DIAGRAM METODA KROMATOGRAFI

Group Ion Excl HPCLBasa Kuat CH2N(CH3)3,Cl-Med Basa N(CH3)3,Cl-Basa Lmh NH(R)2,Cl-Asam Kuat SO3-,H+Med Asam HPO3-,Na+Excl Chromt LC berdasar pemisahan/per perbedaan dimensi molekul.

Contoh kompl camp protein dan estrogen BM beda, dpt dipisahkan dg Chromatografi

KROMATOGRAFI salah satu cara pemisahan dengan dasar analisis menggunakan :Pemisahan tergantung pada gerakan relatif dua fasa tersebut. Dari sifat-sifat kedua fasa Kromatografi dapat digolongkan :

2. G Gas T Padat Krom gas Padat = GC

Dari 4 macam bentuk fasa yang dapat digunakan untuk an. Kromatografi Sistem Kromatografi dibedakan :

1. G Cair T Padat

Semua pemisahan dg kromatografi tgt pada kenyataan bahwa senyawa-senyawa yang dipisahkan, terdistribusi sendiri diantara fasa-fasa gerak dan tetap dalam perbandingan yang sangat berbeda-beda satu sama lain.3. G Cair T CairKrom Partisis Krom Kertas

4. G Gas T Cair Krom. Gas Cair = GLC Krom. Kolom Kapiler.

KROMATOGRAFI SERAPANT = Zat padat berfungsi sebagai adsorbenG = Zat cair

Permukaan partikel padat biasanya lebih aktif daripada bagian dalam. Yang pada umumnya dikatakan mempunyai aktivitas permukaan = Survace Activity.

Bila partikel dimasukkan dalam larutan permukaan partikel mempunyai daya tarik baik terhadap zat larut atau pelarutnya.

Daya tarik / absorbsi dalam bentuk :

Elektrostastik (Ionik) Daya tarik dua dipol Antara dipol dan dipol induksi Kekuatan Vander Waals

Partikel padat yang mempunyai aktivitas permukaan dalam kromatografi dinamakan Adsorben.

ZAT PELARUT*) Zat pelarut mempunyai peranan penting dalam Elusi yang dapat menentukan baik-buruknya pemisahan. *) Zat pelarut yang mampu menjalankan Elusi terlalu cepat akan mampu memisahkan secara sempurna.*) Elusi yang terlalu lambat menyebabkan waktu Retensi lama.

Sebaiknya zat pelarut tergantung dari kekuatan elusinya. Kekuatan zat elusi : daya penyerapan pada penyerap (zat pengisi) kolom.

Kekuatan penyerapan dg me polaritas zat yang diserap.Menurut TRAPPE, kekuatan elusi dari deretan pelarut dalam kolom dg silika gel, Air Murni Metanol Etanol Propanol Aseton Etil Asetat Dietil Eter Kloroform Metilenia Cl Benzana Toluena Trikloretilen Karbon Tetra Cl Sikloheksan Heksan.

Menurut Williams pelarut-pelarut dalam kolom menggunakan carbon aktif untuk pemisahan asam-asam amino dan sakarida dalam larutan :Adalah :Etil Asetat , Dietil Eter , Propanol , Aseton , Etanol , Metanol , Air Murni .

Catatan pelarut harus betul-betul murni.

PENGISIAN DAN CARA KERJA KOLOMPengisian kolom harus dikerjakan dengan seragam. *) Penyeragaman kepadatan dalam kolom dengan vibrator atau planger,*)atau adsorben dimasukkan ke dalam kolom dalam bentuk bubur (Slurry) dan partikelnya dibiarkan me.

Pengisian seragam menimbulkan rongga di tengah-tengah kolom.Bagian dasar / bawah dan atas dari isian kolom diberi glasswool atau sintered glass disc untuk menyangga isian.

Kecepatan elusi sebaiknya :*) konstant, dan *)tgt dari : ukuran partikel bhn isian kolom Dimensi kolom Viskositas cairan Tekanan untuk mengalirkan zat pelarut

PENANGANAN CUPLIKANMemasukkan cuplikan dari atas kolom merupakan hal yang sangat penting Cuplikan harus rataDlm keadaan larutan yg sepekat mungkin??? Dicegah terjadinya Dicegah terjadinya penggoncangan kolomUntuk mendapatkan permukaan rata permukaan penyerap / bahan isian diberi kertas saring atau pasir yang bersih hingga membentuk lapisan tipis.

Pemasukan cuplikan melalui pipet kecil ujung pipet ditempelkan pada dinding kolom. Selama zat cair lepas dari pipet, ujung pipet digerakkan berkeliling dalam kolom, dan diupayakan menyentuh penyerap / bahan isian.Cuplikan yang tertinggal dalam dinding kolom dicuci dengan cara yang sama menggunakan pelarut murni. Bila semua cuplikan telah turun ke bagian bahan penyerap, bahan pelarut / G dapat dimasukkan melalui corong pisah.

Dlm kromatografi ini fasa tetap / stasioner berupa zat padat tetapi cairan.Fasa geraknya juga berupa cairan ~ HPLC High Performance Liquid Chromatography. = Liq-liq Partition Chromatogra phy Zat yang dilarutkan akan terdistribusi dg sendirinya diantara 2 fasa zat cair

Dan sesuai dengan koef partisinya.Perbedaan koef partisi dari berbagai komponen campuran dapat dipisahkan.

Keuntungan kromatografi partisi dengan adsorbsi, karena : Daya ulangnya lebih baik Dari data kelarutan, hasil dapat diramalkan Koef distribusi konstant dalam jangka [ ] yang agak luas dapat menghasilkan puncak yang simetris lebih tajam

SUSUNAN PERALATANPada HPLC dan GLC jauh berbeda.Komponen utama : Reservoir pelarut untuk fase gerak Pompa untuk mengalirkan fase gerak / mobile dg kecepatan dan tekanan tetap Injector untuk memasukkan sampel Ada 2 macam On Coloum Injection / Langsung Holding Loop Injection / langsung

Kolom Detector : D. Ultraviolet D. Fluoresens D. Konduktivitas D. Indeks Refraksi D. FID. Flame Ionitation Detector. Recorder

KOLOM KROMATOGRAFI Dapat berupa pipa gelas dg kran dan gelas penyaring di dalamnya.Ukuran kolom dan efisiensi kolom dapat dihitung secara teoritis.Skema pemisahan dua campuran A danB dengan kolom kromatografi

Semua prosedur kromatografi, kondisi optimum untuk suatu pemisahan merupakan kecocokan antara f tetap dan f gerak.

KLT / TLC fasa tetap berupa lapis tipis, pada umumnya digunakan silika gel.Untuk penggunaan dalam suatu tipe pemisahan perbedaan fasa tetap terletak pada : Struktur Pori-pori Struktur lubang

Silika gel perdagangan :Ukuran 10 - 40 berpengaruh pada dan pemisahan Ukuran 20 1500A80 150 = pori besar

Luas permukaan 300 1000m2/g Kelembaban relatif 45 75% mengikat air 7 20% Sangat higroskopis Deaktivasi ditentukan kelembaban relatif kamar dan penyimpanan lempeng silika gel perlu diperhatikanBerpengaruh pd proses serapan

Macam-macam gel di perdagangan :Silika gel dg pengikat silika gel G dg pengikat - CaSO4 [5-15%] silika gel S dg pengikat - pati2. Silika gel dg pengikat dan indikator flourisense Silika gel GF atau GF 24Berflourisens kehijauan jika dilihat dg UV pendek.Indikator yg digunakan timah-kadmium sulfida atau mangan-timah silikat aktif.3. Silika gel tanpa pengikatSilika gel H atau silika gel N.Lebih stabil dibanding bentuk I.

4. Silika gel tanpa pengikat dengan indikator flourisense.5. Silika gel untuk pemisahan preparatif. Silika gel PF254 + 3666. Alumina dengan pH 9, 7, 4Dengan pengikat CuSO47. Selulosa, sebagai fasa diam KLT diperoleh mekanisme sama pada krom. kertasSelulosa untuk KLT ada 2 bentuk : - serat asli - MonokristalPemilihan fasa gerak pada KLT dengan silika gel / alumina sebagai ft, mengikuti aturan kromatografi serapan.

PELARUT SEMI MIKROSTOP (Menurut kenaikan sifat Hidrofob) banyak digunakan. Kloroform biasanya distabilkan dengan Etanol) Air n. Anil AlkoholFormanida Etil AsetatMetanol EterAsam Asetat n. Butil AsetatEtanol KloroformIsopropanol )) BenzenaAseton Siklo Heksann. Propanol Eter PetroleumTert-butanol PetroleumFenol m. Parafinn. Butanol) Untuk pemisahan senyawa Hidrofil)) Untuk pemisahan senyawa Lipofil

METODOLOGI1. Pembuata Lempeng Lapis Tipis Ukuran lempeng gelas yang biasa digunakan 20 x 20, 20 x 10, 20 x 5 cm Pencucian : - Air (+) deterjen Keringkan- Aseton keringkan Pelapisan : - 30 g bahan pelapis dibuat bubur dengan air atau pelarut lain- Pindahkan dengan segera dalam alat perata.- Ratakan bubur pada lempeng dengan ketebalan 0,25mmUntuk pemisahan preparatif tebal lapisan 0,5 2,0 mm. Pindahkan lempeng pada rak dengan hati-hati, diamkan 30 menit ------- t 100 1200C 1 jam

Simpan dalam Desikator

Perbandingan Bahan dan Pelarut untuk LempengPENOTOLAN CUPLIKAN Lempeng lapis tipis konvensional (20 x 20, 20 x 10, 20 x 5) dengan tebal 0,2 mm. Cuplikan ditotolkan sebagai bercak bulat dengan diameter 3 6 mm, atau berupa garis; 1,5 2 cm dari tepi bawah.

PENOTOLAN CUPLIKAN Lempeng lapis tipis konvensional (20 x 20, 20 x 10, 20 x 5) ,dengan tebal 0,2 mm.. Cuplikan ditotolkan sebagai bercak bulat dg diameter 3 6 mm, atau berupa garis 1,5 2 cm dari tepi bawah.

Penotolan dengan mikro pipet atau microsyringe diperlukan 1 20 L. Kelebihan bahan totolan menyebabkan bercak asimetri danperubahan harga R.

HETP pada KLT biasanya 10 x 10, 10 x 20 cm. diperlukan cuplikan dalam nano pikogram setiap bercak. Diameter bercak harus tidak lebih 1,0 1,5 mm dan vol cuplikan 0,2 L.

Kromatogram biasanya dikembangkan dlm bejana pengembang gelas atau logam yg tertutup dan jenuh dengan uap pelarut.PENGEMBANGAN KROMATOGRAM

Teknik Perbaikan PemisahanPengembangan Berkelanjutan gerak dialirkan pada bagian atas lempeng pengembang. Teknik ini digunakan untuk senyawa dengan R 0,05 0,2 setelah pengembangan pertama.

Pengembangan Dua DimensiCuplikan ditotolkan di salah satu pojok kemudian dikembangkan seperti biasa.

Kemudian diputar 900 sehingga pita pemisahan I terletak pada bagian bawah lempeng dilakukan pengembangan II sehingga terjadi pemisahan berbeda pada arah kedua.

Teknik ini berguna untuk cuplikan yg mengandung banyak penyusun.

Pengembangan SerkulerFasa gerak dialirkan dengan sumbu atau pompa melalui pipa kapiler ditengah lapisan / tetap. Senyawa terlarut bergerak dari tengah penotolan menghasilkan lingkaran-lingkaran sempit.

Pengembangan Beberapa KaliFasa gerak biasanya mudah menguap, diuapkan setelah terjadi pengembangan. Lempeng dikembangkan lagi dengan G yang sama atau berbeda.

METODA IDENTIFIKASIUntuk melihat senyawa berwarna pada lempeng pengembang, biasanya dilakukan metoda sebagai berikut :1. Dengan UV (254 366 mm)a. Pada lap berfluorisensi (S GF254) bercak muncul sebagai bercak hitam.

b. Senyawa berfluorisensi, pd lapisan biasa bercak akan terlihat berfluorisensi.

2. Disemprot pereaksi yg menghasilkan warna atau berfluorisensi.Digunakan utk deteksi asam sulfat, (H2SO4 p., 50% H2SO4, 50% H2SO4 dlm Metanol).

Reaksi ini terbentuk dlm keadaan dingin atau dg --------100 -1200C

- dapat digunakan pada ft organik atau sbg bahan pendukung pati

- Pereaksi lain yg banyak igunakan uap iodium

Faktor yg mempengaruhi gerakan noda dlm KLT yang juga berpengaruh terhadap R1. Struktur kimia senyawa yang dipisahkan.2. Sifat adsorben dan derajat aktivitasnya.Aktivitas di kan dg pemanasan dlm oven.3. Tebal dan kerataan lapisan penyerap.

4. Pelarut & [o kemurnian] f gerak.- Kemurnian pelarut sangat penting- Perbandingan campuran pelarut perlu diperhatikan.

5. Derajat kejenuhan uap dalam bejana pengembangan.

6. cuplikan yang digunakanTetesan cuplikan Tendensi penyebaran nodaKesalahan harga R Terbentuknya ekor Efek kesetimbangan lain

7. Suhu, pemisahan sebaiknya pada suhu tetapHal ini terutama untuk mencegah perubahan-perubahan dalam komposisi pelarut karena penguapan,( perubahan fasa).8. KesetimbanganKesetimbangan dalam KLT lebih penting dalam krom. kertas perlu diupayakan atmosfer dalam bejana jenuh dengan uap pelarut.Gejala atm. bejana jenuh pengembangan dengan permukaan pelarut cekung, fasa gerak bergerak lebih berat di bagian tepi .. harus dihindarkan.

KROMATOGRAFI KERTAS Prinsip sama KLT, hanya fasa tetap digunakan kertas bukan lempengan.Pelarut bergerak melalui serat-serat kertas oleh gaya kapiler, dan menggerakkan komponen cuplikan. Pada perbedaan jarak dalam arah aliran pelarut.

Bila permukaan pelarut mulai bergeraksampai waktu tetentu/ditetapkan, kertasDiambil dan dikeringkan.

Kedudukan dari permukaan pelarut diberi tanda.

Jika senyawa campuran berwarna akanterlihat noda yang terpisah Bila tdk berwarna perlu diteksi dg UV,diMetoda identifikasi yg plg mudah denganBerdasar kedudukan noda relatif terhadap Permukaan pelarut dg harga Rf

BEBERAPA FAKTOR PENENTU R1. Pelarut pentingnya koefisien partisi2. Suhu perubahan suhu merubah koefisien partisi dan kecepatan alir3. Ukuran bejana vol. bejana mempengaruhi homogenitas atmosfer jadi mempengaruhi kecepatan penguapan komponen pelarut.

4. Kertas sesuai jenis berpengaruh thd keseimbangan partisi.5. Sifat campuran.