9-TRANSCRIPTOMA, PROTEOMA Y ANÁLISIS DE LA SECUENCIA …sgpwe.izt.uam.mx/files/users/uami/pacopp/9... · comparaciones cuantitativas entre dos o más condiciones-Finalmente se identifican

TRANSCRIPTOMATRANSCRIPTOMA

- Northern blot- Northern blot

- Aporta información sobre la presencia de un transcrito, su abundancia y su tamaño- Electroforesis: Se realiza en condiciones desnaturalizantes, Gel: agarosa 0,8-1,4% y formaldehído 6%, en buffer MOPS (3-(N-morfolino)propano-sulfónico)- Las muestras deben desnaturalizarse, buffer de carga: MOPS, formamida, formaldehído, colorante- Transferencia: por capilaridad o vacío, similar a Southern- Hibridación: similar a Southern, buffer con más formamida (50%)

- Para comparar diferencias en los niveles de expresión de un gen es muy importante la utilización de un control: generalmente un gen que se exprese constitutivamente: citoesqueleto (-actina), un gen de ARNr. Las intensidades de la señal del gen en estudio deben normalizarse con las del control

- RT-PCR- RT-PCR

- PCR tiempo real- PCR tiempo real

- ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DIFERENCIAL- ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DIFERENCIAL

- Obtener información sobre genes que se transcriben únicamente o con mayor intensidad en una determinada condición respecto a otra. Se busca analizar el transcriptoma completo.- Estos métodos se basan en la utilización de dos poblaciones de ADNc obtenidas a partir del ARN de las dos condiciones a ensayar:

Métodos clásicos:

- Hibridación substractiva- Differential display- cDNA-AFLP- ESTs

Métodos basados en genómica:

- Microarreglos- RNA sequencing


-Se basa en la eliminación de las moléculas de ADNc que están repetidas en las dos condiciones a través de un proceso de hibridación; las moléculas híbridas formadas entre ADNc de las dos condiciones son entonces eliminadas, el resto (expresadas diferencialmente) se aíslan y estudian.

- p.ej. Sistema SSH (Supression Substractive hybridization), de Clontech

- Hibridación substractiva- Hibridación substractiva

- Hibridación substractiva- Hibridación substractiva


- Similar al método de AFLPs pero partiendo del ADNc obtenido a partir de dos condiciones en lugar de DNA genómico. Los patrones de bandas obtenidos con ambas condiciones se comparan para detectar bandas presentes sólo en una condición, indicativo la expresión diferencial de un transcrito.

- cDNA-AFLP- cDNA-AFLP


- Consiste en visualizar en un gel el nivel de expresión de los transcritos provenientes de dos condiciones diferentes y detectar diferencias en la misma.- Actualmente se utilizan métodos basados en PCR (DD-PCR).- Esquema:

- Para cada población de RNA se ponen 3 reacciones de síntesis de ADNc, cada una con un primer oligo-dT anclado: T12A, T12C, T12G

- Finalizada la síntesis de la hebra de ADNc, se añade el primer arbitrario (10-12 bases) y todos los componentes para una reacción de PCR, con 32P-dCTP

- Se cargan las muestras, previa desnaturalización, en un gel de acrilamida del 6% desnaturalizante (7 M urea). Autorradiografía

- Cortar las bandas de interés (expresadas diferencialmente), eluir el ADN y precipitar con acetato de potasio, glicógeno y etanol.

- Reamplificar por PCR usando la combinación adecuada de primer T12M (M= A, C o G) con arbitrario

- Correr un gel de agarosa con el producto de la PCR. Extraer el fragmento del gel para subclonarlo, secuenciarlo, etc.

- Differential display- Differential display

- Differential display- Differential display

Para cada condición se tiene un pool de RNA que se utiliza para síntesis de ADNc y amplificación con: primer oligo-dT anclado + primer arbitrario. Se obtiene así un patrón de bandas amplificadas para cada condición, las cuales se comparan en un gel de poliacrilamida para detectar transcritos expresados diferencialmente.


- Se basa en tres principios

- Una secuencia corta, tag (etiqueta), de 10-14 nucleótidos, contiene suficiente información para identificar de forma única un transcrito.

- Una vez aislados, estos tags pueden unirse para formar largas series de moléculas de ADN que pueden clonarse y secuenciarse.

- La cuantificación del número de veces que un determinado tag está presente en una condición indica el nivel de expresión del gen correspondiente en esa condición

- SAGE: Serial analysis of gene expression- SAGE: Serial analysis of gene expression

- SAGE- SAGE

- Se cortan con las enzimas NlaIII y BsmFI las secuencias tag de cada transcrito de una condición determinada

- Se ligan las secuencias aisladas formando largas cadenas de ADN que se secuencian

- La secuencia nos indica el número de veces que un tag particular está presente, lo que refleja la abundancia de ese transcrito en una determinada condición, permitiendo hacer comparaciones cuantitativas entre dos o más condiciones

- Finalmente se identifican los genes a que corresponden los tags mediante comparación de la secuencia del tag con una base de datos que contenga todos los genes caracterizados de la especie en cuestión

- SAGE- SAGE

Obtención de los tags: Se corta con NlaIII, se añaden adaptadores (linkers) para BsmFI y se corta con esta enzima. BsmFI es del tipo IIs, corta a una distancia de unos 15 pares de bases del sitio de reconocimiento (en el linker), generando fragmentos con una secuencia de 15 pb (SAGE tag), que se ligan para formar concatémeros.


- ESTs: Expressed Sequence Tags- ESTs: Expressed Sequence Tags

- Más que un método de differential display es una técnica que permite identificar cientos de transcritos que se están expresando en una célula en un momento y condiciones determinados: transcriptoma

- Consiste en la obtención de ADNc de la muestra o muestras en estudio, y en la realización de una única reacción de secuencia que permita identificar mediante búsquedas en bases de datos los genes a que corresponden cada uno de los clones secuenciados. Se obtiene así una representación del transcriptoma que puede compararse entre dos condiciones distintas.

- MICROARREGLOS- MICROARREGLOS

- Un arreglo de ADN es una colección de moléculas de ADN (ADNC u oligonucleótidos) dispuestas sobre un soporte sólido como una matriz de filas y columnas

- Macroarreglos: puntos sobre una membrana de nylon o nitrocelulosa, pequeño número. Las sondas (ADNc que proviene de dos condiciones) se marcan por radiactividad. Se detecta la intensidad de la señal en cada punto y se compara la misma entre las dos condiciones.

- Microarreglos: Habitualmente oligonucleótidos (20-80 nucleótidos), cada uno de ellos es una secuencia identificativa de un gen. Contienen hasta 40.000-60.000 puntos. El marcaje de las sondas de ADNc se realiza con fluorescencia: rojo (Cy5) para la condición problema y verde (Cy3) para la condición de referencia. El detector compara la intensidad de la fluorescencia e integra el resultado en cada punto, observándose el resultado final como un punto rojo (genes sobreexpresados en la condición problema), verde (genes con menor expresión en la condición problema) o amarillo-naranja (genes con expresión similar en las condiciones problema y de referencia)

Confección del microarreglo

1. Colecciones de Expressed Sequences Tags (EST)

2. Bibliotecas de ADNc3. Secuencias genómicas

Procedencia de la información de secuencia para la elaboración de los oligonucleótidos o fragmentos de ADN que se fijarán al arreglo.

Confección de arreglos

MICROARREGLOS

Siembra 0,25-1 nL/puntogenerando puntos de 100-150 m de diámetro.

Confección de microarreglos

El experimento tipo consiste en la comparación de los niveles de expresión de todos los genes de un organismo en dos estados celulares (condiciones).

Proceso

1. Aislar ARNm a partir de una muestra biológica.2. Convertir el ARNm en ADNc, utilizando una transcriptasa reversa.3. Marcar el ADNc con nucleótidos fluorescentes (Cy5 y Cy3)4. Hibridar el ADNc marcado en el microarreglo.5. Detectar y cuantificar la fluorescencia utilizando un laser scanner confocal.6. Analizar los resultados.

Hibridación en microarreglos

Síntesis de ADNc

Hibridación en microarreglos

Cy5 Cy3

Cy5 = 633 nm Cy3 = 532 nm

Expresión de 1 > 2

21

Expresión de 1 = 2Expresión de 1 < 2

Microarreglo de levadura

- RNA Sequencing- RNA Sequencing

- Secuenciación del transcriptoma mediante los nuevos métodos de secuenciación (Next Generation Sequencing)

- Permite la obtención de millones de secuencias: gran precisión estadística

- Permite la detección de ARNm con maduración alternativa o transcritos no descritos, mientras que los microarreglos sólo permiten estudiar transcritos ya conocidos (lo que se ha depositado en el microarreglo)

-Puede realizarse con especies en las cuales no existe información previa de su secuencia genómica (si bien los resultados óptimos se consiguen cuando sí está secuenciado el genoma)

PROTEOMA

ESTUDIOS CON PROTEÍNAS: SDS-PAGEESTUDIOS CON PROTEÍNAS: SDS-PAGE

SDS-PAGE: Polyacrilamide Gel Electrophoresis. Permite separar proteínas desnaturalizadas en un gel de poliacrilmida en función de su tamaño.

Se utiliza acrilamida/bis 37:1. La mezcla que se indica es para un gel con un porcentaje de acrilamida del 12%, si este porcentaje varía debe recalcularse la cantidad de acrilamida/bis y de agua destilada a añadir.

Mezcla para gel separador:Acrilamida/bis 40% 9 mlTris-HCl 1,5 M pH 8,5 7.5 mlAgua destilada 13 ml10% SDS 300 l10% APS 100 lTEMED 15 l

Mezcla para gel concentrante:Acrilamida/bis 40% 1 mlTris-HCl 1M pH 6,8 1.25 mlAgua destilada 7.6 ml10% SDS 100 l10% APS 35 lTEMED 5 l

SDS-PAGESDS-PAGE

Buffers y soluciones

• Tampón de electroforesis:25 mM Tris, 192 mM Glicina, 0.1% SDS, pH 8.3

• Tampón de muestra: 0.3 M Tris•HCl, pH 6.8, 5% SDS, 50% glycerol, Azul de bromofenol 0.01%, 2--mercaptoetanol 0,5%

• Solución de teñido:0.125% Coomassie Brilliant Blue R-250, 50% Metanol, 10% Ácido Acético

• Solución de desteñido:50% Metanol, 10% Ácido Acético

SDS-PAGESDS-PAGE

Tinción con Coomasie

Solución de teñido:0.125% Coomassie Brilliant Blue R-250, 50% Metanol, 10% Ácido Acético

Tinción con sales de plata

1- Etanol, ácido acético, H2O (30:10:60)2- Etanol 30%3- Nitrato de plata 0,1%4- NaCl, CuSO4, NH4OH, tiosulfato sódico5- Ácido acético 1%

PAGEPAGE

PAGE: Gel de poliacrilamida nativo, sin SDS

- Cuando se pretende extraer una proteína del gel de forma que conserve su actividad, o bien cuando se quiere ensayar una actividad enzimática en el propio gel, las proteínas no deben desnaturalizarse. Para ello se llevan a cabo las siguientes modificaciones:

- No se añade SDS al gel, buffer de muestra ni buffer de electroforesis- No se añade -mercaptoetanol al buffer de muestra para evitar la reducción

de los puentes disulfuro- Las muestras no se calientan y la electroforesis se desarrolla a 4ºC- Para ver actividad en el gel: éste se incuba con el sustrato adecuado hasta

que aparezcan bandas de actividadDebe tenerse muy en cuenta el pH del gel, ya que las proteína entrarán y se moverán en el gel sólo si tienen carga neta negativa, y esto depende de su punto isoeléctrico.

- Si se quiere recuperar la actividad de una proteína despues de un SDS-PAGE existen protocolos para renaturalizar la proteína

Western BlotWestern Blot

Detección de una proteína mediante anticuerpos tras un SDS-PAGE


Actividad de la enzima fosfatasa alcalina conjugada con el anticuepo secundario


Reacción cruzada con anticuerpos policlonales


Cuantificación de la proteína tras un Western blot como método de determinación de la expresión del gen

Técnicas de ProteómicaTécnicas de Proteómica

Electroforesis bidimensional: 2D SDS-PAGE

Isoelectroenfoque: separación de las proteínas en función de su punto isoeléctrico: pH al cual la carga neta total de la proteína es 0

SDS-PAGE: separación de las proteínas en función de su tamaño


Electroforesis bidimensional: 2D SDS-PAGE

Pueden llegar a detectarse todas las proteínas que se están expresando en una célula

Permite establecer comparaciones entre dos condiciones: sistema de análisis de expresión diferencial


Métodos de identificación de las proteínas

Las proteínas separadas en un 2D (o purificadas por cualquier otro método) pueden analizarse para conocer su masa molecular, huella peptídica y secuencias de péptidos internos en sistemas de espectrometría de masas; esto permite su identificación.

- Huella peptídica: tras digestión con tripsina se obtiene la masa molecular precisa de todos los péptidos resultantes, la cual se compara con la masa virtual obtenida de la información de los genes en la base de datos. Se lleva a cabo con un MALDI-TOF (Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight)

- Para completar la identificación puede hacerse una microsecuenciación de péptidos internos con un LC-MS/MS (Liquid chromatography-tandem MS). Se obtienen secuencias de longitud corta (6-14 aminoácidos) que a menudo presentan ambigüedades.

- Microsecuenciación por Degradación de Edman : Método clásico de secuenciación de péptidos. Requiere al menos 0,5 g de proteína. Es un método más directo, pueden obtenerse secuencias de hasta 20-25 aa, mayor fiabilidad.


Huella peptídica


Huella peptídica


Huella peptídica

SECUENCIACIÓN DEL ADNSECUENCIACIÓN DEL ADN

Método de Sanger o de los didesoxinucleótidosMétodo de Sanger o de los didesoxinucleótidos

- Se basa en la utilización de terminadores: moléculas de didesoxinucleótidos que al incorporarse a la cadena de ADN detienen la reacción de polimerización.

- Una mezcla de los 4 desoxinucleótidos con 1 didesoxinucleótido concreto ocasionará que la reacción de polimerización se detenga al azar generando moléculas de diferente tamaño que se separan en un gel de acrilamida

ANÁLISIS DE LA SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS

3’-TCTGGACGTAAATATTCGGCGGCGTCA-5’5’-A-3’5’-AGA-3’5’-AGACCTGCA-3’5’-AGACCTGCATTTA-3’5’-AGACCTGCATTTATAA-3’5’-AGACCTGCATTTATAAGCCGCCGCA-3’

4 reacciones: ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP

ddATP

5’-A-3’

5’-AGA-3’5’-AGACCTGCA-3’

5’-AGACCTGCATTTA-3’5’-AGACCTGCATTTATA-3’5’-AGACCTGCATTTATAA-3’5’-AGACCTGCATTTATAAGCCGCCGCA-3’

ddATP

3’-TCTGGACGTAAATATTCGGCGGCGTCA-5’5’-AG-3’

5’-AGACCTG-3’5’-AGACCTGCATTTATAAG-3’

5’-AGACCTGCATTTATAAGCCG-3’5’-AGACCTGCATTTATAAGCCGCCG-3’

5’-AGACCTGCATTTATAAGCCGCCGCAG-3’

ddGTP

3’-TCTGGACGTAAATATTCGGCGGCGTCA-5’5’-AGACCT-3’

5’-AGACCTGCAT-3’5’-AGACCTGCATT-3’

5’-AGACCTGCATTT-3’

5’-AGACCTGCATTTAT-3’

5’-AGACCTGCATTTATAAGCCGCCGCAGT-3’

ddTTP

3’-TCTGGACGTAAATATTCGGCGGCGTCA-5’5’-AGAC-3’5’-AGACC-3’5’-AGACCTGC-3’

5’-AGACCTGCATTTATAAGC-3’5’-AGACCTGCATTTATAAGCC-3’

5’-AGACCTGCATTTATAAGCCGC-3’5’-AGACCTGCATTTATAAGCCGCC-3’

ddCTP

5’-AGACCTGCATTTATAAGCCGCCGC-3’

- Gel de acrilamida con reacciones de secuencia, se visualiza una autorradiografía generada por la señal del isótopo 35S-dATP

- En la actualidad el proceso se hace de forma automática. Los terminadores llevan incorporados colorantes fluorescentes de diferente longitud de onda, que permiten hacer la reacción en un único tubo. Tras un proceso de electroforesis capilar un detector láser recoge la señal de cada terminador (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP)

Secuenciación automática

Secuenciación shot-gun

Secuenciación primer walking

5’ 3’

- Tenemos un fragmento para secuenciar clonado en un vector plasmídico. Se lleva a cabo la primera reacción de secuencia con un primeruniversal. A partir de la secuencia obtenida se diseña un segundo primer hacia el extremo 3’ de la misma para que haga de iniciador en la siguiente reacción, y así sucesivamente hasta completar el fragmento a secuenciar

Estrategias de secuenciación en proyectos genoma

Shot-gun Clon a clon de una genoteca

Algunos sitios web relacionados con proyectos genoma

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