1

A membránpotenciál

� Elektromos potenciál különbség a membrán két oldala közt, Em

Réz

Cink

Galvani (1791)

ideg

izom

mérőelektróda

Erősítő (feszültségmérő műszer)

ReferenciaElektróda

Ringeroldat

Regisztrátumvagy elvezetés

idő

fesz

ülts

ég

Nyugalmipotenciál

A membránpotenciál mérése� Mérési elv: feszültségmérő áramkör

Erősítő (feszültségmérő műszer) elemei:

Erősítő

Analóg-digitális

jelátalakító

számítógépadattárolás

Adatanalízis

megjelenítés

Jel

Mérőelektródasejtbe hatolása

idő

2

A membránpotenciál mérése� Példa egy műszerrendszerre

A membránpotenciál mérése� Az első sikeres kísérlet: tintahal óriásaxon

0,5 mm

Hodgkin and Huxley (1939)

Young (1936): Loligo óriásaxon

csillagdúc

csillagidegóriásaxonokkal

Erősítő (feszültségmérő műszer)

ReferenciaElektróda

mérőelektróda

óriásaxon

3

Ionokra ható erők: kémiai grádienselektromos mezőelektrokémiai grádiens

Egyensúlyi potenciál Donnan (1911)fluxus = 0elektromos potenciál különbség ellentételezi a kémiai grádienstionkoncentrációk aránya a membrán két oldalán meghatározott

ElektroneutralitásStatisztikailag páros K+ és Cl- vándorlásKCl diffúziós ráta mindkét irányban egyenlő

Onkotikus nyomás:víztöbblet I-ben

Donnan egyensúly

A nyugalmi potenciál� Sejtmembrán szelektív ionpermeabilitása: kálium

2.5–50.0001Ca2+110-1254-9Cl-145-1505–15Na+

4-5140K+Emlős sejtek

100.0001Ca2+56040–150Cl-44050Na+

20400K+Óriásaxon

ExtracellulárisIntracelluláris

Ionkoncentrációk (m M)

4

A Nernst-egyenlet� A nyugalomban lévő membrán leírására alkalmas

18 oC: 0,05838 oC: 0,061

Káliumra számítva az óriásaxonban: EK= -75,5 mV

Nernst-egyenlet:

Nátriumra számítva az óriásaxonban: ENa= +55,9 mV

Goldman-Hodgkin-Katz egyenlet� A nyugalmi potenciál több ion egyensúlyi potenciálja

A gliasejteknél elegendő a Nernst egyenlet:

A neuronoknál viszont nem elegendő:

Külső kálium koncentráció (mM)

Mem

nrán

pote

nciá

l (m

V)

Mért értékek

Nernst egyenlettelszámított függvény

5

Goldman-Hodgkin-Katz egyenlet� Az aktuális pillanatnyi membránpotenciál kiszámítására

Külső kálium koncentráció (mM)

Mem

nrán

pote

nciá

l (m

V)

Mért értékek

Nernst egyenlettelszámított függvény

GHK egyenlettelszámított függvény

Membránpotenciál és Na-K pumpa� Na-K pumpa nélkül nincs mebránpotenciál

1. Szivárgáskompenzáció

2. Pumpapotenciál: belső negativitás fokozása

6

A membrán passzív elektromos jellemz ői

� A sejtmembrán lipid kettősréteg természetének funkcionális következményei

� Mérési elv: áraminjektáló és feszültségmérő áramkör

A membrán passzív elektromos jellemz ői

Rellenállás > Regyéb komponensek - stimuláló áram állandóRerősítő (feszültségmérő műszer) nagy - nincs jelentős áramfolyás a mérőelektródon át

Ringer oldat

Referenciaelektróda

Erősítő (feszültségmérő műszer)

Mérő-elektródaÁraminjektáló elektróda

ellenállás

Áram-generátorÁram-

mérő

Fürdő-elektróda

Áraminjektáló áramkör Feszültségmérő áramkör

7

A membrán passzív elektromos jellemz ői� Az áraminjektáló és feszültségmérő áramkör

kísérleti alkalmazása Az áraminjektáló áramkörrel negatíváramlépcsőt injektálunk a neuronba:

Eközben a feszültségmérő áramkörrel mérjük a neuron membránpotenciálját:

Az áraminjektáló áramkörrel pozitíváramlépcsőt injektálunk a neuronba:

Eközben a feszültségmérő áramkörrel mérjük a neuron membránpotenciálját:

X tengely: idő (ms)

A membrán passzív elektromos jellemz ői� Membrán kapacitancia

Membrán kondenzátor

Dielektromos állandó (~3 uF/cm2)

A sejtmembrán egyszerű elektromos modellje

Extracelluláris oldat

Konduktancia(ellenállás):ioncsatorna

Kapacitancia(kondenzátor):Lipid kettősréteg

Citoszol

Rezisztív áramKapacitív áram

Töltéseloszlás a membrán mentén

8

A membrán passzív elektromos jellemz ői� Elektrotónusos potenciál és membrán időállandó

Elektrotónusos potenciál:A sejtmembrán passzív feszültségválasza áramlépcsőre

Áramlépcső

Elektrotónusos potenciál(a membrán

feszültségválasza)

Kapacitív áram, Ic

Rezisztív áram, Ir

Membrán időállandó, t

Áramforrás

Membrán

t

X tengely: idő (ms)

A membrán passzív elektromos jellemz ői� Membrán ellenállás

Ohm törvénye:

Bemenő ellenállás a sejt teljes ellenállása a membránon átfolyó áramra vonatkoztatvaarányos a sejtfelülettel

Membrán konduktancia

Specifikus ellenállás

Bemenő konduktancia X ionra; emf = Vm

9

A membrán passzív elektromos jellemz ői� Membrán térállandó

λ, térállandóx, távolság

Rm, specifikus ellenállásRi, belső ellenállásRo, külső ellenállásRl, hosszanti (axiális) ellenállás

Áraminjekció

Mérő-elektródák

NyugalmipotenciálM

embr

ánpo

tenc

iál

Térállandó ( λ)

Távolság

Membrán modell

belülkívül

Áram-forrás

Mérési eredmény

1

2

3

Az akciós potenciál

10

A sejtmembrán magvezető modellje (Hodgkin)

A passzív és aktív membránt is modellező elektromos áramkör

V

I

bemenőrektifikáció

kimenőrektifikáció

lineárisbemenő I-V

lineáriskimenő I-V

anomális kimenőrektifikáció

anomális bemenőrektifikáció

Passzív membrán: lineáris I-V függvény (Ohmikus) Aktív mebrán:1. Rektifikáció: eltérés a lineáris áram-feszültség függvénytől 2. a membránon ellentétes irányban átfolyó áramok nem

egyenlőek3. aktív membránjellemző, feszültségfüggő ioncsatornák

működnek

bemenő rektifikáció

lineáris bemenő áram-feszültség (I-V) viszony

anomális bemenő rektifikáció

1

2

Inge

rlő á

ram

(nA

)

1

2

2

1

3

4

3

4

kimenő rektifikáció

anomális kimenő rektifikáció

Passzív és aktív membrán: áram-feszültség (I-V) függvény

11

Aktív membrán: akciós potenciál

Hiperpolarizáció: 1,2Depolarizáció: 3, 4Küszöb potenciálKüszöb alatti válasz (lehet passzív és aktív)Küszöb feletti válasz (mindig aktív)

Az áraminjektáló áramkörrel áramlépcső sorozatot (1-4) injektálunk a neuronba:

Eközben a feszültségmérő áramkörrel mérjük a neuron membránpotenciálját:

Inge

rlő

ára

m (

nA)

Küszöbpotenciál

Mem

brán

pote

nciá

l (m

V)

Az akciós potenciál alapvet ő tulajdonságai

Hodgkin and Huxley (1939)

Mem

brán

pote

nciá

l (m

V)

Inge

rlő

áram

(nA

)

Túllövés

Küszöb-potenciál

Idő (ms)

Felszállófázis

Leszállófázis

Helyi válasz

Nyugalmipotenciál

utóhiperpolarizáció

küszöbáram

12

Az akciós potenciál alapvet ő tulajdonságai

2A

Abszolút refrakter periódus

Relatív refrakter periódus

ingerek

Ser

kent

hető

ség

Idő

Inge

rlő

ára

m

Akciós potenciált kialakító minimális inger görbéje

Az akciós potenciál alapvet ő tulajdonságai

Fázisos válasz Tónusos válaszakkomodáció

13

Az akciós potenciál lefutása sejttípusra jellemz ő

vázizom szívizom

Az akciós potenciál ionikus mechanizmusai� Nátrium mozgás felelős az akciós potenciál kialakulásáért

3. A túllövés amplitúdója a külső Na koncentráció függvénye Hodgkin and Katz (1949)Extracelluláris tengervíz NaCl tartalmának fokozatos (1-5) cseréje kolin-

kloridra, majd NaCl visszamosása a kolin-klorid helyett (6):

2. Túllövés alatt ENa közelében a Vm

1. Na influx depolarizálja a membránt (Hodgkin and Huxley, 1939)

Mem

brán

pote

nciá

l (m

V)

Idő (ms)

14

Az akciós potenciál ionikus mechanizmusai� Voltage-clamp (feszültségzár) módszer

Cole (1949)Hodgkin and Huxley (1952)- Parancs membránpotenciállal Vm beállítható és tartható,

I = V/R; I = V * gA membránon átmenő áram konduktanciaváltozást jelent

- Parancs membránpotenciált és mért membránpotenciált összehasonlító áramkör, az eltérést feedback áraminjekció kompenzálja

- az áramvisszacsatolás "zárja" a feszültséget- a visszacsatolt áramot mérjük- Előnyei

1. A membránon átfolyó áramot direkt mérjük2. Az ionáramok feszültség és időfüggők; Vm itt állandó, ezzel elválasztjuk a két változót, az ioncsatorna áramok feszültségfüggésedirekt úton mérhető:

Kontroll er ősítő

Feszültségmér őerősítő

Feszültségmér őelektróda

Membránon átfolyó áram

Áram elektródák

Kontrolláram

Parancs V m Mért Vm

Óriásaxon

Hiperpolarizáció Depolarizáció

Par

ancs

Vm

(mV

)M

embr

ánon

átfo

lyó

áram

(nA

)

Az akciós potenciál ionikus mechanizmusai� Az akciós potenciál

voltage-clamp analíziseParancs V m

-59 mV

+20 mV

Membránon átfolyóösszes áram

Membránon átfolyónátrium áram

Membránon átfolyókálium áram

Akciós potenciálmembránpotenciál

görbéje

Nátrium konduktancia

Kálium konduktancia

-59 mV

15

Ionáramok és ioncsatornák

Ionáramok mérése: patch clampNeher and Sakmann (1976), Nobel-díj 1992

Sejtbe injektált áram

Egycsatorna-áramok

Egycsatorna-áramok összege

16

Patch clamp mérési konfigurációkNeher and Sakmann (1976), Nobel-díj 1992

Patch clamp mérési konfigurációk� Példa egy whole cell patch clamp kísérletre

17

A gyors nátrium csatorna működése

1. Feszültségfüggő csatorna: depolarizáció (-75 � -25 mV) konformációváltozást okoz2. Óriási feszültségváltozás a csatornafehérjére vonatkoztatava: 100000 V/cm3. Kapu áram (gating current) töltéssel rendelkező csoportok elmozdulhatnak4. Zárt, nyitott és inaktivált működési állapota lehetséges.Refrakter periódus: Na inaktiváció és K konduktancia együttes hatásaIntracelluláris Na koncentráció alig változik (0,001-1 % /AP, ∆Vmembrán: 0,3 mV) 10-12 M Na+; 100 mV; 160-500 Na+/ µm2/AP;Extracelluláris K koncentráció: rendkívül limitált tér (~30-40 nm a sejtek között) gliális K felvétel

Aktivációskapu

InaktiválódoménParancs V m

Mért áram

A gyors nátrium csatorna szerkezete

tetrodotoxin

Helyi érzéstelenít ők: Lidocain

Alfa és béta skorpiótoxin

S4: pórusformáló alfa hélix

Inkativálóhurok

Alfa alegység:

Alegységekelrendeződése:

Blokkolószerek:

18

A feszültségfüggő K+-csatorna szerkezete

Eukariota kálium csatorna alfa alegység monomerek

bakteriális kálium csatorna monomerek

Eukariotaalegységekelrendeződése:

Blokkolószerek:tetraetilammónium4-aminopiridin

A feszültségfüggő K+-csatorna működése

Rod Mackinnon (Nobel-díj 2003)

Zárt állapotNyitott állapot

A béta alegységek érzékelik a feszültséget éscsavarják az alfa alegységeket

19

A feszültségfüggő K+-csatorna működése

1. Az intracelluláris oldalon aK+ elveszti hidrátburkát

2. Alfa alegység oxigénatomjaiátveszik a hidrátburok szerepét

3. K+ mozgás a 4 lehetségesoxigénzseb között

4. K+ rehidrálódik az extracelluláris oldalon

Két S4 alegység modellje

Ionszelektivitás:a nátrium túl kicsi az alfa alegység oxigénjei között

Az akciós potenciál terjedése

20

A Na-csatornák s űrűsége az idegsejtekenA Na-csatornák az axon iniciális szegmentumon sűrűsödnek,itt a legkisebb a küszöbpotenciál, ezért indul innen az akciós potenciál

Antigén (pl. Na-csatorna)

Nemspecifikus protein

Elsődleges antitest

Másodlagos antitest-enzim komplex

Az enzim szubsztrátja

Mikroszkópban láthatószínes reakciótermék

Immuncitokémia kísérleti elve: A kísérlet eredménye:

A Na-csatornák s űrűsége az idegsejtekenA Na-csatornák a Ranvier-féle befűződéseken is sűrűsödnek

Oligodendrocyta / Schwann-sejt

Myelin hüvely

Axon membránja

Ranvier-féle befűződés

21

Az akciós potenciál pontról pontra terjedése

Az akciós potenciál terjedési tulajdonságai:1. változatlan amplitúdóval és2. egy irányban terjed

Terjedési irány:1. ortodromikus2. antidromikus

Idő (ms)

Helyi Na-csatorna aktiváció

Szomszédos membránfolt depolarizációja

Szomszédos membránfolteléri a küszöbpotenciált

A repolarizált membránfoltabszolút refrakter stádiumba kerül

relatív refrakter periódusbanlévő membránfolt

Terjedési irány

Az akciós potenciál pontról pontra terjedéseAz akciós potenciál visszaterjed a szómába és a dendritekbeSzimultán háromelektródás whole cell patchclamp elvezetés egyetlen piramissejten:

1

2

3

1

2

3

A visszaterjedés sejttípustól függ

piramissejt

Purkinje sejt

22

Az akciós potenciál pontról pontra terjedéseAz akciós potenciál visszaterjed a szómába és a dendritekbe

Intracelluláris Ca2+ koncentráció követése kálcium koncentrációra érzékeny festékkel

(Oregon Green BAPTA) és digitális képalkotással:

Az akciós potenciál saltatoricus terjedése

Terjedés iránya

23

Az akciós potenciál saltatoricus terjedése

Rm, specifikus ellenállásRi, belső ellenállásRo, külső ellenállásRl, hosszanti (axiális) ellenállás Helyi áram Helyi áram

Helyi áramHelyi áram

A térállandó nagyobb a velőhüvelyes axonokban

Nor

mal

izál

tm

embr

ánpo

tenc

iál

Nor

mal

izál

tm

embr

ánpo

tenc

iál