32
301 (Photometry) .. !"#$ ก%&’ก() %*+,- ก!"#ก$ transmittance ".ก (absorbance) 34!" A %T ก ก84กก9" ก84กก:!;<4 #".ก ก=>#".ก ก".ก (atomic absorption spectrophotometry) ก"9#"=ก (atomic emission photometry) ก"ก (fluorescence photometry or fluorometry) " (nephelometry and turbidity) ก"9=ก$ (reflectometry) &.!/’0 กFGกH$ 1. 3K34ก!"#กLก; 2. 3ก:ก8 Beer & Lambart QRQก=; 3. 3!กก9:#R"T9#QRQ!ก; 4. 33=>#".ก; 5. 3W=="T9#KQก=LQR#"T;

ก (Photometry) · ˙ 9 # #˝ 9 #ˆ 1 ˝ˆ ก" 6 )*7% (wavelength)! " # 9 # QR ˝ L ˙ ! ˝ 9"กˆ 10-9 ˙ ˝กHก ก9 # QR ˚b f กHˇ49 #QR 9 # ˝ ˆ4 (lambda; λ) =: ˝ˆ

  • Upload
    others

  • View
    10

  • Download
    0

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: ก (Photometry) · ˙ 9 # #˝ 9 #ˆ 1 ˝ˆ ก" 6 )*7% (wavelength)! " # 9 # QR ˝ L ˙ ! ˝ 9"กˆ 10-9 ˙ ˝กHก ก9 # QR ˚b f กHˇ49 #QR 9 # ˝ ˆ4 (lambda; λ) =: ˝ˆ

ก������������ � 301 ��������ก�������

ก������� ������ (Photometry)

�.�. � �!"# $ ก���%&�'ก() %*+,-�

��� �������� ����������� ���ก��� ���!�"�����#�� �ก�����$� �� ���� transmittance ����"��.�ก���� � (absorbance) ���� �����34��!�"�� A ��� %T ก������������ ������ ก8���� �4ก��ก��9� ��"����������� ������ ก8���� �4ก��ก���:����!��������������;<�4 ���#������"��.�ก���� ��� ������ ก�����= �����>�����#������"��.�ก���� ��� ������ ก������"��.�ก���� ���������� �� (atomic absorption spectrophotometry) ก������"�������� �9�#��"� =�ก������� �� (atomic emission photometry) ก������"�ก������� ��� ������ (fluorescence photometry or fluorometry) ก����������"��� ������� (nephelometry and turbidity) ก������"�������� � �9���=�ก���$� (reflectometry) ���

�&.!/�'���0 ��กFGกH� ����$ 1. �3��� K����34�����ก��� ���!�"�����#�� �ก��L��ก�� ��;�� 2. �3��� ก���:�ก8�� Beer & Lambart ��QR�Q�ก�����=��� ��;�� 3. �3��� !��กก��9:���������#������������ �R����"��T9�#QR�Q�!����������ก��;�� 4. �3��� ��3����=���>�����#������"��.�ก���� ��� ������ ;�� 5. �3��� �W==� �"��T9�#��K�Q�ก�����=��� ��L� QR����#������"��T;��

Page 2: ก (Photometry) · ˙ 9 # #˝ 9 #ˆ 1 ˝ˆ ก" 6 )*7% (wavelength)! " # 9 # QR ˝ L ˙ ! ˝ 9"กˆ 10-9 ˙ ˝กHก ก9 # QR ˚b f กHˇ49 #QR 9 # ˝ ˆ4 (lambda; λ) =: ˝ˆ

��������ก������� 302 ก������������ �

�2��-�

ก8���� �4 (BeerXs law) ก������� � (fluorescence) �"��.�ก���� � (absorbance) �K"�ก���� � (filter) ���������� ���"!�Zก;[[\� (electromagnetic radiant energy) $������� (ground state) $���ก������ (excited state) ����� �93�_�"��.�ก���� � (absorptivity) � �9�#���!Z� (visible light)� ���ก����ก����� (stray light) ���ก��4� ก������ก���#�� ��� � (monochromator) ���ก��4���������� � (photodetector) transmittance, %trancemittance

�!3��4& �,�����)'5)���%

� � =���b���� ���"!�Zก;[[\� (electromagnetic radiant) <G#��b���������.����!�G#�9�#����� ��������� ���#� (wave) ���#��9�#��� �����Z� .����;�"=:��b�������F� ���ก����b� �#�Q�ก�����#��9�# ��กH��ก�����#��9�#����� �=��������ก�����#��9�#<�:�Tก�� �����9�F9�����#��9�#�b���� ����� �� �9��Q���� �����9�#���#��9�#��� 1 ��� �� ก�"� ����6���)*7% (wavelength) !�"� ������� �����#�9�#�� �QR���� ��L���� !���9"�ก�� 10-9 ��� ��กH�ก��ก9�#�� �QR��b� �f��กH�49�#QR��9����� �����#� ��� ����4�� (lambda; λ) =:�����������ก�����#��9�#�"�!�"� ��� 1 ����9� �� ก�"� ����.>7 (frequency) ��กH�ก��ก9�#QR��b� �f��กH�4�9�����$�#���#� ��� ��� (new; ν) !�"� �������$�# ��� =:��������"�����9� (s-1) !���h���<4 (Hertz; Hz)

����������Z� (velocity; c) Q�ก�����#��9�#����� ���"!�Zก;[[\�Q� .ff�ก�F���"�9"�ก��K��.������� �����#��������$�# (c = νλ) !��� 9"�ก�� 2.997x1010 !��������� 3x1010 <�./����9� $�����# �R��������ก�������������Z�=����# �����;� G��ก���"���R��!�ก! (refractive index) �����ก��� ��#���=�������� �����34��!�"������������Z� ���� �����#� �������$�# =����"� ��� �9�#���"�����$�# .�ก�"�=����"����� �����#���� ก�"� Q�9��ก��ก��$�����"�����$�#�#:�ก�"�=����"����� �����#���กก�"�

������������ � �� ก�"� CD&,% (photons) <G#�=����K��ก������$�# !��� ���� �����#�����T ���� �����34� ����� �ก��

E � �ν nnnn.. �ก��9�# 1

��� E ���

λ nnnn.. �ก��9�# 2

L� E = �f��กH�49�#QR��9����������L[��� � = ��� �"���9�#�������4 (PlanckXs constant) <G#����"�9"�ก�� 6.62x10-27 ���4ก-����9� (erg.sec)

Page 3: ก (Photometry) · ˙ 9 # #˝ 9 #ˆ 1 ˝ˆ ก" 6 )*7% (wavelength)! " # 9 # QR ˝ L ˙ ! ˝ 9"กˆ 10-9 ˙ ˝กHก ก9 # QR ˚b f กHˇ49 #QR 9 # ˝ ˆ4 (lambda; λ) =: ˝ˆ

ก������������ � 303 ��������ก�������

��#���=���� �ก��9�# 1 ��� �ก��9�# 2 =����"� ��� �9�#������$�# .�ก�"�!������� �����#����

ก�"�=������������กก�"� Q�9�������� ��� �9�#������$�#�#:�ก�"�!������� �����#���กก�"�=������������� ก�"� ��� ���"!�Zก;[[\����"����� �����#�ก����������ก <G#���"��R"������ �����#���R�#��� ก�"��ก������ ��Q������9�# 11.1 R"������ �����#�9�#�� ��:������ �ก�4QR�ก�����ก�����=������!49����� �����ก ��� ���#�R"�����9��;�L��� (ultraviolet) ���� �9�#���!Z� (visible light) � �9�#���!Z���R"������ �����#���!�"�� 390-780 ��L���� "�����#����9��;�L���9�#�� �QR�Q����������!49����������ก� ."��!�"�� 180-390 ��L���� � ����=�ก�����9�� 4���� � �"��=�ก!���;[9�#; �!����b�9�� ���b���� �K �9�#��!�� T�"����� �����#� <G#����H 4���!Z��b� ��� $����"�R"������ �����#���� �9�#���!Z���� �9�#$.ก�.�ก������ �9�# �9���Q!�!Z�=���"�;����������9�# 11.2 ������ 9�#�.�ก���� ����� �����#�R"�� 400-480 ��L���� ( ���:����) ;�������"� � ����� �����#���#�T �9�����ก�� <G#����H 4���!Z��b� �!���� �� ก� �9�#���!Z�����"� ��." ����� (complementary color) ��� �9�#$.ก�.�ก��� <G#�กZ��� ��� ������ $������:�� � ���Q!� "��9�# ������ 9�#�.�ก���� � �� � (505-555 ��L����) � �9�#K"����ก��;������ � �R��. $�� "��� � ���� (650-700 ��L����) ;�9�# ������ ���� � � ����=�K"�� ������ 9�#������� ���� ������ ����;�"�.�ก���� � ���� ��"�.�ก���� � �� �����:���� (495-505 ��L����) Q�9�������� $�� "��� � �� �;�9�# ������ ����=�;�"��� � �9�����ก�� ���� ������ =��.�ก���� ���#�;��!�� ก���� � ����

ก��9�#���H 4���!Z����$��b� ��"��T;������ ��������� � �9���=�ก���$���9�#�����H 4 <G#������Q�����������H 4��� ����"���� �R"������ �����#� 390-700 ��L���� 9:�Q!�!Z��b� ��"��T $����� � �9��������� �����#���ก=�กR"�����ก�"��กZ=����;�"!Z����$�����T

/G ก � 6��'-�H���)*7%���ก4�&.! ��#� ��<G#���==��b� ����� ;���� !���L��ก�� ��K� ก�����#�� �=���ก���.�ก����������

�����#�����;�� <G#�=�9:�Q!�ก��ก�����# ����� $��>����������� ������ ก�����# ����� $��>���������9�#ก��G����=;���ก"

1. �������s�����������Zก���� (electron) Q�L��ก�� �����"���กG�� ก�"����� ���# �=�ก $������� (ground state) �b� $���ก������ (excited state)

2. ก�� �#� �9��������3�L������4 (covalent bond) Q�L��ก�����# �����;� 3. ก��!��������3�L������4���# �����;� ก�����# ����� >��>����"��� "�����ก�"�� ����ก���������9�#=:������� �������9�#�.�ก���

;��=G��b��W==� :���f9�#=�ก:�!��R�����ก�����# ����� $��>��������� L� 9�#�;�ก�����# � $��>����������� ��=�ก $��������b� $������ ����ก����������.�ก�����กก�"�ก�� �#� �9��������3�L������4 ก��!��������3�L������4����ก������������ 9�# �� ก���.�ก���

Page 4: ก (Photometry) · ˙ 9 # #˝ 9 #ˆ 1 ˝ˆ ก" 6 )*7% (wavelength)! " # 9 # QR ˝ L ˙ ! ˝ 9"กˆ 10-9 ˙ ˝กHก ก9 # QR ˚b f กHˇ49 #QR 9 # ˝ ˆ4 (lambda; λ) =: ˝ˆ

��������ก������� 304 ก������������ �

�������=�ก���#����[���� (infrared) R"��Qก������ �9�#���!Z� =�9:�Q!�ก��ก�� �#� �9��������3�L������4Q�L��ก�� ก�����# � $��>�������� ��=�ก $��������b� $������ ��กก��=�กก���.�ก������#�� �9�#���!Z� ���9��;�L��������� ��Zก<4 ������������������3�L������4=�G��ก��3���R��������3�L������4Q�L��ก������T &����">7 11.1 �� ����#���"!�Zก;[[\� (electromagnetic spectrum)

JH������6���)*7% (λλλλ) J*7, �>6ก �-)H�5)���% >25 cm ���#���9 � (radio waves) ก��=�กก��!������ก�����Zก����

(electron-spin orientation) 0.4 u 25 cm ���#�;�L���[ !��� ����4

(microwaves or radar) ก��=�กก��!�����������Zก����Q�L��ก�� (molecular rotation)

25,000 u 4,000,000 nm � ����[����R"��;ก� (far infrared)

ก��=�กก�� �#� �9�����L��ก�� (molecular vibration)

2,500-25,000 nm � ����[���� (true infrared) 800 - 2,500 nm � ����[����R"��Qก�� (near

infrared) 400 - 800 nm � �9�#���!Z� (visible light) ก��=�กก�����# ����������

���Zก����9�#� ." ����ก �� (valence electron transition)

10 u 400 nm ������;�L��� (ultraviolet; UV)

0.1 - 10 nm ��� ��ก<4 (X-ray) ก��=�กก�����# �������������Zก����R���Q� (inner-shell electron transition)

< 0.1 nm ��� ��ก���!���;�L<L9�(gamma rays or isotopes)

ก��=�กก�����# ���������������� (nuclear transition)

(=�ก Frings C, Gauldie J. Spectral techniques. In: Kaplan LA, Pesce AJ, eds. Clinical chemistry: theory, analysis, and correlation. St. Louis: The CV Mosby Company, 1984: 53.)

Page 5: ก (Photometry) · ˙ 9 # #˝ 9 #ˆ 1 ˝ˆ ก" 6 )*7% (wavelength)! " # 9 # QR ˝ L ˙ ! ˝ 9"กˆ 10-9 ˙ ˝กHก ก9 # QR ˚b f กHˇ49 #QR 9 # ˝ ˆ4 (lambda; λ) =: ˝ˆ

ก������������ � 305 ��������ก�������

&����">7 11.2 ���� �9�#���!Z� (visible light) ��� ��." ����� ( ��� ������ )

����6���)*7%* (%�C% �&�)

�>�,����">7�,� -M% NO7�.(ก(ก)*%C6���)')�6

�>���)')�6 �*7,���">7�,� -M% �)*7,%">7�H�%

350-430 430-475 475-495 495-505 505-555 555-575 575-600 600-650 650-700

�"�� (violet) ��:���� (blue) ��:������� � (green blue) � �����:���� (blue green) � � (green) � ���!���� (yellow green) !���� (yellow) �� (orange) ��� (red)

��:������!���� (yellow blue) !���� (yellow) �� (orange) ��� (red) R��. (purple) �"�� (violet) ��:���� (blue) ��:������� � (green blue) � �����:���� (blue green)

!�� !�� *R"������ �����#�L� ������9�#���!Z��b� ���� ��>4 (column) 9�# ��

(=�ก Frings C, Gauldie J. Spectral techniques. In: Kaplan LA, Pesce AJ, eds. Clinical chemistry: theory, analysis, and correlation. St. Louis: The CV Mosby Company, 1984: 53.)

����9�#QR�ก������ ��Q!�ก��ก�����# � $��>����������� �� =G�G��ก��R�����3���9�#�b�

���4���ก��=:�������R��������3����9�#��Q�L��ก���� ������T <G#��b���� �����s�������� ����"��R��� ��������.����ก���.�ก������#��� ���"��T=G�;�"!����ก�� �����9�# 11.3 ;��� ������ �����#�9�# ���"��T�.�ก�������������9�#ก�# ���� ก��� �����9�� 4R��<��� (organic complex) <G#������3����������!�� �����3�;�=�$G�!�� ������3� �.����ก���.�ก����������#�=G��b�K���=�ก���3����9�#� ."Q�L��ก��

�.����ก���.�ก������#�� ��� �� ����$� ��;����� ก��[���� �����34��!�"���"�ก���.�ก���� �ก���"����� �����#� �� กก��[����"� absorption spectrum ������� "��� ��Q��.�9�# 1 ก��[���=�� �� >��>����������� ��9�#���# �����;���#� ��K� ก�����#�� ����� �����#��"��T ��ก��[9�# ก .�G��� ���"� ��;���.�ก����������=�ก��� ����� �����#�����;������9:�Q!����Zก����Q�L��ก�������������กG�� ก��[��������L R�4��กQ�ก����� �ก�4QR�Q�������=������!4������ �� ���QR�;����Q�ก���9�#�������9�#�.�ก����������9�#�#:�T R"� R"������������[����

Page 6: ก (Photometry) · ˙ 9 # #˝ 9 #ˆ 1 ˝ˆ ก" 6 )*7% (wavelength)! " # 9 # QR ˝ L ˙ ! ˝ 9"กˆ 10-9 ˙ ˝กHก ก9 # QR ˚b f กHˇ49 #QR 9 # ˝ ˆ4 (lambda; λ) =: ˝ˆ

��������ก������� 306 ก������������ �

&����">7 11.3 ���� �����#�9�#$.ก�.�ก���L� ���"��T

���(ก)*%���

-�(H">7 (ก)*%���

����6���)*7%">7(ก)*%�����ก�! (λλλλmax)

�)'5)�">7(ก)*% (εεεεmax)

λλλλmax1 εεεεmax1 λλλλmax2 εεεεmax2 λλλλmax3 εεεεmax3 Ether -O- 185 1,000

Thioether -S- 194 4,600 215 1,600 Amine -NH2 195 2,800

Thiol -SH 195 1,400

Disulfide -S-S- 194 5,500 255 400 Bromide -Br 208 300

Iodide -I 260 400

Nitrile -C≡N 160 -

Acetylide -C≡C- 175-180 6,000

Sulfone -SO2- 180 - Oxime -NOH 190 5,000

Azido >C=N- 190 5,000

Ethylene -C=C- 190 8,000

Ketone >C=O 195 1,000 270-285 18-30

Thioketone >C=S 205 Strong

Esters -COOR 205 50

Aldehyde -CHO 210 Strong 280-300 11-18 Carboxyl -COOH 200-210 50-70

Sulfoxide >C-O 210 1500

Nitro -NO2 210 Strong

Nitrite -ONO 220-230 1,000-2,000 300-400 10

Azo -N=N- 285-400 3-25

Notroso -N=O 302 100

Nitrate -ONO2 270 12

(shoulder)

-(C=C)2- (acyclic)

210-230 21,000

-(C=C)3- 260 35,000 -(C=C)4- 300 52,000

-(C=C)5- 330 118,000

-(C=C)2-

(alicyclic) 230-260 3,000-8,000

-C=C-C=C 219 6,500 -C=C-C=N 220 23,000

-C=C-C=O 210-250 10,000-20,000 300-350 Weak -C=C-NO2 229 9,500

Benzene 184 46,700 202 6,900 255 170

Diphenyl 246 20,000 Naphthalene 220 112,000 275 5,600 312 175

Anthracene 252 199,000 375 7,900 Pyridine 174 80,000 195 6,000 251 1,700

Quinoline 227 37,000 270 3,600 314 2,750 Isoquinoline 218 80,000 266 4,000 317 3,500

(=�ก Frings C, Gauldie J. Spectral techniques. In: Kaplan LA, Pesce AJ, eds. Clinical chemistry: theory, analysis, and correlation. St. Louis: The CV Mosby Company, 1984: 54.)

Page 7: ก (Photometry) · ˙ 9 # #˝ 9 #ˆ 1 ˝ˆ ก" 6 )*7% (wavelength)! " # 9 # QR ˝ L ˙ ! ˝ 9"กˆ 10-9 ˙ ˝กHก ก9 # QR ˚b f กHˇ49 #QR 9 # ˝ ˆ4 (lambda; λ) =: ˝ˆ

ก������������ � 307 ��������ก�������

�(/">7 11.1 Absorption spectrum ��h�L�Lก���� (oxyhemoglobin)

(=�ก Frings C, Gauldie J. Spectral techniques. In: Kaplan LA, Pesce AJ, eds. Clinical chemistry theory, analysis, and correlation. St Louis: The CV Mosby Company, 1984: 55.)

��!���L��ก�� ��!�� R���9�#�.�ก����������=�ก���#�� ����� =���"� �������9�#�.�ก���

��ก��Q��.����������������9��9� ��� �ก�� A° + hν A∗ A° + �������� .......... �ก��9�# 3

A° = L��ก�� ��Q� $������� ( $� ���กก�"�) A∗ = L��ก�� ��Q� $���ก������ (;�" $� �) hν = �������L[�������� ����� �����#� c /λ ��L���� �� ��!���L��ก�� �����R���9�#�.�ก����������=�ก>� ��ก���� =���"� �������9�#�.�ก���

��ก��Q��.���������������������� � ��� �ก�� A° + hν1 � A∗ � A∗∗ + �������� � A° + hν2 ........n �ก��9�# 4 A° + ���������#� R"� �������� � A∗ � A° + hν2 .......... �ก��9�# 5

A∗∗ = L��ก�� ��Q� $���ก������ (;�" $� �) ��"��������������9�#�#:�ก�"� A∗

Page 8: ก (Photometry) · ˙ 9 # #˝ 9 #ˆ 1 ˝ˆ ก" 6 )*7% (wavelength)! " # 9 # QR ˝ L ˙ ! ˝ 9"กˆ 10-9 ˙ ˝กHก ก9 # QR ˚b f กHˇ49 #QR 9 # ˝ ˆ4 (lambda; λ) =: ˝ˆ

��������ก������� 308 ก������������ �

��#�� �ก��9�ก��L��ก���� ��Q� ������=��.�ก����������=�ก� ������ �������

��ก��Q��.���������������� ��� �ก��9�# 3 !��� �����R�����=�� �������9�#�.�ก��� "��!�G#���ก��Q��.������������������� "��9�#!�����"� ��ก��Q��.��������� � ��� �ก��9�# 4 9���������� ���� $��������������<G#� $� � ��#��.�ก�������=�ก���#�� ���;�=�9:�Q!� $������������L��ก����#���กG��ก�"��ก�� <G#�9:�Q!�L��ก��;�" $� � !�����=�� ก�"�� ."Q� $���ก������ ������� "��ก������=�$.ก��"� ��ก����#�Q!�ก��� ." $������� �������9�#��"� ��ก��������=� ."Q��.����������������!����������� �

% 6���,� transmittance �)'�H�(ก)*%��� (absorbance)

$����"� ���#�� ����� �����#�!�G#�<G#������������������9"�ก�� IO K"�� ������ ���� "��!�G#� ���������������� �!���K"�� ������ ���� "��9"�ก�� IS ����.�9�# 11.2 ก IS "�����"���� ก�"� IO ����������� "��!�G#�$.กL��ก���� ������ �.�ก���;�� ����� "����!�"�� IS/IO �� ก�"� transmittance (T) ���QR��b���R��9�#��ก$G��������������9�#$.ก�.�ก���L� ������ ��"����� � "��!�G#���=$.ก�.�ก���!��� �9���=�กK����>�R��Q " ������ (������4; cuvette) (IR) �Wf!������=�ก�;L� ���ก���.�ก���� ��� ������ ������� (reference solution or blank solution) ����.�9�# 11.2 ��#��:���!�ก������������ �9�#$.ก�.�ก���!��� �9���=�กK����>�R��Q " ������ L� ������ ����������=���L��ก���� ���"��T!����ก�� ������ ���� "�� ก��� ;�"��L��ก�� ��9�#=����ก���.�ก���� � ���ก�����=�QR�������49�#������!���������ก����9"�ก�� 9:�=�ก�� ��R����� �ก�� !�����=QR�������4������ Q������������ ������ �������=�;�"�.�ก���� � ������� IO ��� IR =����"�9"�ก�� �"� T �� ������ �������=G�9"�ก�� IR/IO !��� 1.00 �"� T =���� ก�"� 1.00 �� =G��� �����b��"� %T �9� L� %T = 100 T ก������"�ก���.�ก���� ��� ������ �� ������"� %T ��������49�#Q " ������ ��������b� 100 %T ��������"� T �� ������ ���� "��9� �ก�� ������ �������=�9"�ก�� IS/IR

��#���=����=�ก�� ���� T !��� %T =�!Z��"��b�ก����� �� "������������ �9�#!���!���ก���.�ก����� ������ ��#�QR��b���R����ก�"�ก���.�ก���� � �"� %T ��� � ���"���ก���.�ก���� ���ก Q�9��ก���ก�� $���"� %T ��ก� ���"���ก���.�ก���� ���� ���� �����34�b����KกK��ก����!�"���"� %T ก��ก���.�ก���� � ��ก��9 �F� ��4=G�ก:�!���:���R����ก�:���� �H�(ก)*%��� (absorbance; A or optical density; OD) ��#�QR���ก�"�ก���.�ก���� � L� ก:�!��Q!�

A = log (IS/IR) = - log T = log (1/T) = log (100/%T) = log 100 u log %T = 2 u log %T !���

A = 2 ^ log %T .......... �ก��9�# 6

Page 9: ก (Photometry) · ˙ 9 # #˝ 9 #ˆ 1 ˝ˆ ก" 6 )*7% (wavelength)! " # 9 # QR ˝ L ˙ ! ˝ 9"กˆ 10-9 ˙ ˝กHก ก9 # QR ˚b f กHˇ49 #QR 9 # ˝ ˆ4 (lambda; λ) =: ˝ˆ

ก������������ � 309 ��������ก�������

ก. ������ ���� "�� . ������ �������

�(/">7 11.2 � ���������������� ���#����9��K"�� ������ b ����!������ ������ 9�#� ����9��K"��!�������ก������������4

������5%#0�'-�H�� A �)' %T ก4���� �����%�,����)')�6 =�กก��FGกH�Q��� �.F. 1760 ��� �.F. 1852 ;�����������=���9�#��ก��9 �F� ��4 ������b�ก8 2 ก89�#ก�# ����ก��ก���.�ก���� ��� ������ ���

1. กa�,��)� 4 �0& (Lambert's law) ก�"���"� .�� 5 7�����ก�����'6'"��">7��� %"���H�%���)')�6 �H�ก��(ก)*%���d'��ก�O+%&��,6H�� /e%��H�% ������ �"��.�ก���� �

�� ������ =����K���������ก������ ������ 9�#� �K"�� !��� A α b ��#� b ��� ����ก������ �9��9�#� ����9��K"�� ������

2. กa�,� 4>6�0 (Beer's law) ก�"���"� .�����)')�6�>���� �����%��ก�O+%�H�(ก)*%����,����d'��ก�O+%&�� /e%��H�%ก4���� �����%">7 5 7��O+% g%"��ก)4ก%.�����)')�6�>���� �����%))��H�ก��(ก)*%���d'))�,6H�� /e%��H�% JH%ก% ������ �"��.�ก���� �

�� ��=����K�����ก������������ ������ !��� A α C ��#� C ��� ���������� ������

��#����ก89��� ��ก8����� ก�� =�;��ก8���� �4���������4� (Beer and Lambert' law) ��� �H�ก��(ก)*%����,����)')�6d'�/��%&������ �����%�)'����ก�����'6'"��">7

|------| b

� �ก"��K"�����ก��� ������� � = IO

� �K"�����ก��� ������� � = IR

|------| b

� �ก"��K"�����ก��� ������� � = IO

� �K"�����ก��� ������� � = IS

Page 10: ก (Photometry) · ˙ 9 # #˝ 9 #ˆ 1 ˝ˆ ก" 6 )*7% (wavelength)! " # 9 # QR ˝ L ˙ ! ˝ 9"กˆ 10-9 ˙ ˝กHก ก9 # QR ˚b f กHˇ49 #QR 9 # ˝ ˆ4 (lambda; λ) =: ˝ˆ

��������ก������� 310 ก������������ �

��� %"���H�%���)')�6 !��� A α bC �W==������ ��� กก8���� �4���������4��"� กa�,� 4>6�0 $���������!�� ��ก8�b� �ก������F� ��4=�;��������

A = kbC

L� k �b��"���9�# $��ก:�!��Q!����������� ������ (C) ��!�"� �b� ก���/���� !��� g/L ����ก������ ������ 9�#� ����9��K"�� (b) ��!�"� �b� <�. =�QR� a �b� �f��กH�4�9��"���9�# k ����� �� a �"� �H���/�'� "# $ก��(ก)*%��� (absorptivity)

Q�ก���9�#!�"� ���������� ������ �b�L����4 !��� L��/���� (Molar or mol/L) =��� ก�"� ����� �93�_ก���.�ก���� �Q!�"�"� molar absorptivity ���QR� �f��กH�4�b���<���� (epsilon; ε) �9��"���9�# k

A = abC -�*, A = εεεεbc nnn.. �ก��9�# 7 �"� ����� �93�_ก���.�ก���� ��� ����� �b��"�s�������� �� R"� molar absorptivity ��

nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) 9�#���� �����#�� � 340 ��L���� 9"�ก�� 6.22x103 L⋅mol-1⋅cm-1 !�� �����"� $���:� ������ NADH �������� 1 L��/���� ;�����"�ก���.�ก���� �9�#���� �����#�� � 340 ��L���� =�;���"�ก���.�ก���� �9"�ก�� 6.22x103 ��ก=�ก����"� ����� �93�_ก���.�ก���� ��� �� ��QR����L R�4Q���#��FGกH�������� �93�_�� ��;�� ���� "��R"�

�������.��� (bilirubin) ��� �93�_ (���L��ก�� = 584) ��#����� Q����L�[��4� (chloroform) 9�#���!>.�� 25°<. =����"� ����� �93�_ก���.�ก���� �9"�ก�� 60,700+1,600 L⋅mol-1⋅cm-1 9�#���� �����#� 453 ��L���� $���:� �������.������� "�� 5 �ก. ���� Q����L�[��4����������������b� 1 ���� �����:�;����ก���.�ก���� �9�#���� �����#� 453 ��L���� 9�#���!>.�� 25°<. L� QR�������49�#������ก���� 1 <�. ;���"��.�ก���� �9"�ก�� 0.490 ����$�:����������� �93�_�������.������� "��;��������

$���b� �������.������ �93�_�������� 5 �ก./���� !��� 0.005 ก���/���� ���=�����"�ก���.�ก���� �;��9"�ก�� (60,700 L⋅mol-1⋅cm-1)(1 cm)(0.005/584 mol⋅L) = 0.520 ������� �������.������� "��=G���������� �93�_ 9"�ก�� 0.490/0.520 !��� 94%

=�ก �ก�� A = abC =����"� a ��� b �b��"���9�# $��� �ก��[���� �����34��!�"�� A (�ก� y) ��� C (�ก� x) =�;��ก��[ ����������=��������ก� y 9�#�"� 0 ����.�9�# 11.3 ก

�ก�� A = 2 - log %T = abC ����$� �Q!�"�b� log %T = -abC + 2 !���

Page 11: ก (Photometry) · ˙ 9 # #˝ 9 #ˆ 1 ˝ˆ ก" 6 )*7% (wavelength)! " # 9 # QR ˝ L ˙ ! ˝ 9"กˆ 10-9 ˙ ˝กHก ก9 # QR ˚b f กHˇ49 #QR 9 # ˝ ˆ4 (lambda; λ) =: ˝ˆ

ก������������ � 311 ��������ก�������

log %T = -abC + log 100%T $��� �ก��[���� �����34��!�"�� log %T (�ก� y) ��� C (�ก� x) =�;��ก��[ ����������=��������ก� y 9�#�"� 100%T ����.�9�# 11.3

�ก�� log %T = -abC + 2 ����$� �Q!�"�b� %T = 10(-abC + 2) $��� �ก��[���� �����34��!�"�� %T (�ก� y) ��� C (�ก� x) =�;��ก��[ ��L������ ����.�9�# 11.3 �

กa�,� 4>6�0ก4ก�� ">64�H����� �����%�,����)')�6 ก8���� �4�����L R�4Q�ก��9� �!����������� �� L� QR����#�����ก���.�ก���� ��� ������ (spectrophotometer or photometer) ����"��.�ก���� ��� �� �����:����:����!����������� �� &�,6H�� 1 ����"��.�ก���� ��� ������ NADH 9�#���� �����#� 340 ��L���� L� QR�������4 ก���� 1 <�. ;���"�9"�ก�� 0.350 ����$�:�������������� NADH =�;��������

d�กกa�,� 4>6�0 A = abC

0.350 = 6.22x103 L⋅⋅⋅⋅mol-1⋅cm-1 x 1 cm x C C = 5.6x10-5 mol/L

���������� NADH = 5.6x10-5 L��/����

ก���:����!���������������� "�� 1 =:��b�����9����"� ����� �93�_ก���.�ก���� ��� �� ����"�9�#�:����;��=�$.ก����กZ�"���#� ������ 9�#��������b� ������ 9�#;�"�� ����#���ก��ก�����=��� ���������49�#Q " ������ �������������ก����$.ก������� Q�9�����������ก=�����"�ก���.�ก���� ��� ������ "��9� �ก�� ������ 9�#9����"��������� �� ก ������ 9�#9� �!��"�������������"� ���)')�6��&�k�% (standard solution) !��������) 4�0 &,�0 (calibrator solution) ก������"�ก���.�ก���� ��� ������ "����� ������ �����������QR�!���������49�#������ก������!���9"�ก�����9:�=�ก�� ��� "���� �ก�� R"� 9:�=�ก�ก��!������ ��กR����� �ก�� ���������"�ก���.�ก���� ��� ������ �������;�� 9"�ก�� Astd ����� ������ "��;�� Aunk $������������ ������ �������9"�ก�� Cstd =��:����!����������� ������ "�� (Cunk) ;��������

Page 12: ก (Photometry) · ˙ 9 # #˝ 9 #ˆ 1 ˝ˆ ก" 6 )*7% (wavelength)! " # 9 # QR ˝ L ˙ ! ˝ 9"กˆ 10-9 ˙ ˝กHก ก9 # QR ˚b f กHˇ49 #QR 9 # ˝ ˆ4 (lambda; λ) =: ˝ˆ

��������ก������� 312 ก������������ �

�(/">7 11.3 � ��ก��[���� �����34 ก. �"��.�ก���� � (A) . log %T ��� �. %T ก������������

������ =�กก8���� �4 A = abC

�"��.�ก���� ���!��� ��������� Astd = abCstd .......... �ก��9�# 8 �"��.�ก���� ���!��� ������ "�� Aunk = abCunk .......... �ก��9�# 9

��#��:� �ก��9�# 8 !����� �ก��9�# 9 ������� �ก��Q!�"=�;�� .��9�#QR�Q�ก���:����!��"����������� ��������

C�� ���

���� C��� ......n �ก��9�# 10

&�,6H�� 2 ������ ������� NADH �������� 5.0x10-5 L��/���� ����"� A ;�� 0.23 $�� ������ "������"��.�ก���� �;��9"�ก�� 0.30 =����������� NADH Q� ������ "��9"�Q� �9��"��"��T��� .���:������� �ก��9�# 10 =�;��������

C�� ���.���

�.��� �5.0 � 10��� = 6.52x10-5 L��/����

Page 13: ก (Photometry) · ˙ 9 # #˝ 9 #ˆ 1 ˝ˆ ก" 6 )*7% (wavelength)! " # 9 # QR ˝ L ˙ ! ˝ 9"กˆ 10-9 ˙ ˝กHก ก9 # QR ˚b f กHˇ49 #QR 9 # ˝ ˆ4 (lambda; λ) =: ˝ˆ

ก������������ � 313 ��������ก�������

�"��.�ก���� ��� ������ "����=�:���9� �!��"���������=�กก��[� ���"��.�ก���� ��� ������ ��������"��"��T ���� ��Q��.�9�# 11.3 � ก��[����� ก�"� ก��D��&�k�% (standard curve or calibration curve) Q�ก�� ����ก��[���������� ����$9:�;��L� �:� ������ �������9�#9����"�����������9:����ก��� �������=��� �������"��.�ก���� �R"��� �ก�� ������ "�� �:��"��.�ก���� �����"������������ �=������ �����34Q�ก����Hก��[ L� Q!��"��.�ก���� �� ."���ก� x ����"���������� ."���ก� y ��ก �����K"��=���"��TL� Q!�=����#����9�#=����ก�� 0, 0 Q�R��9�H8� �����9�#��ก=�K"��=��9�ก=�� ���� �ก������ �����34��!�"���"��.�ก���� �ก�����������b� �ก�� �����9�#��=��������ก� y 9�#�"� 0 (A = abC, a ��� b ���"���9�#Q�����ก�����) ��"Q�9��������� ��������� �����34���=���ก;��$G����������"�!�G#�9"����� 9�����������"��.�ก���� ��� ��;�"�b�;����ก8���� �4Q�9�กก��� ���� ก��� ������

1. ���)')�6�>���� �����%��ก ก %l/ ����$��������������กก��=�L��ก���� �� "��!�G#�9�#;�" ��K� ก��� � ��������"�ก���.�ก���� �=�;�" �9���������L��ก���� ��9�#��Q� ������

2. �)*7%���">7gJ�g%�'44ก����>�)*7%�������6���)*7%,*7%/% ;�"QR"� ����� �����#��� � (monochromatic light) L��ก�� ���.�ก������#�� ��"��T;��;�"9"�ก��������ก��4���������� �;�" ����$� ก���#�� �R����"��T;�� �������9�#����������กT�"��.�ก���� �=G�;�" �����34ก���"���������

3. �'44ก������� �������,� ��*7,�&�,�l�H�>���%,ก�'44ก��&��d� (stray light) ;���ก��ก�����=����"��.�ก���� � ����$����� ���ก����ก�����;�$G����ก��4���������� � �"��.�ก���� �9�#���;��=���� ก�"������b�=��� �"��.�ก���� �=G�;�" �����34ก���"���������

Q����#�� �กL9�L[L������4 (spectrophotometer) =���R"�� :�!���Q "������4 <G#���������K.�QR���"� Q!�� �>� ��กK"����;�Q�R"��Q "������4 ��#�;�$G�������� �=G�9:�Q!�ก������"��.�ก���� �K������;�� ��K.�FGกH����� ��Q!�!Z��"� $�����#�� �กL9�L[L������4��� ���ก����ก�����=�����ก����ก =�9:�Q!����� �����34��!�"���"�ก���.�ก���� �ก�����������b� �������� �� ���� ��Q��.�9�# 11.4

4. g%ก�3>">7&�"2�)')�6-�*,C� )ก!),*7%mg%���)')�6�����.�4ก�%ก��(ก)*%����,�C� )ก!)���">7&�,�ก��� !�����L��ก��9�#�b� ������� �� ."Q� ������ 9�#���=��� =�9:�Q!��"��.�ก���� �;�" �����34ก���"���������

ก���9�#ก��[ ��������� �����34��!�"���"��.�ก���� �ก������������ก;��$G���������Q� �� ก�"��������������"� �H����� /e% ��%&�� (linearity) �,�ก��D��&�k�%

Page 14: ก (Photometry) · ˙ 9 # #˝ 9 #ˆ 1 ˝ˆ ก" 6 )*7% (wavelength)! " # 9 # QR ˝ L ˙ ! ˝ 9"กˆ 10-9 ˙ ˝กHก ก9 # QR ˚b f กHˇ49 #QR 9 # ˝ ˆ4 (lambda; λ) =: ˝ˆ

��������ก������� 314 ก������������ �

�(/">7 11.4 � ��K���� ���ก����ก�����=����"����� �����34��!�"�� �"��.�ก���� �ก���"����������� �� ก�� ����ก��[�������=�9:�Q!�9�����=:�ก���"����� �����34��!�"���"�ก���.�ก���� �ก��

���������b���� �����$G�9"�Q� L� 9�#�;���ก=�QR�R"��9�#�"����� �����34�b� �������QR��:����9� �!��"� ������ "�� ���� .��9�#QR�Q�ก���:����!����������b�ก���:��������������� �ก�� ����� <G#� ��������� �����34�b���� �����Q�9�ก�"��������� ��"�����b�=������� �����34;�";���b� �����Q�9�ก�����������9�#;������$G�����

Q�ก���9�#�"�ก���.�ก���� �;�" �����34����b� �����ก���"��������� =:��b�����9� �!��"���������=�กก��[�������9"����� ���ก��[�������9�# ����กZ;�"�b� �������� ���.�9�#���� �;��Q�ก��� �ก��[������� :�!���9� ��"�!���������� ��������� "��Q��.�9�# 11.5 �����������

1. �ก� x ��� �"��.�ก���� � 2. �ก� y ��� �"����������� �� ���������� �"��b����������� ��Q� �����!�"�

����������;� 3. =������ �����349�#���;��=�กก�����=����"��.�ก���� � 4. �����9�#��#���ก=�ก=�� 0, 0 Q!�K"��=���"��T �����กQ!� ��� ��9�#�"������b� �������

ก��[������� Q�ก���9�#;�";��QR� ������ �������!��� blank ����F.� 4 =����=;�";����#����9�# 0, 0 กZ;�� 5. R�#�ก��[�������������9�#9:�ก��[������� 6. Q�ก���QR���:� � :��Z=�.�!�����:� �9�#9����� ����ก�� �#�����>�� ����������!���� �

����:� �R��������� ����$����:� � �#�����>������ ���9:�ก��[�������Q!�"

Page 15: ก (Photometry) · ˙ 9 # #˝ 9 #ˆ 1 ˝ˆ ก" 6 )*7% (wavelength)! " # 9 # QR ˝ L ˙ ! ˝ 9"กˆ 10-9 ˙ ˝กHก ก9 # QR ˚b f กHˇ49 #QR 9 # ˝ ˆ4 (lambda; λ) =: ˝ˆ

ก������������ � 315 ��������ก�������

กa�,� 4>6�0ก4ก���2�%�3-��,�& � &>�,� ,%lN�0 Q��W==���� !�"� �ก� (international unit) 9�#QR������������;<�4!����������������;<�4(enzyme activity) ��� IU !��� U <G#�;��ก:�!�������������;<�4 1 IU !��� 1 U Q!�!�� $G� /� ��3 ,%lN�0">7�����.6H,6�)�6���&+�&�%l� 1 l�C��C�) g% �)� 1 %�"> p�6g&��p��'">7ก2�-%

���������;<�4 1 U/L =�!�� $G����� "��������� 1 ���� ����;<�49�# ����$ "� �� ���������;�� 1 ;�L��L�� Q���� 1 ��9� >� Q�� >���9�#ก:�!�� ก�����=�����������;<�4Q�9����������ก��F� ก��9:����ก��� ����9�#=:���� �������ก�����# ������"��.�ก���� ��� ���������9�#����!��� ��K����349�#��#�G���"��� ������9�#!�G#� �����:����:�����b��������������;<�4 ���� "��R"� ก�������������;<�4���9���;hL��=�� (lactate dehydrogenase; LD) ��F� ���ก��� ����������

L-lactate + NAD+ Pyruvate + NADH

�������ก�����# ������"��.�ก���� ��� ��K����34 (��� NADH) 9�#���� �����#� 340

��L���� �"��.�ก���� �9�#���# �����>� Q����9�#ก:�!�� ����$�:����:����!�������;�� L� QR�ก8���� �4 ���� "��R"� ���;�� ∆A/��9� =�ก �ก������ �4 =�;�� ∆A = εbC

������� C (mol/min⋅L) = ( ������ Q�!������=���) ก���9�#������������ ������ Q�!������=��� 9"�ก�� TV (total volume) ��. ���������� ������ "��9�#QR����=������!4 9"�ก�� SV (sample volume) ��. ��#��:����Q!��b������� NADH �"�������� ������ "�� 1 ����=�;��������

C (mol/min⋅L) = ( ������ "��Q�!������=���)

���# �!�"� ���������=�ก L�� �b� ;�L��L�� L� �.���� 106 =�;��������

C (µmol/min⋅L) = ( ������ "��Q�!������=���)

LDH

A (/min)

SV (mL) ε (L·mol-1·cm-1) b (cm)

TV (mL) x ∆ A(/min) x 106

(L·mol-1⋅cm-1) b (cm)

TV (mL) X ∆A (/min )

SV (mL) ε (L⋅mol-1⋅cm-1) b (cm)

Page 16: ก (Photometry) · ˙ 9 # #˝ 9 #ˆ 1 ˝ˆ ก" 6 )*7% (wavelength)! " # 9 # QR ˝ L ˙ ! ˝ 9"กˆ 10-9 ˙ ˝กHก ก9 # QR ˚b f กHˇ49 #QR 9 # ˝ ˆ4 (lambda; λ) =: ˝ˆ

��������ก������� 316 ก������������ �

�(/">7 11.5 ���� "��ก��[�������������.��"��T9�#���� �;����ก��[������� ������ �� NADH 9�#�:����;����!�"� �b� µmol/min⋅L !�� $G� ������ NADH 9�#ก��G��Q�!�"� ;�L��L���"���� 1 ��9� L� ก��9:������;<�49�#��Q����� "�� 1 ���� <G#�กZ����� ����!�"� �����;<�4 ������� Q�ก���:����!���������;<�4=G�QR� .��������

�������������;<�4 (IU/L) = ∆�!"�#�$

%�&"�'

��#� ∆A = �"�ก�����# ������"��.�ก���� ��"��� ���� 1 ��9� TV = �"������������� ������ Q�!������=��� ��!�"� �b� ��. SV = �"�������� ������ "��9�#QR�9:����ก��� ����=��� ��!�"� �b� ��. b = �"�����ก������������49�#QR�Q " ������ ���=��� ��!�"� �b� <�. ε = �"� ����� �93�_ก���.�ก���� ���K����34!��� ���������9�#���ก���.�ก���� �

!�"� �b� L⋅mol-1⋅cm-1

0.000

0.100

0.200

0.300

0.400

0.500

0.600

0.700

0.800

0.900

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

ยูเรียไนโตรเจน (มก./ดล.)

ก��[������� :�!���ก�����=��� .�� ;�L��=� (urea nitrogen)��� ��3� diacetyl monoxime reaction (15 ��. . 2545)

������

ก��

�� ���

����

����

�� 52

0 �

���

��

Page 17: ก (Photometry) · ˙ 9 # #˝ 9 #ˆ 1 ˝ˆ ก" 6 )*7% (wavelength)! " # 9 # QR ˝ L ˙ ! ˝ 9"กˆ 10-9 ˙ ˝กHก ก9 # QR ˚b f กHˇ49 #QR 9 # ˝ ˆ4 (lambda; λ) =: ˝ˆ

ก������������ � 317 ��������ก�������

&�,6H�� 3

Q�ก������������������;<�4 LD L� ���ก�����# ������"��.�ก���� ��� NADH <G#��b�K����34�����ก��� ����=��� ;���"�9"�ก�� 0.010 A/��9� ��3�ก�����=���QR� ������ "��������� 0.1 ��. QR���:� ����=������!4������� 3.0 ��. ������49�#Q " ������ ���=����"��.�ก���� �������ก���� 1.0 <�. �"� ����� �93�_ก���.�ก���� ��� NADH 9"�ก�� 6.22x103 L⋅mol-1⋅cm-1 =��:����!� �������������;<�4Q� ������ "�� �9��"��"��T Q� .�� =�;��������

�������������;<�4 (U/L) =

= 50 U/L ��*7,���H�(ก)*%����,����)')�6 ���4���ก���"��T�����#������"��.�ก���� ��� ������ � ������.�9�# 11.6 ���4���ก��!��ก=��� 5 ���4���ก��������

ก � � = s R

�(/">7 11.6 � �����4���ก�������#������"��.�ก���� � ก. �!�"��������� � . R"��Q!�� ��� �. ���ก��4� ก������ก���#�� � �. R"��Q!�� ���ก =. ������4���R"��Q "������4 s. ���ก��4���������� � R. ���ก��4� ��K�

1. �-)H�5)���%��� (Source of radiant energy) 9:�!���9�#Q!��������� ����� �����#�

�"��T ���� "��R"� !���9�� �� (tungsten-filament lamp) !����hL�=� (halogen lamp or tungsten halide filament lamp) !���;hL��=��� R��4� (hydrogen discharge lamp) !��� ���9��� ��� R��4� (deuterium discharge lamps) ���!���;�������� (mercury-vapor lamp) �b����

!���9�� ���b�!���;[[\�9�#; �!���9:���� ���9�� �� ���Zก >� Q�!���;�"���=��ก� Q�T;�� !������=�Q!��������� �R"�����#� 360-950 ��L���� $�����=��ก� ;�L����!����ก� ��3���!�."h;��4 (halides) Q�!���=�ก�� �b�!����hL�=� <G#�=�Q!��������� �9�#��ก�"�!���9�� �� ���Q!�� ����� �����#�R"��Qก��ก��� ����9��;�L�����ก����� !���;hL��=��� R��4����!������9��� ��� R��4�=�Q!��������� �R"�����9��;�L��� (220-360 ��L����) ��"!���

(3.0+0.1) x (0.010) x 106

(0.1) x (6.22x103) x (1.0)

Page 18: ก (Photometry) · ˙ 9 # #˝ 9 #ˆ 1 ˝ˆ ก" 6 )*7% (wavelength)! " # 9 # QR ˝ L ˙ ! ˝ 9"กˆ 10-9 ˙ ˝กHก ก9 # QR ˚b f กHˇ49 #QR 9 # ˝ ˆ4 (lambda; λ) =: ˝ˆ

��������ก������� 318 ก������������ �

���9��� ��� R��4�=�Q!�������� ���กก�"� !���;��������=�Q!������ �9�#���� �����#� 313, 365, 405, 436 ��� 546 ��L���� !�������� ��:���QR�Q�ก�����= ������$.ก���������ก��4� ก������ก���#�� ������#������"��.�ก���� � ���QR�ก�����#������"��.�ก���� ���R��� ก ����� 9���� high-performance liquid chromatography (HPLC)

2. ,!/ก�30�6ก�)' )*,ก�)*7%��� (Wavelength selector) 9:�!���9�#������ก� �9�#����

9��R"��� ��� (entrance slit) Q!�;��� �9�#������ �����#�9�#����ก�� K"����ก��9��R"��� ���ก (exit slit) ���� "��R"� �K"�ก���� � (filter) �������L�������4 (monochromator) �K"�ก���� �=� ��Q!�s���� ����� �����#�!�G#�K"����ก9��R"��� ���ก����.�ก���� ����� �����#���#�T;�� "������L�������4=�� ก� ������ก�b�R"������ �����#��"��T��� ���<G� (prism) !���ก����� (grating) ����������กQ!�� ����� �����#�9�#����ก��K"����ก9��R"��� ���ก ���#������"��.�ก���� �9�#QR��K"�ก���� ��b����� ก������ก���#�� � =��� ก�"�L[L������4 $��QR�����L�������4=��� ก�"� �กL9�L[L������4

3. � � �&&0�)'JH,�g�H� � �&&0 (Cuvette and cuvette holder) ������4!���<��4 ���

>�R��9�#QR����=� ������ 9�#=�����"��.�ก���� � ���ก:�!������!���� ������ 9�#Q!�� ����9��K"�� ��=���.�9��ก����กก������ ����!�G#������� ��ก���������#����=� ������ !���9:��b��.�9�� �#!��# � K�������9�#=�Q!�� ����9��K"��=�9:�Q!��� ������� <G#�=�QR�����ก��������������b����ก:�!������!���� ������ ����� ก�"� ����ก�����,�� � �&&0 (cuvette path length) "��Q!f"=�9:�Q!�������ก���� 1 <�. ��"กZ������ก���������#�T;�� ������49�#9:�=�ก�ก��=�QR����ก���.�ก���� �R"������ �����#� 320-950 ��L���� ก���9�#����ก�����ก���.�ก���� �Q�R"������ �����#���� ก�"� 320 ��L���� =�����QR�������49�#9:���� ���9<4 (quartz) !���<���ก� (silica)

4. ,!/ก�30����� ������ (Photodetector) 9:�!���9�#���# ��������������� ��b�

ก��� ;[[\� <G#�������ก��� ;[[\�9�#ก��=�ก���ก��4���������� �$.กQR��b���R����ก���������������� �9�#�กก��9� L� $.ก�\����Q���=�;[[\���#����# ��b��"��.�ก���� �!��� %T 9�#���ก��4� ��K�

J% �,�,!/ก�30����� ������">7%2���gJ�ก4 ��*7,���H�(ก)*%��� ;���ก" 4.1 Barrier layer cell -�*, photovoltaic cell ���4���ก��>� Q������ก��4���� �����

�.�9�# 11.7 ก ���ก����� �K"�L�!�9�����!���!�Zก9�#��R����� ��กG#�����:�;[[\� R"� ������ ��ก;<�4(cuprous oxide) !���<����� � (selenium) ���9�� ." ������K"�L�!����T���9���กR��� R"� L�!���� � � ����$K"���K"�L�!����T���;�� �K"�L�!�9�����!���!�Zก9:�!���9�#�b�

Page 19: ก (Photometry) · ˙ 9 # #˝ 9 #ˆ 1 ˝ˆ ก" 6 )*7% (wavelength)! " # 9 # QR ˝ L ˙ ! ˝ 9"กˆ 10-9 ˙ ˝กHก ก9 # QR ˚b f กHˇ49 #QR 9 # ˝ ˆ4 (lambda; λ) =: ˝ˆ

ก������������ � 319 ��������ก�������

���;[[\���ก (cathode) "���K"�L�!����T9:�!���9�#�b����;[[\��� (anode) ��#���� �K"���K"�L�!������;�ก��9�ก�� ��กG#�����:� =�9:�Q!�ก��ก��;!������Zก����>� Q� ��กG#�����:���9�#�K"�L�!������ =G�ก�������"��F�ก 4;[[\��������ก����� $���:����#�����ก��� ;[[\� (ampmeter) ���"�9�#�����ก����� =� ����$���������ก��;!������Zก����Q� ��กG#�����:�;�� ������ก��� ;[[\�9�#ก�����=����K��������������������� �9�#��ก��9� ���ก��4���������� �R������;��"�� ����� �����#�R"�����9��;�L���$G����� �����#������� 1,000 ��L���� ����� ;�"��� ��������9��� ;�"����ก���������;[[\�Q�ก��9:���� ������ก��� ;[[\�9�#ก��G�����K��������������������� � =����� �����ก��4���� �R��������� $��� ��กก��9��b�������T������ก��� ;[[\�9�#ก��=�;�"���K��ก������������������ � <G#��b�K�=�ก������������ก��4 (fatigue effect) ���ก��4R������=����������� �;����Q�R"������"��K������� 30 ����9�

4.2 Photomultiplier tubes !�����=�� ก�"� !������Zก���� !������ ����$ � �ff��;[[\�;����ก >� Q�!������ก����� ���;[[\�=:����!�� ������� ��Q��.�9�# 11.7 ���;[[\�!�"����9:�=�ก�K"�L�!�9�#;��"�� ���ก ��#�� �ก��9�K�������;[[\���ก L�!�=��.�ก�������� �������"� ���Zก������ก��Q� �� "������������������� �9�#��ก��9� ���Zก����9�#$.ก��"� =�ก���;[[\���ก=���#�;�ก��9�K�������;[[\����$����<G#�9:�=�กL�!�;��"�� �R"�ก�� กZ=�ก��ก���.�ก���������������"� ���Zก���������#�;�R�K�������;[[\�����"�����!��� ก����"� ���Zก����=�ก���;[[\���"�������=���กG�������� 4-6 9"� �������!������Zก�������=G� ����$ � �ff��;[[\�;����กG���b�9���.����=:�������;[[\�9�#��>� Q�!��� R�����L�!�9�#QR�9:����;[[\��b��W==� ก:�!���"�!������Zก����=���� ����"�� ����� �����#�Q� ��#���=����ก��9:�!���9�#�����;[[\�>� Q�!��� ��=��"�;�� 3 R��� ��� �b������ก �b������ ����b�9��������ก��������Q������ �ก�� �� ก�"� ;�L�� (dynodes) ก��9:������!������Zก����=:��b�����Q!��������;[[\��ก"���;[[\��"��T ��#�Q!���ก��� ;[[\���������� ;!������=� � ก"��=G�QR����������� �;�� �� กก��� ;[[\���������� 9�#;!�Q!������=�����"� ก��� ��� (dark current) �W==����!������Zก���������;�L����ก$G� 15 ��� !������Zก����QR����=���������� �;������ก ���;��"�� ���������� T;����

5. ,!/ก�30����) (Readout device) 9:�!���9�#��� �ff��;[[\�=�ก���ก��4���=���������� ��������b��"��.�ก���� �!��� %T ���� ��K� ก��� ��K������#������"��.�ก���� ���"���กT=��b���� ก����"��.�ก���� ���� %T ���R���"���=�b�Z�R��!����.��� �9���=�กก��=ก Q��W==���� �ff��;��$.ก�����b� �ff����=�������� ��K��b������"��.�ก���� ��!��� %T ��ก=�ก���;����� �ก�49�L�L� ����������4��R"� Q�ก��������K� �ff��;[[\�9�# "���=�ก

Page 20: ก (Photometry) · ˙ 9 # #˝ 9 #ˆ 1 ˝ˆ ก" 6 )*7% (wavelength)! " # 9 # QR ˝ L ˙ ! ˝ 9"กˆ 10-9 ˙ ˝กHก ก9 # QR ˚b f กHˇ49 #QR 9 # ˝ ˆ4 (lambda; λ) =: ˝ˆ

��������ก������� 320 ก������������ �

���ก��4���=���������� � =G�9:�Q!����#������"��.�ก���� �QR��"� G���������� �93�>��Q�ก��������K����.���กG��

�(/">7 11.7 K��� �����4���ก��>� Q������ก��4���������� �

ก. Barrier layer cell . Photomultiplier tube (=�ก Hicks R. Spectrophotometry. In: Hick R, Schenken JR, Steinrauf MA, eds. Laboratory instrumentation. 2nd ed. Philadelphia: Harper & Row Publishers, 1980: 29.)

��#���=����=�ก���4���ก��!��ก�����#������"��.�ก���� �����=����"�����;������#��

=�G��ก����� �93�>�������4���ก��!��ก 3 ���4���ก����� �!�"��������� � ���ก��4� ก������ก���#�� � ������ก��4���������� � 9����������ก��9:���������4���ก��9��� ��ก�# ����ก���"����� �����#�9�#QR�����"��.�ก���� �

�W==�������ก��� ����=������!4 ��9����������ก "��Q!f"�b����ก��� �9�#����;<�4�b�����"� ���������� ����������#������"��.�ก���� �9�#!��� ��:���QR�ก�����9��������������ก� ����������9�# 11.4

ก��&��d�,4�!3p�5 ��*7,���H�(ก)*%����,����)')�6

ก��&��d�,4�!3p�5 ��*7,���H�(ก)*%������&��d�,4g% �*7,�&H��m ������ 1. ����.(ก&�,��,�����6���)*7%��� (Wavelength accuracy) !�� $G� �������ก��

���"����� �����#�� �9�#K"����ก=�ก���ก��4� ก������ก���#�� �ก���"����� �����#�� �9�#� ����!����W����#�� ��3����= ������$.ก����9�#;����� �93�>��=����# �!����������� �9�#Q!����#�� ���� ����# � (line spectrum) R"� !���;��������<G#�Q!������ �9�#���� �����#� 313, 365, 405,

Page 21: ก (Photometry) · ˙ 9 # #˝ 9 #ˆ 1 ˝ˆ ก" 6 )*7% (wavelength)! " # 9 # QR ˝ L ˙ ! ˝ 9"กˆ 10-9 ˙ ˝กHก ก9 # QR ˚b f กHˇ49 #QR 9 # ˝ ˆ4 (lambda; λ) =: ˝ˆ

ก������������ � 321 ��������ก�������

436 ��� 546 ��L���� !���!���;hL��=��� R��4����!������9��� ��� R��4�<G#� ����$Q!����#�� ���� ����# �9�#���� �����#� 486 ��� 656 ��L���� ��#����# �!�������Q!������"����� ��

&����">7 11.4 � ��R"������K������!���R"��9:����9�# ����� :�!������#������"��.�ก���� �9�#QR�ก��������=�����;<�4

�!3��4& ก��gJ���% ����� 5)� Carry-over sample to sample Temperature accuracy Equilibration time Sample handing Accuracy Precision Size Reagent handing Mixing time Photometric performance (at a rate of 0.01 A/min) Initial absorbance 0-1 A Initial absorbance 1-2 A Wavelength accuracy Bandwidth Wavelength range Absorbance range Linearity Cell path/placement Absorbance drift (10 to 60 min) Absorbance accuracy Absorbance reproducibility Low 0-1 A High 1-2 A

<0.3% +0.1°C 20 sec

1%

0.5% 50 µL or less

<10 sec

<3% <5%

+2 nm <8 nm

Variable 0-2.0 A <2%

<0.6% <2% <2%

+2% +4%

(=�ก Frings C, Gauldie J. Spectral techniques. In: Kaplan LA, Pesce AJ, eds. Clinical chemistry: theory, analysis, and correlation. St. Louis: The CV Mosby Company, 1984: 60.)

Page 22: ก (Photometry) · ˙ 9 # #˝ 9 #ˆ 1 ˝ˆ ก" 6 )*7% (wavelength)! " # 9 # QR ˝ L ˙ ! ˝ 9"กˆ 10-9 ˙ ˝กHก ก9 # QR ˚b f กHˇ49 #QR 9 # ˝ ˆ4 (lambda; λ) =: ˝ˆ

��������ก������� 322 ก������������ �

���#�QR�������ก���"����� �����#�� ���!��� $�����ก��4� ก������ก���#�� �9:����K���ก�� =�;�"��� ����� �����#����ก�"��K"����ก��=�ก����� ก������ก���#�� � ��ก��3�!�G#� :�!���ก�����= �� ��=QR��K"�ก��=กก���� �9�#�������� ����� <G#�9����"����� �����#�� �9�# �������.�ก���;���� R"� Lh��� ���ก;<�4 (holmium oxide) <G#��.�ก���� ����� �����#� 241, 279, 287, 333, 361, 418, 453, 536 ��� 636 ��L���� !��� ;����� � (didymium) <G#��.�ก���� ����� �����#� 573, 585, 685, 741 ��� 803 ��L���� ��ก=�ก�����=QR� ������ 9�#L��ก�������$.ก���� ����������������9����"����� �����#�� �9�# �������.�ก���;���� :�!������= �� R"�

L��� <� �;�L���� (potassium dichromate) 4.0 �ก.% Q� 0.05 N L��� <� �;h���ก;<�4 (potassium hydroxide; KOH) ������ ����.�ก���� �;����9�#���� �����#� 374+4 ��L����

L�����4���;��4 (cobalt chloride) 4.4 ก���% Q� 1% ก��;hL�������ก (hydrochloric acid; HCl) ������ ����.�ก���� �;����9�#���� �����#� 512+5 ��L����

������ ��ก<�h�L�Lก���� (oxyhemoglobin solution) ��� �L� =��=���Z��������Q� 0.05% ���L��� �;h���ก;<�4 (ammonium hydroxide; NH4OH) ������ ����.�ก���� �;����9�#

���� �����#� 540+4 ��� 576+4 ��L���� �:� ������ ������"��.�ก���� �9�#���� �����#��"��T �����:��"��.�ก���� �����"�����

�����#���� �ก��[ L� Q!��ก� x �b��"��.�ก���� � �ก� y �b��"����� �����#� $���"����� �����#�9�#���ก�� �� .� ���� ��ก��[���ก���"��.�ก�����L��ก�� �� � ���"����ก��4� ก������ก���#�� �9:�����ก��

ก�����= ������$.ก���������� �����#�� �������= ��� "����� 2 �"����� �����#� :�!������#�� �กL9�L[L������49�#QR�ก������b����� ก� � $��QR����<G��b����� ก� ����9:�� "����� 3 �"����� �����#�

2. ก��&,4�%,� /e% ��%&���,�,!/ก�30���� (Linearity of detector response) �"�

�.�ก���� �9�#� ���b��"�9�#������=�ก�������������9�#ก��9�ก�����ก��4���������� � <G#�������������34�b� �����ก���"��������� ����b�������� :���fQ�ก����� �ก�4QR����#�� :�!�������������� ��L� QR�ก8���� �4 ก�����= ��ก����� ��������ก��4���� ���� ��=QR��K"�ก��=ก9�#������!����ก�"��ก��!�� �K"�������"��.�ก���� � ����������!4�.���� �����34���"��.�ก���� �ก������!����ก��=ก Q�9�����������กQR� ������ 9�#���������.�ก���� ��b�;����ก8���� �4 ��� �Q!������������"��T��������"��.�ก���� � �:���� �ก��[���� �����34��!�"���"��.�ก���� �����"��������� ��#����= ���"������� �����34��� �����!���;�" ���� "�� ��R"� ��ก<�h�L�Lก���� ���9�#���� �����#� 415 ��L���� ����;�L��[���� (p-nitrophenol) ���9�#���� �����#� 405 ��L���� L�����4���L��� �<��[� (cobalt ammonium sulfate) ���9�#���� �����#� 512 ��L���� ������4<��[� (copper sulfate) ���9�#���� �����#�

Page 23: ก (Photometry) · ˙ 9 # #˝ 9 #ˆ 1 ˝ˆ ก" 6 )*7% (wavelength)! " # 9 # QR ˝ L ˙ ! ˝ 9"กˆ 10-9 ˙ ˝กHก ก9 # QR ˚b f กHˇ49 #QR 9 # ˝ ˆ4 (lambda; λ) =: ˝ˆ

ก������������ � 323 ��������ก�������

650 ��L���� !��� ������ �� �K ���!�� �� � <G#����9�#���� �����#� 257, 410 ��� 630 ��L����

3. ���%,ก�'44ก��� (Stray radiation) !�� $G� � �9�#ก��9����ก��4���������� �

L� ;�"K"��������4Q " ������ ��#����=��� � ���ก����ก�����=���K�9:�Q!�ก���.�ก���� �;�"�b�;����ก8���� �4 ���9:�Q!��"������b� �������ก��[��������#:��� ก�����= ��� ���ก����ก�����9:�;��L� QR��K"�ก���� �!��� ������ 9�# ����$�.�ก������� �����#�� �9�#���=���;��!��������"� %T <G#����;���"� 0%T $��;�"��� ���ก����ก����� ���� "�� ������ 9�#QR����= ��� ���ก����ก����� ;���ก" ��3� ����4���� (lithium carbonate; LiCO3) QR����= ��9�#���� �����#�� ���� ก�"� 250 ��L���� L<�� �L��;��4 (sodium bromide; NaBr) QR����= ��9�#���� �����#�� ���� ก�"� 240 ��L���� �����<�L�� (acetone) QR����= ��9�#���� �����#�� ���� ก�"� 320 ��L���� ���#�����ก���.�ก���� ������� ���ก����;�"ก�� 1%T

4. ����.(ก&�,��,��H�(ก)*%��� (Photometric accuracy) �"��.�ก���� �9�#QR�

�:����!����������� ������ L� ���=�ก �ก������ �4 (A=εbC) L� ;�"9� �ก���"��.�ก���� ���!����������9�#9����"�������� �"��.�ก���� �9�#���=�ก���#������������$.ก���� .� <G#�����$.ก�������"�9�#���;��G��ก����=�ก�������"���������������� ��b��"��.�ก���� � ก�����= ������$.ก��������QR��K"�ก���� ��������9�#ก:�!���"��.�ก���� �9�#������;�� :���ก��������������R��� (National Bureau of Standards; NBS) ;��ก:�!���K"�ก���� ��������9�#QR����= ������$.ก�������"��.�ก���� ������ ก�"� neutral-density glass filters SBM 930 Q�!�G#�R���� 3 �K"� ��"���K"�;��ก:�!���"��.�ก���� �9�#������;�� :�!���ก�����9�#���� �����#�� � 4 �"����� �����#� �K"�ก���� � :�!���QR����= ������$.ก�������"��.�ก���� �9�#<�����QR�Q�!����������ก���"��T ���;�����ก�����= ��=�ก :���ก��������������R��� �����K"�ก���� �����;�"��9�#����;� � "��;�กZ�����=��� �ก�4�:� ������ ���R��� :�!���QR����= ��;�� R"�

L��� <� �;�L���� 12.0 �ก.% Q� 0.01 N ก��<��[.��ก (sulfuric acid; H2SO4) �������"�

�.�ก���� �9�#���� �����#� 257 ��L���� ;�� 1.738+0.03 !����������"��.�ก���� �9�#���� �����#� 350 ��L���� ;�� 1.288+0.02 ������4<��[�����;h��� (copper sufate pentahydrate; CuSO4.5H2O) 4.0 ก���% Q�

1% ก��<��[.��ก �������"��.�ก���� �9�#���� �����#� 650 ��L���� ;�� 0.448 !��� �������"��.�ก���� �9�#���� �����#� 510 ��L���� ;�� 0.48

Page 24: ก (Photometry) · ˙ 9 # #˝ 9 #ˆ 1 ˝ˆ ก" 6 )*7% (wavelength)! " # 9 # QR ˝ L ˙ ! ˝ 9"กˆ 10-9 ˙ ˝กHก ก9 # QR ˚b f กHˇ49 #QR 9 # ˝ ˆ4 (lambda; λ) =: ˝ˆ

��������ก������� 324 ก������������ �

ก����H�(ก)*%����,�,'&,�, ��' (Atomic absorption spectrophotometry)

L��ก�� ��$.ก� ก��ก�b�������� ��;��L� QR�����������;�9:��� ���3������L��ก�� ������� ��กZ����� �����ก���.�ก����������#�� �R"��� �ก��L��ก��9�#� ."Q��.� ������ ������� =G�QR�ก8���� �4����� �ก�4QR��:����!�������������� ��;�� $�� ����$����"��.�ก���� ���������� ������ ���#��9�#QR�����"��.�ก���� ���������� �� �� ก�"� ���#������"��.�ก���� ���������� �� (atomic absorption spectrophotometer; AAS) ก������"��.�ก���� ���������� �� ����$QR��:����!�������L�!��"��T R"� ���<� � ��ก��<� � ��3� � 9����� ��ก� � ��ก�#����L�!���#�T ���4���ก���"��T �����#������"��.�ก���� ���������� ��� ������.�9�# 11.8 ���4���ก��!��ก=��� 6 ���4���ก�� <G#�9:�!���9�#�"��Tก��

ก � � = s R < �(/">7 11.8 � �����4���ก�������#������"��.�ก���� ���������� �� ก. Hollow cathode lamp . Chopper �. Flame and burner assembly �. R"��Q!�� ��� =. ���ก��4 � ก������ก���#�� � s. R"��Q!�� ���ก R. ���ก��4���������� � <. ���ก��4� ��K�

Hollow cathode lamp 9:�!���9�#Q!����#�� ���� ����# � :�!���QR�Q�����ก������"��.�ก���� ���������� ��

Chopper ��� Q����9�#!������ �����Z���9�# ��#�������=��!��ก����"� ���#�� �=�ก!��� hollow cathode ��;�Q�����ก�����

Flame and burner assembly 9:�!���9�#�.��� ������ 9�#=����=���;�9:�Q!��b����������Zก���K�;!��Q!�ก��ก��"�!��ก��������� ��Q����;[

JH,�g-���� ��� JH,�g-����,,ก�)',!/ก�30�6ก�)' )*,ก�)*7%��� 9:�!���9�#���ก������ ����� �����#�9�#����ก�����Q!�K"��;�ก��9����ก��4���������� �

,!/ก�30����� ������=����# ��������������� �9�#ก��9�Q!��b� �ff��;[[\���#��:�;������b��"��.�ก���� ����� ��K�9�#,!/ก�30����)

�"�ก���.�ก���� ���������� ��=����K������������������ ��9�#ก��G��=�กก��K�;!��Q����;[ =G�QR�ก8���� �4�:����!�������L�!�Q� ������ ;��

/xdd6�2��yg%ก���/� ��3C)-'C6gJ� ��*7,���H�(ก)*%����,�,'&,�, ��' ��� 1. ������Q!� ������ $.ก�:���;�K�;!��Q������9�#��9�#Q�����ก�����

Page 25: ก (Photometry) · ˙ 9 # #˝ 9 #ˆ 1 ˝ˆ ก" 6 )*7% (wavelength)! " # 9 # QR ˝ L ˙ ! ˝ 9"กˆ 10-9 ˙ ˝กHก ก9 # QR ˚b f กHˇ49 #QR 9 # ˝ ˆ4 (lambda; λ) =: ˝ˆ

ก������������ � 325 ��������ก�������

2. ������Q!����!>.��ก��K�;!�� ������ Q!���9�# ������!>.������ .���!��� :�!���ก��

���# �Q!��b�������� ��;����ก9�# �� 3. ������Q!��:�� �=�ก!��� hollow cathode K"��ก��"�!��ก��������� �� L� ก������

flame and burner assembly Q!�!��� � 4. ���ก��4���#���ก��9�#QR�Q�������=������!4 ���� �������F=�ก;������L�!�9�#����

ก������$.ก������ก����� ก��QR����#������"��.�ก���� ���������� ��������F� ����R:���f���������Q=Q�����

ก�������3�����b�� "����ก ��s�������=ก������K���������"����=���;�� ����K������9�#��=ก��G��Q�����ก�������� ��3����ก��=�ก�W==� �"��T9�#����ก����3�ก�����=��� ������

1. ;���������R���Q����� "�����= ����$������ก��;������กก�� �����ก��9�#��ก���;�� �ก��� �������������;[ <G#���K�9:�Q!�ก��������� ����� ��������=���;���"��#:�ก�"������b�=��� ����K�������������� ก�"� chemical interference R"� Q�ก�����=���L�!����<� � $������ "�����=��;������L� s���[� [�;���� =�9:�ก��L��ก�����<� �[� [�<G#���ก���;�� �ก ��3��ก�;�Wf!������=QR�;����L�!����9���� (lanthanum) Q "��Q����� "�����=��� <G#�;�������9����=�;�� "�ก��;�������<� �=��ก��;�������9�

2. ������� ��Q����;[��=$.ก���# �Q!�� ."Q� >��;������ก;�� $����������=�ก���;[ .���กก��;� ;������ก���;�" ����$�.�ก����������� �9�#��"� ��Q�����ก����� �������=�9:�Q!����=���;���"��#:�ก�"������b�=��� ����K�������������� ก�"� ionization interference ��3�������K������������9:�L� QR����;[9�#�����!>.���#:�ก�"� R"� ���;[=�กก��K�;!����� �ก� ��<9���� (acetylene) �����ก�F !�����=��#�L�!���#�9�#ก���b�;����;���"� ก�"�Q�=:������กT =�9:�Q!�ก�����Zก������ ����ก��K�;!�� <G#����Zก������ ��9�#ก��G��=�R"� 9:�Q!����ก��� �ก��ก��;������L�!�9�#���ก��;����� ��

3. ������ก�"��9��ก� >����������!�"�� ������ "��9�#���ก�� ������ �������9�#QR�9� ��"� ��=�b�K�9:�Q!�ก��ก��������� ��Q����;[�� ������ "����� ���������;�"�b� �� "���� �ก�� =G�9:�Q!�ก��9� ��"�K������;�� R"� ����!����� ������ �������������� "�����=���;�"9"�ก�� ����K�������������� ก�"� matrix interference ��3��ก�;กZ����� � ����� � ������ "����� ������ �������9�#QR�9� ��"�Q!�������ก�"��9��ก� >��������Q!���� 9�# �� ���� "��R"� ก�����=���������L�!�Q�<���� �������=��=��<������� ��#�������!���Q!�Qก���� �ก�� ������ ������� !���9:�Q!� ������ �������������!���Qก���� �ก��<����!���<����9�#=��=������ ������ ������� :�!���9� ��"����<� �Q�ก�����=������<� �Q�<�������=��=����� ������ 9�#������������L<�� �Qก���� �ก���"�9�#��Q� ������ "�����=��� ����L<�� �;����9:�Q!��"����=������<� ��#:���;��

4. ���� �������ก�������:��!�"��� burner Q�����ก������b��W==� :���f�"�����$.ก�������������"� :���ก�����=��� �����b����4���ก��9�#���# � ��Q!��b�������� ����#�

Page 26: ก (Photometry) · ˙ 9 # #˝ 9 #ˆ 1 ˝ˆ ก" 6 )*7% (wavelength)! " # 9 # QR ˝ L ˙ ! ˝ 9"กˆ 10-9 ˙ ˝กHก ก9 # QR ˚b f กHˇ49 #QR 9 # ˝ ˆ4 (lambda; λ) =: ˝ˆ

��������ก������� 326 ก������������ �

QR�Q�ก����� <G#�����Q!�ก����ก9�# �����Q������9�#��9�#����R"��ก����� ก�������������ก��;!����ก� R�����������ก� R"� Q�ก��K�;!������!��� ������9�#��� ����K������9�#ก��=�ก burner ����� ก�"� burner problems

5. �������������;[ ����$ก������Q!�������� ����� "��9�#ก��G��=�กก��K�;!�� ������ ;�� ." $���ก������<G#�;�" $� � ���ก��ก����"� �������� �R"�����#��� �ก��9�#QR�Q�����ก�������ก�� ������� �9�#���;��=G���กG��!����"��.�ก���� �=���� �� =G�9:�Q!��"�9�#���;����� ก�"������b�=��� �� ก����K�������������"� emission interference ����K�������������ก�;L� ���4���ก��9�#�� ก�"� chopper ������ก����� chopper �b�Q����9�#!������ �����Z���9�# ��#�������=��!��ก����"� ���#�� �=�ก!��� hollow cathode ��;�Q�����ก����� =��!��9�# chopper ���Q!�� �=�ก!��� hollow cathode K"�� �ff��9�#���;��=�ก���ก��4���������� ��b� �ff��9�#����=�ก���#�� �9�#��"� =�ก�����Q� $���ก������������#�� ��� hollow cathode 9�#!���=�กก���.�ก������������ �� =��!��9�# chopper ���;�"Q!�� �=�ก!��� hollow cathode K"�� �ff��9�#���;��=�ก���ก��4���������� ��b� �ff��9�#����=�ก���#�� �9�#��"� =�ก�����Q� $���ก�������� �� "���� � ������� chopper =G�R"� ก:�=������K������������;�� ก����H����� ������">7/)H,6d�ก,'&,�, ��' (Atomic emission photometry) ��������9�#!��� �=�ก���;[ ����$9:�Q!�;������ก��L�!������;� (alkali; A+) Q� ������ ���# �;�� ."Q��.�������� �� (Ao) ��������Q� $���ก������ (A*) ��� �ก������"��

A+ + e- Ao Ao + heat A* A* Ao + hν

�����Q� $���ก������;�" $� �=���"� �������� � (hν) ��ก�� ���������������

� � (I) 9�#��"� ��ก��=����K�����ก�������������Q� $���ก������!���������;������ก�����������Q� ������ ��� �ก�� I = k[A+] ���#������������ �9�#��"� =�ก������� ��Q� $���ก������ �� ก�"� atomic emission photometer !��� �� ก ���T �"� flame photometer ���4���ก�� :���f�����#������� 4 ���4���ก�� � ������.�9�# 11.9

Flame and burner assembly 9:�!���9�#�.��� ������ 9�#=����=���;�9:�Q!��b����������Zก���K�;!��Q!�ก��ก��"�!��ก��������� ��9���Q� $���������� $���ก������Q� /)�lD

JH,�g-���� ��� JH,�g-����,,ก�)',!/ก�30�6ก�)' )*,ก�)*7%��� 9:�!���9�#���ก������ ����� �����#�9�#��"� =�ก������� ��Q� $���ก������Q!�K"��;�ก��9�,!/ก�30����� ������

Page 27: ก (Photometry) · ˙ 9 # #˝ 9 #ˆ 1 ˝ˆ ก" 6 )*7% (wavelength)! " # 9 # QR ˝ L ˙ ! ˝ 9"กˆ 10-9 ˙ ˝กHก ก9 # QR ˚b f กHˇ49 #QR 9 # ˝ ˆ4 (lambda; λ) =: ˝ˆ

ก������������ � 327 ��������ก�������

,!/ก�30����� ������ =����# ��������������� �9�#ก��9�Q!��b� �ff��;[[\���#�

�:�;������b��"������� ������ ��K�9�#,!/ก�30����)

R

ก � � = s �(/">7 11.9 � �����4���ก�������#������"�������� �9�#��"� =�ก������� �� ก. Flame and burner assembly . R"��Q!�� ��� �. ���ก��4� ก������ก���#�� � �. R"��Q!�� ���ก =. ���ก��4���������� � s. ���ก��4� ��K� R. ���;[

L�!�!�."�����;��4�b�L�!�9�#��ก����b�;����;����Q� ������ ��:� ��#�$.กK�;!����� ���;[=�Q!����#�� ���ก�"��ก�� R"� L<�� �=�Q!����#�� � �!���� L��� <� �Q!����#�� � ��"����� ��3� �Q!����#�� � ���� ก�����=���������L�!�9��� ��Q����� "�� "����=9�������ก��� ��3����������� �9�#��"� =�ก������� ��$���b���3�������� (reference method) ก����H�ก�� �*,�����,����)')�6 (Fluorescence photometry or fluorometry) ���ก8ก���4����� ��� ���b�K�=�ก���ก��� ���!�"��L��ก�� ��ก���������� � ��#����� ������#�� ����#��9�#ก��9�ก��L��ก��Q� ������ �������������=ก��=��ก��=� (scattered) ;�Q�9�F9����#� !������#��9�#K"��;�L� ;�"��ก��$.ก�.�ก��� (transmitted) !���$.ก�.�ก��� (absorbed) ;��L� L��ก�� ������ ���#�� �9�#ก��=��ก��=� ������#�� �9�#K"��L� ;�"��ก���.�ก���L� L��ก�� ��=������� �����#�9"����!����ก�����#�� �9�#ก��9�L��ก�� �� ��"$�����#�� �����$.ก�.�ก���L� L��ก�� ���������9�#$.ก�.�ก���=����# ��.�������� R"� ���# ��b���������������� !�����=$.ก��"� �����ก��Q��.�����������#�� �9�#���"�����������#���� ก�"���� (���� �����#���กG��) ���#�� �9�#$.ก��"� ��ก�������ก=�� ."Q�R"�����#�9�#���!Z�;�� =G��� ก�"� ก�� �*,���� (fluorescence) ����� กL��ก��9�# ����$����� �;���"� ��� �*,���� (fluor) ����������������� �9�#��"� ��ก�����=����K�����ก�������� ������� �9�#��Q� ������ �������ก������������ ������#�� �9�#��"� ��ก���� ������ =G�QR�Q�ก��!������� ��;�� �� ก���#������"�������� �9�#��"� ��ก���� ������ ��#�$.กก��������� ���#�� ��"� ��*7,���H� �*,�����,����)')�6 (fluores-cence photometer) ���4���ก�� :���f�����#���� 6 ���4���ก������ ��Q��.�9�# 11.10

-),5)���%��� (Energy lamp) 9:�!���9�#Q!��������� � :�!���ก������ �� ,!/ก�30�6ก�)' )*,ก�)*7%����2�-�4ก�'&!�%��� 9:�!���9�#� ก� �=�ก!�������������������ก��s������#�� � :�!���ก������ ��Q!�K"����ก9��JH,�g-����,,ก ��#�ก������L��ก�� ��<G#�Q ";��Q�� � �&&0

Page 28: ก (Photometry) · ˙ 9 # #˝ 9 #ˆ 1 ˝ˆ ก" 6 )*7% (wavelength)! " # 9 # QR ˝ L ˙ ! ˝ 9"กˆ 10-9 ˙ ˝กHก ก9 # QR ˚b f กHˇ49 #QR 9 # ˝ ˆ4 (lambda; λ) =: ˝ˆ

��������ก������� 328 ก������������ �

g�H��� � �9�#$.ก��"� =�ก���ก8ก������� �=�K"����9��JH,�g-����">7/)H,6,,ก�,����;�9�#,!/ก�30�6ก�)' )*,ก�)*7%���">7/)H,6,,ก�,���� ��#����� ก������กs������#�� �9�#ก��=�กก������� �9�#Q!�;�ก��9�9�#,!/ก�30����� ������ <G#�=����# ��������������� ��b��������;[[\� "�Q!�,!/ก�30����)�����b��"����=������� ��K� ก��������!H%�,�������%),6 (Nephelometry and turbidity) ��#��:�� ���������#�� ����#��;�ก��9�ก�����>��9�#����� � ."Q� ��K � ��=ก��ก�� �9���ก��� !���ก��=��ก��=� ;�Q�9�F9���"��T !�����=$.ก�.�ก���L� ���>������ !���K"��9���;�L� ;�"$.ก�.�ก��� ก������������ �9�#ก��=��ก��=� ;�Q�9�F9��9�#9:����ก������������ก�����#��9�#��� �ก��9� �� ก�"� nephelometry ���#��9�#QR������ ก�"� nephelometer ก������������ �9�#ก��=��ก��=� ;�Q����������� �ก��ก�����#��9�#��� �ก��9� �� ก�"� turbidity ���#��9�#QR����������#�� �กL9�L[L������4 ������� �9�#ก��=��ก��=� ;�Q�9�F9���"��T=����K��ก�������������������>�� ������� ������� =G� ����$�:����!����������>��9�#��� �� Q� ��K �;�� L� Q����������9:�Q!� ������� �b������� �ก�� ���4���ก�� :���f�����#�� nephelometer � ������.�9�# 11.11

-),5)���%���9:�!���9�#Q!����#�� ������� )%N0������9:�!���9�#���� �Q!�K"��JH,�g-���� ���;�9�#��H%ก�,���6ก�����#�������ก���#�� � :�!������Q����� ���#�� �Q�����ก��

���=�;�ก��9����>�� ��9�#Q "Q�� � �&&0 ������� �9�#ก��=��ก��=� =�ก���������b���� θ $.ก���=������ ,!/ก�30����� ������ Q�����ก�����=���,!/ก�30/},�ก%���%,ก�'44ก���;�"Q!�$G����ก��4���������� � ,!/ก�30����)=���� �ff��;[[\�=�ก���ก��4���=��������# ��b��"����=������� ��K�

���=�ก��������9�#!��� � :�!������������� ������#�� nephelometer G��ก����������>��������� �����#�� �9�#��� ��#����#�� �ก��9�ก�����>������� 9�#�b������� �ก�� ��กH��ก��ก��=��ก��=� ��� �=��b�;�;�� 3 ��� ���� ��Q��.�9�# 11.12 $����������>����� ก�"� 0.1 9"����"����� �����#�9�#ก��9� $���"��b����>������Zก 9�F9��ก��ก��=��ก��=� � �=�;�Q�9�ก9�F9�� ��"=������ Q�9�F9������s�กก���������� $��������>��Qก���� �!������ ก�"��"����� �����#�� �9�#ก��9��Zก��� $���"��b����>�����Q!f" 9�F9��ก��ก��=��ก��=� � �=�;�Q�9�ก9�F9�� ��"=�����กQ�9�F9��9�#�"��;�����!���!���9�F9���� �ก��� �ก��9� $��������>����กก�"��"����� �����#�� �9�#ก��9� $���"��b����>�����Q!f"��ก 9�F9��ก��ก��=��ก��=� � �=�;�Q�9�F9��9�#�"��;�����!���!���9�F9���� �ก��� �ก��9�

Page 29: ก (Photometry) · ˙ 9 # #˝ 9 #ˆ 1 ˝ˆ ก" 6 )*7% (wavelength)! " # 9 # QR ˝ L ˙ ! ˝ 9"กˆ 10-9 ˙ ˝กHก ก9 # QR ˚b f กHˇ49 #QR 9 # ˝ ˆ4 (lambda; λ) =: ˝ˆ

ก������������ � 329 ��������ก�������

� �

ก =

s <

R �(/">7 11.10 � �����4���ก�������#������"�ก������� ��� ������

ก. !����������� � . ���ก��4� ก������ก���#�� � :�!���ก������ �� �. R"��Q!�� ���ก :�!���ก������ �� �. ������4���R"��Q "������4 =. R"��Q!�� �9�#��"� ��ก�� ���� s. ���ก��4� ก������ก���#�� �9�#��"� ��ก�� �� R. ���ก��4���������� � <. ���ก��4� ��K�

ก � � =

s R <

�(/">7 11.11 � �����4���ก�������#�� nephelometer

ก. !����������� � . ��<4���� � �. R"��Q!�� ��� �. �K"�ก������� ก� � =. ������4���R"��Q "������4 s. ���ก��4�\��ก��� ���ก����ก����� R. ���ก��4���������� � <. ���ก��4� ��K�

θ

Page 30: ก (Photometry) · ˙ 9 # #˝ 9 #ˆ 1 ˝ˆ ก" 6 )*7% (wavelength)! " # 9 # QR ˝ L ˙ ! ˝ 9"กˆ 10-9 ˙ ˝กHก ก9 # QR ˚b f กHˇ49 #QR 9 # ˝ ˆ4 (lambda; λ) =: ˝ˆ

��������ก������� 330 ก������������ �

ก. ���>������Zก [������>�� (d) ��� ก�"� 0.1 9"������� �����#�� � (λ)9�#ก��9�]

. ���>�����Q!f" [������>�� (d) ��� ก�"����� �����#�� � (λ) 9�#ก��9��Zก��� !���9"�ก��]

�. ���>�����Q!f"��ก [������>�� (d)

��กก�"����� �����#�� � (λ) 9�#ก��9�]

�(/">7 11.12 � ����กH��ก��ก��=��ก��=� � ���#�ก��9����>�� ��

(=�ก Hicks R. Spectrophotometry. In: Hick R, Schenken JR, Steinrauf MA, eds. Laboratory instrumentation. 2nd ed. Philadelphia: Harper & Row Publishers, 1980: 68.) ก����H����� �������'"�,%d�ก�&.! (Reflectometry) ��#����#�� �ก��9�K�����$� L��ก�� ��=��.�ก����������;�� "��!�G#���� �9���� � "��9�#;�"�.�ก�����ก�� $��ก:�!�� Ro �b�������� �ก"��ก��9�K�����$� ��� Rtest �b�������� �9�# �9���=�กK�����$� �"� log (Ro/Rtest) �� ก�"� reflection density; DR �"� DR �b��"�9�#QR���กก���.�ก���� ���L��ก�� ��9�#� ."��K�������$� <G#����� ก���"��.�ก���� ��� ������ ���� ������ �����34Q��.�9�# 11.13 ������� =G����L��QR�ก8���� �4 :�!����:����!����������� ��9�#� ."��K�����$�;��

���#������������ � �9���=�กK�����$� �� ก�"� reflection photometer ���4���ก�� :���f�����#��� ��Q��.�9�# 11.14

���#�� �=�ก-),5)���%���=�K"��;�9�#,!/ก�30�6ก�)' )*,ก�)*7%���9��JH,���� ��� � �9�#$.ก������ก=���ก9��JH,����,,ก;�ก��9�ก��� ��,��&.! ,!/ก�30����� ������=����# �������� �9�# �9���=�ก���$��b� �ff��;[[\� "�Q!�,!/ก�30����)���# ��b��"����=������� ��K�

d < 0.1 λ

d > λ 0°

d < λ

45° 90°

Page 31: ก (Photometry) · ˙ 9 # #˝ 9 #ˆ 1 ˝ˆ ก" 6 )*7% (wavelength)! " # 9 # QR ˝ L ˙ ! ˝ 9"กˆ 10-9 ˙ ˝กHก ก9 # QR ˚b f กHˇ49 #QR 9 # ˝ ˆ4 (lambda; λ) =: ˝ˆ

ก������������ � 331 ��������ก�������

�(/">7 11.13 � ������ �����34���"� optical density ����"� reflection density

ก � � =

s R

�(/">7 11.14 � �����4���ก�����#������������ � �9���=�ก���$� ก. !����������� � . R"��� ��� �. ���ก��4� ก������ก���#�� � �. R"��� ���ก =. K�����$����9�# G�=��K�����$� s. ���ก��4���������� � R. ���ก��4� ��K�

��!/ 9����ก������������ �9�#���# �����!���=�กก�����ก��� ���!�"��L��ก�� ��ก�����#�� ���!�� 9���� ;���ก" ก������"��.�ก���� ��� ������ ก������"��.�ก���� ���������� �� ก������������ �9�#��"� =�ก������� �� ก������"�ก������� ��� ������ ก������"������"��� ������� ���ก�������������� � �9���=�ก���$� �b���� 9�����"��T!�"����;��$.ก�:������ �ก�4QR�Q�ก��������!4������ ��9����������ก� "����ก�� Q��W==���� L� s���ก������"��.�ก���� ��� ������ $���"��b�9����������������������!4������ ��9����������ก

� �ก"��K"�����ก��� ������� � = IO

� �K"�����ก��� ������� � = IS

Optical density !��� A = log (Io / Is)

� �ก"��ก��9�K�����$� ������� � = RO

� � �9���=�กK�����$� ������� � = Rtest

Reflection density = log (Ro / Rtest )

Page 32: ก (Photometry) · ˙ 9 # #˝ 9 #ˆ 1 ˝ˆ ก" 6 )*7% (wavelength)! " # 9 # QR ˝ L ˙ ! ˝ 9"กˆ 10-9 ˙ ˝กHก ก9 # QR ˚b f กHˇ49 #QR 9 # ˝ ˆ4 (lambda; λ) =: ˝ˆ

��������ก������� 332 ก������������ �

4��3�%!ก��

1. Ackermann PG: Electronic instrumentation in the clinical laboratory. Boston: Little Brown and company, 1972: 43-5.

2. Fasman GD: Handbook of biochemistry and molecular biology: physical and chemical data. Ohio: CRC Press Inc., 1976: 390.

3. Frings C, Gauldie J. Spectral techniques. In: Kaplan LA, Pesce AJ, eds. Clinical chemistry: theory, analysis, and correlation. St Louis: The CV Mosby company, 1984: 51-73.

4. Hicks R. Spectrophotometry. In: Hick R, Schenken JR, Steinrauf MA. Laboratory instrumentation. 2nd ed. Philadelphia: Harper & Row Publishers; 1980: 29.