso spektroskopijos (NMR) būdais. Kartais,

norint gauti papildomą informaciją, reikalingą patvirtinti nustatytą struktūrą, naudojami kiti

metodai, kaip infraraudonųjų spindulių spektroskopija, UV spektroskopija, radio spindulių

kristalografija.

17

1.3. Česnako ir jo aktyvių junginių panaudojimas medicinoje

Česnakas priklauso česnakinių augalų šeimai Allium. Šiai šeimai priklauso tokie

augalai, kaip svogūnas, poras. Randama įrodymų, kad žmonės česnaką naudoja jau apie 7000

metų, jis kilęs iš centrinės Azijos [24] ir ilgai buvo svarbus Viduržemio regione. Česnaką taip pat

naudojo ir Senovės Egiptiečiai – kulinarijai ir medicinai [66].

Senovėje česnakas buvo naudojamas nuo daug sutrikimų: nuo parazitų, kvėpavimo

problemų, blogo virškinimo, silpnumo [14].

Šiais laikais, norint įrodyti medicininį česnako veikimą, buvo atlikti tyrimai, jais

nustatyta:

nauda kardiovaskuliarinei sistemai [50, 38],

cholesterolio akumuliaciją ant kraujagyslių

sienelių stabdantis poveikis gyvūnams [64] ir

žmonėms [10, 11, 43, 22, 65, 68, 40, 42],

vazodilataciją sukeliančios savybės [13],

trombocitų agregaciją slopinančios savybės [49,

18, 15, 50],

peršalimo prevencijos [39, 48, 44, 55, 45] ir

gydomosios savybės [69, 44],

cukraus kiekį reguliuojančios savybės [11, 47],

priešvėžinės savybės [51].

Taip pat česnakas buvo naudojamas kaip

antibiotikas. Pirmojo ir antrojo pasaulinio karo metais

česnakas buvo naudojamas kaip antiseptikas, norint

išvengti gangrenos [68]. Pastaraisiais metais buvo

buvo atliktas tyrimas, kur burnos skalavimo skystis,

5 pav. Česnakas turintis 2,5% česnako ekstrakto, veikė antimikrobiškai [29].

Česnakas gali būti naudojamas ir kaip vaistas nuo infekcijų, taip pat ir grybelinių ligų, tokių kaip

pienligė [57].

Česnako galvutėse yra nuo 6 iki 14 mg/g bekvapės cheminės medžiagos aliino (S-

alilcysteino sulfoxidas) [37].

18

Sutraiškius česnaką, fermentas aliinazė, kuris paprastai yra kaupiamas atskiruose

ląstelės dariniuose, yra paskleidžiamas ir susimaišo su aliinu. Dėl jų tarpusavio reakcijos

susidaro alicinas (dialiltiosulfonatas, česnakui kvapą suteikianti medžiaga) [34].

Anksčiau buvo manoma, kad alicinas yra aktyvusis česnako ingredientas, bet nustačius,

jog gyvame organizme jo skilimo pusperiodis yra per trumpas reikšmingai paveikti grybelius,

buvo nustatyta, kad tik alicino skilimo produktams būdingos priešgrybelinės savybes in vivo [26].

Taip pat buvo nustatyta, kad kepenyse dialilo disulfidas, vienas iš aktyvių alicino skilimo

produktų, gali būti metabolizuotas atgal į aliciną [67].

6 pav. Aktyvūs česnako komponentai ir jų skilimo produktai [101]

Kaip jau buvo aptarta, alicinas ir/ar jo skilimo produktai yra pagrindiniai biologiškai

aktyvūs česnako ingredientai, veiksmingi prieš bakterijas, virusus, grybelius, parazitus [9]. Jų

veikimas aiškinamas kaip reakcija tarp junginių sulfido molekulių ir mikroorganizmų sulfhidrilinių

(SH) grupių aminorūgštyse ir ląstelių baltymuose [51].

Buvo tiriamas alicino gebėjimas pereiti pro ląstelių membranas. Gauti rezultatai rodė, kad

fosfolipidų dvisluoksnis nesudaro barjero alicino skverbimuisi į ląstelę, taip pat į ląstelę jis

patenka nepakitęs. Buvo padaryta išvada, kad didelis alicino biologinis aktyvumas yra dėl

reakcingumo su mažos ir didelės molekulinės masės tioliais (CSH grupėmis) ir dėl gero

praeinamumo į ląsteles [41].

Buvo tiriamas ir alicino veikimas prieš MRSA bakterijas. Alicino tyrimas prieš 30 MRSA

padermių parodė didelį aktyvumą prieš jas, įskaitant ir kitoms cheminėms antimikrobėms

19

medžiagoms atsparias MRSA padermes. 88 % ištirtų padermių minimali inhibuojanti alicino

koncentracija buvo 16 mg/l, o visų padermių dauginimasis inibuotas pasiekus 32mg/l

koncentraciją. 88 % MRSA padermių minimali baktericidinė alicino dozė buvo 128 mg/l, ir visos

buvo nužudytos pasiekus 256 mg/l. 82 % šių padermių buvo rezistentiškos mupirocinui. Taip pat

šiame tyrime buvo ištirta, jog stabilesni yra vandeniniai alicino dariniai, spėjama dėl vandenilinių

jungčių [20].

Kaip matome lentelėje (1 lentelė), alicinas pasižymi plačiu antimikrobiniu poveikiu.

Daugumoje atvejų LD50 buvo didesnė, nei įprasta šiuolaikiškiem antibiotikam.

1 lentelė. Alicino antibakterinis aktyvumas [76]

Bakterijų padermė Alicino koncentracija

(LD50 µg/ml) Komentaras

Escherichia coli 15 Jautri antibiotikams

Escherichia coli 15 Rezistentiška antibiotikams

Staphylococcus aureus 12 Jautri

Staphylococcus aureus 12 Rezistentiška meticilinui

Streptococcus pyogenes 3 Jautri

Streptococcus β hemolyticus >100 Rezistentiška antibiotikams

Proteus mirabilis 15 Jautri

Proteus mirabilis >30 Rezistentiška antibiotikams

Pseudomonas aeruginosa 15 Jautri cefproziliui

Pseudomonas aeruginosa >100 Rezistentiška antibiotikams

Enterococcus faecalis >100 Rezistentiška antibiotikams

Alicinui ir jo skilimo produktams būdingas S CH2

R radikalas. Alicinas

sudarytas iš dviejų tokių radikalų, o jo skilimo produktuose šis radikalas išlikęs, tik sujungtas su

kitais radikalais. Dėl šio S-alyl radikalo pasikartojimo visose molekulėse galima spręsti, kad jis

yra atsakingas už alicino ir jo skilimo produktų antimikrobinį aktyvumą, nes jis padidina

molekulės lipofiliškumą, taip pagerindamas patekimą į bakterijas, o siera sudaro vandenilinius

ryšius su baltymų SH grupėmis. Prijungus alilo radikalą prie rodanino molekulės susidaro

S CH2SR

R fragmentas, panašus į ajoeno, turintis du sieros atomus. Remiantis

20

šaltiniais alicino dariniai turintys kelis sieros atomus turi stipresnį antimikrobinį veikimą, dėl

stipresnio jungimosi su bakterijų baltymais [21].

1.4. Rodaninas ir jo dariniai

Rodaninas - penkianarė heterociklinė

molekulė, susidedanti iš tiazolo su karbonilo grupe

ant ketvirto anglies atomo - turi platų farmakologinį

veikimo spektrą: antigrybelinį, antivirusinį,

antibakterinį, antinavikinį ir antidiabetinį potencialą

[71]. Rodanino dariniai veikia inhibuojančiai daug

taikinių, kaip hepatito C viruso NS3 proteazę [60],

aldozės reduktazę [16, 27], beta- laktamazę [28],

UDP-N-acetilmuramoil-L-alanino ligazę [59], 8 pav. Rodaninas

antidiabetinius agentus [23], katepsiną D [42], histidino dekarboksilazę [25].

Panašūs į rodaniną fragmentai aptikti beta - laktaminių antibiotikų struktūrose:

9 pav. Aztreonamas 10 pav. Cefeksimas

11 pav. Cefepimas

21

Rodanino molekulės poveikis koreguojamas įvairiais pakaitais. Daugelis aprašytų

rodanino junginių turi pakaitus 5-oje žiedo padėtyje. Į penktąją padėtį pakaitai įvedami vykdant

aldolinę (Knoevenagel‘io) kondensaciją. Jos metu, vykdant reakciją skirtinguose tirpikliuose,

naudojami katalizatoriai: natrio acetatas, amonio acetatas ar kt. Pagal Lietuvoje atliktus

mokslininkų ir studentų tyrimus stipriausiu antimikrobiniu poveikiu pasižymėjo rodanino junginiai

su į 5 padėtį įvestu 5-nitrofuranu [4, 1, 6, 8, 5].

Lietuvoje su rodanino molekule buvo susintetinta daug junginių [4, 1, 6, 8, 5], tačiau

didžiausią pasisekimą turėjo prof. habil. dr. E. Tarasevičiaus susintezuota medžiaga –

nifumezinas, turinti sulfanilamidinį pakaitą 2-oje padėtyje ir nitrofurano 5-oje padėtyje, kuriai

buvo atlikti ikiklinikiniai tyrimai.

12 pav. Nifumezinas

1.5. Apibendrinimas

Pasaulio sveikatos organizacijos duomenimis priešmikrobinių junginių poreikis yra didelis

ir didėjantis dėl mikrobų rezistentiškumo antibiotikams. Dėl to būtina kurti naujus antibiotikus, o

juos lengviau kurti tiriant ir mėgdžiojant gamtoje esančius ir antimikrobiškai veikiančius junginius.

Nuo seno naudojamas ir antimikrobiniu poveikiu pasižymi česnakas. Nustatyta, kad tai

jame esantis alicinas ir jo metabolitai suteikią česnakui antimikrobinį poveikį, taip pat ir didelį

susirūpinimą keliančias atsparias S. aureus bakterijas.

Rodanino antimikrobinis aktyvumas taip pat jau senai žinomas ir tirtas, dėl to tikimąsi, kad

alicino ir rodanino junginiai veiks baktericidiškai.

22

2. TYRIMO METODIKA

2.1. Rodanino darinių sintezė

2.1.1. 5-pakeistų rodanino darinių sintezė

Norint pagaminti 5 pakeistus rodanino darinius, reikia paimti 0,1 mol (13,3 g) rodanino,

0,1 mol norimo aldehido ir amonio acetato (ar natrio acetato, kai naudojamas aldehidas

nitrofurfurolas). Įpilama 15 ml ledinės acto rūgšties. Kaitinama 100°C iki 10 min. Reakcijos su

nitrofurfurolu metu kaitinama 30 min ne didesnėje nei 60°C temperatūroje. Reakcijos eigoje

iškrenta nuosėdos. Tirpalas atšaldomas, nuosėdos filtruojamos pro stiklo filtrą vakumu ir

perplaunamos ledine acto rūgštimi, etanoliu, eteriu. Tuomet gautos nuosėdos kristalizuojamos iš

acetono arba izopropanolio.

Taip gauti junginiai: 2-5-(5-nitrofuran-2-ilmetilen)-1,3-tiazol-4-onas, 2-5-(p-

brombenziliden-2-ilmetilen)-1,3-thiazol-4-onas, 2-5-(p-chlorbenziliden-2-ilmetilen)-1,3-thiazol-4-

onas, 2-5-(furan-2-ilmetilen)-1,3-thiazol-4-onas, 2-5-(4-hidroksi-3metoksi-2-ilmetilen)-1,3-thiazol-

4-onas, 2-5-(p-nitrobenziliden -2-ilmetilen)-1,3-thiazol-4-onas, 2-5-(p-dimentilaminobenziliden-2-

ilmetilen)-1,3-thiazol-4-onas.

2.1.2. 5-pakeistų-2-alil-rodanino darinių sintezė

Šiems junginiams gaminti naudojami 5-pakeisti rodanino dariniai. Imama 5 mmol 5-

pakeisto rodanino junginio, pilama 7ml benzeno ir 5 mmol N,N-diizopropiletilamino. Mišinys

šildomas mikrobangų krosnelėje 200W 20 min, kol nuosėdos ištirpsta. Vėliau į mišinį pilama 4 ml

alilbromido tirpalo ir šildoma mikrobangų krosnelėje 400W 20 min, kol susidaro bespalviai

kristalai. Vykdant reakcija su rodanino junginiais, turinčiais nutrofurfurilo pakaitą 5-oje padėtyje,

nuosėdos susidaro mišinį ištraukus iš mikrobangės ir palikus kambario temperatūroje, kitų

reakcijų metu nuosėdos iškrenta vykdant reakciją. Reakcijos mišinys su nuosėdom plaunamas

vandeniu ir filtruojamos pro stiklo filtrą vakumu, plaunama etanoliu ir eteriu. Gautos nuosėdos

kristalinamos, kristalizacija pirmu tirpikliu vyksta su anglimi. 2-prop-2-enilsulfanil-5-(5-nitrofuran-

2-ilmetilen)-1,3-tiazol-4-onas (VIP-41) kristalinta iš etilo acetato ir izopropanolio, gauta 0,49 g; 2-

23

prop-2-enilsulfanil-5-(p-brombenziliden-2-ilmetilen)-1,3-thiazol-4-onas (VIP-42) kristalinta iš

acetonitrilo, izopropanolio, etilo acetato, gauta 0,48 g; 2-prop-2-enilsulfanil-5-(p-chlorbenziliden-

2-ilmetilen)-1,3-thiazol-4-onas (VIP-43) kristalinta iš acetonitrilo, etanolio, etiloacetato, gauta

0,43 g; 2-prop-2-enilsulfanil-5-(furan-2-ilmetilen)-1,3-thiazol-4-onas (VIP-44) kristalinta iš

cikloheksano, gauta 0,27 g; 2-prop-2-enilsulfanil-5-(4-hidroksi-3-metoksibenziliden-2-ilmetilen)-

1,3-thiazol-4-onas (VIP-45) kristalinta iš acetonitrilo, izopropanolio, acetonitrilo, benzeno, gauta

0,323 g; 2-prop-2-enilsulfanil-5-(p-nitrobenziliden-2-ilmetilen)-1,3-thiazol-4-onas (VIP-46)

kristalinta iš izopropanolio gauta 0,85 g; 2-propilsulfanil-5-(p-dimentilaminobenziliden-2-

ilmetilen)-1,3-thiazol-4-onas (VIP-47) kristalinta iš izopropanolio, gauta 0,61 g. Gautų junginių

tirpalai pasižymi specifiniu, česnaką primenančiu kvapu.

Šiomis reakcijomis gauti šie junginiai: 2-prop-2-enilsulfanil-5-(5-nitrofuran-2-ilmetilen)-1,3-

tiazol-4-onas (VIP-41), 2-prop-2-enilsulfanil-5-(p-brombenziliden-2-ilmetilen)-1,3-thiazol-4-onas

(VIP-42), 2-prop-2-enilsulfanil-5-(p-chlorbenziliden-2-ilmetilen)-1,3-thiazol-4-onas (VIP-43), 2-

prop-2-enilsulfanil-5-(furan-2-ilmetilen)-1,3-thiazol-4-onas (VIP-44), 2-prop-2-enilsulfanil-5-(4-

hidroksi-3-metoksibenziliden-2-ilmetilen)-1,3-thiazol-4-onas (VIP-45), 2-prop-2-enilsulfanil-5-(p-

nitrobenziliden-2-ilmetilen)-1,3-thiazol-4-onas (VIP-46), 2-propilsulfanil-5-(p-

dimentilaminobenziliden-2-ilmetilen)-1,3-thiazol-4-onas (VIP-47).

Reakcijos eiga ir rezultatai tikrinami plonasluoksnės chromatografijos būdu, sistema

acetonas:toluenas (4:1), matomas gelsvai fluorescuojantis taškas. Gautiems VIP-41-47

junginiams nustatyti UV ir IR spektrai.

2 lentelė. 5-pakeisti-2-alil-rodanino junginiai

Jung.

Nr R

Išeiga (%)/

reakcijos

laikas (min.)

Lyd. Temp.

°C

Mol. Formulė

(Mr)

Grynumas

pagal ESC %

VIP-41

56/70 141-144 C11H8N2O4S2

296 79,56

24

VIP-42

90/50 156-158 C13H10BrNOS2

340 99,05

VIP-43

78/50 137-138 C13H10BrNOS2

295 98,76

VIP-44

62/50 77-78 C11H9N2O2S2

251 99,45

VIP-45

84/50 141-142 C14H13NO3S2

307 98,52

VIP-46

77/50 135-137

C13H10N2O3S2

306

60,05

VIP-47

81/50 128-130 C16H17NOS2

303 99,31

2.1.3. 5-nitrofurfuril-2-propil-rodanino (VIP-48) sintezė

Šiam junginiui gaminti naudojamas 2-5-(5-nitrofuran-2-ilmetilen)-1,3-tiazol-4-onas. Imama

5 mmol 5-pakeisto-rodanino junginio, pilama 7ml benzeno ir 5 mmol N,N-diizopropiletilamino.

Mišinys šildomas mikrobangų krosnelėje 200W 10 min, kol nuosėdos ištirpsta. Vėliau į mišinį

pilama 4 ml propiliodidas tirpalo ir šildoma mikrobangų krosnelėje 400W 10 min, kol susidaro

bespalviai kristalai. Nuosėdos susidaro ištraukus iš mikrobangės ir palikus kambario

temperatūroje. Reakcijos mišinys su nuosėdomis plaunamas vandeniu ir filtruojamos pro stiklo

filtrą vakumu, plaunama etanoliu ir eteriu. Gautos nuosėdos kristalinamos iš izopropanolio su

anglimi ir etilo acetato.

25

Reakcijos eiga ir rezultatai tikrinami plonasluoksnės chromatografijos būdu, sistema

acetonas:toluenas (4:1). Junginiui nustatyti UV ir IR spektrai.

3 lentelė. 5-nitrofurfuril-2-propil-rodaninas

Jung.

Nr R

Išeiga

(%)/

reakcijos

laikas

(min.)

Lyd. Temp. °C Mol. Formulė

(Mr)

Grynumas

pagal ESC

VIP-48

56/30 146-148 C11H10N2O4S2

298 100

2.2. Lydymosi temperatūros nustatymas

Susintetintų junginių lydymosi temperatūra nustatoma Koflerio lydymosi temperatūros

nustatymo aparatu. Jis susideda iš mikroskopo, kaitinimo elemento, termometro.

Ant objektinio stiklelio uždedamas mažas kiekis medžiagos ir ant viršaus uždedamas kitas

objektinis stiklelis. Medžiaga sutrinama tarp abiejų stiklelių. Vėliau objektiniai stikleliai dedami

ant kaitinimo elemento ir pro mikroskopą stebimi junginio struktūros pokyčiai.

Lydymosi pradžia laikoma pirmo lašelio atsiradimas, o pabaiga – kai visas junginys virsta

skysčiu ir nebėra kristaliukų.

Junginių lydymosi temperatūros pateikiamos antroje ir trečioje lentelėse.

26

2.3. Junginių strūktūros nustatymas IR spektroskopijos būdu

Junginių spektrai buvo užrašyti Perken Elmer Spektrum – 100 spektrometru naudojant

ATR (angl. Attenuated total reflection) priedą, užnešant mažą tiriamo junginio kiekį ant cinko

selenido kristalo.

Tirtų junginių IR spektrai pateikiami 1 priede.

2.4. Junginių grynumo nustatymas

Junginių grynumas nustatomas efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodu.

Analizei buvo naudojamas Waters 2695 chromatografas (Waters Corporation, Milford, USA) bei

fotodiodų matricos detektorius Waters 996 PDA (Waters Corporation, Milford, USA). Kolonėlė

junginių atskyrimui C 18 4,6x250 mm, 5 µm ACE kolonėlė, kuri buvo laikoma išoriniame

termostate, 25°C temperatūroje. Prieš atliekant analizę buvo paruošiami tiriamųjų medžiagų

tirpalai tirpinant 1 mg medžiagos 10 ml acetonitrile. Chromatografijai buvo naudojama 10 µl

tirpalo. Mobiliosios fazės greitis 1,2 ml/min. Buvo naudota tokia gradiento sistema: tirpalas A –

0,1% trifluoracto rūgštis vandenyje, tirpalas B – acetonitrilas; 0 min. – 80% A ir 20% B, 15 min. –

20% A ir 80 % B, 20 min. – 10% A ir 90% B, 21 min. – 80% A ir 20% B. Veikliųjų junginių

detekcija atlikta 200-600nm bangų intervale. Rezultatai pateikiami antroje ir trečioje lentelėse.

4 lentelė. Junginių UV-vis pikai

Junginys UV-vis pikai

VIP-1 244; 299; 407

VIP-2 268; 311; 371

VIP-3 267; 311; 370

VIP-4 281; 317; 399

VIP-5 200; 286; 407

VIP-6 316; 375

VIP-7 231; 318; 412

VIP-8 293; 469

27

2.5. Junginių antimikrobinio poveikio tyrimas in silico

Junginių antimikrobiniui poveikiui in silico nustatyti buvo naudojama speciali kompiuterinė

programa TRIPOS SYBYL-X (bandomoji versija).

TRIPOS SYBYL-X yra molekulinio modeliavimo programa. Ji sukurta norint palengvinti ir

pagreitinti aktyvių junginių paiešką vaistų paieškoje. Molekulinis modeliavimas apima daugeli

teorinius ir skaičiavimo metodus, naudojamus modeliuoti ar imituoti molekulės elgseną. Viena iš

svarbiausių molekulinio modeliavimo savybių, tai, kad molekulinės sistemos yra atomistiniame

lygyje. Molekulinio modeliavimo metu skaičiavimai gali būti atliekami dideliam kiekiui medžiagų

vienu metu. Molekulinis modeliavimas suteikia galimybę ištirti gyvame organizme vykstančius

reiškinius: baltymų susilankstymą, fermentų katalizę, konformacinius pokyčius, baltymų

stabilumą, atpažinimo procesus DNR ir membranose.

Atlikus molekulinį modeliavimą programa matematiniais metodais suskaičiuoją apytikrį

rezultatą, kuris parodo intramolekulinių, ne kovalentinių, jungčių, tokių kaip vandenilinės jungtys,

sąveikos stiprumą tarp pasirinktos molekulės ir tiriamos medžiagos atomų. Kuo rezultatas

didesnis, tuo junginio sąveika su mikroorganizmo baltymais stipresnė, ir tiriamasis junginys

galimai aktyvesnis. Taip pat matuojami atstumai tarp tiriamojo junginio vandenilinį ryšį

sudarančios molekulės ir baltyme esančio NADH+ vandenilio atomų. Atstumas matuojamas

Angstremais (Å).

Eiga. Visų pirma internetinėje duomenų bazėje [http://pdb.org] surandama jau

iškristalizuota 4BNF baltymo struktūra. Tuomet baltymas paruošiamas darbui. Pirmiausia iš

baltymo polimerinės struktūros išskiriamas jo monomeras. Iš baltymo turi būti pašalinama

kristalografijos būdu nustatyta triklozano molekulė, kuri išsaugojama atskirai vėlesniems

palyginimams. Baltymas yra paruoštas, kai jis rodomas kaip monomeras, nebeturintis prijungtos

triklozano molekulės.

Paruošus baltymą atliekamas jo validavimas, norint patikrinti programos ir kompiuterinės

informacijos tikslumą. Validavimo metu tyrimam išsaugotą triklozano molekulę bandoma prijungti

prie baltymo, taip pat, kaip ji buvo prisitvirtinusi prieš ją pašalinant iš monomero struktūros.

Validavimo metu keičiami molekuliniai ir programos parametrai, priklausomai nuo to, į kokius

parametrus norėtume, kad programa atsižvelgtų, kaip: tiriamų junginių molekulių vidinį judėjimą,

išsilanktymą prisijungimo metu, 20 faktorių prisijungimo būdų ir kt. Suradus tinkamus parametrus

jie išsaugomi tirti kitus junginius (17 pav.).

Tiriant junginius būtina stebėti ar jis jungiasi prie monomero aktyviojo centro.

28

In silico tyrimo rezultatai pateikiami penktoje lentelėje.

5 lentelė. Tyrimo in silico rezultatai

Junginys Rezultatas Vandenilinių ryšių

skaičius

VIP-41 5,96 2

VIP-42 5,17 3

VIP-43 5,44 2

VIP-44 6,34 4

VIP-45 4,87 4

VIP-46 5,01 2

VIP-47 6,28 4

VIP-48 5,39 1

2.6. Junginių antimikrobinio poveikio tyrimas in vitro

Susintetinti junginiai buvo tiriami mikrobiologiškai in vitro. Aktyvumas buvo tiriamas prieš

šias bakterijų ir grybelių kultūras:

1. Staphylococcus aureus ATCC 25923

2. Staphylococcus epidermidis ATCC 12228

3. Enterococcus faecalis ATCC 29212

4. Escherichia coli ATCC 25922

5. Klebsiella pneumoniae ATCC 33499

6. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

7. Proteus mirabilis ATCC 12459

8. Bacillus cereus ATCC 8035

9. Bacillus subtillis ATCC 6633

10. Candida albicans ATCC 60193

Bakterijų ir grybelių pasirinkimą lėmė jų skirtingi struktūriniai ypatumai: gramteigiamos

bakterijos: S. aureus, Staphylococcus epidermidis; gramneigiama E. coli, sudarančios sporas

B. subtilis ir B. cereus, sudaranti kapsulę K. pneumoniae, šliaužianti P. Mirabilis. Taip pat jie

29

dažnai pasirenkami kaip standartiniai mikrobai priešmikrobiniams tyrimams. P. aeruginosa yra

atspari daugeliui antimikrobinių vaistų, o E. faecalis – vienas dažniausių hospitalinių infekcijų

sukėlėjų, be to, jis labai jautrus nitrofurantoino poveikiui [103], todėl naudinga nustatyti, ar

susintetinti nauji nitrofurano dariniai yra aktyvūs prieš šias bakterijas. C. albicans – vienas iš

dažniausiai grybelines infekcijas sukeliančių bakterijų, dėl to dažnai naudojamas kaip

standartinis grybelis tyrimams.

Bakteriostatinės (fungistatinės) junginių koncentracijos nustatytos serijinio skiedimo

būdu standžioje terpėje (Mueller-Hinton broth II, BBL, Cockeysville, JAV).

Etaloninių mikroorganizmų kultūrų paruošimas. Etaloninės bakterijų ir grybelio

C. albicans kultūros buvo auginamos 1 parą prieš tyrimą, termostate, 5 ml mėgintuvėliuose ant

nuožulnaus Miulerio-Hintono agaro. Termostate kultūros laikomos ~24 valandas 35°C. Mikrobų

suspensija gaminama iš išaugintų mikrobų kultūrų fiziologiniame natrio chlorido (0,9 %) tirpale,

standartizuojama McFarland standartiniu indikatoriumi, kuris matuoja mėgintuvėlyje esančios

suspensijos drumstumą. Mikrobų suspensija laikoma standartizuota, kai indikatoriaus reikšmė

lygi 0,5 (tai reiškia, kad 1 ml mikrobų suspensijos yra 1,5 × 108 mikrobų ląstelių).

Tiriamųjų junginių paruošimas mikrobiologiniam tyrimui. Tiriamiamieji junginiai

tirpinami dimetilsulfokside (DMSO), kadangi jų tirpumas vandenyje prastas. Buvo paruošti 1000

µg/ml koncentracijos tirpalai. DMSO taip pat būdingas priešmikrobinis veikimas, todėl kartu buvo

atliekamas kontrolinis tyrimas. Vėliau tiriamųjų junginių tirpalai buvo perkelti į Petri lėkšteles,

kartu dedamas agaras ir sumaišoma sterilia kilpele, taip paruošiami 500 µg/ml koncentracijos

tirpalai. Standartizuotos mikrobų kultūrų suspensijos kilpele po 0,1 ml buvo sėjamos ant

sustingusios standžios terpės su atitinkama junginių koncentracija. Pasėtai mikrobų kultūrų

suspensijai išdžiūvus, Petri lėkštelės dedamos į termokamerą parai laiko.

Kontrolei ant standžiosios Miulerio–Hintono terpės buvo sėjamos etalonines bakterijų ir

grybelio C. albicans kultūros be tiriamosios medžiagos. Kitą dieną vertinamas mikrobų augimas

ir lyginamas su kontrole.

Tirtų junginių minimalios baktericidinės koncentracijos (MSK) pateiktos šeštoje lentelėje.

30

6 lentelė. Antimikrobinio aktyvumo tyrimų rezultatai esant 500 µg/ml koncentracijai

Junginys MSK, µg/ml

S.

au

reu

s A

TC

C 2

59

23

S.

ep

ide

rmid

is

AT

CC

12

22

8

E.

fae

ca

lis A

TC

C 2

92

12

E.

co

li A

TC

C 2

59

22

K.

pn

eu

mo

nia

e A

TC

C

33

49

9 3

P.

ae

rug

ino

sa A

TC

C 2

785

P.

mir

ab

ilis

AT

CC

12

45

9

B.

ce

reu

s A

TC

C 8

03

5

B.s

su

bti

lis

A

TC

C 6

63

3

C.

alb

ica

ns

AT

CC

60

19

3

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

VIP-41 500 500 500 500 500 >500 >500 500 >500 500

VIP-42 >500 >500 >500 >500 >500 >500 500 >500 >500 >500

VIP-43 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500

VIP-44 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500

VIP-45 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500

VIP-46 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500

VIP-47 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500

VIP-48 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500

2.7. Apibendrinimas

Šiame skyriuje pateikiami junginių sintezės aprašymai, junginiams atliktų tyrimų

aprašymai ir rezultatai, kaip: lydymosi temperatūros nustatymas, UV ir IR spektrų nustatymas,

grynumo įvertinimas, junginių priešmikrobinis aktyvumo nustatymas in silico ir in vitro.

31

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. Rodanino darinių sintezė

2-alil-rodanino junginiai buvo sintetinami dėl panašios struktūros česnako junginiui aliinui

ir iš jo išskirtam junginiui alicinui. Česnako junginiai yra nuo seno naudojami, nuo įvairių infekcijų

ir jų aktyvumas yra ištirtas įvairiais tyrimais. Tad manyta, kad rodaninas dar labiau pastiprins

aliino veiksmingumą. Įdomu, kad rodanino alilo junginiai turi česnakui būdingą kvapą.

Prieš pradedant sintezę buvo atlikta jau susintetintų junginių duomenų bazių analizė. Buvo rasta

nedaug susintetintų S-alil rodanino darinių su pakaitais 5 – oje padėtyje, bet nei vienam jų

nebuvo atlikti priešmikrobiniai tyrimai.

Elektroninėje duomenų bazėje rastas vienas jau susintezuotas junginys – VIP–44, tačiau

jam nebuvo atlikta panašių tyrimų.

Pagal turimus duomenis galima palyginti skirtingų aldehidų pakaitų 5 – oje rodanino žiedo

padėtyje antimikrobinį poveikį. Taip pat remiantis jau atliktais magistriniais darbais su panašiais

aldehidais, įvertinti alicino darinio 2 – oje rodanino žiedo padėtyje poveikį mikroorganizmams.

3.1.1. 5-pakeistų-rodanino darinių sintezė

Rodanino-5-pakeistiems junginiams buvo naudojamas jau pagamintas rodaninas. Jis

buvo kristalintas iš butanolio tirpalo. Reakcija buvo vykdoma atliekant Knoevangel‘io

kondensaciją. Šiuo metodu į 5 – ają rodanino žiedo padėtį buvo jungiami aldehidai. Šiai reakcijai

kaip katalizatorius buvo naudojamas amonio acetatas ar natrio acetatas (vykdant reakciją su

nitrofurfurolu). Lietuvoje atliktų tyrimų duomenimis, reakcijos su amonio acetatu vykdavo geriau,

jų išeiga geresnė [80].

Kaip reakcijos tirpiklis buvo naudojama acto rūgštis. Iš pradžių acto rūgštyje, kaitinant, yra

ištirpinami rodaninas ir aldehidas, o vėliau įdedamas katalizatorius. Maišant iškrenta nuosėdos.

Reakcija su nitrofurfurolu vyksta apie 10 minučių, taip pat iškrentant nuosėdoms. Gautos

medžiagos kristalizuojamos acetonu.

32

13 pav. 5-pakeistų-rodanino junginių sintezė

3.1.2. 2-alil-5-pakeistų-rodanino darinių sintezė

Norint gauti 2-alil-5-pakeistus-rodanino junginius vykdoma rodanino-5-pakeistų junginių

alkilizacija. Ji susideda iš dviejų etapų. Pirmasis žingsnis yra rodanino druskų formavimas.

Rodanino-5-acetilo junginiai alkilinami naudojant N,N-diisopropiletilaminą ir nepolinį tirpiklį –

benzeną. Mišinys maišomas, kol susidaro rodanino. Vėliau vykdoma alkilizacija, naudojant

alilbromidą. Reakcijos laikas yra gana ilgas, nes negalima šildyti reakcijos mišinio.

Eksperimentiškai matoma, jog šildant reakcijos mišinį susidaro daugiau šalutinio produkto –

rodanino-N-alilo. Norint pagreitinti reakciją buvo naudojama mikrobangų krosnelė. Tai žymiai

pagreitino reakcijos laiką, o reakcijos mišinys likdavo neįkaitęs. Reakcijos metu susidarydavo

permatomi amonio druskos kristalai, o reakcijos eigai sekti buvo naudojama plonasluoksnė

aliuminio plokštelių chromatografija (PLC), naudojant tirpiklių sistemą toluenas:acetonas (4:1).

Įvykus reakcijai ant aliuminio plokštelės buvo matomi geltonai fluorescuojantys 2-alil-rodanino-

33

5-acetilo dariniai ir melsvi N-alil-rodanino-5-acetilo junginiai. Norint išgryninti 2-alil-rodanino-5-

acetilo darinius buvo atliekama kristalizacija. Pirmoji kristalizaciją buvo vykdoma su anglimi,

vykdant karštą filtraciją iš skirtingų tirpiklių. Buvo matomas akivaizdus kristalų šviesėjimas.

Vėliau, dėl skirtingų susidariusių junginių tirpumų, kristalizacijai buvo pasirenkami skirtinngi

tirpikliai. Remiantis PLC rezultatais medžiagos buvo kristalinamos nuo 1 iki 4 kartų, skirtingais

tirpikliais. Taip gaunami: Šiomis reakcijomis gauti šie junginiai: 2-prop-2-enilsulfanil-5-(5-

nitrofuran-2-ilmetilen)-1,3-tiazol-4-onas (VIP-41), 2-prop-2-enilsulfanil-5-(p-brombenziliden-2-

ilmetilen)-1,3-thiazol-4-onas (VIP-42), 2-prop-2-enilsulfanil-5-(p-chlorbenziliden-2-ilmetilen)-1,3-

thiazol-4-onas (VIP-43), 2-prop-2-enilsulfanil-5-(furan-2-ilmetilen)-1,3-thiazol-4-onas (VIP-44), 2-

prop-2-enilsulfanil-5-(4-hidroksi-3-metoksibenziliden-2-ilmetilen)-1,3-thiazol-4-onas (VIP-45), 2-

prop-2-enilsulfanil-5-(p-nitrobenziliden -2-ilmetilen)-1,3-thiazol-4-onas (VIP-46), 2-propilsulfanil-

5-(p-dimentilaminobenziliden-2-ilmetilen)-1,3-thiazol-4-onas (VIP-47).

S

NH

S

O

R

S

N

S

O

R CH2

BrCH2

N

CH3 CH3

CH3

CH3 CH3

14 pav. 5-pakeistų-rodanino junginių alkilizacija

34

15 pav. 2-alil-5-vanilin-rodanino kristalai

3.1.3. 2-propil-5-nitrofurfuril-rodanino (VIP-48) sintezė

Šiai sintezei naudojamas jau pagamintas 5-nitrofurfuril-rodaninas. 2-propil-5-pakeisti

rodanino dariniai sintetinami panašiai, kaip ir 2-alil-5-pakeisti-rodanino junginiai, tik vietoj

alilbromido naudojamas propil-jodidas. Gautas 2-propil-5-nitrofurfulil-rodaninas kristalinamas iš

izopropanolio, naudojant anglį, ir iš etilo acetato.

35

S

NH

S

O

R

S

N

S

O

R CH3

ICH3

N

CH3 CH3

CH3

CH3 CH3

16 pav. 2-propil-5-nitrofurfuril-rodanino junginių sintezė

3.2. Junginių struktūros nustatymas IR spektroskopijos būdu

Junginių strūktūra buvo nustatyta IR spektroskopijos būdu. Spektrai buvo analizuojami

pasinaudojant internete rastomis lentelėmis, su organinių junginių funkcinių grupių IR

absorbcijos dažniais [105, 106]. Rezultatai pateikiami septintoje lentelėje.

7 lentelė. Junginių strūktūros nustatymas IR spektroskopijos būdu

Junginys Dažnis Grupė

1705 Keto VIP-41

1475, 1340 Nitro 1690 Keto

VIP-42 660 Br 1690 Keto

VIP-43 751 Cl

VIP-44 1680 Keto VIP-45 1665 Keto

1700 Keto VIP-46

1510, 1340 Nitro VIP-47 1660 Keto VIP-48 1665 Keto

3.3. Junginių antimikrobinio aktyvumo tyrimas in silico

Junginių tyrimui in silico reikėjo pasirinkti taikinį. Juo pasirinkau bakterijoje S. aureus

esanti baltymą 4BNF. Taikiniu pasirinkau S. aureus, dėl šios bakterijos infekcijų gausėjimo ir

rezistentiškumo antibiotikams didėjimo [73], Susintezuotų junginių priešmikrobinis tyrimas in

36

silico atliktas panaudojant kompiuterinio modeliavimo programą “SYBYL-X”. Gauti rezultatai

buvo lyginami su triklozano junginio molekulinio modeliavimo rezultatais. Triklozano aktyvumas

prieš skirtingas MRSA padermes svyruoja MSK (minimali slopinati koncentracija) nuo 0,12 mg/l

iki 4 mg/l ir MBK (minimali baktericidinė koncetracija) nuo 0,25 mg/l iki 32 mg/l [19]. Jo

molekulinio modeliavimo rezultatas 3,99, o atstumas tarp vendenilinius ryšius sudarančių

molekulių – 2,88 Å.

17 pav. 2-alil-5-vanilin-rodanino molekulė prisijungusi prie 4BNF baltymo

Iš rezultatų matome, kad visų gautų junginių molekulinio modeliavimo rezultatai,

jungiantis su 4BNF baltymu, yra geresni nei lyginamojo triklozano.

Tik vieno junginio (VIP-45) rezultatas yra mažesnis nei 5, keturių junginių rezultatas yra

lygus, arba didesnis nei 5, ir dviejų junginių aktyvumas didesnis nei 6. Pats didžiausias

rezultatas nustatytas junginio 5-furfuril-2-alil-rodanino (VIP-44) (16 pav.).

Pastebėta, kad vieni iš aktyviausių junginių yra su furano žiedais. Remiantis LSMU atliktais

tyrimais, junginiai su nitrofurfurolo pakaitu turi didžiausią aktyvumą prieš S. aureus [1, 4, 6], todėl

stebina, kad furano junginio su nitro grupe 5-oje padėtyje rezultatas mažesnis, nei tiesiog su

furano grupe. Junginio VIP-41, kurio antroje padėtyje yra propeno radikalas, rezultatas didesnis

nei junginio VIP-48 su propano radikalu.

Taip pat iš visų rodanino junginių su benzeno pakaitu 5-oje padėtyje, pats aktyviausias

para padėtyje, turintis dimetilamino pakaitą.

37

18 pav. Junginių molekulinio modeliavimo sąveikos su 4BNF baltymu rezultatas

3.4. Junginių antimikrobinio aktyvumo tyrimas in vitro

Norint įvertinti junginio antimikrobinio aktyvumo rezultatų teisingumą in silico, buvo

atliktas pirminis antimikrobinis tyrimas in vitro užnuodytos lėkštelės standžioje terpėje metodu

prieš S. aureus. Taip norint praplėsti tyrimą buvo atliktas tyrimas in vitro ir prieš kitas bakterijų

padermes.

Mikroorganizmai pasirinkti dėl jų skirtingų struktūrinių ypatumų. Bakterijos

Staphylococcus aureus (gramteigiama), Staphylococcus epidermidis (gramteigiama), E. coli

(gramneigiama), B. subtilis ir B. cereus (sudarančios sporas), K. pneumoniae (sudaranti

kapsulę), P. mirabilis (šliaužianti). P. aeruginosa atspari daugumai antimikrobinių vaistų, o

E. faecalis – vienas dažniausių hospitalinių infekcijų sukėlėjų [17]. C. albicans – vienas

pagrindiniu grybelinių infekcijų sukėlėjų.

Junginiai tyrimui buvo tirpinami DMSO, nes jie turi būti visai ištirpę ir nesikristalizuoti

maišant su vandeniniu agaro tirpalu, o DMSO yra itin geras tirpiklis. Tačiau DMSO pasižymi

0

1

2

3

4

5

6

7

VIP-41

VIP-42

VIP-43

VIP-44

VIP-45

VIP-46

VIP-47

VIP-48

Triklozanas

38

antimikrobinėmis savybėmis, todėl buvo daromas kontrolinis mėginys nustatyti, ar junginių

tirpinimui naudojamas DMSO tūris pasižymi antimikrobiniu aktyvumu. Gauta, kad 5 % DMSO

tirpalas įtakos mikroorganizmų augimai neturi.

19 pav. Kontrolinis antimikrobinio tyrimo in vitro mėginys

Atlikus ažvalginį tyrimą gauti rezultatai, jog tik trys susintezuoti junginiai turi antimikrobinį

veikimą (VIP-41;VIP-42; VIP-47). VIP-41 antimikrobiškai veikia septynias iš dešimties

mikroorganizmų padermes (B. cerius, C. albicans, S. aureus, S. epidermidis, E. faecalis, E. coli,

K. Pneumonine). VIP-42 veikia tik vienintelę P. Mirabilis. Daugiausiai mikroorganizmų veikia

junginys VIP-47, 5-oje rodanino padėtyje turintis p-dimetilaminobenzaldehido pakaitą, jis

pasižymi priešmikrobiniu veikimu prieš visų bakterijų ir grybelio C. albicans kultūras.

39

20 pav. 2-alil-rodanino su dimedilamino benzaldehido pakaitu 5-oje padėtyje antimikrobinio tyrimo in vitro rezultatai

8 lentelė. Pirminio mikrobiologinio tyrimo rezultatai esant 500 µg/ml tiriamojo junginio

koncentracijai

Junginys

S.

au

reu

s A

TC

C 2

59

23

S.

ep

ide

rmid

is

AT

CC

12

22

8

E.

fae

ca

lis A

TC

C 2

92

12

E.

co

li A

TC

C 2

59

22

K.

pn

eu

mo

nia

e A

TC

C

33

49

9 3

P.

ae

rug

ino

sa A

TC

C 2

785

P.

mir

ab

ilis

AT

CC

12

45

9

B.

ce

reu

s A

TC

C 8

03

5

B.s

su

bti

lis

A

TC

C 6

63

3

C.

alb

ica

ns

AT

CC

60

19

3

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

VIP-41 + + + + + - - + - + VIP-42 - - - - - - + - - - VIP-43 - - - - - - - - - - VIP-44 - - - - - - - - - - VIP-45 - - - - - - - - - - VIP-46 - - - - - - - - - - VIP-47 + + + + + + + + + + VIP-48

- - - - - - - - - -

40

Tyrimo in silico rezultatai ne visai atitiko tyrimo in vitro rezultatus. Daugumos junginių

kurių molekulinio modeliavimo rezultatas buvo didesnis už triklozano, S. aureus baktericidiškai

veikianti koncentracija buvo didesnė nei 500 µg/ml, o triklozano nuo 0,25 mg/l iki 32 mg/l. Du

junginiai (VIP-41, VIP-47), kurių molekulinio modeliavimo rezultatai buvo didžiausi taip pat,

vieninteliai iš visų junginių, pasižymėjo ir didesniu nei 500 µg/ml aktyvumu prieš S. aureus.

Nors VIP-44 su furano pakaitu 5-oje rodanino molekulės padėtyje rezultatai in silico

žadėjo didesnį aktyvumą nei junginiui VIP-41 su nitro grupe 5-oje furano padėtyje, tačiau tyrimai

in vitro parodė atvirkščius rezultatus.

Sintezuojant junginius, iškėliau hipotezę, jog antimikrobinis aktyvumas stipresnis, jei

pakaitas 2-oje rodanino molekulės padėtyje turės dvigubą jungtį, kaip alicino molekulėje (17

pav.). Norint patikrinti šią hipotezę, buvo susintezuotas junginys su vienguba jungtimi pakaite

(18 pav.).

S

N

S

O

O

N+

O-

O

CH2

21 pav. 2-alil-5-nitrofurfuril-rodaninas

S

N

S

O

O

N+

O-

O

CH3

22 pav. 2-propil-nitrofurfuril-rodaninas

Šią hipotezę patvirtino ir tyrimai in silico ir in vitro. VIP-41 molekulinio modeliavimo

rezultatas 5,96, o VIP-48 5,39. Tiesa, skirtumas nėra labai didelis. Atlikus apžvalginius

antimikrobinius tyrimus in vitro, matoma, kad junginys VIP-41 (17 pav.) veikia net 7 bakterijų

padermes esant 500 µg/ml, o VIP-48 (18 pav.) esant tokiai koncentracijai neveikia nei vienos.

Tad aktyvumas tikrai priklauso nuo dvigubo ryšio 2-alil-5-nitrofurfurol-rodanine.

41

22 pav. 2-alil-rodanino su nitrofurfurilo pakaitu 5-oje padėtyje antimikrobinio

tyrimo in vitro rezultatai

23 pav. 2-propil-rodanino su nitrofurfurilo pakaitu 5-oje padėtyje antimikrobinio

tyrimo in vitro rezultatai

Kita hipotezė buvo, kad junginių su nitrofurfurilo pakaitu aktyvumas didesnis nei junginio

VIP-44, kurio furfurolo žiedo 5-oje padėtyje nėra nitro grupės. Kaip jau nurodyta anksčiau,

junginys VIP-41 esant 500 µg/ml koncentracijai veikia net 7 bakterijų padermes, o VIP-44 (19

pav.) esant šiai koncentracijai neveikia nei vienos. Tai patvirtina šią hipotezę.

24 pav. 2-alil-rodanino su furfurilo pakaitu 5-oje padėtyje antimikrobinio

tyrimo in vitro rezultatai

42

S

N

S

O

O CH2

25 pav. 2-alil-5-furfuril-rodaninas

Taip pat įsprendžiant iš tyrimo rezultatų, kad 2-alil-rodanino junginiai su para-brom ar

para-chlor benzaldehidų pakaitais 5-oje padėtyje yra mažiau aktyvūs nei su nitrofurfurilo pakaitu,

galima teigti, kad alilo pakaitas pats nesuteikia rodaninui aktyvumo, o suteikia pakaitas 5-oje

padėtyje - nitrofurfurilas.

3.5. Apibendrinimas

Buvo tirti gautų junginių antimikrobiniai aktyvumai in silico ir in vitro. Gauti rezultatai in

silico nėra visai tikslūs, palyginus su in vitro. Patys aktyviausi junginiai nustatyti VIP-41 ir VIP-47.

Tai taip pat įrodo rodanino darinio su dvigubuoju ryšiu 2-oje rodanino molekulės padėtyje

esančiame pakaite didesnis antimikrobinis aktyvumas nei identiško su propilo pakaitu.

Buvo pastebėtas ir rodaninio darinio su nitrofurfurolo pakaitu 5-oje padetyje didesnis

antimikrobinis aktyvumas nei rodanino darinio su furfurolu. Tai įrodo nitro grupės svarbą.

Reikalingi detalesni VIP-41, VIP-42, VIP-43 junginių tyrimai.

43

4. IŠVADOS

1. Tyrimui susintetinti 8 nauji 4-tiazolinono dariniai: 7 su alilo pakaitu 2-oje padėtyje ir

skirtingais aldehidais 5-oje padėtyje; taip pat vienas lyginamasis junginys su propilo

pakaitu 2-oje padėtyje ir nitrofurfurilo 5-oje.

2. Atliktas tyrimas in silico programa SYBYL-X ir pirminis tyrimas in vitro užnuodytos

lėkštelės standžioje terpėje metodu. Vieni aktyviausų in silico nustatyti junginiai VIP-41 ir

VIP-47 taip pat buvo vieninteliai aktyvūs prieš S. aureus ir in vitro.

3. Geram 2,5-pakeistų-4-tiazolinono junginių antimikrobiniam veikimui būtinas dvigubas

ryšys 2-oje molekulės padėtyje esančiame pakaite. Taip pat junginių aktyvumas didėja į

penktoje rodanino molekulės padėtyje esančio furfurolo 5-tą padėtį įvedus nitro grupę.

Pats alilo pakaitas junginiams reikšmingo aktyvumo nesuteikia, o svarbesnis aktyvumui

aldehido pakaitas 5-oje padėtyje.

44

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS

Susintezavus 4-tiazolinono darinius su alilo pakaitu, atlikus jų antimikrobinius tyrimus in

silico ir apžvalginius tyrimus in vitro, pastebėtas jų antimikrobinis potencialas. Dėl šių rezultatų

rekomenduojamas detalesnis nustatytų aktyvių junginių tyrimas in vitro.

45

6. LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Kelmelytė E. 3-amino rodanino 3-, 5-, 3, 5-pakeistų darinių sintezė ir jų antibakterinio bei

priešgrybelinio aktyvumo įvertinimas.Kaunas 2013 [magistro darbas].

2. Mačiulaitis R., Petrikaitė V., Aukštakalnienė A., Janušonis T. Antimikrobinių vaistų

vartojimo įvertinimas ir palyginimas su jų racionalaus vartojimo rekomendacijomis.

Medicina (Kaunas) 2006; 42(12); 999-1005.

3. Mačiulaitis R., Miciulevičiūtė J., Stirbienė I. Racionalus antimikrobinių vaistų vartojimas.

Vilnius, 2004.

4. Pelakauskas V. Rodanino-3-acto ir 3-propano rūgščių darinių sintezė ir jų antibakterinio

bei priešgrybelinio aktyvumo įvertinimas. Kaunas 2013 [magistro darbas].

5. Petrikaitė V. 2,5-pakeistų tiazolidinono darinių sintezė ir jų priešgrybelinio bei

antibakterinio aktyvumo įvertinimas. Kaunas, 2007 [daktaro disertacija].

6. Remeikis L. Naujų 3, 5-pakeistų 3-amino-2-tiokso-4-tiazolidinono darinių su

cikloheksanono ir ciklopentanono pakaitais sintezė ir antibakterinio ir priešgrybelinio

aktyvumo tyrimas. Kaunas 2013 [magistro darbas].

7. Radžiūnas R. Синтез и изучение биологической активности производных

тиазолинона-4 на основе аминогуанидинов. Харьков, 1988 [daktaro disertacijos

santrauka].

8. Tarasevičius E. Синтез, свойства и биологическая активность 2-

амино(гидразино-аминогуанидино)-4-оксотиазолинов с ароматическими и

гетероциклическими заместителями. Москва, 1990 [habilituoto daktaro disertacijos

santrauka].

9. Ankri S, Mirelman D. Antimicrobial properties of allicin from garlic. Microbes Infect

1999;2:125–9.

10. Ashraf R., Aamir K., Shaikh A. R., Ahmed T. Effects of garlic on dyslipidemia in patients

with type 2 diabetes mellitus. J Ayub Med Coll Abbottabad 2005;17:60-4.

11. Ashraf R., Khan R. A., Ashraf I. Garlic (Allium sativum) supplementation with standard

antidiabetic agent provides better diabetic control in type 2 diabetes patients. Pakistan

journal of pharmaceutical sciences, 2011;24:565-70.

12. Balunas M. J., Kinghorn A. D. Drug discovery from medicinal plants.Life

sciences, 2005;78:431-44.

46

13. Benavides G. A., Squadrito G. L., Mills R. W., Patel H. D., Isbell T. S., Patel R. P., Kraus

D. W. Hydrogen sulfide mediates the vasoactivity of garlic. Proceedings of the National

Academy of Sciences 2007;104:17977-82.

14. Block E. Garlic Other Alliums. RSC publishing 2010 p. 245-95.

15. Borrelli F., Capasso R., Izzo A. A. Garlic (Allium sativum L.): adverse effects and drug

interactions in humans. Molecular nutrition & food research, 2007;51:1386-97.

16. Bruno G., Costantino L., Curinga C., Maccari R., Monforte F., Nicolo F., Vigorita M. G.

Synthesis and aldose reductase inhibitory activity of 5-arylidene-2, 4-

thiazolidinediones. Bioorganic & medicinal chemistry, 2002;10:1077-84.

17. Butler M.S. The role of natural product chemistry in drug discovery. Journal of Natural

Products. 2004;67:214–53.

18. Chan K, Yin M, Chao W. Effect of diallyl trisulfide-rich garlic oil on blood coagulation and

plasma activity of anticoagulation factors in rats. Food Chem Toxicol 2007;45:502–7.

19. Ciusa M. L., Furi L., Knight D., Decorosi F., Fondi M., Raggi C., Oggioni M. R. A novel

resistance mechanism to triclosan that suggests horizontal gene transfer and

demonstrates a potential selective pressure for reduced biocide susceptibility in clinical

strains of< i> Staphylococcus aureus</i>. International journal of antimicrobial

agents, 2012;40:210-20.

20. Cutler RR., Wilson P. Antibacterial activity of a new, stable, aqueous extract of allicin

against methicillan-resistant Staphylococcus aureus. British Journal of Biomedical

Science 2004;61:71–4.

21. Davis S. R. An overview of the antifungal properties of allicin and its breakdown products

– the possibility of a safe and effective antifungal prophylactic Mycoses 2005;48:95-100

22. Durak I., Kavutcu M., Aytaç B., Avcı A., Devrim E., Özbek H., Öztürk H. S. Effects of

garlic extract consumption on blood lipid and oxidant/antioxidant parameters in humans

with high blood cholesterol. The Journal of nutritional biochemistry 2004;15:373-77.

23. Eidi A., Eidi M., Esmaeili E. Antidiabetic effect of garlic (< i> Allium sativum</i> L.) in

normal and streptozotocin-induced diabetic rats. Phytomedicine 2006;13.9:624-629.

24. Ensminger, AH. Foods & nutrition encyclopedia. Vol. 1. CRC Press 1994. p. 750

25. Free, C. A., Majchrowicz, E., & Hess, S. M. Mechanism of inhibition of histidine

decarboxylase by rhodanines. Biochemical pharmacology 1971;20:1421-28.

47

26. Freeman F., Kodera Y. Garlic chemistry: stability of S-(2-propenyl)-2-propene-1-

sulfinothionate (allicin) in blood, solvents, and simulated physiological fluids. J Agric Food

Chem 1995;43:2332–8.

27. Fujishima H., Tsubota K.. Improvement of corneal fluorescein staining in post cataract

surgery of diabetic patients by an oral aldose reductase inhibitor, ONO-2235. British

journal of ophthalmology, 2002;86:860-3.

28. Grant E. B., Guiadeen D., Baum E. Z., Foleno B. D., Jin H., Montenegro D. A., Hlasta D.

J. The synthesis and SAR of rhodanines as novel class C β-lactamase

inhibitors. Bioorganic & medicinal chemistry letters, 2000;10:2179-82.

29. Groppo F., Ramacciato J., Motta R., Ferraresi P., Sartoratto A. Antimicrobial activity of

garlic against oral streptococci. Int. J. Dent. Hyg. 2007;5:109–15.

30. Hardej D., Ashby Jr C. R., Khadtare N. S., Kulkarni S. S., Singh, S. Talele, T. T. The

synthesis of phenylalanine-derived C5-substituted rhodanines and their activity against

selected methicillin-resistant< i> Staphylococcus aureus</i>(MRSA) strains. European

journal of medicinal chemistry 2010;45:5827-32

31. Hashemi S., Nasrollah A., Rajab M. Irrational antibiotic prescribing: a local issue or global

concern? Excli Journal 2013;12:384-95

32. Imai J., Ide N., Nagae S., Moriguchi T., Matsuura H., Itakura Y. Antioxidant and radical

scavenging effects of aged garlic extract and its constituents. Planta medica 1994;60.05:

417-20.

33. Kendler B. S. Garlic (< i> Allium sativum</i>) and onion (< i> Allium cepa</i>): A review of

their relationship to cardiovascular disease. Preventive medicine, 1987;16:670-85.

34. Ko J. A., Lee Y. L., Jeong H. J., Park H. J. Preparation of encapsulated alliinase in

alginate microparticles. Biotechnology letters 2012;34:515-8.

35. Kyung K. H., Lee Y. C. Antimicrobial activities of sulfur compounds derived from S-alk

(en) yl-L-cysteine sulfoxides in Allium and Brassica. Food Reviews International

2001;17:183-98.

36. Lahlou M. Screening of Natural Products for Drug Discovery. Expert Opinion on Drug

Discovery 2007;2:697-705.

37. Lawson LD. Garlic: a review of its medicinal effects and indicated active compounds.

Phytomedicines of Europe: Chemistry and Biological Activity, ACS Symposium

1998;691:176–209.

48

38. Lau B. H. Suppression of LDL oxidation by garlic compounds is a possible mechanism of

cardiovascular health benefit. The Journal of nutrition 2006;136:765-8.

39. Lissiman E., Bhasale A. L., Cohen M. Garlic for the common cold. Cochrane Database

Systematic Reviews 2012;3.

40. Mahmoodi M., Islami M. R., Asadi K. G., Khaksari M., Sahebghadam L. A., Hajizadeh M.

R., Mirzaee M. R. Study of the effects of raw garlic consumption on the level of lipids and

other blood biochemical factors in hyperlipidemic individuals. Pakistan journal of

pharmaceutical sciences 2006;19.4:295-8.

41. Miron T, Rabinkov A, Mirelman D, Wilchek M, Weiner L. The mode of action of allicin: its

ready permeability through phospholipid membranes may contribute to its biological

activity.Biochim Biophys Acta 2000;1463:20–30.

42. Momose Y., Meguro K., Ikeda H., Hatanaka C., Oi S., Sohda T. Studies on antidiabetic

agents. X. Synthesis and biological activities of pioglitazone and related

compounds. Chemical & pharmaceutical bulletin 1991;39:1440-5.

43. Mottaghitalab M.; Taraz Z. Garlic powder as blood serum and egg yolk cholesterol

lowering agent. Journal of Poultry Science. 2004;41:50-57.

44. Nahas R., Balla A. Complementary and alternative medicine for prevention and treatment

of the common cold. Canadian Family Physician 2011;57:31-6.

45. Nantz M. P., Rowe C. A., Muller C. E., Creasy R. A., Stanilka J. M., Percival S. S.

Supplementation with aged garlic extract improves both NK and γδ-T cell function and

reduces the severity of cold and flu symptoms: A randomized, double-blind, placebo-

controlled nutrition intervention. Clinical Nutrition 2012;31:337-44.

46. Patwardhan B., Vaidya A. D. B., Chorghade M. Ayurveda and Natural Products Drug

Discovery. Current Science 2004;86:789-99.

47. Phil R. A. M., Khan R. A., Ashraf I. Effects of garlic on blood glucose levels and HbA1c in

patients with type 2 diabetes mellitus. Journal of Medicinal Plants Research, 2011;5:

2922-8.

48. Pittler, M. H., & Ernst, E. Clinical effectiveness of garlic (Allium sativum). Molecular

nutrition & food research 2007;51:1382-5.

49. Rahman K. Effects of garlic on platelet biochemistry and physiology. Mol Nutr Food

Res 2007;51:1335-44.

49

50. Rahman K., Lowe G. M. Garlic and cardiovascular disease: a critical review. The Journal

of nutrition 2006;136:736-40.

51. Ross Z., O’Gara E., Hill D., Sleightholme H., Maslin D. Antimicrobial properties of garlic

oil against human enteric bacteria: evaluation of methodologies and com-parisons with

garlic oil sulfides and garlic powder. Appl Environ Microbiology 2001;67:475–80.

52. Saleem M., Nazir M., Ali M. S., Hussain H., Lee Y. S., Riaza N., Jabbara A. Antimicrobial

natural products: an update on future antibiotic drug candidates. Natural product reports,

2010, 27.2:238-54.

53. Schou C. Garlic: A Taste for Health. Ethnobotanical Leaflets, 2011;2000:10.

54. Shamseer L., Charrois T. L., Vohra S. Complementary, Holistic, and Integrative Medicine

Garlic. Pediatrics in Review 2006;27:77-80.

55. Sheela C. G., K. T. Augusti. Antidiabetic effects of S-allyl cysteine sulphoxide isolated

from garlic Allium sativum Linn. Indian journal of experimental biology 1992;30.6:523-6.

56. Shuford J, Steckelberg J, Patel R. Effects of fresh garlic extract on Candida albicans

biofilms. Antimicrob. Agents Chemotherapy 2005;49:473.

57. Silagy C., Neil A. Garlic as a lipid lowering agent--a meta-analysis. Journal of the Royal

College of Physicians of London 1993;28.1:39-45.

58. Sim M. M., Ng S. B., Buss A. D., Crasta S. C., Goh K. L., Lee S. K. Benzylidene

Rhodanines as Novel Inhibitors of UDP-< i> N</i>-Acetylmuramate/l-Alanine

Ligase. Bioorganic & medicinal chemistry letters 2002;12:697-9.

59. Sing, W. T., Lee, C. L., Yeo, S. L., Lim, S. P., & Sim, M. M. Arylalkylidene rhodanine with

bulky and hydrophobic functional group as selective HCV NS3 protease

inhibitor. Bioorganic & medicinal chemistry letters, 2001;11:91-4.

60. Singh, S. B., & Barrett, J. F. Empirical antibacterial drug discovery—foundation in natural

products. Biochemical pharmacology, 2006;71:1006-15.

61. Sobenin I., Andrianova I., Sereda E., Borodina L., Karagodin V., Orekhov A. The effects

of time-released garlic powder tablets on acute respiratory in children. Medical and Health

Science Journal 2011;9:31-7

62. Solheim M, Aakra A, Snipen LG et al. Comaparative genomics of entrococcus faecalis

from healthy norewegian infants. BMC Genomics 2009;10:194.

63. Song MX, Zheng CJ, Deng XQ, Wang Q, Hou SP, Liu TT at al. Synthesis and

bioactivity evaluation of rhodanine derivatives as potential anti-bacterial agents. Eur J

Med Chem 2012;54:403-12.

50

64. Sovová M, Sova P. Pharmaceutical importance of Allium sativum L. 5. Hypolipemic

effects in vitro and in vivo.Ceska Slov Farm 2004;53:117–23.

65. Tanamai J., Veeramanomai S., Indrakosas N. The efficacy of cholesterol-lowering action

and side effects of garlic enteric coated tablets in man. JOURNAL-MEDICAL

ASSOCIATION OF THAILAND 2004;87:1156-61.

66. Tattelman E. Health effects of garlic. American family physician 2005;72

67. Teyssier C, Guenot L, Suschetet M, Siess MH. Metabolism of diallyl disulfide by human

liver microsomal cytochromes P 450 and flavin-containing monooxygenases. Drug Metab

Dispos 1999;27:835–41.

68. Thomson M., Al-Qattan K. K., Bordia T., Ali M. Including garlic in the diet may help lower

blood glucose, cholesterol, and triglycerides. The Journal of nutrition 2006;136:800-2.

69. Weber N. Andersen D. North J., Murray, B, Lawson L., Hughes B. In vitro virucidal effects

of Allium sativum (garlic) extract and compounds. Planta medica 1992;58:417–23.

70. Zervosen A., Lu W. P., Chen Z., White R. E., Demuth T. P., Frère J. M. Interactions

between penicillin-binding proteins (PBPs) and two novel classes of PBP inhibitors,

arylalkylidene rhodanines and arylalkylidene iminothiazolidin-4-ones. Antimicrobial agents

and chemotherapy 2004;48:961-9.

71. Zvarec O, Polyak SW, Tieu W, Kuan K, Dai H, Pedersen DS at al. 5-

Benzylidenerhodanine and 5-benzylidene-2-4-thiazolidinedione based antibacterials. Eur

J Med Chem 2012;22:2720-2.

72. AllergyNet. Prieiga per Internetą: http://www.allallergy.net/

73. ECDC. Annual epidemiological report Reporting on 2011 surveillance data and 2012

epidemic intelligence data. Prieiga per Internetą:

http://ecdc.europa.eu/en/publications/publications/annual-epidemiological-report-2013.pdf

74. Merriam-Webster Online Dictionary. Prieiga per Internetą: http://www.merriam-

webster.com/dictionary/antimicrobial

75. Prieiga per Internetą:

http://www.softdent.lt/publikacijos.aspx?load=5_lt.htm&meniuID=1&AspxAutoDetectCooki

eSupport=1

76. World Health Organization. Antimicrobial resistance. 2013, Fact sheet Vol. 194. Prieiga

per Internetą: http://www.who.int/en/

77. Sumpradit N., Chongtrakul P., Anuwong K., Pumtong S., Kongsomboom K., Butdeemee

P at al. Antibiotics smart use: a workable modelį for promoting the rational use of

51

medicines in Thailand. Bulletin of the World Health Organization. 2012;90:905-13 [cite

2013-04-28] Prieiga per Internetą: http://www.who.int/bulletin/volumes/90/12/12-

105445/en/

52

7. PRIEDAI

1 Priedas. Susintezuotų junginių chromatogramos, UV-vis ir IR spektrai

VIP-48

13,5

06

16,8

44

AU

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

Minutes

2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00

Retention Time Area % Area

1 13,506 37169 0,69

2 16,844 5346364 99,31

16,845 Peak 2

293,6

469,2

AU

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0,80

0,90

nm

200,00 250,00 300,00 350,00 400,00 450,00 500,00 550,00

53

VIP-47

11,7

54

AU

0,00

0,20

0,40

0,60

Minutes

2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00

Retention Time Area % Area

1 11,754 3222646 100,00

54

11,753 Peak 1

231,2

318,5

412,6

AU

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

nm

200,00 250,00 300,00 350,00 400,00 450,00 500,00 550,00

55

VIP-46

12,4

77

12,9

58 1

6,2

07

18,3

91

AU

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

Minutes

2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00

Retention Time Area % Area

1 12,477 528326 28,20

2 12,958 100891 5,38

3 16,207 1125065 60,05

4 18,391 119349 6,37

16,203 Peak 3

228,8 277,1

316,1

375,4

462,0 520,0546,7

AU

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

0,20

nm

200,00 250,00 300,00 350,00 400,00 450,00 500,00 550,00

56

VIP-45

9,2

77

12,6

42

AU

0,00

0,20

0,40

0,60

Minutes

2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00

Retention Time Area % Area 1 9,277 50786 1,48 2 12,642 3389263 98,52

57

12,643 Peak 2

200,8

286,5

407,8

AU

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

nm

200,00 250,00 300,00 350,00 400,00 450,00 500,00 550,00

58

VIP-44

10,5

22

14,1

94

AU

0,00

0,50

1,00

1,50

Minutes

2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00

Retention Time Area % Area

1 10,522 54860 0,55

2 14,194 9852085 99,45

14,195 Peak 2

281,8317,3

399,4

AU

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

1,60

1,80

nm

200,00 250,00 300,00 350,00 400,00 450,00 500,00 550,00

59

VIP-43

15,5

17

18,9

12

AU

0,00

0,10

0,20

0,30

Minutes

2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00

Retention Time Area % Area

1 15,517 24367 1,24

2 18,912 1939834 98,76

60

18,912 Peak 2

267,7

311,4

370,6

AU

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

nm

200,00 250,00 300,00 350,00 400,00 450,00 500,00 550,00

61

VIP-42

16,0

56

19,4

53

AU

0,00

0,05

0,10

Minutes

2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00

Retention Time Area % Area

1 16,056 8538 0,95 2 19,453 890124 99,05

19,484 Extracted

268,8

311,4

371,8

455,9 488,6 531,0557,7584,4

AU

0,000

0,010

0,020

0,030

0,040

0,050

0,060

0,070

0,080

0,090

0,100

0,110

nm

200,00 250,00 300,00 350,00 400,00 450,00 500,00 550,00

62

VIP-41

10,4

63

10,9

57

11,8

07

14,2

54

15,0

90

16,4

59AU

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

Minutes

2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00

Retention Time Area % Area 1 10,463 61231 2,38 2 10,957 34725 1,35 3 11,807 15199 0,59 4 14,254 2043565 79,56 5 15,090 366782 14,28 6 16,459 47156 1,84

63

14,257 Peak 4

244,1

299,6

407,8

551,6

AU

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

nm

200,00 250,00 300,00 350,00 400,00 450,00 500,00 550,00