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国内外奶牛胚胎移植技术研究及产业化进展

北京安伯胚胎生物技术中心余文莉

第一部分

奶牛胚胎移植及相关技术的研究进展

第一部分

奶牛胚胎移植及相关技术的研究进展

奶牛胚胎移植技术

定义

是指对生产性能优良和遗传性稳定的母牛经过超数排卵处理后，将多出自然排卵数几倍的受精卵取出，或者将通过体外受精方式获得的胚胎，分别移植到生理状态相同的受体母牛体内，使之产出优良后代的技术。

奶牛胚胎移植技术的意义

1

充分发挥优良母畜的繁殖潜力，成倍提高繁殖效率

2

用MOET技术培育种公牛，加大选择强度，缩短世代间隔

3

代替活畜进行洲际、国际引种

4

建立基因库，保存品种资源

奶牛胚胎移植技术的关键技术环节

超数排卵技术

非手术胚胎采集技术

胚胎冷冻 /解冻技术

受体牛同期发情技术

非手术胚胎移植技术

以胚胎移植为基础的相关胚胎生物技术

胚胎移植胚胎移植

AA

DD

BB

CC

EE其它

体外受精技术

胚胎性别鉴定技术

胚胎分割技术胚胎性别控制技术

国内外胚胎移植及主要相关生物技术的研究成果时间表技术名称

国内 国际 时间差

牛超数排卵 1978 中科院遗传所和上海市奶牛公司

1940 Casida 38 年

牛非手术冲胚 1978 中科院遗传所和上海市奶牛公司 1972 Sugie 6 年

胚胎程序化冷冻 1982 中科院遗传所和上海市奶牛公司

1972 Whittingham

10 年

胚胎玻璃化冷冻 1993 朱士恩 1985 Rall 8 年

胚胎分割 1987 窦忠英 1981 Willadsen 6 年

胚胎嵌合体 1989 丛笑倩 1984 Bradley 5 年

牛体外受精 1989 旭日干 1978 Brackett 11 年

PCR 胚胎性别鉴定 1992 曾溢滔等 1990 Herr 2 年

牛活体采卵 1999 刘云海 1982 Sirard 17 年

体细胞克隆 2000 张涌 1997 Wilmut 3 年

牛胚胎移植主要专项技术国内外水平比较

技术名称 美国、加拿大 国内超数排卵获可用胚 * 5.5~6.5 枚 5~6 枚

鲜常规胚胎移植妊娠率 * 55%~65% 50%~60%

冷冻常规胚胎移植妊娠率 * 50%~60% 40%~50%

PCR 性别鉴定准确率 98%±2% 98%±2%

性控胚胎雌性率 85%~95% 85%~95%

取样后鲜胚移植妊娠率 * 55%~65% 50%~55%

取样后冻胚移植妊娠率 * 55%~65% 40%~50%

性控胚胎妊娠率 * 55%~65% 40%~50%

*饲养管理水平对技术指标影响较大

1. 超数排卵技术 牛超数排卵的目的：最大限度地获得受精卵和可用胚胎 牛的超排反应和胚胎质量变异性很大

促性腺激素种类、批号、处理时间、剂量、年龄、季节、品种 处理时卵巢生理状态、营养状况、繁殖状态和重复超排次数等

牛的超排方法： CIDR+FSH+PG(16 天 )

目前的研究重点：提高超排效率 1 、重复超排：间隔；超排次数 2 、抑制素免疫提高牛超排效率 3 、与超排有关的基因位点的研究

重复超排效果的比较

(数据来自北京安伯胚胎生物技术中心 )

次别 处理牛数

超排有效n %

平均回收胚数

平均可用胚数

平均退化胚数

平均未受精数

第一次 84 78 92.9% 10.76±4.51a 7.26±3.65a 2.38±2.47a 1.12±1.51a

第二次 32 29 90.6% 10.59±5.94a 7.79±5.04a 2.00±1.73a 0.79±0.94A

第三次 29 28 96.6% 10.36±4.86a 6.25±4.06a 2.57±2.65a 1.54±2.53AB

ab

第四次 20 19 95.0% 12.26±6.66a 7.26±4.27a 2.53±3.67a 2.47±3.76Bb

第五次 13 12 92.3% 11.42±7.57a 7.08±5.71a 2.25±2.01a 2.08±2.15AB

ab

注：同列上标大写字母相同者表示差异不显著（ P>0.05 ）

2. 同期发情技术 不同牛同期发情方案的效果比较 *（李树静等， 2002年）

* 牛同期发情的目的是便于人工受精和胚胎移植，更适于集约化管理。受体牛营养状况对同期发情效果有显著影响。

方法 1 次或 2 次 PG 肌注 CIDR+PG CIDR+E2+PG 备注 原理 溶黄体 延长黄体期 延长黄体期 外周血液孕酮

水平迅速下降 发情率 53.1% （ 1 次 PG ）；

81.0% （ 2 次 PG ） 83.2% 88.4%

发情时间 注射后 48~96h 撤栓后 36~72h 撤栓后 36~48h

同期化程度

发情率均匀分布在注射后 48~96h

85% 以上在撤栓后48h 内发情

95% 以上在撤栓后 48h 内发情

黄体合格率 86.3% 93.8% 82.5%

移植妊娠率 43.7% 58.3% 48.8%

优点 成本低发情较集中，可精确安排工作量；受体牛利用率高

发情高度集中，可精确安排工作量

缺点 发 情 分 散 ， 不 易 精确安排工作量 成本高 成本高

3. 胚胎冷冻技术 胚胎程序化冷冻 ( 植冰 ):

1.5M 乙二醇（ 0.1M 蔗糖），直接解冻移植

进口胚胎检疫条例要求： 透明带完整； 0.1% 胰蛋白酶洗 10 次； 在全封闭的细管中冷冻。

胚胎玻璃化冷冻 (玻璃化溶液、提高降温速度 ) ： OPS玻璃化冷冻 细管法 冷冻环法 滴冻法 微细玻璃管法、 封闭式拉长塑料细管法

4. 胚胎性别鉴定及控制技术

胚胎性别鉴定技术： PCR 法（电泳和非电泳鉴定）：

• 双引物一步法 PCR扩增，耗时 65 分钟。灵敏度、准确率高、污染率和不反应率低，适于在生产现场应用。

• 2002 年， Hasler 对 7-8 日龄的 3,964 枚体内胚胎及 1181 枚体外胚胎进行了性别鉴定，在妊娠后经 B 超测试获得的准确率为雄性为 98.7% 、雌性为 94.4% 。

LAMP 法：• 环 -媒恒温扩增法，比 PCR 法更为快速简便，无需电泳，肉眼即可辨别，但鉴定准确率不高，容易产生非特异性扩增。

胚胎性别控制技术： 用分离后的 X 或 Y 精子生产体内或体外受精胚胎

PCR胚胎性别鉴定与 X 精子胚胎性别控制技术在奶牛中的应用效果比较

（体内受精冷冻胚胎， 2002~2010 年，李树静等）胚胎类型 常规胚胎 PCR 性别鉴定胚胎 X 精子性别控制胚胎

特点  对受精后 6 － 7天的早期胚胎进行取样，分析 DNA

用分离后的精子输精，获得近 90 ％性别一致的后代

超排获得的可用胚胎数量

5~6 枚(育成牛、经产

牛 )

5~6 枚(非鉴定，育成牛、

经产牛 )

3~5 枚(育成牛 )

得到一头母牛犊所需胚胎数量 5 枚 5 枚 (非鉴定 ) 3 枚 (X 性控胚胎 )

得到一头母牛犊所需受体母牛数量 6头 3头 4头

移植妊娠率 45%~50% 45%~50% 35~45%产母犊率 45~50% 95~99% 75~85%

获得 1 头 6 月龄母牛犊的成本 14260元 8140元人民币 6480元

优点 操作简便 ， 可任意选择种公牛

准确率高，可任意选择种公牛 操作简便，雌性率较高

缺点 成 本 高 ， 效 率低

操作较烦琐，耗时长，成本高 对种公牛的选择有局限性

不同类型胚胎移植后对妊娠率和产犊情况的影响

注： i. 同一列数值中具有相同字母上标示差异不显著 (P>0.05) ；ii. 同一列数值中具有不同字母上标示差异极显著 (P<0.01) 。

 移植

受体数妊娠

受体数妊娠率

(%)产犊数 产母犊数 产母犊率

(%)

常规胚胎 380 117 46.58a 111 54 48.65a

性别控制胚胎 206 76 36.89a 71 53 74.65b

性别鉴定胚胎 231 104 45.02a 99 98 98.99c

个人观点

胚胎性别鉴定技术和精子分离性别控制技术是以胚胎移植和人工授精技术为基础衍生出的生物技术，它们强化了胚胎移植和人工授精的目的。

每项技术都有其特定的应用层面和定位，也有其特定的使用范畴。就象胚胎移植技术不可能取代人工授精技术一样，精子分离技术也不可能取代常规冻精生产， X 精子生产的性控胚胎也不可能完全取代性别鉴定后的雌性胚胎。

每项技术都有其长处，也有其不尽人意的地方，应该深入研究、取长补短、共同发展。

5. 活体采卵及体外受精技术

成年牛活体采卵（ OPU ）技术： 盲采法 内窥镜法 B型超声波导引法卵子回收数为 6.04 枚每头每次，卵母细胞回收率为 42.9％

幼畜超排活体采卵技术： IVF 体外受精技术水平：囊胚率在 40%左右（ 43% ，阳年生

等）

OPU 体外受精技术水平：囊胚率在 30%左右幼畜超排活体卵的体外受精技术

体内受精胚胎与体外受精胚胎的应用效果分析胚胎类型 常规体内受精胚

胎 IVF 胚胎 OPU 胚胎 ( 成年牛 )

生产效率 5~6 枚 / 头 / 次 工厂化批量生产 1~2 枚 / 头 / 次

移植妊娠率 与人工授精情期受胎率接近 (40~60%)

远低于人工授精情期受胎率10~30%

远低于人工授精情期受胎率 10~30%

优、 缺点比较

系谱完整，可按需要选择父本、母本

缺乏母亲系谱，只可选择公牛

系谱完整，可按需要选择父本、母本

ET 后 代 可做核心育种群及种公牛

可能产生杂种， ET后代不能做种用，只能补充生产群

ET 后代可做核心育种群及种公牛

胚胎成本高，受体牛饲养成本合理

胚胎成本低，受体牛饲养成本高

胚胎成本高，受体牛饲养成本高

适用范围 洲际引种、良种快速扩繁 胚胎工程试验材料 挖掘老龄、幼龄优秀个

体的繁殖潜力

6. 胚胎分割技术

双半胚、全胚移植效果比较 (李树静等， 2009年）

类型 移植头数

妊娠头数

产犊受体头数

产犊数

双胎数( 对 )

成活头数

妊娠率(%)

成活率(%)

鲜双半胚 20 17 15 25 10 17 85.00%a 68.00%a

鲜全胚 52 33 29 29 0 29 55.77%b 100.00%b

注： 同一列数值中具有相同字母上标表示差异不显著 (p>0.05) 。同一列数值中具有不同字母上标表示差异极显著 (p<0.01) 。

7. 提高受体移植妊娠率

移植妊娠率是奶牛胚胎移植产业化应用中关键因素

受体牛营养状况对移植妊娠率影响显著；季节、胚胎质量、冷冻、取样对移植妊娠率无显著影响

提高受体移植妊娠率的研究 干扰素

滋养层组织

第二部分

奶牛胚胎移植技术产业化发展历程

第二部分

奶牛胚胎移植技术产业化发展历程

何为产业化？

经济学定义： 是指要使具有同一属性的企业或组织集合成社会承认

的规模程度，以完成从量的集合到质的激变，真正成为国民经济中以某一标准划分的重要组成部分。

全国科学技术名词审定委员会： 将所设计和实施的胚胎生物工程，形成为创造和满足

人类经济需要的物质和非物质性生产的、从事盈利性经济活动并提供产品和服务的产业。

发展规模及速度

年度 区域 生产 ET 牛犊规模 品种 注册登记的

ET 奶牛头数 运作形式

1978 年 北美 近 1万头 奶牛、肉牛 ----- 完全商业化

1980 年 北美 近 10万头30% 奶

牛、 70%肉牛

8298头 完全商业化

1991 年 全世界 移植 240730头 奶牛、肉牛 18727头（北美） 完全商业化

1996 年 全世界 移植 412573头 奶牛、肉牛 142598头（美国） 完全商业化

2002 年 全世界 移植 50万头奶牛、肉牛（北美 36万头奶牛）

  完全商业化

国外牛胚胎移植技术发展规模及速度

年度 发展阶段  生产规模 运作形式

1978~1990年

实验室研 究阶段 ----- 国家及省市研究项目资助

1991~1995年 中试阶段 每年生产移植犊牛几百头 国家重大科技项目资助

1998~2001年 产业化初期 每年生产移植犊牛几百头 国家重大科技项目资助

2002 年 产业化初期 移植近万头 农业部“万枚高产奶牛胚胎移植富民工程”资助

2003~2009年 产业化中期 每年生产移植犊牛几千头

1. 国家引种专项经费2. 养殖户和省政府共同筹资（河北）

3. 企业自筹（河北、黑龙江、海南、辽宁等）

表 6 我国牛胚胎移植技术发展规模及速度

中国与加拿大 2008年、 2009年奶牛胚胎移植规模比较

内容 中国(2008)*

加拿大(2008)*

中国(2009)*

加拿大(2009)

供体头数（头） ≈4000 11092 ≈4000 11059

可用胚胎采集总数（枚） ≈20000 70571 ≈20000 74828

冷冻胚胎总数（枚） ≈20000 47739 ≈20000 49535

常规鲜胚移植总数（头） ？ 21256 ？ 22626

性别鉴定鲜胚移植总数（头） ≈100 1208 ≈100 1469

常规冻胚移植总数（头） ≈1500 19988 ≈1000 23503

性别鉴定冻胚移植总数（头） ≈4000 1283 ≈4000 1619

胚胎出口总数（枚） ----- 8883 ----- 8901

胚胎进口总数（枚） ≈2000 94 ≈2000 89

生产 OPU 胚胎总数（枚） ？ 650 ？ 564

生产离体卵巢体外受精胚胎总数（枚） ？ 3200 ？ 0

IVF 鲜胚移植总数（头） ？ 299 ？ 206

IVF 冻胚移植总数（头） ？ 0 ？ 3

*没有确切的统计数字。？不确定是否做过该项工作和所做的数量。

应用范畴

扩繁优秀母牛： 1990 年的统计，美国荷斯坦奶牛核心群母牛的 27.5%

和优秀种公牛的 44% 来自胚胎移植产生的后代。

快速生产优质种公牛： 目前，北美地区、法国参加后裔测定的青年公牛 85%

以上的是胚胎移植后代。

以胚胎代替活畜引种： 目前，北美向全球每年出口牛胚胎达 29,000 枚；我国每年引进牛胚胎 1,500~2000 枚。

制约我国奶牛胚胎移植技术产业化发展的瓶颈

行业不规范成本高尚未形成规范的系谱登记和发行、种公牛排名、

后裔测定、 DHI测定体系 加拿大： LPI(Lifetime Profit Index )

美国： TPI (Total Performance Index)

美、加： Official Pedigree online

尚未形成市场化推动的种牛拍卖会等商业活动 加拿大： National Holstein Shows （ Holstein

Association Canada ，每年 2 次）

国内外奶牛胚胎移植技术产业化应用效果分析

在北美， 80% 以上的奶牛场做过胚胎移植，在加拿大 40 － 50%的奶牛场一直坚持做胚胎移植，他们把自家牛群中生产性能最好、遗传性能最强的母牛选为供体，选择在美国和加拿大排名前 50名的种公牛精液来生产胚胎，移植到自家的育成牛中，使育成牛的第一胎生产高产奶牛的后代。这样待育成牛第一胎产奶生产性能测定出结果后，即可决定该牛是进入核心群、生产群，还是被淘汰。

美国的年奶产量在 10 年内上升上了 20% ，而同期的母牛头数却下降了 10% ，胚胎移植技术对其贡献率占 70% 以上。美、加两国排名前 100名的种公牛中 90% 以上是胚胎移植的后代。

2002 年全世界共移植奶牛性别鉴定雌性胚胎 6700例，其中加拿大为 4700例，美国为 2000例。

自 2002 年以来，全世界每年生产 10~15万枚奶牛体外受精胚胎，其中源自活体采卵的体外受精胚胎不足 1000 枚；每年移植奶牛体外受精胚胎不足 1000头，以活体采卵的体外受精胚胎为主。

国内外奶牛胚胎移植技术产业化应用效果分析

  移植头数 妊娠头数 妊娠率(%)

产犊数 产母犊数 产犊准确率 (%)

2005年 2664 1194 44.82

11321110 98.06

2006年 4136 1959 47.36

18711838 98.24

2007年 4586 2338 50.98

23102276 98.53

2008年 3662 1949 53.22

19011872 98.47

2009年 2841 1509 53.12

811*

802* 98.89*

Total 17889 8949 50.03 8025 7898 98.42

北京安伯胚胎生物技术中心 2005~2009 年性别鉴定胚胎移植结果 ( 河北 )

注：“ *” 代表该数据为不完全统计的部分数据 (截至完稿时 2009 年胚胎移植的产犊未结束 )

奶牛胚胎移植技术的效益体现在哪儿？

胎次 品种来源 头数 产奶量 (kg) 乳脂率 (%) 乳蛋白率 (%)

2 国产奶牛 65 6,703±143a 3.2~3.4 2.8~3.0

2性别鉴定胚胎移植后

代 38 9,506±189b ≥4.0 ≥3.2

国内品种荷斯坦奶牛与性别鉴定胚胎移植后代的产奶性能统计

母牛类型 母牛头数 全年受胎率 (%) 产犊头数 母犊头数 母犊率 (%)

育成牛 * 205 94.63(194/205)a 183 132 72.13a

经产牛 149 89.93(134/149)a 129 62 48.06b

总计 354 92.66(328/354)a 312 194 62.18

性别鉴定胚胎移植对母牛群体扩繁的影响

注： 同一列数值中具有相同字母上标表示差异不显著 (p>0.05) 。同一列数值中具有不同字母上标表示差异极显著 (p<0.01) 。

同一列数值中具有相同字母不同大小写之间表示差异显著 (p<0.05) * 表示胚胎移植结合人工授精的繁育技术路线。

奶牛胚胎移植技术的效益体现在哪儿？

发展模式高产奶牛 优秀种公牛

超数排卵 常规冻精 X冻精

性控雌性体内胚胎

性鉴雌性体内胚胎

性鉴雄性体内胚胎

常规胚胎 性别鉴定胚胎组织块

移植到各地区同期发情的合格受体牛

对应的胚胎冷冻解冻技术

高产优质母牛犊 计算机管理系统