PEMISAHAN DENGAN CARA KROMATOGRAFI

I. Tujuan1. Mengetahui harga Rf dari masing-masing noda2. Mengetahui prinsip kerja dari berbagai macam jenis kromatografi

II. Landasan TeoriKromatografi adalah teknik pemisahan dimana suatu zat dalam campuran diuraikan berdasarkan kemampuannya untuk diserap oleh komponen lain yang ada dalam kromatografi yang dikenal sebagai fasa diam. Dalam kromatografi, komponen-komponen terdistribusi dalam dua fasa, yaitu fasa diam dan fasa gerak. Fasa diam dapat berupa zat cair atau padat. Sedangkan fasa bergerak dapat berupa cairan atau gas. Dengan demikian, kromatografi dapat dibedakan menjadi aras dasar kombinasi antara fasa diam dan fasa bergerak. Kombinasi tesebut dapat berupa cair-gas, padat-cair, cair-cair dan gas-padatTransfer masa antara fasa dian dan fasa gerak terjadi karena bila molekul-molekul terserap pada permukaan fasa diam yang dapat berupa zat padat atau zat cair. Kemampuan fasa diam untuk mengadopsi fasa bergerak sangat bergantung pada sifat-sifat fasa diam dan fasa bergerak. Untuk setiap zat, hal ini sangat spesifik sehingga teknik kromatografi dusamping bertujuan untuk pemisahan dapat pula digunakan untuk mengidentifikasi suatu zat. Pada saat ini telah dikenal cukup banyak teknik kromatpgrafi, diantaranya: kromatografi kertas, lapis tipis (TLC), gas (GC), kolom dan ekslusi. Dengan berbagai cara tersebut, kegiatan prevatif dan analitik semakin valid dan reliablw hasil yang diperoleh.(Tim kimia analitik II, 2014)Teknik kromatografi kertas diperkenalkan oleh Consden, Gordon dan Martin (1994), yang menggunakan kertas saring sebagai penunjang fase diam. Kertas merupakan selulosa murni yang memiliki afinitas terhadap air atau pelarut polar lainnya. Bila air diadsorbsikan pada kertas, maka akan membentuk lapisan tipis yang dapat dianggap analog dengan kolom. Lembaran kertas berperan sebagai penyangga dan air bertindak sebagai fase diam yang terserap di antara struktur pori kertas. Cairan fase bergerak yang biasanya berupa campuran dari pelarut organik dan air, akan mengalir membawa noda cuplikan yang didepositkan pada kertas dengan kecepatan yang berbeda. Pemisahan terjadi berdasarkan partisi masing-masing komponen diantara fase diam dan fase bergeraknya.(Yazid, 2005)Dalam teknik kromatografi kertas, proses pengeluaran asam mineral dari kertas disebut desalting. Larutan ditempatkan pada kertas dengan menggunakan mikropipet pada jarak 2-3 cm dari salah satu ujung kertas dalam bentuk coretan garis horizontal. Setelah kertas dikeringkan, diletakkan di ruang yang sudah dijenuhkan dengan air atau dengan pelarut yang sesuai. Penjenuhan dapat dilakukan 24 jam sebelum analisis. Descending adalah salah satu teknik di mana cairan dibiarkan bergerak menuruni kertas akibat gravitasi. Pada teknik ascending, pelarut bergerak ke atas dengan gaya kapiler. Nilai Rf harus sama baik pada descending maupun ascending. Sedangkan yang ketiga dikenal sebagai cara radial atau kromatografi kertas sirkuler. Kondisi - kondisi berikut harus diperhatikan untuk memperoleh nilai Rf yang reprodusibel. Temperatur harus dikendalikan dalam variasi tidak boleh lebih dari 0,5oC. Kertas harus didiamkan dahulu paling tidak 24 jam dengan atmosfer pelarutnya, agar mencapai kesetimbangan sebelum pengaliran pelarutnya pada kertas. Dilakukan beberapa pengerjaan yang parallel, Rfnya tidak boleh berbeda lebih dari 0,02.Suatu atomiser umumnya digunakan sebagai reagent penyemprot bila batas permukaan pelarut dan zat terlarut dalam kertas ingin dibuat dapat dilihat. Atomiser yang halus lebih disukai. Gas - gas juga dapat digunakan sebagai penanda bercak, untuk karbohidrat notasi Rg digunakan untuk menggantikan Rf. Setelah penandaan bercak batas permukaan, selanjutnya dapat dilakukan analisis kalorimetri atau spektroskopi reflektansi bila sampel berupa logam. Materi yang terdapat di dalam kertas dapat ditentukan secara langsung dengan pelarutan. Kromatografi kertas selain untuk pemisahan dan analisis kuantitatif, juga sangat bermanfaat untuk identifikasi. Hal ini dapat dilakukan misalkan dengan membuat grafik antara Rm terhadap jumlah kation dalam suatu deret homolog.(Khopkar, 2008)Kromatografi dapat digolongkan berdasrkan fase yang terlibat antar lain:1. Kromatografi gas-cair, bila fase geraknya berupa gas dan fase diamnyaberupa cairan yang dilapiskan pada padatan pendukung yang inert2. Kromatografi gas-padat, bila fase geraknya berupa gas dan fase diamnya berupa padatan yang dapat menyerap/mengadsorpsi3. Kromatografi cai-cair, bila fase gerak dan diamnya berupa cairan, dimana fase diamnya dilapiskan pada permukaan padatan pendukung yang inert4. Kromatografi cair-padat, bila fase geraknya berupa gas sedangkan fase diamnya berupa padat an yang amorf yang dapat menyerapKromatografi juga dapat didasarkan atas prinsipnya, misalnya kromatografi partisi (partition chromatography) dan kromatografi serapan (adsorption chromatography).Fase BergerakFase DiamPrinsipTeknik Kerja

GasPadatAdsorbsiKromotografi gas-padat

CairPadatAdsorbsi, PartisiKromatografi kolom, KLT, kromatografi kertas

CairCairPartisiKromatografi kolom, KLT, kromatografi kertas

GasCairPartistiKromatografi gas-cair

(Yazid, 2005)III. Prosedur PercobaanA. Alat dan Bahan1. Alata. Seperangkat alat-alat gelasb. Kertas saring whatmanc. Palt TLCd. Chambere. Pipa kapilerf. Guntingg. Seperangkat alat kromatografi gash. Seperangkat alat kromatografi kolomi. Mistarj. Pensilk. Lumpang porselenl. Pipet tetesm. Corong pisah2. Bahana. Butanol pab. Kristal iodc. Sampel ekstrak daund. Kloroforme. n-pentanaf. n-heptanag. n-heksanah. Asam nitrati. Aniline ptalatj. Etanolk. Asetonl. Kapasm. Aseton dan natrium sulfat

B. Skema Kerja1. Butanol : asam asetat : air (4 :1 : 5)Pemisahan dan Penentuan Karbohidrat dengan Kromatografi Kertas

Disiapkan sebagai fasa gerak dengan dicampurkan larutan tersebut

Larutan sampelDisiapkan kertas whatman no. 1 yang telah dijenuhkan dengan uap air

Larutan penyemprot berupa aniline platatDisiapkan yang terdiri dari beberapa macam karbohidrat

Larutan standarDisiapkan untuk menandai berkas gula reduksi dan uap iodine untuk gula non reduksi

Disiapkan yang tediri dari zat murni untuk glukosa, fruktosa, maltose dan amilumDisiapkan perangkat kromatografi kertas

Larutan standarDiberi garis pada kertas + 0,5 cm dari pinggirnya

Ditotolkan 3-4 larutan pada garis tersebutDimasukkan kertas tersebut dalam posisi tegak pada chamber yang telah berisi larutan standarDibiarkan beberapa lama hingga pelarut naik mendekati batas tepi atas kertas lalu diangkat dan dikeringkanDisemprot zat pemula noda yang sesuai dengan larutan standar yang digunakanDicatat nilai RF-nyaDiulangi kegiatan ini untuk semua larutan standard dan juga sampel

HasilDibandingkan RF yang diperoleh dan dapat ditentukan jenis karbohidrat yang terdapat dalam sampel

2. 50 gr daunPemisahan Komponen Penyusun Daun Bayam secara TLC

Diekstraksi zat dengan menggunakan 10 mL aseton dan 25 mL FEDipindahkan hasil ekstraksi ke dalam corong

Lapisan aseton, FE dan zat terekstrakDitambahkan 10 mL air dan dikocok serta dipisahkan

Diambil dan ditambahkan natrim sulfatDipanaskan beberapa saat secara perlahan sehingga ekstrak tersebut dapat lebih pekatDigunakan ekstrak ini sebagai sampel dan ditotolkan pada plat TLC

Etanol dan kloroform (1 : 1)Dilakukan hal serupa sebagaimana kromatografi kertas

Dicampur dan diguanakan sebagai fasa gerak (eluen)Diganti kertas dengan plat TLCDiberi garis pada kedua sisi kertas + 1 cm dan pada salah satu garisnya ditotolkan sampelDimasukkan plat ke dalam chamber yang berisi fasa gerak dan dibiarkan beberapa saat hingga eluen mancapai batas garis atasDiangkat plat TLC dan ditempatkan dalam gelas kimia yang berisi padatan iodiumDitutup gelas kimia tersebut dengan kertas saring dan dibiarkan beberapa saat hingga noda pada plat tampakDitandai noda-noda yang terlihat dan dihitung nilai Rf-nyaDilakukan hal serupa tetapi menggunakan fasa bergerak yang terdiri dari etanol dan kloroform (2 :1) atau (1 : 2)

Hasil Dibandingkan nilai Rf-nya

3. Pemisahan Zat dengan Kromatografi Koloma. Kapas atau glass woll Siapkan kolom dengan cara berikut

Ditempatkan dalam kolom kering dan ditekan hingga mencapai dasar kolomDitutup klem dan ditambahkan 10 mL PE dan dihilangkan gelembung pada kapas dengan batang pengaduk

20 gr aluminaDitambahkan pasir + 3 mm dari tinggi kapas

Dicampurkan dalam gelas kimia 100 mL dengan menggunakan 40 gr PEDiaduk dengan sampel untuk menghilangkan gelembung udaraDimasukkan campuran tersebut ke dalam kolom secara perlahan-lahanDipadatkan dengan cara diketuk-ketuk dinding kolom dengan pensilDibiarkan lapisan alumina turun, kemudian ditambahkan lagi pasir setinggi 5 mm diatas lapisan alumina tersebut

HasilDitambahkan secara perlahan eluen di atas lapisan pasir

b. PelarutPengerjaan Kolom Kromatografi

Ditampung di dalam gelas Erlenmeyer 250 mL ketika klem dibuka hingga pelarut tepat di atas lapisan eterDitambahkan 25 tetes (0,6 mL) zat yang telah diekstrak dari percobaan TLCDibuka kran hingga zat ini turun sebagian, tetapi jangan sampai kolom benar-benar keringDitambahkan 5 mL PE dan dibiarkan mengalir melalui kolom dengan cara dibuka klem dan ditutup klemDitambahkan eluen pertama (PE : CH2Cl2 = 4 : 1)Dibuka klem dan dibiarkan pelarut turunDipisahkan tiap fraksi yang berbeda warna ke dalam tabung yang berbedaDilakukan penambahan eluen (CH2Cl2 : methanol = 95 : 5)Diulangi lagi prosedur elusi ini hingga semua fraksi yang berbeda warna di perolehDiberi label tiap tabung yang berisi larutan dengan warna yang berbeda

HasilDiidentifikasi komponen yang terdapat dalam tiap tabung dengan cara TLC tersebut

4. Campuran standarPemisahan Senyawa dengan Kromatografi Gas

Campuran larutan sampelDisiapkan yang terdiri dari 5 mL n-pentana, 10 mL n-heksana dan 15 mL n-heptana

Disiapkan yang perbandingan jumlahnya tidak diketahuiDiset alag GC sesuai dengan kondisi percobaan yang diperlukanDigunakan syringe yang sesuai dan diambil kromatografi untuk tiap-tiap senyawa

HasilDibandingkan dengan kromatogram campuran larutan standard an kromatogram dari tiap individu larutan standar

IV. Hasil dan PembahasanA. Hasil1. Data pengamatana. Pemisahan dan penentuan karbohidrat dengan kromatografi kertasPercobaan ini gagal, karena noda tidak naik ke atas.

b. Pemisahan komponen penyusun daun bayam secara TLCPerlakuan Pengamatan

a. 50 gr bayam + 75 mL dietil eter + 30 mL aseton didiamkan selama 20 menitb. 28,5 mL ekstrak + 10 mL aquades

c. Dipisahkand. Dipanaskane. Ekstrak ditotolkan pada plat TLCf. Plat TLC dimasukkan ke dalam eluen I (etanol : kloroform = 2 : 1)

Disinari sinar UV

g. Plat TLC dimasukkan dalan eluen II (etanol : kloroform = 1 : 1)

Disinari sinar UV

h. Plat TLC dimasukkan dalam eluen III (etanol : kloroform = 1 : 2)

Disinari sinar UVMenghasilkan larutan yang berwarna hijau tuaV ekstrak = 28,5 mLTerbentuk 2 lapisanLapisan atas = larutan ekstraksLapisan bawah = airVolume ekstrak = 22 mLLarutan menjadi lebih pekat

Menghasilkan 3 noda yang baikNoda 1 = berwarna hijau tosca dengan jarak 3,1 cm dan Rf = 0,775Noda 2 = berwarna hijau tua dengan jarak 3,4 cm dan Rf = 0,85Noda 3 = berwarna hijau muda dengan jarak 0 cm dan Rf = 0Terjadi perbuhan warna pada noda 2 dari hijau tua menjadi coklatMenghasilkan 3 noda yang kurang baikNoda 1 = berwarna hijau tosca dengan jarak 2 cm dan Rf = 0,5Noda 2 = berwarna hijau muda dengan jarak 0 cm dan Rf = 0Noda 3 = berwarna kuning dengan jarak 3,4 cm dan Rf = 0,85Terjadi perubahan warna pada noda 3 dari kuning menjadi jelas dan noda 1 dari hijau tosca menjadi coklatMenghasilkan 3 noda yang tidak baikNoda 1 = berwarna hijau tosca dengan jarak 2,1 cm dan Rf = 0,525Noda 2 = berwarna hijau muda dengan jarak 0 cm dan Rf = 0Noda 3 = berwarna kuning dengan jarak 3,4 cm dan Rf = 0,85Tidak ada perubahan apapun

c. Pemisahan zat dengan kromatografi kolomPercobaan ini gagal, karena pada saat membuka bagian keran pada kolom, keran tersebut tidak mau terbuka

d. Pemisahahn senyawa dengan kromatografi gasPercobaan ini tidak dilakukan, karena alat yang digunakan pada kromatografi gas ini tidak ada

2. PerhitunganPemisahan Komponen Penyusun Daun Bayam secara TLCRf = Jarak noda Jarak eluena. Etanol : kloroform (2 : 1)Rf1 = 3,1 cm 4 cm = 0,775Rf2 = 3,4 cm 4 cm = 0,85Rf3 = 0 cm 4 cm = 0

b. Etanol : klorofom (1 : 1)Rf1 = 2 cm 4 cm = 0,5Rf2 = 0 cm 4 cm = 0Rf3 = 3,4 cm 4 cm = 0,85

c. Etanol : kloroform (1 : 2)Rf1 = 2,1 cm 4 cm = 0,525Rf2 = 0 cm 4 cm = 0Rf3 = 3,4 cm 4 cm = 0,85

B. PembahasanKromatografi adalah teknik pemisahan fisik suatu campuran zat-zat kimia yang berdasarkan pada perbedaan migrasi dari masing-masing komponen campuran yang terpisah pada fase diam dibawah pengaruh pergerakan fase yang bergerak. Beberapa sifat fisika umum dari molekul yang dipakai sebagai asa teknik pemisahan kromatografi adalah : Kecenderungan molekul untuk teradsorpsi oleh partikel-partikel padatan yang halus Kecenderungan mlekul untuk melarut pada fase cair Kecenderungan molekul untuk teratsirKromatografi merupakan suatu teknik pemisahan dengan proses berlipat ganda, artinya selama proses berlangsung terjadi berulang kali kontak adsorbsi; atau partisi dari komponen-komponen yang dipisahkan.Harga Rf merupakan ukuran kecepatan migrasi suatu senyawa pada kromatogram dan pada kondisi konstan merupakan besaran karakteristik dan reprodusibel. Harga Rf didefinisikan sebagai perbandingan antara jarak senyawa dari titik awal dan jarak tepi muka pelarut dari titik awal. Ada beberapa faktor yang menentukan harga Rf yaitu pelarut, suhu, ukuran dari bejana, dan kertas. Perubahan suhu dapat merubah koefisien partisi dan juga kecepatan aliran sedangkan ukuran tau volume dari bejana dapat mempengaruhi homogenitas dari atmosfer jadi mempengaruhi kecepatan penguapan dari komponen-komponen pelarut dari kertas.Ciri noda yang baik adalah ketika noda yang ditotolkan terserap dengan bentuk yang konstan atau tidak meninggalkan noktah pada jalan yang dilaluinyaPada percobaan pemisahan secara kromatografi ini dilakukan beberapa perlakuan, yaitu pemisahan dan penentuan karbohidrat dengan kromatografi kertas, pemisahan komponen penyusun daun bayam secara TLC dan pemisahan zat dengan kromatografi kolom. Sedangkan untuk pemisahan senyawa dengan kromatografi gas tidak dilakukan, karena alat yang digunakan tidak ada.

1. Pemisahan dan penentuan karbohidrat dengan kromatografi kertasPrinsip dasar kromatografi kertas adalah partisi multiplikatif suatu senyawa antara dua cairan yang saling tidak bercampur. Jadi partisi suatu senyawa terjadi antara kompleks selulosa-air dan fasa gerak yang melewati berupa pelarut organik yang sudah dijenuhkan dengan air dan melalui serat dari kertas oleh gaya kapiler dan menggerakkan komponen dari campuran cuplikan pada perbedaan jarak pada arah aliran pelarut. Bila permukaan pelarut telah bergeser sampai jarak yang cukup jauh atau setelah waktu yang telah ditentukan, kertas diambil dari bejana dan kedudukan dari permukaan pelarut diberi tanda dan lembaran kertas dibiarkan kering. Jika senyawa-senyawa berwarna maka mereka akan terlihat sebagai pita atau noda yang terpisah. Jika senyawa tidak berwarna harus dideteksi dengan cara fisika dan kimia. Yaitu dengan menggunakan suatu pereaksi-pereaksi yang memberikan sebuah warna terhadap beberapa atau semua dari senyawa-senyawa. Bila daerah dari noda yang terpisah telah dideteksi, maka perlu mengidentifikasi tiap individu dari senyawa. Metoda identifikasi yang paling mudah adalah berdasarkan pada kedudukan dari noda relatif terhadap permukaan pelarut, menggunakan harga Rf.Pengaruh utama kertas pada harga Rf timbul dari perubahan ion dan serapan, yang berbeda untuk macam-macam kertas. Kertas mempengaruhi kecepatan aliran juga mempengaruhi kesetimbangan partisi.Kromatografi kertas dapat digunakan terutama untuk kandungan tumbuhan yang mudah larut dalam air, satu keuntungan utama kromatografi kertas adalah kemudahan dan kesederhanaannya pada pelaksanaan pemisahan, yaitu hanya pada lmbaran kertas saring yang berlaku sebagai medium pemisahan dan penyangga. Untuk kromatografi kertas preparatif diperlukan kertas yang lebih besar dari pada utuk analisis. Suatu analisis kimia menjadi meragukan jika pengukuran sifat tidak berhubungan dengan sifat spesifik senyawa terukur. Analisis meliputi pengambilan cuplikan, pemisahan senyawa pengganggu, isolasi senyawa yang dimaksudkan, pemekatan terlebih dahulu sebelum identifikasi dan pengukuran.Pada percobaan ini, kita akan menentukan nilai Rf dari larutan cuplikan dengan menggunakan kromatografi kertas. Cuplikan yang digunakan larutan karbohidrat yang menggandung glukosa fruktosa, maltose dan amilum. Larutan karbohidrat yang digunakan adala sari nanas, sari Dalam kromatografi kertas, fase diam adalah kertas saring atau kertas serap yang sangat seragam. Fase gerak adalah pelarut atau campuran yang sesuai. Alasan untuk menutup wadah adalah untuk meyakinkan bahwa astmosfer dalam gelas kimia terjenuhkan denga uap pelarut.Percobaan ini, tidak dapat ditentukan nilai Rf nya, karena noda tidak naik ke atas. Hal ini mungkin disebabkan pada larutan standar yang ditotolkan pada kertas tidak disemprot dengan aniline ptalat atau diuapkan dengan iodin. Aniline ptalat digunakan untuk menandai berkas gula reduksi, sedangkan uap iodine digunakan untuk gula non reduksi.Gula reduksi adalah gula yang mempunyai kemampuan untuk mereduksi. Hal ini dikarenakan adanya gugus aldehid atau keton bebas. Senyawa-senyawa yang mengoksidasi atau bersifat reduktor adalah logam-logam oksidator seperti Cu (II). Contoh gula yang termasuk gula reduksi adalah glukosa, manosa, fruktosa, laktosa, maltosa, dan lain-lain. Sedangkan yang termasuk dalam gula non reduksi adalah sukrosa.

2. Pemisahan komponen penyusun dau bayam secara TLCBayam(Amaranthusspp.) merupakantumbuhanyang biasa ditanam untuk dikonsumsidaunnyasebagai sayuran hijau. Tumbuhan ini berasal dariAmerikatropik namun sekarang tersebar ke seluruh dunia. Tumbuhan ini dikenal sebagai sayuran sumber zatbesiyang penting.Langkah pertama yang dilakukan adalah eksttraksi sampel. Daun bayam yang akan digunakan terlebih dahulu dikeringkan, kemudian ditimbang sebanyak 50 gram lalu ditambahkan 30 mL aseton dan 75 mL dietil eter. Penambahan larutan ini berfungsi untuk melarutkan klorofil. Sehingga didapatkan ekstraknya sebanyak 28,5 mL.Pada ekstrak tersebut ditambahkan 10 mL aquades lalu dikocok larutan tersebut. Saat terbentuk 2 lapisan, lapisan tersebut dipisahkan. Pada dasar corong pisah masih terdapat sedikit air, sehingga perlu ditambahkan natrium sulfat. Penambahan natrium sulfat ini berfungsi untuk menghilangkan air yang masih terdapat pada larutan ekstrak. Larutan ekstrak didapatkan sebanyak 22 mL. Larutan ekstrak tersebut dipanaskan. Dilakukan pemanasan agar larutan tersebut lebih pekat.Fase gerak membawa zat terlarut melalui media fase diam sehingga terpisah dari zat terlarut lainnya yang terelusi lebih awal atau paling atau paling akhir karena perbedaan afinitas masing-masing zat terlarut dengan fase diam. Fase diam disini adalah berupa zat padat yang disebut adsorben yang digunakan adalah pelat TLC silika gel. Silika gel merupakan penyerap yang paling banyak digunakan dalam kromatografi lapis tipis. Senyawa netral yang merupakan gugusan sampai tiga pasti dapat dipisahkan pada lapisan yang diaktifkan dengan memakai pelarut organik atau campuran pelarut yang normal. Karena sebagian besar silika gel bersifat sedikit asam, maka asam agak mudah dipisahkan, jadi meminimumkan reaksi asam-basa antara penyerap dengan senyawa yang dipisahkan. Sedangkan fase gerak yang sering digunakan adalah berupa campuran dari pelarut organik dengan tujuan untuk memperoleh pemisahan yang lebih baik. Kombinasi pelarut berdasarkan atas polaritasnya, sehingga akan diperoleh sistem pengembang yang cocok. Pelarut yang digunakan dalam percobaan ini adalah etanol dan kloroform.Dalam 4 buah gelas kimia diisikan campuran pelarut yaitu, etanol : kloroform = 2 : 1, etanol : kloroform = 1 : 1, etanol : kloroform = 1 : 2. Masing-masing campuran pelarut tersebut digunakan untuk menguji sampel dengan menggunakan pelat TLC. Pelat TLC sebelumnya telah dibentuk dengan ukuran 5x1 cm. Kemudian diberi batas atas dan batas bawahnya menggunakan pensil. Alat yang digunakan haruslah pensil, kerena jika menggunakan pena ataupun spidol, tintanya akan ikut terjerap. Pelat TLC menggunakan alumina sebagai stasioner. Kemudian larutan sampel diambil dengan menggunakan pipa kapiler dan ditotolkan pada tengah salah satu batas. Pelat yang telah ditotolkan larutan sampel dimasukkan secara vertikal atau diagonal pada gelas kimia berisi campuran larutan pelarut. Lalu ditunggu sampai noda terbawa oleh pelarut dan pelarut mencapai batas atas. Kemudian diukur jarak yang ditempuh noda dan jarak garis depan pelarut dan dihitung Rf-nya.Pada eluen etanol : kloroform (2 : 1), menghsilkan 3 noda yang baik. Noda pertama berwarna hijau tosca dengan jarak 3,1 cm dan Rf-nya 0,775, noda kedua berwarna hijau tua dengan jarak 3,4 cm dan Rf-nya 0,85 dan noda ketiga berwarna hijau muda dengan jarak 0 cm dan Rf-nya 0. Lalu pada plat TLC disinari dengan sinar UV pada panjang gelombang 254 nm. Pada saat disinari sinar UV terjadi perubahan warna pada noda kedua, yaitu dari warna hijau tua menjadi coklat.Pada eluen etanol : kloroform (1 : 1), menghsilkan 3 noda yang kurang baik. Noda pertama berwarna hijau tosca dengan jarak 2 cm dan Rf-nya 0,5, noda kedua berwarna hijau muda dengan jarak 0 cm dan Rf-nya 0 dan noda ketiga berwarna kuning dengan jarak 3,4 cm dan Rf-nya 0,85. Lalu pada plat TLC disinari dengan sinar UV pada panjang gelombang 254 nm. Pada saat disinari sinar UV noda kuning menjadi jelas dan noda yang berwarna hijau tosca menjadi coklat.Pada eluen etanol : kloroform (1 : 2), menghsilkan 3 noda yang tidak baik. Noda pertama berwarna hijau tosca dengan jarak 2,1 cm dan Rf-nya 0,525, noda kedua berwarna hijau muda dengan jarak 0 cm dan Rf-nya 0 dan noda ketiga berwarna kuning dengan jarak 3,4 cm dan Rf-nya 0,85. Lalu pad plat TLC disinari dengan sinar UV pada panjang gelombang 254 nm. Pada saat disinari sinar UV tidak terjadi perubahan apapun.

3. Pemisahan zat dengan kromatografi kolomPemisahan berdasarkan kromatografi adsorpsi, sangat tergantung pada distribusi pada kedua fase cair dan padat. Untuk pemisahan pigmen dari tumbuhan, dapat dilakukan dengan kromatografi kolom. Alat yang digunakan yaitu kolom yang di dalamnya berisi fase stasioner (padat atau cair). Campuran ditambahkan ke kolom dari satu ujung dan campuran akan bergerak dengan bantuan pengembang yang cocok (fase gerak). Pemisahan dicapai oleh perbedaan laju turun masing-masing komponen dalam kolom, yang ditentukan oleh kekuatan adsorpsi atau koefisien partisi antara fase gerak dan fase diam (stationer).Kromatografi kolom bertujuan untuk mengisolasi komponen dari campurannya. Pada kromatogarfi kolom digunakan kolom dengan adsorben sillika gel karena kolom yang dibentuk dengan silika gel memiliki tekstur dan struktur yang lebih kompak dan teratur. Silika gel memadat dalam bentuk tetrahedral raksasa, sehingga ikatannya kuat dan rapat. Dengan demikian, adsorben silika gel mampu menghasilkan proses pemisahan yang lebih optimal.Silica gel dapat membentuk ikatan hidrogen di permukaannya, karena pada permukaannya terikat gugus hidroksil. Oleh karenanya, silica gel sifatnya sangat polar. Jika fasa gerak yang digunakan sifatnya non-polar, maka pada saat campuran dimasukkan, senyawa-senyawa yang semakin polar akan semakin lama tertahan di fasa stasioner, dan senyawa-senyawa yang semakin tidak (kurang) polar akan terbawa keluar kolom lebih cepat.Dalam proses pemisahan dengan kromatografi kolom, adsorben silika gel harus senantiasa basah karena, jika dibiarkan kering, kolom yang terbentuk dari silika gel bisa retak, sehingga proses pemisahan zat tidak berjalan optimal. Selain itu, kondisi yang senantiasa basah berperan untuk memudahkan proses elusi (larutan melewati kolom) dalam kolom.Kolom yang digunakan dalam kromatografi kolom dapat berupa gelas, plastik atau nilon. Ukuran kolom yang lazim digunakan mempunyai diameter dalam 2 cm dan panjang 45 cm. Ujung bagian bawah dilengkapi dengan kran untuk mengatur laju alir eluen. Untuk menahan fasa diam (adsorben) biasanya digunakan kapas gelas (glass wool) atau gelas berpori (fritted glass). Sorben yang digunakan dalam kromatografi kolom diantaranya arang, magnesium silikat, alumina, silika gel, kalsium sulfat dan serbuk selulosa. Berikut ini beberapa golongan solutnya misalnya alkana, alkena, aromatis, eter, ester, keton, aldehid dan alkohol.Berikut ini gambar-gambar bagan dalam kromatografi kolom :

Pada percobaan ini, tidak bisa dilakukan sampai akhir, karena keran yang terdapat pada kolom tidak bisa dibuka, sehingga percobaan mengenai pemisahan dengan kromatografi kolom ini tidak dapat dilanjutkan.Sehingga praktikkan mencari diliteratur pemisahan zat (daun bayam) dengan kromatografi kolom. Pada literature yang praktikkan dapatkan langkah pertama adalah menyiapkan kolom yang akan digunakan untuk pemisahan pigmen tersebut dengan menimbang silica sebanyak 2 gram, kemudian silica dilarutkan dengan pelarut aseton sehingga terbentuk bubur silica. Setelah itu dimasukkan bubur silica tersebut ke dalam kolom yang mana kolom tersebut sudah disumbat dengan kapas pada bagian ujungnya. Pelarut aseton : heksana (3 : 7) dialirkan ke dalam kolom silica dan diketuk-ketuk dinding kolom agar bubur silica tersebut tertata rapi atau padat hingga tidak ada udara yang menempati kolom tersebut, kolom harus bebas dari gelembung udara karena bila ada gelembung udara maka proses pemisahan yang terjadi tidak akan sempurna sehingga akan terjadi penyebaran noda. Pelarut aseton : hekasan (3 : 7) ini berfungsi sebagai fase geraknya. Proses pemisahan dengan kromatografi kolom, bubur silica harus basah karena apabila dibiarkan kering, kolom yang terbentuk dari bubur silica bisa retak, sehingga proses pemisahan zat tidak berjalan optimal. Selain itu, kondisi yang basah berperan untuk memudahkan proses elusi (larutan melewati kolom) dalam kolom. Setelah kolom kromatografi siap dipakai, ekstrak sampel daun bayam dimasukkan ke dalam kolom, lalu memasukkan pelarut ke dalam kolom dan membuka kerannya, dan terlihat pigmen dari sampel daun mulai bergerak turun dan mulai menetes. Fraksi-fraksi yang keluar dari kolom ini ditampung dalam tabung reaksi dan mengganti tabung reaksinya ketika warna mulai berubah. Larutan warna ini adalah pigmen dari dau bayam.Fraksi yang diperoleh tersebut diuji dengan KLT, mengamati jenis pigmen apa saja yang terdapat pada tiap fraksi yang didapat.Hasil yang didapatkan yaitu berupa noda-noda pada lempeng silica tersebut, dimana farksi I berwarna kuning ++, fraksi II berwarna hijau dan fraksi III berwarna kuning + . Warna-warna noda ini menunjukkan senyawa tertentu karena senyawa-senyawa tertentu memiliki warna tertentu pula. Noda yang berwarna kuning pekat (kuning ++) kemungkinan adalah senyawa -karoten, warna hijau kemungkinan adalah senyawa klorofil a dan berwarna kuning muda (kuning +) adalah kemungkinan klorofil b. Namun noda-noda ini belum pasti senyawa karotenoid, klorofil a dan klorofil b, karena banyak senyawa yang memiliki warna yang sama. Untuk mengetahui dengan pasti jenis noda-noda ini merupakan senyawa karotenoid, klorofil a dan klorofil b maka harus dihitung harga Rf nya karena harga Rf merupakan identitas dari suatu senyawa.Berdasarkan hasil perhitungan, harga Rf dari masing-masing fraksi adalah fraksi I sebesar 0,31, fraksi II sebesar 0,28 dan fraksi III sebesar 0,19. Dari harga Rf ini menunjukkan noda-noda tersebut bukan senyawa -karoten, klorofil a dan klorofil b karena berdasarkan literatur harga Rf klorofil a, klorofil b dan karotenoid masing-masing sebesar 0,4; 0,38 dan 0,625.Namun bisa saja noda-noda tersebut merupakan senyawa yang dimaksud mengingat warna-warna dari noda dan karenaseringkali nilai Rf berbeda dari satu kertas ke kertas lainnya. Kemungkinan harga Rf dari literatur menggunakan kertas yang berbeda dengan kertas yang digunakan saat praktikum sehingga nilai Rf yang diperoleh juga berbeda.Jenis pigmen pada sampel bayam dilihat dari warna nodanya antara lain fraksi I adalah -karoten, fraksi II adalah klorofil a dan fraksi III adalah klorofil b.

4. Pemisahan senyawa dengan kromatografi gasPemisahan senyawa dengan kromatografi gas ini tidak dilakukan percobaan, karena alat yang akan digunakan pada percobaan ini tidak ada. Sehingga praktikkan mengambil pembahasan ini dari literature.Kromatografi gas merupakan metode yang tepat dan cepat untuk memisahkan campuran yang sangat rumit. Waktu yang dibutuhkan beragam, mulai dari beberapa detik untuk campuran sederhana sampai berjam-jam untuk campuran yang mengandung 500-1000 komponen. Komponen campuran dapat diidentifikasikan dengan menggunakan waktu tambat (waktu retensi) yang khas pada kondisi yang tepat. Waktu tambat ialah waktu yang menunjukkan berapa lama suatu senyawa tertahan dalam kolom.waktu tambat diukur dari jejak pencatat pada kromatogram dan serupa dengan volume tambat dalam KCKT dan Rf dalam KLT. Dengan kalibrasi yang patut, banyaknya (kuantitas) komponen campuran dapat pula diukur secara teliti. kekurangan utama KG adalah bahwa ia tidak mudah dipakai untuk memisahkan campuran dalam jumlah besar. Pemisahan pada tingkat mg mudah dilakukan, pemisahan campuran pada tingkat mg mungkin dilakukan; tetapi pemisahan dalam tingkat pon atau ton sukar dilakukan kecuali jika tidak ada metode lain.Pada saat penyuntikan, alat kromatografi gas melaporkan hasil dari kromatografi dalam bentuk signal, adapun hasil signal tersebut untuk beberapa senyawa/larutan adalah sebagai berikut:Methanol:

Propanol:

Butanol:

Pentanol:

Larutan standar dengan komposisi 1:1:1:1. Dengan RT adalah waktu retensi (Retention Time), Area adalah luas segitiga di bawah puncak, Type adalah jenis puncak yang tercatat (PB: Penetrate to Base, BB: Base to Base), Width adalah jebar dasar puncak, dan Area% adalah persentase perbandingan luas segitiga di bawah puncak (untuk suatu komponen) dengan luas total segitiga yang ada.Cara kerja alat kromatografi gasPada dasarnya, dalam alat kromatografi gas, ada dua jenis detektor, yang pertama adalah Flame Ionization Detektor, dan yang kedua adalah Thermal Conductivity Detektor. Namun, untuk praktikum kali ini, jenis detektor yang dipakai adalah Thermal Conductivity Detektor. Fasa diam yang dipakai adalah metal silicon gum. Gas yang digunakan sebagai gas pembanding dan gas pembawa adalah gas nitrogen karena di samping nitrogen cenderung murah jika dibandingkan dengan jenis gas yang lain, nitrogen juga inert, aman (dibandingkan dengan gas lain yang mudah terbakar), dan mudah didapat.Pada percobaan kali ini, suhu kolom yang digunakan adalah 50-90C dengan Initial time 1 menit, laju perubahan suhu adalah 10C per menit, dan final time adalah 1 menit. Maksudnya, pada saat alat kromatografi gas digunakan, suhu kolom akan bertahan di 50C selama 1 menit, setelah itu suhu akan naik secara bertahap dengan kelajuan 10C per menit sampai suhu kolom itu mencapai 90C. Setelah mencapai suhu 90C, alat kromatografi gas pun akan kembali menahan suhu kolom selama 1 menit dan setelah itu, proses kromatografi akan berhenti. Dalam kromatografi gas, suhu di bagian injeksi harus lebih tinggi dari suhu akhir kolom. Pada detektor pun, suhu yang digunakan cukup relative tinggi, yaitu 160C. Kolom yang digunakan pun adalah kolom kapiler yang sangat panjang namun mempunyai diameter yang sangat kecil. Total panjang kolom kapiler dalam alat kromatografi gas ini adalah 30 meter dengan diameter 0,053 mm. Metil Silicon Gum yang ada di dalam kolom kapiler ini mempunyai sifat polar yang cenderung tarik menarik dengan senyawa yang mempunyai sifat polar juga.Prinsip utama pemisahan dalam kromatografi gas adalah berdasarkan perbedaan laju migrasi masing-masing komponen dalam melalui kolom. Komponen-komponen yang terelusi dikenali (analisa kualitatif) dari nilai waktu retensinya (RT).Factor-faktor yang mempengaruhi waktu retensiNilai/harga waktu retensi (RT) tiap komponen disebabkan oleh perbedaan titik didih (Td) masing-masing komponen, perbedaan massa molekul relative (Mr)/perbedaan ukuran komponen, interaksi/keterikatan masing-masing komponen dengan fasa stasioner/fasa diam (misalnya oleh karena sifat kepolaran fasa diam serta fasa geraknya), panjang kolom, diameter kolom, temperatur kolom dan laju/temperatur aliran gas pembawa serta tingkat kejenuhan kolom.Semakin rendah titik didih suatu komponen maka waktu retensinya akan semakin kecil/singkat karena pada temperatur tertentu zat tersebut sudah menjadi fasa uap sehingga bisa bergerak bebas/lebih cepat sebagai fasa gerak dalam kolom kapiler sedangkan komponen lainnya masih dalam fasa cairan. Jadi komponen yang terlebih dahulu menjadi uap akan lebih cepat keluar dari kolom. Oleh karena itu, methanol mempunyai waktu retensi lebih singkat dari propanol, propanol mempunyai waktu retensi yang lebih singkat dari butanol, dan butanol mempunyai waktu retensi yang lebih singkat dari pentanol.Semakin kecil ukuran sebuah komponen dan semakin kecil nilai massa molekul relatifnya (Mr) maka sebuah komponen akan lebih dapat bergerak bebas/lebih cepat keluar dari kolom. Jadi semakin kecil ukuran komponen dan semakin kecil Mr komponen maka waktu retensinya akan semakin kecil pula. Oleh karena itu, methanol mempunyai waktu retensi lebih singkat dari propanol, propanol mempunyai waktu retensi yang lebih singkat dari butanol, dan butanol mempunyai waktu retensi yang lebih singkat dari pentanol.Jika fasa diamnya bersifat nonpolar, maka komponen yang akan terelusi lebih cepat adalah komponen yang paling polar, karena ikatan dengan fasa diamnya relatif lebih lemah.Begitu juga sebaliknya jika fasa diamnya polar maka komponen yang lebih cepat yaitu komponen yang paling nonpolar. Jadi kepolaran fasa diam dan fasa gerak sangat mempengaruhi waktu retensi masing-masing komponen.Semakin panjang kolom, maka RTmenjadi lambat karena jarak yang harus ditempuh oleh senyawa tersebut cenderung lebih jauh. Sebaliknya, jika kolom pendek, maka RTmenjadi lebih cepat karena jarak yang harus ditempuh oleh senyawa tersebut untuk menuju detektor cenderung lebih dekat.Temperatur kolom harus disesuaikan dengan titik didih larutan senyawa organik. Apabila temperatur kolom terlalu rendah daripada titik didih larutan, maka tidak akan timbul puncak karena kalor atau temperature kolom tidak cukup untuk menguapkan senyawa yang ada. Sedangkan jika temperatur kolom jauh lebih tinggi daripada titik didih larutan, maka TRmenjadi sangat cepat karena senyawa yang ada langsung menerima kalor dengan cepat untuk segera mengubah wujudnya menjadi gas.Pengaruh pengotor Pada percobaan kali ini, jika kita memperhatikan hasil cetakan dari alat kromatografi gas, kita dapat melihat adanya puncak puncak kecil. Puncak-puncak kecil itu adalah pengotor, baik itu pengotor yang ada di dalam kolom yang akhirnya terbaca oleh detektor, maupun pengotor yang ada di dalam senyawa (terbawa oleh senyawa ketika penyuntikkan). Seharusnya, tidak ada pengotor di dalam kita melakukan suatu analisis terhadap suatu sampel atau suatu senyawa. Hasil yang paling ideal adalah ketika yang dihasilkan adalah suatu garis lurus yang ada pada base yang diikuti oleh puncak-puncak yang cukup significant yang menunjukkan komponen utama dari senyawa tersebut.Factor kesalahanDalam praktikum ini, ada beberapa factor kesalahan yang membuat hasil kromatografi gas tidak seideal yang diharapkan, yaitu kemurnian analit dan ketidaktepatan waktu penginjeksian dengan penekanan tombol start pada alat kromatografi gas. Untuk itu, kita dapat menggunakan analit dengan tingkat kemurnian yang lebih tinggi dan kita dapat melatih atau membiasakan diri melakukan kromatografi gas sehingga waktu penginjeksian dan penekanan tombol dapat dioptimalkan setepat mungkin.Pembahasan hasil percobaanPada saat senyawa methanol dianalisis, hasil analisis menyatakan bahwa waktu retensi untuk methanol adalah 1,369 menit dan keseluruhan analit adalah methanol murni.Pada saat menganalisis senyawa propanol, timbul/ terdapat dua buah puncak, yaitu dengan waktu retensi 1,302 menit dan 1,795 menit dengan perbandingan persentase area 15,51498% dan 84,48502. Jika kita bandingkan dengan waktu retensi methanol (1,369), maka kita bisa mendapatkan hasil bahwa senyawa propanol yang kita analisis mengandung kurang lebih 15% methanol dan bukan 100% propanol murni. Kemungkinan penyebabnya adalah propanol yang ada sudah berinteraksi dengan udara bebas karena dibiarkan terbuka, sehingga ada rantai propanol yang terputus dan menjadi methanol.Sama halnya seperti propanol, hasil analisis buthanol juga menunjukkan bahwa buthanol yang kita analisis mengandung 14% methanol karena terdapat puncak pada waktu retensi 1,310 dengan persentase area 14%. Selebihnya, terdapat puncak pada waktu retensi 2,414 dengan persentase area 85% yang tidak lain adalah buthanol itu sendiri.Pada saat menganalisis pentanol, ternyata pentanol yang ada pun bukanlah pentanol murni 100%. Terdapat 8% methanol yang kemungkinan juga merupakan hasil dari pentanol yang terurai karena telah cukup lama berinteraksi dengan udara bebas. Waktu retensi dari pentanol itu sendiri adalah 2,818 menit.Jika kita perhatikan waktu retensi masing masing senyawa tersebut, kita telah berhasil membuktikan bahwa waktu retensi methanol lebih kecil dari waktu retensi propanol, waktu retensi propanol lebih kecil dari waktu retensi buthanol, dan waktu retensi buthanol lebih kecil dari waktu retensi pentanol.Ketika senyawa campuran dengan dianalisis, timbul empat buah puncak yang masing masing puncaknya timbul di sekitar waktu retensi berada di sekitar waktu retensi methanol, propanol, buthanol dan pentanol. Dari waktu retensi dan perbandingan persentase area yang ada, kita bisa melihat bahwa perbandingan antara methanol, propanol, buhanol, dan pentanol dalam senyawa campuran mendekati 1:1:1:1. Namun jika kita amati lebih lanjut, persentase area untuk pentanol hanya sekitar 20%, kemungkinan penyebabnya adalah pentanol itu sudah terurai menjadi senyawa yang lain karena berinteraksi dengan udara bebas.Untuk sample, setelah dianalisis dengan menggunakan kromatografi gas, didapatkan juga ada 4 buah puncak yang waktu retensinya juga berkisar di antara waktu retensi methanol, propanol, buthanol, dan pentanol. Untuk puncak dengan waktu retensi 1,330 (methanol), persentase perbandingan area terhadap total area puncak adalah 48,88542% mendekati 50%. Untuk puncak dengan waktu retensi 1,590 (propanol), persentase perbandingan area puncak adalah 15,96455%, mendekati 15%. Untuk puncak dengan waktu retensi 2,125 (buthanol), perbandingan persentase area puncak terhadap total area puncak adalah 19.80757% mendekati 20%. Dan untuk puncak dengan waktu retensi 2,754 (pentanol), perbandingan persentase area puncak terhadap total area puncak adalah 15,34246% mendekati 15%. Jika kita bandingkan keempat persentase tersebut, maka kita bisa mendapatkan perbandingan methanol : propanol : buthanol : pentanol = 50 : 15 : 20 : 15 = 10 : 3 : 4 :3.

V. Kesimpulan dan SaranA. KesimpulanDari percobaan yang telah dilakukan dapat disimpulkan :1. Kromatografi adalah teknik pemisahan fisik suatu campuran zat-zat kimia yang berdasarkan pada perbedaan migrasi dari masing-masing komponen campuran yang terpisah pada fase diam dibawah pengaruh pergerakan fase yang bergerak2. Harga Rf didefinisikan sebagai perbandingan antara jarak senyawa dari titik awal dan jarak tepi muka pelarut dari titik awal3. Percobaan pemisahan dengan kromatografi kertas, tidak dapat ditentukan nilai Rf nya, karena noda tidak naik ke atas4. Percobaan pemisahan daun bayam secara KLT didapatkan nilai Rf-nya, pada eluen etanol : kloroform (2 : 1) Rf-nya noda 1 = 0,775 ; noda 2 = 0,85 dan noda 3 = 0. Pada eluen etanol : kloroform (1 : 1) Rf-nya noda 1 = 0,5 ; noda 2 = 0 dan noda 3 = 0,85. Pada eluen etanol : kloroform (1 : 2) Rf-nya noda 1 = 0,525 ; noda 2 = 0 dan noda 3 = 0,855. Secara literature pada daun bayam terdapat senyawa -karoten, klorofil a dan klorofil b.6. Dari keempat persentase tersebut, didapatkan perbandingan methanol : propanol : buthanol : pentanol = 50 : 15 : 20 : 15 = 10 : 3 : 4 :3

B. SaranPada percobaan pemisahan dengan cara kromatografi ini, ada beberapa percobaan yang gagal dan ada juga percobaan yang tidak dilakukan. Hal ini disebabkan karena alat yang digunakan rusak dan juga ada alat yang tidak tersedia di laboratorium serta bahan yang digunakan pada sebagian percobaan tidak disediakan. Untuk itu praktikkan menyarankan agar menyediakan alat dan bahan yang lengkap sesuai dengan percobaan yang akan dilakukan, sehingga praktikum dapat berjalan dengan lancar.

VI. Daftar PustakaKhopkar, SM.2008.Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: UI-PressTim kimia organik I. 2014. Penuntun Praktikum Kimia Organik I. Jambi: Universitas JambiYazid, Estien. 2005.Kimia Fisik untuk Paramedis. Yogyakarta: ANDI30