- 1 -

A TORQUE TENO VÍRUS (TTV) FERTŐZÉS LEHETSÉGES

PROVOKÁLÓ SZEREPÉNEK VIZSGÁLATA AUTOIMMUN

HÓLYAGOS BŐRBETEGSÉGEKBEN

Doktori értekezés

BLAZSEK ANTAL ZSOLT

Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola

Témavezető: Dr. Kárpáti Sarolta egyetemi tanár, egyetemi tanár, az

orvostudományok doktora

Hivatalos bírálók: Dr. Kovalszky Ilona egyetemi tanár, Ph.D., D.Sc.

Dr. Bata Zsuzsanna egyetemi docens, Ph.D., D.Sc.

A szigorlati bizottság elnöke: Prof. dr. Falus András, egyetemi tanár, Ph.D., D.Sc.

A szigorlati bizottság tagjai: Dr. Marschalkó Márta, egyetemi docens, Ph.D.

Dr. Csikós Márta, egyetemi tanársegéd, Ph.D.

Dr. Solt Anna, biológus, Ph.D.

- 2 -

Tartalomjegyzék

Rövidítések jegyzéke………………………………………………………………… 3

I. Összefoglalás…….…………………………………………………………………… 6

II. Célkitűzés…………………………………………………………………………….. 10

III. Irodalmi áttekintés………………………………………………………………….. 12

IV. Beteganyag és Módszerek……………………..……………………………………. 47

V. Eredmények…………………………………………………………………………... 54

VI. Megbeszélés…………………………………………………………………………... 65

VII. Irodalomjegyzék……………………………………………………………………… 68

VIII. Saját publikációk jegyzéke………………………………………………………….. 81

IX. Az értekezéssel kapcsolatos közlemények másolatai………………………………. 83

- 3 -

Rövidítések jegyzéke

ALT = alanin-aminotranszferáz

HCV = hepatitis C vírus

TTV = TT vírus = Torque Teno Virus

PCR = polymerase chain reaction, polimeráz láncreakció

DNS = dezoxiribonukleinsav

ssDNS = egyszálú dezoxiribonukleinsav

dsDNS = duplaszálú dezoxiribonukleinsav

RNS = ribonukleinsav

UTR = nem átíródó régió

CDS = kódoló régió

ORF = open reading frame, DNS leolvasási keret

APC = antigén prezentáló sejt

BLAST = Basic Local Aligment Search Tool

BPAG1 = bullosus pemphigoid antigen 1

BPAG2 = bullosus pemphigoid antigen 2

BP230 = 230 kD molekulasúlyú bullosus pemphigoid antigen = BPAG1

BP180 = 180 kD molekulasúlyú bullosus pemphigoid antigen = BPAG2

NC16 = BP180 fehérje nem kollagénszerű doménja

NC16a = az NC16 domain extracelluláris részlete

Tm = DNS olvadási hőmérséklet real-time PCR rendszerben

Ag = antigén

At = antitest

BM = basalmembrán

BP = bullosus pemphigoid

C3 = komplement 3

CAV = chicken anemia virus

CD = coeliakia

CP = cicatrizáló pemphigoid

CE = sejt elszarusodó boríték (cell envelope)

- 4 -

CPM = count per minute (LTT tesztnél thymidine count per minute)

DEJ = dermoepidermalis junkció

Dsc = desmocollin

Dsg = desmoglein

DHD = dermatitis herpetiformis Duhring

DIF = direkt immunofluoreszcens

EBA = epidermolysis bullosa acquisita

ECD = extracelluláris domének

EEM = erythema exsudativum multiforme

ELISA = enzime linked immunosorbent assay

EMA = endomysium ellenes antitest

FITC = fluorescein-isothiocyanate

HD = hemidezmoszóma

HG = herpes gestationis

HIV = human immundeficiencia vírus

IF = immunfluoreszcens

Ig = immunglobulin

IIF = indirekt immunofluoreszcens

IL = interleukin

IVIG = intravénás immunglobulin

LAD = linearis IgA dermatosis

LD = lamina densa

LE = lupus erythematosus

LL = lamina lucida

MS = multiple sclerosis

NYP = nyálkahártya pemphigoid

PBS = foszfát puffer (NAIRN-féle módosított)

PCV = porcine circovirus

PV = pemphigus vulgaris

PF = pemphigus foliaceus

PPB = protein-protein BLAST

- 5 -

RA = rheumatoid arthritis

SEM = short, exact matches BLAST

SI = stimulációs index

SPD = sub-basalis dense plate

SSK = salt-split skin

SSSS = staphylococcal scalded skin syndrome

str. = stratum

tTG = szöveti transzglutamináz

eTG = epidermális transzglutamináz

- 6 -

ÖSSZEFOGLALÁS

A TORQUE TENO VÍRUS FERTŐZÉS LEHETSÉGES PROVOKÁLÓ SZEREPÉNEK

VIZSGÁLATA AUTOIMMUN HÓLYAGOS BŐRBETEGSÉGEKBEN

A TT vírus (TTV) egyszálú, negatív-sense DNS genommal rendelkező, az Anellovirus

genusba sorolt vírus. Újabb kutatási eredmények szerint a vírusnak szerepe lehet a szisztémás

lupus erythematosus (SLE) és az idiopathiás myopathiák autoimmun folyamatainak

provokálásában, kialakításában. Mindkét betegségcsoport esetében gyakran tapasztalhatóak

súlyos bőrtünetek. Korábban kimutatták a TTV jelenlétét bőrben is – így felmerülhet a kérdés,

képes-e a vírus bőrspecifikus autoimmunitás provokálására.

Az autoimmun hólyagos kórképek vizsgálata során elméletben többször felmerült, hogy

bizonyos virális ágensek szerepet játszhatnak a bullosus pemphigoid (BP), a pemphigus vulgaris

(PV), vagy a dermatitis herpetiformis (DH) pathomechanizmusában – azonban ezen elméleteket

nem sikerült kellően bizonyítani.

Vizsgálataink során először a betegségek ismert antigén determinánsainak szekvenciáit –

BP180 NC16 és C-terminális domének ill. BP230 BP-ben,; desmoglein3 (DSG3) PV-ben,

desmoglein1 (DSG1) PF-ban; a szöveti és epidermális transzglutaminase, (TGM2 ill. TGM3 v.

TGc ill. TGe) DH-ban - vetettük össze TTV eredetű fehérjeszekvenciákkal, a hasonlóságot

többféle szinten is megvizsgálva. Az online BLAST analízis során külön dolgoztunk hosszabb,

de kevésbé pontos szekvenciális hasonlóságokat (protein-protein BLAST) és a rövidebb, de

pontosabb egyezést kimutató algoritmusokkal. Hosszabb szekvencia-egyezéseket csak a BP

antigének esetében sikerült kimutatni, SEM egyezéseket minden fehérjénél azonosítottunk.

Eredményeinket a szekvenciák prediktáltan determináns helyeivel is összevetettük – szintén a BP

esetében (BP180) azonosítottunk antigenitás és TTV szekvencia-egyezéseket.

Meghatároztuk az egyes betegségcsoportokban a virális DNS prevalenciát a betegek

savójában, majd az értékeket egészséges, önkéntes véradók értékeivel vetettük össze. A TTV

kimutatását nested PCR és valós-idejű PCR kimutatás kombinációjával végeztük 93 autoimmun

hólyagos bőrbetegségben szenvedő beteg, 95 a teljes betegcsoporthoz korban és nemben illesztett

kontroll valamint 50 a BP csoporthoz illesztett kontroll egyedek szérum mintáin. Az eredmények

specifikusságát random szekvenálással validáltuk.

- 7 -

Az autoimmun hólyagos betegek összevont, általános csoportjában a TTV prevalencia

értéket a kontroll csoportéval összevethetőnek találtuk (74/93 (77,89%) vs. 62/95 (65,26 %), p <

0,076), csak úgy, mint a PV csoport (19/33) esetében. A DH betegek TTV DNS prevalencia

értéke magasabb volt, itt csupán egy tendenciát észleltünk (17/20), amely magasabb esetszámú

csoportnál szignifikáns is lehet. Eredményeink alapján a BP betegek körében szignifikánsan

magasabb (36/40, p < 0,032) prevalenciát sikerült kimutatnunk. A betegek kora és neme, a

betegség aktivitása, a betegség fennállásának ideje, valamint a specifikus autoantitestek jelenléte

nem mutatott szignifikáns asszociációt a TTV-DNS pozitivitással.

Vizsgáltuk továbbá, hogy a BP betegek limfocitái felismerik-e a TTV vírus eredetű

fehérjék egy konzervatív részletét. A vizsgálat során kémiailag szintetizált peptid több

koncentrációjával végeztünk 4 BP beteg ill 3 egészséges szemény limfocita kultúráin limfocita

transzformációs tesztet (LTT). Mind a négy beteg limfocitái esetében szignifikánsan erős reakciót

mutatottak a limfociták, a peptidre reagálva, míg a kontroll személyek közül csak egy esetben

tapasztaltunk minor választ a peptid egy koncentrációja esetében. Kísérletünkben tehát a BP

betegek limfocitái felismerték a TTV eredetű szekvenciát.

Adataink felvetik annak a lehetőséget, hogy egy hosszasan fennálló, lappangva hordozott

TTV fertőzés – mivel a vírusantigének nagyfokú hasonlóságot mutatnak a BP egyes

antigénjeinek epitópjaival - szerepet játszhat a BP pathomechanizmusának kialakulásában.

- 8 -

SUMMARY A POSSIBLE ROLE OF TORQUE TENO VIRUS INFECTION AS A TRIGGERING

AGENT IN AUTOIMMUNE BULLOUS DERMATOSES

The TT virus (TTV), a member of the single-stranded DNA virus genus Anellovirus has

been shown to commonly infect humans, yet with no detectable pathogenicity. Recent studies

imply that TTV may contribute to provokeing autoimmune progresses in the pathogenesis of

systemic lupus erythematosus and idiopathic inflammatory myopathies – diseases able to cause

frequent, in some cases severe skin manifestations. Since TTV was demonstrated to be present in

the skin, we wanted to investigate, whether this virus is able to trigger skin-specific

autoimmunity.

Viruses had been also hypothesized to contribute to disease pathogenesis in autoimmune

bullous skin disorders including bullous pemphigoid (BP), pemphigus vulgaris (PV), and

dermatitis herpetiformis (DH) – but this thesis has never been solidly proven.

We analyzed known antigen determinants of BP (BP180 NC16 and C-terminal domains;

BP230), PV (desmoglein3, Dsg3), PF (desmoglein1, Dsg1) and DH (tissue and epidermal

transglutaminase (TGM2 or TGc) and (TGM3 or TGe)) for similarity to TTV originated proteins.

Online BLAST comparisons were done at different levels, on longer but less matching (protein-

protein BLAST) and on short exact matches (SEM BLAST). TTV similarities on large scale were

only detected for BP while TTV SEM results were found for all antigens. When BLAST results

were compared to predicted antigenic sites within the targeted autoantigens only BP180 was

found to show overlaping antigenic and TTV similarity sites.

We assessed the prevalence of TTV DNA in these disorders and compared them to results

from healthy blood donors. Detection of TTV was carried out by nested PCR and real-time PCR

in the sera of 93 patients with bullous skin disorders, 95 age and sex matched healthy blood

donors, and 50 healthy blood donors age and sex matched for the bullous pemphigoid patient

group. Identity of the PCR products was confirmed by sequencing.

We found, that the detection rate of TTV DNA in the whole bullous group of patients was

comparable with that in healthy controls (74/93 (77,89%) vs. 62/95 (65,26 %), p < 0,076), as was

in the group of PV where patients had no increased prevalence of TTV (19/33). Patients with DH

showed a slight, but not significant tendency to carry TTV DNA (17/20). The TTV DNA

- 9 -

prevalence in the BP group was significantly elevated (36/40, p < 0,032). Age, gender, activity,

presence of antigen-specific auto-antibodies or disease duration had no influence on TTV

positivity in either group.

We further analyzed whether lymphocytes of BP patients recognize a conserved region of

the TTV proteins. For this we used a synthetized peptide sequence in a lymphocyte

transformation test. Lymphocyte cultures of 4 BP patients and 3 otherwise healthy controlls were

assayed with different peptide concentrations. While all BP patient lymphocytes reacted strongly

with the peptide, only one control sample showed a minor reaction at only one

peptideconcentration. We concluded, that only the BP lymphocytes recognized the peptide.

Our data suggests that the persistence of TTV in the human body may contribute to the

pathogenesis of BP.

- 10 -

I. Célkitűzés

A TTV fertőzésről és következményeiről felhalmozott irodalmi ismeretek mennyisége

jelentős – azonban az információk és a következtetések részben ellentmondóak. A

rendelkezésünkre álló a magyar populációban készített felmérések eredményei sem egységesek, a

TTV vírusfertőzés pathogenetikai jelentősége továbbra is tisztázatlan.

Éppen a közelmúlt eredményei állították reflektorfénybe a TTV és az immunitás

kapcsolatának igazolására irányuló vizsgálatok fontosságát, felismerve, hogy a vírus

legvalószínűbb targetjei az immunsejtek, ezen belül is, a már aktiválódott, osztódó lymphocyták

és monocyták valamint a csontvelőben található progenitor formáik.

Érdekes vita bontakozott ki arról, hogy a hosszas vírus-hordozás az immunszuppressziót

vagy az immunrendszer kóros túlműködésését vonja-e maga után. Korábbi kutatási

munkásságom eredményei alapján nem tartom kizártnak, hogy a vírus a multifaktoriális

autoimmun betegségek triggerelő faktoraként számbavehető.

Munkásságom során elsajátítottam a szérum vírus nuleinsav-izolátumok készítését,

beállítottam egy érzékeny, nested PCR alapú, real-time detektáláson alapuló módszert, melyben a

termék specificitását SYBR-GREEN melting curve analízissel biztosítottam. Ezen módszer

igénybevételével több autoimmun megbetegedés pl. a szisztémás lupus erythematosus,

rheumatoid arthritis, osteoarthritis és autoimmun myopathiak prevalencia-vizsgálatait végeztem

korábbi társszerzőimmel.

Jelen értekezésemben tárgyalt vizsgálataink során a TTV fertőzés a bőr-specifikus

autoimmunitás megindításában betöltött lehetséges szerepének komplex in silico és in vitro

vizsgálatát tűztem ki célul.

A vizsgálatok elvégzésében egy multidiszciplináris munkacsoport volt segítségemre, a

Semmelweis Egyetem Bőr-, Nemikórtani és Bőronkológiai Klinika Ambulanciájának és

Osztályainak orvosai, akik a betegek klinikai diagnózisát felállították és gondozásukat végezték,

valamint a Klinika Genetika és Immunfluoreszcens Laboratóriumának, az MTA-SE Molekuláris

Medicina Kutatócsoportjának, valamint a Szentágothai János Regiuonális Egyetemi

Tudásközpont ill. a Kurume Orvostudományi Egyetem Bőrgyógyászati Tanszékének orvos és

biológus munkatársai, akikkel az autoimmunitás molekuláris targetjeinek in vitro elemzését

közösen végeztük el.

- 11 -

Három, a bőr ismert autoantigénjei ellen irányuló, hólyagképződéssel járó kórkép - a BP,

a pemphigus betegségcsoport (PV és PF) és a DH – esetében terveztük vizsgálatainkat elvégezni.

Célunk in silico hasonlóság-kutató módszerekkel és antigén-predikció segítségével

kimutatni a megbetegedések leggyakoribb molekuláris targetjeinek és a TTV fehérjéinek

esetleges hasonlóságait és pontos egyezéseit. Szignifikáns egyezések esetén az azonosított

régióban antigenitás predikciót is tervezünk végezni.

In vitro vizsgálataink során a betegek és kontrollok szérumából izolált nukleinsav-

extraktum TTV DNS pozitivitásának, a különböző csoportok prevalencia értékeiknek felmérését

és összehasonlító elemzését tűztük ki célul.

Munkacsoportunkkal elsőként végeztünk TTV kimutatást bőr-specifikus autoimmunitást

mutató, hólyagképződéssel járó kórképek esetében.

Eredményeink hozzájárulhatnak nem csupán ezen betegségek multifaktoriális és részben

ismeretlen etiológiájának további részleteiben történő megismeréséhez, ezen túl azonban további

bizonyítékul szolgálhatnak a TTV autoimmunitás terén betöltött szerepének alátámasztásában.

- 12 -

II. IRODALMI ÁTTAKINTÉS

A. AZ AUTOIMMUN HÓLYAGOS BŐRBETEGSÉGEK

A.1. Az autoimmun hólyagképződés molekuláris targetjei

Az epidermist dinamikus változások jellemzik, melyeket biológiailag a differenciáció - a

bazális réteg keratinocitái előbb a str. spinosum majd a str. granulosum építése után végül

korneocitákká (szarusejtekké) érnek valamint a cornified envelope (CE) kialakításában vesznek

részt és a patológiás behatásokra adott korrekciós mechanizmusok (sebgyógyulás, gyulladás ill.

más szignál-kiváltotta reakciók) csoportjaiba sorolhatunk. Ezek a változások a fiziológiás

szerkezetet fenntartó, struktúrális molekula-rendszereket is érintik. [1]

Az keratinocyták közötti strukturális kapcsolatok kiemelt elemei a dezmoszómák (D) és a

hemidezmoszómák (HD), amelyek mellett a tight junction (TJ), gap junction (GJ) és adherent

junction (AJ) szerkezetek is fontos szerepet töltenek be [2].

1. ábra: A hámsejtek kapcsoló struktúráinak és azok funkcióinak vázlatos bemutatása.

A: A kapcsoló struktúrák (TJ, AJ, D, GJ, HD) elhelyezkedése és funkciói B: A horgonyzó elemek (anchoring junction: D, HD) működésének strukturális elemei

C: Az anchoring junction elemeinek elhelyezkedése (D, HD) Módosítva: Alberts et al . Molecular biology of the Cell [2]

- 13 -

Az autoimmun hólyagképződés során pathogén humorális (de fontos celluláris elemekkel

is bíró) immunválasz indul meg a főbb kapcsoló struktúrák kulcsfontosságú fehérjéi, valamint a

struktúra-integritás kialakításában nélkülözhetetlen enzimek ellen [3].

A következőkben röviden bemutatom ezen target-fehérjék fiziológiás szerepét,

elhelyezkedését és interakcióit, majd az egyes betegségcsoportok bemutatásánál részletezem az

adott kórképekben betöltött immunpathológiai szerepüket és jelentőségüket.

A.1.1. A dezmoszómák struktúrfehérjéi

A dezmoszóma fény- és elektronmikroszkópiával is vizualizálható struktúrális elem,

amely az intracelluláris plakk-proteinekből és a transzmembrán adhéziós cadherin típusú

fehérjékből, mint pl. a desmocollin és desmoglein molekulákból épül fel - ezutóbbi dezmo-

szomális cadherinek rögzítik egymáshoz a szomszédos féldezmoszómán keresztül a sejteket.

A főbb plakk-komponensek a plakoglobin (PG), a plakophillinek (PP1-4), a desmoclamin,

az envoplakin és a desmoplakin (DP1-2) molekulák. A desmocollinok (Dsc) és desmogleinek

(Dsg) egymáshoz valamint a plakkoglobinokhoz kötődnek. A desmoplakinok a keratin

filamentumok hoz kötődnek, de egymáshoz is a PP-n, ill. a Dsg és Dsc-hez pedig a PG-n

keresztül is kapcsolódnak (lásd még 2/B ábra.). [4]

2. ábra: A dezmoszóma szerkezeti felépítése A: a dezmoszóma elektronmikroszkópos képe B: a dezmoszóma felépítésének vázlatos képe

C: a dezmoszómális kapcsolatot felépítő fehérjék kapcsolatai Módosítva: Alberts et al. Molecular biology of the Cell [2] ill. Dusek et al. J.Derm.Sci 45/2007 alapján [4]

- 14 -

hemidezmoszóma

A.1.2. A hemidezmoszómák fehérjéi és a dermo-epidermalis junkció (DEJ) [5-10]

A DEJ a következő elemekből áll:

• a bazális sejtek sejtmembránja

• a hemidezmoszómális (HD) komponensei

• a lamina lucida (LL)

• a lamina densa (LD)

• anchor rostok

A bazális keratinocyták speciális adhéziós struktúrája a hemidezmoszóma (HD), amely a

sejteket a BM-hoz és ezen keresztül a dermishez rögzíti. A hemidezmoszóma intracelluláris része

a keratin tonofilamentumokhoz kapcsolódó hemidezmoszómális plakk. A hemidezmoszómális

egység további alkotórészei: a sejtmembrán és a plakk fehérjéit a BM-hoz rögzítő ún.

transzmembrán proteinek.

3. ábra: A DEJ ill. a hemidezmoszóma alkotórészeinek interakciói (módosítva: R.M. Vodegel, 2004) A hemidezmoszómális plakk fehérjéi

A HD plakk két autoimmunitásban fontos fehérjéje a bullous pemphigoid antigén 1

(BPAG1 v. BP230) és a plectin. A BP230 és a plectin a plakinok fehérje-szupercsaládjába

tartoznak, akárcsak a dezmoplakinok. Szerepük a bazális - 5 és 14 keratin filamentumoknak a

hemidezmoszómákhoz történő rögzítésében jelentős.

- 15 -

A plectin ~500 kDa molekula tömegű fehérje, a keratin intermedier filamentumokhoz és

az α6β4 integrin β4 alegységéhez is képes kötődni. A BPAG1 230 kDa tömegű, a HD

transzmembrán komponenseit köti: a BPAG2 (BP180, XVII. kollagén) citoplazmatikus doménjét

és az α6β4 integrin β4 alegységét.

A hemidezmoszómális transzmembrán fehérjék

A β4 transzembrán integrin hosszú, citoplazmatikus része plakin kötő helyeket tartalmaz,

míg az extracelluláris doménnek a sejtadhézióban van alapvető szerepe, mint a legtöbb integrin

esetében, fiziológiás szerekkezete heterodimer, ebben párja az alfa-6 integrin. A heterodimer

forma, az α6β4 integrin többféle laminin (6 és 10) molekulával képes interakcióba lépni,

legnagyobb affinitással a laminin 5 (332) -t köti.

A lamina lucida (LL) és lamina densa (LD)

A BPAG2 átér a LL-n, C-terminálisával a LD-ban végződik. A BPAG2 az anchor

filamentumok legfontosabb alkotóeleme. Kollagén szerkezetéből adódóan alapvtően trimer

szerkezetű. Az extracelluláris részlet 15, kollagén szerkezetű, subdoménből tevődik össze (C1-

C15), melyeket 16 rövid, nem kollagén szekvencia szakít meg (NC1-16). Az intracelluláris

domén a β4 integrin kötőhelye. Immunpathológiailag legfontosabb az úgynevezett NC16

extracelluláris subdomén (NC16a), mely közvetlenül a transzmembrán régió mellett található.

A LL felsőbb részének ultrastruktúrális elemei az anchor filamentumok és az α6β4

integrin. A LL alsóbb része és a LD területe különböző laminineket és IV. kollagént tartalmazó

hálózatból áll, melyben stabilizáló elemekként heparán szulfát hálózatos glikoproteinek -

nidogen, perlecan és fibulinok találhatóak.

Az anchor rostok

A sublamina densa területén az ún. anchor rostok találhatóak, melyeknek legfőbb

komponense a VII. kollagén. Prokollagén formában a keratinocitákban bizonyosan és

valószínűsíthetően a fibroblasztokban is szintetizálódik.

- 16 -

Primer szekvenciája három fő részre osztható - egy nagyméretű N-terminális globuláris

doménre (NC-1), egy centrális kollagén doménre és egy kisebb méretű C-terminális globuláris

részletre (NC-2). A szekréciót követően a fehérje maturációja során NC-2 domének proteolítikus

hasítással levállnak, a VII. prokollagén monomerek antiparalel szuper-tripleteket képeznek,

amelyek aggregálódva az anchor rostokat hozzák létre.

A DEJ, mint funkcionális egység

A keratin intermedier filamentumok, a HD, az anchor filamentumok és az anchor rostok

tehát egy funkcionális egységet képeznek, mely a hám kötőszövethez történő rögzítését biztosítja.

Az egyes struktúrfehérjék ill. komplex kölcsönhatásaik intakt működésének jelentőségére

mutat rá, hogy a veleszületett hólyagképződéssel járó epidermolysis bullosa betegségcsoport

patogenezisében ezen fehérjék genetikai eredetű károsodásának folyománya a hólyagképződés.

- 17 -

A.1.3. A transzglutamináz enzim-család [11-18]

A transzglutamináz enzimcsalád (EC 2.3.2.13) kovalens kötések kialakulását katalizálja

szabad aminocsoportok és gamma-karboxilcsoportok között. Ilyen kémiai keresztkötéseket

képeznek különböző fehérjékben, polipeptidekben, illetve ezek között – általában lizin (Lys, K)

és glutamin (Glu, N) oldalláncok ligálásával (izodipeptid kötés, 4. ábra). Ez a típusú peptidkötés

nagyban ellenálló a proteolitikus hatásokkal szemben.

4. ábra: A transzglutamináz enzimek katalizálta reakció sematikus áttekintése [14]

A transzglutaminázok által létrehozott keresztkötött fehérje polimerek nagyban

oldhatatlanok, így a stabil struktúrák, mint például barrierek kiépítésében lehetnek hasznosak.

Mivel az általuk katalizált kémiai reakció irreverzibilis, aktivitásuk szigorú kontroll alatt áll.

A humán szervezetben legalább 8 különböző transzglutamináz enzim fordul elő, melyek

aminosav szekvenciája jelentős hasonlóságot (homológiát) mutat. Katalitikus részletük

(YGQCW) is azonos, de antigén tulajdonságaik különbözőek.

- 18 -

• Plazma transzglutamináz (XIII faktor, fibrin-stabilizáló faktor): aktivitása a véralvadás

végső fázisában, a thrombin által fibrinogénből létrehozott fibrin stabilizálásához

szükséges. Proformájából a thrombin által aktiválódó, kalcium dependens enzim.

• Keratinocyta transzglutamináz (kTG, TGM1): a keratinocyták terminális differenciációja

során keletkező elszarusodó boríték (cornified cell envelope, CE) létrehozásában vesz

részt. Ez az oldhatatlan struktúra poszttranszlációs kovalens kötések által nyeri el végső

szerkezetét, melynek izodipeptid kötéseit egyéb szöveti és epidermális TG-k aktivitása

mellett a kTG-k hozza létre. A TGM1 nem csak peptid, de észter kötések szintézisét,

valamint deaminálását is képes katalizálni.

• Szöveti transzglutamináz (tTG, TGM2): Ubiquiter előfordulású enzim, expressziójának

jellegzetes helye a máj, bél, simaizom, endothel sejtek, de vörösvérsejtekben is jelen van.

Az epidermisben a basalis sejtekben a legjelentősebb a festődése. Kalciumot igényel

működéséhez, kifejeződésére a retinoidsav serkentőleg hat. Számos feltételezett

funkciója mellett szerepet játszik a sebgyógyulásban, az apoptózisban, a sejt-

differenciációban, tumorellenes reakciókban és az extracelluláris mátrixkomponensek

stabilizálásában. A vékonybélben a tTG legfontosabb szubsztrátja a gliadin, melyet

irreverzibilisen megköt, a Gln pozíciókat deaminálja, helyükön Glu-k keletkeznek így a

molekulát erőteljesen a negatív irányba polarizálja.

• Epidermális transzglutamináz (eTG, TGM3): A eTG a kTG-hez hasonlóan részt vesz az

epidermalis keratinocyta CE kialakulásában. A hámban a stratum granulosum és a

stratum spinosum legfelső rétegeiben és a szőrtüszőkben expresszálódik és mutat

aktivitást. Ezen kívül még számos humán (vese, tüdő) és egér szöveten (vékonybél, agy,

lép, gyomor, nyelőcső) is kimutatták lehetséges expresszióját, azonban a működőképes,

aktív fehérje jelenlétét nem sikerült minden esetben igazolni.

• Prosztata transzglutamináz (pTG, TGM4): a humán szervezetben betöltött szerepe eddig

nem tisztázott, de prosztatában ill. prosztatarák sejtvonalakban kifejeződik az enzim.

• TGMX=TGM5; TGMY=TGM6; TGMZ=TGM7: három újonnan azonosított humán

transzglutamináz, melyek szerepe és a kifejeződésének helye jelenleg még pontosan nem

ismert. A TGM5 szerepe vélhetően az indukált differenciációban és a CE kialakulásában

lehet, ui. missense mutációit az „acral peeling skin syndrome” (APSS) genetikai

megbetegedéssel sikerült kapcsolatba hozni.

- 19 -

A.2. Autoimmu eredetű hólyagképződéssel járó kórképek

A.2.1 Pemphigus csoport

A pemphigus szó görög eredetű (pemphix), jelentése buborék, hólyag. A pemphigus

betegségcsoportba olyan krónikus, szerzett autoimmun betegségeket sorolunk, melyeknél a bőrön

és a nyálkahártyákon intraepidermális hólyagképződés alakul ki, és amelyekre kezelés nélkül a

lethalis kimenetel jellemző. Szövettani jellemzője az akantolízis valamint az intraepidermális

hólyagképződés, az immunhisztokémiai vizsgálatokkal pedig a keratinocyták felszínéhez kötődő,

gyakrabban IgG, ritkábban IgA típusú keringő antitestek detektálhatóak. [19, 20, 21]

Az intraepidermális hólyagképződés közvetlen oka az adhézió megszűnése az egyes

keratinocyták között a hámon belül - ennek molekuláris szintű hátterében a kapcsoló fehérjék, a

dezmoszómális kadherin molekulák ellen képződő, pathogén autoellenanyagok jelenléte,

bekötődése áll, melyek meggyengítik az egyébként erős, intercelluláris kapcsolatot. [22, 23]

A legtöbb esetben az ellenanyagok poliklonálisak, a klinikailag aktív betegek esetében

leggyakrabban az IgG osztályba, s ezen belül az IgG4 alosztályba sorolhatóak. [24, 25, 26] A

remisszió állapotában a betegek szérumából gyakorta kimutatható az azonos specificitású, de

IgG1 alosztályú ellenanyagforma. [26]

A keringő ellenanyag pathogenitásának bizonyítékául a következő tények szolgálnak [3]:

• a PV aktivitás korrelál az auto-ellenanyag titerének módosulásával

• aktív PV-ban szenvedő anyák újszülött gyermekein átmeneti hólyagképződés

figyelhető meg, ez a méhlepényen keresztül átszűrődő anyai EA-k jelenlétével korrelál

• újszülött egereken pemphigus szerű léziók indukálhatóak az aktív PV betegek IgG

izolátumának segítségével.

A pemphigus csoportot klasszikus felosztás szerint a következő alcsoportokra bonthatjuk:

• Pemphigus vulgaris (PV) csoport: a hólyagképződés a bazális membrán felett történik,

az epidermis alsóbb rétegeiben

• Pemphigus foliaceus (PF) csoport: a hólyagképződés a bazális membrántól távolabb,

az epidermis felsőbb rétegeiben jön létre

• IgA pemphigus (továbbiakban nem részletezzük): IgA osztályú EA-k közvetítette

autoimmunitás jellemzi, autoantigénjei a desmoglein 1 v. 3 ill. a desmocollin 1 v. 3

- 20 -

A.2.1.1. A pemphigus vulgaris (PV)

A PV esetek több mint fele a szájnyálkahártyán fájdalmas eróziók kialakulásával

kezdődik, vagy már a betegség korai szakaszában kialakulnak a szájnyálkahártya tünetek. A

törzsön, végtagokon vékony, petyhüdt falú, könnyen megnyíló bullák jelennek meg. Gyakran a

hajas fejbőr, az arc és a nyak is érintett. A szájnyálkahártya gyakori érintettsége mellett ritkábban

más nyálkahártyákon (nyelőcső, végbél, genitális nyálkahártyán) is kialakulhatnak a tünetek. A

betegség kezelés nélkül régen könnyen fatális kimenetelű volt, mely leggyakrabban a

hólyagfedelek leválásával kialakuló erosiok szekunder infekciójából kialakult sepsis miatt

következett be. Autoantigénje a desmoglein 3.

A bőrből végzett hisztológiai vizsgálat során (a biopsziát célszerű a hólyagos és ép bőr

határáról készíteni) acantholyticus, intraepithelialis hólyag képződése látható. A hólyag alatt

gyakran csak a basalis sejtsor marad az alapon – ez az ún. tombstone effektus. A hólyag

belsejében lekerekedett, dezmoszómális kötéseiket elvesztett acantholyticus keratinocyták (ún.

Tzank sejtek) láthatóak.

A DIF vizsgálat elvégzéséhez, a rutin szövettannal ellentétben, a hólyagot övező ép

bőrből készült biopsziás mintára van szükség. A keratinocyták felszínén – általában az egész

epidermis területén, függetlenül a hólyag szintjétől – élénk IgG (dominánsan IgG4) és

komplement (C3) fluoreszcencia figyelhető meg a dezmoszómák mentén.

Az IIF vizsgálattal vagy ELISA-val a desmoglein 3 ellenes keringő EA jelenlét

mutathatjuk ki. PV esetében az IF-t majom nyelőcsövön, vagy perilézionális melanoma mellől

eltávolított (biztonsági szegély) ép humán bőrön végezzük, melyen a vizsgálat eredményeként

hálózatos intercelluláris festődés látható. Az antitestek titere korrelál a betegség aktivitásával, sőt

egyes vizsgálatok szerint a titer már a klinikai recidívát megelőzően megemelkedhet, így sok

esetben prediktív jel lehet. Az IIF vizsgálat során ritkán fals-pozitív eredményt adhatnak olyan

folyamatok (egyéb hámlesio, pl. toxikus epidermalis necrolysis, égés). [27]

5. ábra: A PV szövettani (A), DIF (B) és IIF (C) képe

A B C

- 21 -

A.2.1.2. A pemphigus foliaceus (PF)

A PF a PV-nál ritkábban előforduló megbetegedés. A két kórkép egyik legszembetűnőbb

különbsége, hogy a PF a nyálkahártyákon tünetet nem okoz. A felületes hólyagok elsősorban a

fejbőrön, arcon, mellkason, valamint a hát felső részén alakulnak ki. Hólyag ritkán látható,

pörkkel fedett erosiók uralják a képet, gyakori a bakteriális szuperinfekció.

A bőrből végzett hisztológiai vizsgálat során acantholyticus, intradermalis hólyag

képződése látható, mely szuperficiálisan (str. spinosum felső része, str. granulosum) alakul ki.

Autoantigénje a desmoglein 1. [27]

A.2.1.3 Brazil pemphigus (fogo selvagem, endémiás pemphigus foliaceus)

A PF infektív eredetű formájának tartják, mely Dél-Amerikában (elsősorban Brazíliában)

endémiás. Subcorneális hólyagképződés és keringő Dsg1 elleni antitestek jellemzik.

A betegek nagy része természetes vizek közelében, rossz szociális és higiénés

körülmények között él; a kórképet triggerelő infektív ágens, környezeti antigén feltehetően a

„Simulium nigrimanum” fekete légy közvetítésével kerül a szervezetbe. A felületes bullák az

arcon, hajas fejbőrön, törzsön alakulnak ki. Szájnyálkahártya tünet nem fordul elő. Igen jellemző

viszont az égő fájdalom, melyről a „fogo selvagem” nevet kapta. A hisztológiai, DIF és IIF

vizsgálat eredménye megegyezik a PF-szal. [27]

A.2.1.4 A hólyagképződés különböző szintjének, mechanizmusa a pemphigus csoportban: az

ún. kompenzációs teória

6. ábra: Cadherin (Dsg és Dsc kifejeződés az epidermisben. A hólyagképződés magassága összefügg az adott

rétegben kifejeződő autoantigénekkel. Dusek et al. J.Derm.Sci 45/2007 alapján [4]

- 22 -

A különböző klinikai variánsok és az autoantitest jelenléte közötti összefüggés jól

magyarázható az elszarusodó és az el nem szarusodó hámok eltérő dezmoszómáinak desmoglein

expressziós mintázatával. A bőr esetében a Dsg1 a felső rétegekben, leginkább a stratum

granulosum szintjén, míg a Dsg3 expressziója leginkább az epidermis suprabasalis régiójában

jellemző. A nyálkahártyák el nem szarusodó szöveti képében általánosan jellemző a Dsg3

kifejeződés, míg a Dsg1-é csak nagyon kevéssé. Ebből is következik, hogy a Dsg3 a nyálkahártya

léziók kruciális autoimmun target antigénje, valamint, hogy a PF antitestek nem váltanak ki

hólyagképződést a nyálkahártyán. (6. ábra) [21, 4]

A PV betegek auto-At specificitása leginkább a Dsg3 extracelluláris részlete (EC) ellen

irányul, amely az epidermális keratinocyták egyik fő dezmoszómális adhéziós fehérjéje. A PF

esetében a humorális autoimmunitás főként a desmoglein 1 (Dsg1) ellen irányul, amely magas

homológiát mutat a Dsg3-mal. Számos esetben tapasztalható, hogy a PV betegek autoreaktivitást

mutatnak a Dsg1, PF betegek pedig a Dsg3 antigénjeivel szemben is. [28]

7. ábra: Az epidermisben kifejeződő e-cadherinek alapvető szerkezete

J.Derm.Sci 45/2007 alapján [4]

A megfelelő specificitású autoantitestek rekombináns Dsg3-EC segítségével történő

kiszűrése után a PV IgG izolátum elveszíti hólyagképződés-indukáló hatását. Ennek ismertében

az EC és az ellene irányuló antitestek tanulmányozásával pontosan azonosították az

autoimmunitás cél-részleteit.

Az Dsg3-EC-t az N-terminálistól számozva, a felosztott öt doménből (EC 1-5) az első

kettő esetében sikerült bizonyítani a suprabasalis acantholysisben játszott szerepét. Ehhez, az EC

részletek rekombinánsan előállított formáit felhasználva álló fázisként affinitás kromatográfia

rendszeren IgG típusú ellenanyagokat tisztítottak PV beteg szérumából.

- 23 -

Csak az EC1 és EC2 affinitású ellenanyagok váltottak ki újszülött egerekben

hólyagképződést. In vitro adatok segítségével igazolták, hogy az IgG1 és IgG4 alosztályú PV

betegekből nyert ellenanyagok nagyobb mértékben az EC2 és kisebb mértékben az EC1 ellen

irányulnak. Ezzel összhangban azonosították a Dsg3 esetében a B-sejt epitópokat, melyek az EC1

és EC2 területén, és kisebb affinitással az EC4-ben is megtalálhatóak. [22, 24, 29, 30]

8. ábra: Az Dsg ectodomain szerkezete, ill. az abban azonosított epitóp részletek

Hertl et al alapján módosítva [3] A Dsg4 molekulával (Dsg3: 50%-ban, Dsg1-el: 41%-ban homológ) szembeni immunitás

szintén jellemző a PV és PF betegekre. A Dsg4 elleni autoimmunitást leginkább az anti-Dsg1

pozitív nyálkahártya és bőr érintettséggel is járó pemphigus formák kapcsán említik. [31,32]

A PV klasszikus esetben nyálkahártya lesiokkal jelentkezik, melyek Dsg3 ellen irányuló

autoantitestek következményei. A nyálkahártya és bőr léziókat is mutató betegek esetében a

szérumból IgG4 >>IgG1 alosztályú Dsg1 és Dsg3 ellen irányuló autoantitestek vannak jelen. A

PF autoantitestek a Dsg1 N-terminális konformáció-szenzitív régiója ellen irányulnak. [22, 33]

A Dsg csoport elleni autoimmunitás és a pemphigus pathogenezis finomabb

megismerésének céljából Amagai és mts-ainak sikerült pemphigus modellállatokat előállítani

olyan Rag-/- KO egyedekből, melyekbe Dsg3-/- KO egértörzs Dsg3-al immunizált egyedeiből

splenocitákat transzplantáltak. A transzplantációt követően a recipiens Rag2 KO egerek a PV

klinikai tüneteit mutatták, bőr és nyálkahártya hólyagzás ill. suprabazális akantolízis volt

megfigyelhető. A modellben zajló patogén immunfolyamatok követése a Dsg3 középső része

valamint C-terminálisa ellen irányuló a patogenezisben kiemelkedő szerepű autoimmunitásra

iránytotta a figyelmet. [34]

Ezen újabb adatok szerint ezen részletek, melyekben a homológia kisebb fokú és gyakran

hosszabb részletekig kiterjedő aminosavszekvencia különbségek is kimutathatóak, fontos

szerepet játszhatnak, a betegség induló szakaszában zajló autoimmunitás targetjeként [35]

Megkérdőjelezhető továbbá a szignifikanciája és bizonytottsága azon adatoknak, melyek

PV targetként azonosították az acetilcholin receptor az α9- és pemphaxin acetilcholin

receptorokat. [36, 37, 38]

- 24 -

A.2.2. Pemphigoid csoport

Bár a hólyagképződéssel járó betegségek évszázadok óta ismeretesek, csupán 50 éve

született meg a Levernek (1953) köszönhetően a pemphigus csoporttól szövettanilag is

elkülönülve a pemphigoid betegségcsoport fogalma. Jordon révén 1967 [39] óta ismert, hogy a

betegség pathogenezisének folyamatai a bazális membránhoz, a dermo-epidermalis junctio (DEJ)

területéhez köthetőek – ez ellen irányuló kötött és keringő ellenanyagok által. Ma ezek a

betegségek a szervspecifikus autoimmunitás egyik modelljeként ismertek, azonban számos

kérdés továbbra is nyitott maradt.

A betegségekre jellemző, hogy a bullosus fázisban normál vagy erythemas alapon

vesiculák és hólyagok (bullák) alakulnak ki. A hólyagok feszes falúak, gyakran szimmetrikusan a

végtagok és a hát feszülésnek kitett felszínein helyezkednek el. A szájüreg az esetek 10-30%-ban

érintett. A nyálkahártyák, a szem, az orr, a garat, a nyelőcső valamint az anogeniális régió

érintettsége kevésbé jellemző. [40,41,42]

Az ebbe a csoportba sorolható főbb betegségek, és antigénjeik:

Kórkép Antigén

bullosus pemphigoid (BP) BP180, BP230

hegesedő (cicatrizáló) nyálkahártya pemphigoid

(CP)

BP180, BP230

herpes gestationis (HG) BP180

linearis IgA dermatosis (LAD) *

epidermolysis bullosa acquisita (EBA) VII. kollagén

bullosus sistemas lupus erythematosus (BSLE) *

Lichen planus pemhigoides (LPP) *

anti epiligrin ellenanyag Laminin5 *:több alcsoport ismert antigenitás alapján

- 25 -

A.2.2.1 Bullosus pemphigoid (BP)

A.2.2.1.1. Klinikai kép

A BP az idősebb generációkat érinti elsősorban, a betegség általában a 60. életév után

kezdődik. Német és francia adatok szerint 6,1-7/millió új megbetegedést észlelnek évente.

Szemben a más autoimmun megbetegedéseknél tapasztaltakkal, a BP férfiaknál gyakrabban

fordul elő. A 90 év felettiek megbetegedésének relatív rizikója 300 szoros a 60 éves vagy az

alattiakhoz képest. Bár a betegség általában időskorban kezdődik, fiatalkori és gyermekkori

formáját is ismerjük. [43,44,45]

A BP több autoimmun betegséggel is társulhat (RA, dermatomyositis (DM), SLE), ill.

néhány esetben malignus elváltozásokkal kapcsoltan jelenik meg, azonban egyik tényezővel sem

sikerült szoros összefüggést kimutatni. A BP ritkább, gyógyszer okozta formái is ismeretesek.

Diuretikumok, nem szteroid gyulladásgátlók (NSAID-k) és antibiotikumok szedése kapcsán

dokumentálták eddig a BP kialakulását. Valószínűsíthető, hogy a betegek már valamilyen

hajlammal rendelkeztek a bőrspecifikus autoimmunitás kialakulására, melyre adott esetben a

bizonyos antigének jelenléte (malignus folyamatok, gyógyszerek) erősítőleg hat. [46,47,48]

9. ábra: A BP szövettani (A), DIF és IIF képe (C: majom nyelőcső, D: humán SSK)

A BP szövettani képére a subepidermális hólyagképződés, dominánsan eosinophil

granulocytákat, emellett limphocytákat, histiocytákat, valamint neutrophil granulocytákat

tartalmazó gyulladásos infiltrátum jellemző (9/a. ábra).

A 60-as években Jordon mutatta ki, hogy a betegekben immunhisztokémiai vizsgálattal a

DEJ-hoz lineárisan kötődő ellenanyagok vannak jelen. [39] A betegség korai szakaszában DIF

vizsgálattal gyakran csak lineáris C3 depozitum detektálható, melyhez a későbbiekben IgG

festődés is társul (9/b).

IIF vizsgálattal a betegek több, mint 80%-ában mutathatók ki keringő IgG típusú, BM

ellenes antitest, melyek döntő többsége az IgG4, kisebb része az IgG1 alosztályba tartozik. SSK

A B C D

- 26 -

IIF technikát alkalmazva az ellenanyagok klasszikus pemphigoidban az epidermális oldalhoz

kötődnek. [49,50] (9/c és d)

BP-s betegekben a keringő ellenanyagok titere és a betegség aktivitása között nincs olyan

szoros összefüggés, mint PV esetén. Újabb vizsgálatok szerint a klinikai tünetek a BP180 NC16a

elleni antitestek szérumszintjével korrelálnak, míg a rutin IIF vizsgálat eredménye, titere kevésbé

követi az aktivitást. [51]

A.2.2.1.2. Etiopathogenesis

A BP autoimmun etiológiájában az autoantigének ismertek (BP180, BP230). Az

autoreaktív ellenanyagok kötődése következményeként jön létre a szöveti károsodás az antigén-

antitest komplexek lerakódási helyein. Az autoantitestek pathogenitását in vitro és in vivo

állatkísérletek segítségével sikerült igazolni.

10. ábra: A BP180 és BP230 vázlatos fehérjeszerkezete

Szinte minden BP beteg szérumából kimutatható a BPAG2, BP180 immundomináns

régiója, az NC16a elleni autoantitest. Ezzel kapcsolatban egyre inkább előtérbe kerül az

ellenanyagok termelésének és az ehhez kapcsolódó T-sejtes funkciók kérdése. Újabb adatok

szerint a betegek NC16a specifikus memóriasejtekkel is rendelkeznek, amelyek in vitro

indukcióval antitest-termelésre serkenthetők. Az NC16a-n kívül más extra- és intracelluláris

doménjeire specifikus autoreaktív keringő (poliklonális) ellenanyag van jelen a BP betegekben.

Kimelkedő még a BP180 C-terminális régiójának az antigenitása.[52-56]

Diagnosztikus jelentősége lehet a BPAG1, BP230 ellenes anitesteknek is. A BP betegek

szérumában a C-terminális 700 bp-nyi hosszúságú részletét felismerő IgG antitesek 80%-os, az

N-terminálist felismerők 30%-os gyakorisággal fordulnak elő [57,58,59].

Ezeken túl számos új epitópot felismerő klón válhat aktívvá a BP-s betegekben az ún.

„epitope spreading” mechanizmussal. Ennek lényege, hogy az immunológiai választ kiváltó

- 27 -

molekulán belül, de akár a molekulához fehérje-fehérje interakcióval csatlakozó partnereken is az

immunrendszer újabb és újabb fogást keres és talál, vagyis nem csak a BP180-n és BP230-n, de a

DEJ egyéb, pl. plectin és laminin fehérjéin is új epitópokat felismerő B- és T-sejt klónok

aktiválódhatnak. [60,61]

Az autoantitest termelés indukciójában fontos az autoreaktív T-sejtek szerepe. BP betegek

vérében mind a Th1, mind pedig a Th2 citokin profilt termelő, BP autpantigének el sejteket

sikerült azonosítani. A Th1 profil inkább IgG1 és IgG2 alosztályú ellenanyag termelést, míg a

Th2 döntően IgG4 és IgE típusú ellenanyagok képződését segíti elő. A Th1 profil inkább IgG1 és

IgG2 alosztályú ellenanyag termelést, míg a Th2 döntően IgG4 és IgE típusú ellenanyagok

képződését segíti elő, mely utóbbi a betegségre jellemző pruritus kialaktásában ill. az eosinophil

granulociták toborzásában játszhat szerepet. A BP betegek szérumában mind a négy típusú

ellenanyagot leírták. [62,63,64]

A.2.2.2 Cicatrizáló nyálkahártya pemphigoid (CP)

Heterogén betegségcsoport - a szubepidermális hólyagképződés bármely nyálkahártyán

kialakulhat a bőr érintettségével (10-25%), de gyakrabban anélkül. Súlyos krónikus klinikai

tünetek jellemzik, szinte minden esetben hegesedéssel jár.

A különbözőképpen alkalmazott nomenklatúra zavart okozhat: a cicatrizáló pemphigoid,

benignus nyálkahártya pemphigoid, szájnyálkahártya pemphigoid, ocularis cicatrizáló

pemphigoid, és a helytelenül alkalmazott ocularis pemphigus egyaránt ide sorolható.

Amenyibben manifesztálódnak bőrtünetek, a klasszikus BP-vel ellentétben leggyakrabban

a fejet, a hajas fejbőrt, és a felsőtestet érintik, a betegek 25%-ban fordulnak elő. A nyálkahártya

tünetek elsősorban a szájnyálkahártyát érintik, ezt követi – gyakorisági sorrendben - a szem, az

orr, a garat, az ano-genitalis régió, a gége, majd a nyelőcső nyálkahártyája [65].

CP autoantigénként több különböző BM komponenst azonosítottak: BPAG2, BPAG1, egy

120 kDa fehérje, mely a 180 kDa BPAG2 extracelluláris, kisebb kollagén szakaszának felel meg,

valamint a laminin 5, laminin 6, VII. kollagén, az integrin β4 alegység, valamint egy 45 kDa, egy

168 kDa molekulatömegű epithelialis fehérje és az uncein. Az uncein a „19-DEJ-1” monoklonális

antitestek antigénje, az anchor filamentumok komponense [66,67,68].

- 28 -

A betegek döntő többségében az ellenanyagok a BPAG2-hez kötődnek: vizsgálatok

szerint a COOH-terminálishoz közeli régióhoz szignifikánsan gyakrabban, mint a keratinocyta

membrán közelében elhelyezkedő NC16a doménhez. A betegek egy kisebb része BPAG1 elleni

antitestekkel is rendelkezik. Az egyes klinikai altípusok és a különböző target antigének között

ma még nem tisztázott az összefüggés.

Prognózis és terápia szempontjából 2 csoportra oszthatjuk a betegeket: alacsony és nagy

rizikójú betegcsoportra. A nagy rizikójú csoportba a szemészeti, gégészeti és genitalis (ritkábban

fordul elő) tünetekkel rendelkező, az alacsony rizikójú csoportba a kizárólag szájnyálkahártya,

illetve szájnyálkahártya- és bőrtünetekkel rendelkező betegeket sorolják. Rossz prognosztikai

jelnek tartják, ha IgG és IgA típusú keringő BM elleni antitestek egyszerre vannak jelen a beteg

savójában.

Mivel az antigén-target BM komponensek szempontjából a BP és a cicatrizáló BP betegek

között nem mutatkozott különbség az értekezés tárgyát képviselő vizsgálatok során a gyakoribb

BP és ritka CP beteg-csoportokat nem választottunk ketté.

A.2.2.3 Epidermolysis bullosa acquisita (EBA)

Az epidermolysis bullosa acquisita (EBA) klinikai képe két módon, egy gyulladásos és

egy nem gyulladásos formában jelentkezhet. A klasszikusabb, nem gyulladásos forma során a

traumának kitett területeken (térd, könyök, kézhát), vagy a törzsön kialakuló, heggel, illetve

miliumokkal gyógyuló, subepidermalis hólyagok kialakulása jellemző. A klinikai tünetek

emlékeztethetnek porphyria cutanea tardára, BP-ra, CP-ra. A kórkép kezelése nehéz, gyakran

nem kielégítő a szisztémás szteroidok adása. Általában agresszívabb terápiát igényel. [67,68]

A gyulladásos formában a betegség leginkább a BP-re hasonlít, ilyenkor kiterjedt

tünetekkel és hólyagokkal jelentkezik a betegség, amelyek aztán miliumok és atrophiás hegek

nélkül gyógyulhatnak. Gyakorta megfigyelhető a kétfajta kép keveredése is. [68]

Az autoantigén az anchor rostok fő alkotórésze, a VII. kollagén. Az antitestek többsége a

VII. kollagén globuláris, nem kollagén, 145 kDa molekulatömegű, lamina densa közeli

doménjéhez kötődik.

A perilesionális bőrből készült direkt immunhisztológiai vizsgálat során a BM mentén a

BP-hoz hasonlóan lineáris IgG és C3 pozitív fluoreszcencia látható. Mivel a DIF és rutin IIF

- 29 -

vizsgálat alapján nem lehet egyértelműen elkülöníteni a két betegséget, a differenciál

diagnosztikában a SSK IIF technikát valamint immoblott és ELISA technikát alkalmazzuk. Az

SSK IIF során az EBA esetén az antitestek a dermális oldalhoz kötődnek. A rutin IIF technika az

esetek kevesebb, mint 50%-ban pozitív. [70,71,72]

Mivel az antigén-target BM komponensek szempontjából a BP és a az EBA betegek

között jól definiálható a különbség az értekezés tárgyát képviselő vizsgálatok során a BP beteg-

csoportot az esetleges EBA vagy EBA/overlap csoportoktól elkülönítetten vizsgáltuk.

- 30 -

A.2.3 Dermatitis herpetiformis Duhring

A dermatitis herpetiformis (DH) egy intenzív viszketéssel járó, krónikus glutén indukálta

autoimmun hólyagképződéssel járó kórkép, amely a dermalis papillák csúcsán történő szemcsés

IgA csapadékkal és lappangó coeliakia (CD) társulásával jellemezhető. A DH elnevezést Louis

Duhring alkalmazta 1884-ben herpetiform, hólyagos kórkép leírásakor [73]. Azt, hogy ezen

kórképben a bőrtünetek eltérnek a klasszikus hólyagos betegségeknél látottaktól (valódi hólyagok

csak ritkán láthatóak, szemben a viszkető, látványosan polimorf bőrtünetekkel), Brocq figyelte

meg. Mindkét bőrgyógyász érdemeit elismerve hívják a kórképet Duhring-Brocq betegségnek is. A.3.1. Klinikai kép

A DH a felnőttkor korai éveiben jelentkezik, de előfordulhat a gyermek- és időskorban is.

A DH betegekre leginkább az extensor felszíneken eloszló, a könyök és a térd felett intenzíven

viszkető csoportos erythemás papulák vagy vesiculák jellemzőek. A predilekciós helyek a

könyök, a térd, a váll és a lapockák, a hajas fejbőr valamint a fartájék. A jellemző viszketés

gyakran megelőzi a bőrtünetek kialakulását. Ritkábban látható nagyobb hólyag, azonban

általában kisebb, feszes falú, egymástól elszigetelten található vesiculák képződnek. A bőrön

sokszor csak excoriált erythemás papullák vagy erythema látható. [74,75,76]

A DH betegséghez lappangó coeliakhia (CD) társul, de a betegek általában nem mutatják

a jellegzetes gastrointestinális tüneteket. A DH betegekre általában jellemzőek a CD tünetek - a

jejunum lamina propria mononukleáris infiltráltsága mellett a villus atrophia, amelyek egy

biopszián fénymikroszkóppal még nem mindig detektálhatóak, így általában multiplex jejunális

mucosa biopszia vétele szükséges a CD tünetek morphológiai igazolásához. Ezért is jelentős az a

megfigyelés, hogy a CD (TGM, EMA) specifikus IgA festődés már diszkrét morfológiai

eltérések esetében is igazolja a diagnózist. [77,78,79]

A DH betegek kb. 10%-ában egyéb autoimmun kórképek, mint az autoimmun thyreoditis,

I. típusú diabetes mellitus, szisztémás lupus erythematosus (SLE), Sjögren-betegség, vitiligo is

előfordulhatnak. Ennek oka a genetikai predilekció, HLA-asszociációk, illetve a nem HLA-típusú

immungenomikai elemek, mint pl. bizonyítottan immunállapot-módosító szerepű toll-like recepor

(TLR), mannose binding lectin (MBL), tumor nekrózis faktor (TNF) polimorfizmusok [80,81],

valamint bizonyos interleukinok és receptoraik hajlamosító vagy védő alléljei által. A kezeletlen,

nem diétázó betegek hajlamosak malignus lymphomákra [82].

- 31 -

A.3.2. Etiopathogenesis

A DH (és a CD) kialakulását extrinsic és intrinsic faktorok komplex együttesének

eredményeként fogjuk fel. A betegség klinikai spektruma a kevés vagy csak néhány enyhe

tünettől a súlyos felszívódási zavarokig terjedhet [81].

Minden CD és DH betegben egyaránt kimutatható a HLA-DQ2 (95%) vagy -DQ8 (5%)

szerotípus, amely a DQA1*0501/DQB1*02 v. DQA1*03/DQB1*0302 allélek kombinációja.

Ettől eltérő HLA-adatokat bizonytottan csak a japán populációban írtak le. [83, 84]

A hátterében a glutén/gliadin peptidek eltérő antigén prezentációja állhat, autoimmun

gyulladásos immunválaszt váltva ki a vékonybél lamina propria kötőszövetei ellen.

A DH és CD betegek szérumában endomysium ellenes IgA antitestet (EMA) azonosítottak,

amely egyben érzékeny és specifikus módon alkalmas a CD betegek szerológiai azonosítására is.

Később bizonyítást nyert, hogy az EMA antigénje a szöveti transzglutamináz (tTG) gliadin

emésztés által indukált fő autoantigénje. Valószínűsíthető, hogy a gliadinok átalakításában

neoantigének generálása által vesz részt a pathológiai folyamatokban. [85,86]

A tTG irreverzibilisen köti a gliadint. Ezen permanens kötődésen keresztül az epitope

spreading mechanizmussal [60] válhat maga az enzim is a gliadin mellett szintén antigénné,

autoantigénné. Amennyiben az APC-k ilyen tTG-hez kapcsolt gliadin fragmentumokat dolgoznak

fel és mutatnak be az MHC-II-n, a T-sejtek és közvetítésükkel a B-sejtek válasza a gliadin és a

tTG ellen is irányulhat. A gliadinhoz való kötődés során, illetve a gliadin ellenes immunválasz

hatására további, a tTG addig rejtett epitópjai is feltárulhatnak. A tTG a hámban a basalis

keratinocytákban és a dermis endothel sejtjeiben is jelen van, ennek ellenére a DH betegek

papillaris dermisében lerakodó IgA precipitátumok mégsem tartalmaznak tTG-t. [87]

Emellett a DH és CD betegek szérumában antitesteket találhatunk egy másik a szöveti

formával nagyban homológ epidermális transzglutamináz (eTG) ellen is. Az eTG ellenes IgA

antitestek DH-ban nagy affinitást és aviditást mutatnak, amelyet a csak CD specifikus tünetekkel

rendelkező betegek esetében nem tapasztalunk. Bizonyítást nyert továbbá, hogy a papilláris

dermisben lerakódó IgA depozitumokkal kolokalizáltan, az ép bőrben nem kimutatható eTG

felhalmozódás észlelhető. Mindez valószínűsíti, hogy a DH tünetes bőrben IgA-eTG

immunkomplexek rakódnak le, valamint hogy a DH autoimmun targetje valójában az eTG. [88]

- 32 -

B. A TORQUE TENO VÍRUS (TTV)

1997-ben Nishizawa et al. transzfúzión átesett betegekből megemelkedett ALT szint

mellett egy addig ismeretlen vírusgenom eredetű szekvenciát izoláltak. A betegek esetében más,

klasszikus májgyulladást kiváltó (A-E hepatitis) vírus jelenlétét nem sikerült igazolni. A virális

szekvencia jelenléte akkor korrelálni látszott a hepatitis fennállásával. [89]

A reprezentációs differenciál-analízissel (RDA) kimutatott szekvencia az adatbázisok

semelyik másik vírus-, vagy egyéb genomjával sem mutatott azonosságot, ezáltal igazolódott,

hogy új virális ágenst sikerült izolálniuk. A vírust először az első páciens monogramja alapján TT

vírus névre keresztelték, később ez a rövidítés a transzfúzió transzmittálta vírus elnevezés

rövidítéseként volt ismeretes – az akkori elmélet alapján, mely szerint a vírus leginkább

transzfúzió útján terjedhet. Mai ismereteink szerint a vírus cseppfertőzéssel terjedhet. A vírust

később ismételten átkeresztelték, mai neve a Torque Teno vírus „vékony gyűrű” – amely egyben

a vírusgenom biokémiai felépítésére is utal. [90]

Az 1997-napjainkig terjedő időszakban a TT vírus intenzív kutatás tárgya, számos

földrajzi populációban és klinikai területen jelenléte, szerepe az egyes pathológiai folyamatokban

kivizsgálásra került. A nemzetközi adatok szerint a vírus meglepően magas arányban van jelen az

egészséges populációban is. A magas prevalencia, a TTV fertőzés stabilitása, és bármilyen

pathogenitás további bizonyítatlansága ún. kommenzalista vírust sejtet, amely a TTV ismerete

előtt vírusok szempontjából csak elméleti fogalom volt, bár más mikroorganizmusok esetében

nem ritka állapot. [90,91,92]

A következőkben röviden ismertetem a TT vírussal kapcsolatos általános kutatási

ismereteket, majd a vírusfertőzés klinikai aspektusait részletezem.

B.1. A TT vírusról felhalmozott ismeretek

B.1.1. A TTV szerkezeti felépítése

TTV felépítésével kapcsolatban vizuális képpel sokáig nem rendelkeztünk – a vírussal és

annak felépítésével kapcsolatban megismert legtöbb tényállás kísérletes eredetű.

- 33 -

- A TT vírus részecskeátmérője kb. 30-50 nm: TTV pozitív plazma ultracentrifugációs

kísérletsorozatban egyre szűkebb pórusokon fugálták keresztül a mintákat. A pozitivitás a

30 és 50 nm-es pórusátmérőjű szűrők közötti részre koncentrálódott. [93]

- A TT vírus nem rendelkezik külső lipidburokkal:

o Kimutták TTV-t az epében [94]

o A transzfúzió általi transzfekció lehetőségéből arra következtethetünk, hogy a

készítmények lipidburokkal rendelkező vírusokat inaktiváló szerei a TTV

virulenciára hatástalanok [95]

o A külön detergensekkel kezelt vérkészítmények recipiensei között is nagy

prevalenciával fordultak elő TTV fertőzöttek [96,97]

o Ulracentrifugációs izolációs kísérletben, ha a TTV pozitív frakciót lipid-struktúra

denaturáló szerrel (Tween 80) kezelik, a vírus ülepedése a továbbiakban nem

változik meg [98]

- A TT vírus genom egyszálú, kovalensen zárt, negatív polarizációjú DNS:

o A TTV genom integritását az RNase A és a legtöbb II. típusú restrikciós enzim

nem változtatja meg. [94]

o A vírus genomja szenzibilis a DNase I és a Mung Bean Nuclease egyszálú DNS

hasító aktivitásával szemben. [94]

o Hibiridizációs kísérletekben állapították meg a TTV genom DNS száljának

negatív polaritását. [94]

2000-ben sikerült TTV izolátumról elektronmikroszkóppal a vírusrészecskékről uranil-

acetátos festéssel képet készíteni. További elektronmikroszkópos vizsgálatokkal sikerült a vírus

átmérőjét pontosabban meghatározni, 30 nm körüli nagyságban.

11. ábra: A TTV vizualizálásának lehetőségei:

A: elektronmikroszkópia víruskoncentrált, radioaktívan jelölt plazmából [99]

B: fluoreszcens DNS hibridizáció fertőzött sejtekben [100]

- 34 -

B.1.2. A TTV taxonómiája

Azon vírusokat, amelyek kisméretű, egyszálú DNS genommal és külső lipidburokkal nem

rendelkeznek, a TTV felfedezésekor a Circoviridae családba sorolták. Ebben a taxonban addig

nem volt humán vírus ismeretes, ennek kapcsán felmerült, hogy a vírus más ultrastruktúrális

különbségeit figyelembe véve kerüljön új taxonba, amelynek a Circinoviridae nevet javasolták.

[93, 101]

A Circoviridae családban három, a gerinceseket megbetegítő vírust tartottak 1997 előtt

számon: a csőr és a tollak papagájoknál tapasztalt betegségét kialakító „beak and feather disease

virus”-t (BFDV), a sertések circovírusát (PcV), valamint a csirkék vírusos vérszegénységét okozó

„chicken anemia virus”-t (CAV). A BDSV és PcV vírusok nagyobb hasonlósága révén a

Circovirus genus-ba lettek sorolva, a CAV a Gyrovirus genus tagja. A Circoviridae taxon azon

tagjai, amelyek növényeket betegítenek meg, új csoportba, a Nanoviridae családba lettek sorolva.

A TTV megismerésekor a CAV mutatta vele a legtöbb genetikai rokon vonást: az újonnan

megismert vírushoz hasonlóan három nagyobb és több kisebb ORF-el rendelkezik. [102]

2000-ben került sor a TTV-hez nagyban hasonló, de méretében jóval kisebb vírus, a TTV-

like minivirus (TLMV) névre keresztelt ágens felfedezésére. A leírók javasolták, hogy a CAV,

TTV és TMV vírusokat egy új taxonba különítsék el, melynek akkor a Paracircoviridae nevet

javasolták. [103,104]

2002-ben javasolták a TTV és TLMV külön genusba sorolását. Az új genus nevének az

Annellovirus (kis gyűrű) megnevezést javasolták. Ezt a javaslatot a Vírus Taxonómia Nemzetközi

Bizottsága (ICTV) később elfogadta, a genust azonban a Circoviridae családból kiemelte. A

jelenleg is érvényben lévő „VIIIth ICTV Értekezés” alapján a TTV és TLMV családhoz hozzá

nem rendelt Anellovirus genus tagja, 00.107.0.01 taxon azonosító jelzést viseli. [99]

B.1.3. A TTV genomi felépítése, genomi funkciók

1999-ben 10, 2004-ben 61, 2007-re 73 teljes vagy majdnem teljes genomi szekvencia

ismeretes különböző TTV vírus izolátumokról. Számos altípus adatai szerepelnek az

adatbázisokban, ezeket egy bizonyos ideig genotípus csoportokba sorolták. A nagy genomi

- 35 -

eltérésekre hivatkozva az izolátumok egy részét több szerző a TTV-től eltérő fajként kezeli (SEN,

YONBAN, SANBAN vírusok), ezeket azonban az ICTV még nem erősítette meg [105,106].

12. ábra: A TTV genomi felépítése

A TTV genom mérete kb. 3,6-3,8 kb., funkció szempontjából két részre osztható. A

kódoló szakasz, mely a fehérjéket kódoló ORF-ket tartalmazza a kb. a 2/3-a, míg a genom

fennmaradó 1/3-a nem kódoló, átíródó szakasz (UTR). Az UTR GC-gazdag DNS régiónak

bizonyult, amely egyszálú másodlagos ún. stem-loop (hajtű) struktúrák kialakítására is képes

lehet, ezáltal megnehezítve a szekvenciájának pontos meghatározását. Ezen nehézségek miatt

feltételezték az első időszakban, hogy a TTV genom lineáris. Ebben a szakaszban találhatjuk meg

a genom funkcionális elemei közül a TATA és a CAAT boxokat, amelyek a kódoló szakaszok

átírásához szükségesek. A TTV vírusgenom leginkább konzerváltnak tűnő szekvenciarészlete –

az izolátumok között bizonyos részletekben 80-90% általános azonosságot találhatunk. Jellemzői

a „inverted repeat” szekvenciák – rövid közel-azonos szekvenciák invertáló ismétlése. [107-110]

A TTV kódoló genom-régiójában több ORF található. A legnagyobb, valószínűsíthetően a

kapszid fehérjét (ORF1) kódoló szakasz kb. 2,3 kb.-nak felel meg, 760-770 körüli aminosav-

számmal bíró fehérjét kódolhat. Vizsgálatok alapján ez a fehérje szekvencia és struktúra alapján

is rokona lehet a CAV VP1 kapszid-fehérjének – kiemelendő a hasonlóság az N-terminális

közelében található arginin-gazdag régióval. [111,112]

A korai in silico vizsgálatok további két, egy kb. 150 és egy kb. 57 aminosavból álló

fehérjét kódoló régiót azonosítottak. Ezt követően sikerült COS-1 sejtekben in vitro expressziós

technikával meghatározni az előbb megnevezett cisztronokkal azonos régióban, de eltérő frame-

ben leolvasott további ORF-ket, így ma 5 TTV-ORF potenciális létezéséről tudunk, amelyek

- 36 -

közül azonban nem mindegyik mutatható ki minden ismert izolátumban. A vizsgálat során az is

kiderült, hogy a TTV replikációja során előállított pozitív szálról mRNS nem keletkezik.

Az 5 potenciális ORF-ből 4 szerepe nem pontosan ismert. Az ORF2 kódolta fehérje

esetében struktúrproteint feltételeznek. A többi kisebb fehérje valószínűsíthetően replikációs

elem, ún. Rep fehérje lehet. Ilyen kódolt fehérjéket más, a Circoviridae családba sorolt vírusoknál

is észleltek. Érdekesség, hogy míg a TTV DNS 3 különböző mRNS-t kódolhat , addig a CAV

vírus egyetlen a negatív szálról származó policisztronos mRNS-sel rendelkezik, a PCV pedig

kétféle mRNS-t ír át, egyet a negatív és egyet a pozitív szálról. Ebből arra kell következtetnünk,

hogy a genomi felépítésben és struktúrálisan rokon vírusoknak felfogható csoportok között is

nagyban eltérő molekuláris mechanizmusok, stratégiák érvényesülnek mind a genomi

funkcionalitásban, mind a replikáció terén. [113,114]

B.1.4. A TTV replikációja, a vírus szaporodása

A replikációs mechanizmus, amellyel a TTV sejtekben szaporodni képes, nem ismert. A

lehetséges mechanizmusokra a hasonló felépítésű Circoviridae családba tartozó vírusokról

felhalmozott ismereteink alapján vonhatunk le következtetéseket. Sajnos a Circoviridae

replikációjára vonatkozó ismereteink sem minden részletre kiterjedőek.

A circovírusok a sejtmagban szaporodnak, replikációjuk a sejt ciklusának „S” fázisában

termelt fehérjéitől független. [115, 116] A TTV genom nem kódol olyan fehérjét, amely jelen

ismereteink alapján bármilyen nukleinsav-polimeráz aktivitású fehérjével homológiát mutathatna,

így feltételezhetően a vírus a sejtben megtalálható polimerázait használhatja fel replikációjához.

Más elméletek szerint a vírusnak ún. helper-vírusra van szüksége a szaporodásához. [93]

A replikáció mechanizmusával kapcsolatban többször felmerült a vírusnál tapasztalt

genomi heterogenitásával kapcsolatban a replikáció pontosságának illetve a hibajavítás hiányának

kérdése. A replikációs mechanizmus, és egyáltalán a polimeráz aktivitású replikációs enzim

ismeretének hiányában a kérdés a jövőbeli kutatások tárgya marad. [97]

Egyes szerzők szerint az ORF1 felépítése és a kisebb ORF-k valószínűsíthető funkciója

alapján a replikáció a „rolling cycle” modell egy variánsa lehet. Ez ellen szól, hogy bizonyos

nonanukleotid motívumok, amelyek a „rolling cycle”-t használó vírusok esetében jelen vannak,

itt hiányoznak. [116]

- 37 -

Biztos pontnak tűnik a replikációt illetően, hogy stabil, de ideiglenes kettős-szálú genomi

formát involvál, amelyet sikerül többféle szövetmintából is kimutatni – ezzel nagyban gyengítve

azon hipotézist, hogy a TTV egy hepatitis vírus. A replikáció helye, esetleges sejti, vagy szöveti

specifikussága nem ismert. TTV replikációt sikerült a csontvelőből ill. csontvelői eredetű

sejtekből is kimutatni. Szokatlan, hogy a vírus szaporodása csak aktivált fehérvérsejteken volt

kísérletesen bizonyítható. [117]

A vírus a replikációt ill. a vírusfehérjék transzlációját követően a citoplazmában állhat

össze fertőzőképes virionná, valószínűleg „inclusion body”-kat képezve, majd a sejtek lízisével

kerülhet ki a sejtek környezetébe. Sikerült kimutatni egy olyan 105 aa nagyságú TTV eredetű

fehérjét, amely a hepatocelluláris carcinoma sejtvonalakban bizonyítottan képes volt apoptózist

indukálni. A TAIP (TTV-eredetű apopotózist indukáló protein) homológ a CAV VP3 (apoptotin)

fehérjével, amely a p53 független apopózis útvonalat képes indukálni. Mivel az apoptotin egy

potenciális új citosztatikum lehet, a TAIP fehérje aktivitását is megvizsgálták számos más

sejtvonalon is, azonban jóval kevésbé effektív apoptózis-indukáló potenciált észleltek. Bizonyos

fokú szelektivitást is megfigyeltek a májsejt carcinoma eredetű sejtvonalak irányában. [118-120]

B.1.5. A TTV genom heterogenitása

A genomi heterogenitás főleg az RNS genomú vírusokra jellemző, de a TTV-nél is

tapasztalható, ezzel a tulajdonságával a TTV nagyban különbözik a többi DNS vírustól. Az RNS

vírusok heterogenitásának biokémiai oka a RNS-dependens nukleinsav-polimeráz enzimek

viszonylagos másolási pontatlansága valamint esetlegesen a hibajavítási funkció kiesése. A TTV

esetében tapasztalt heterogenitás egyik okaként a másolási pontatlanságot tartják számon, de

felmerült egy esetleges RNS intermedier szerepe is. [121]

A heterogenitás eloszlása a teljes genomon egyenlő mértékű. Két izolátum teljes genomi

szekvenciája akár több mint 50%-ban is eltérhet egymástól, az UTR-ben az eltérések ált. 70-75%

körül jelentkeznek. [107,122]

A TTV izolátumok csoportosítását Okamoto et al. kezdeményezte az N22 régió alapján:

amely az ORF1 viszonylagosan konzervált régiójának 30%-on felüli eltérésekor új genotípust,

15%-os eltérésekor új altípust azonosított. A későbbiekben rengeteg genotípus azonosítására sor

került, amelyeket 5 fő csoportra ún. genocsoportra osztottak szét. Mivel a fertőzési lehetőség

- 38 -

folyamatosnak tekinthető a genotípusok keverednek, a gazda egyszerre nem csak egy

genocsoport elemét hordozhatja. Az egyes genocsoportok és azok kombinációik hordozói eltérő

plazma vírus-szintet mutatnak újabb közlések szerint. [93, 107, 123- 125]

Az egyes csoportokon belüli heterogenitást fokozza az a tény, hogy akár a különböző

genocsoportokba tartozó vírusok is képesek a genetikai rekombinációra [125, 126].

- 39 -

B.2. A TTV fertőzés klinikai jelentősége

B.2.1. A TTV fertőzés kimutatása, diagnosztikai módszerek

A TTV fertőzés diagnózisának felállítása napjainkig nehézségekbe ütközik. Ennek okai:

1.) nem ismerjük a fertőzés célsejtjeit vagy szöveteit – annak ellenére, hogy számos szövetből

kimutattak a vírus DNS replikációs intermedier duplaszálú formáját és TTV eredetű RNS-t;

2.) a TTV ellenes immunválasz formája és természete korántsem ismert, így még nem tudjuk,

hogy az egyes vírus ellenes antitesteknek milyen szerepe lehet a klinikai diagnosztikában. Olyan,

rutinszerűen alkalmazható szerológiai módszert nem írtak még le, amely virális eredetű antigént

felismerő ellenanyag v. akár a virális antigének kimutatására alkalmas a plazmában, sem olyan

diagnosztikai PCR metodika nem került bevezetésre, amely a TTV jelenlétet genocsoportjától

függetlenül kimutatja.

A kimutatás a felfedezéstől számító korai szakaszban tradícionálisan az N22 régióra

korlátozódott nested és seminested PCR technológiával történik. Az UTR szerkezetének

megismerése után erre a régióra is terveztek rendszereket, azzal az előnnyel, hogy itt a

szekvencia állandóbbnak bizonyult. [93, 122, 126]

Amíg az N22 PCR csak 1-6 genotípusokat ismerték fel, addig az UTR PCR-ek már több

mint 16 genotípus azonosítására alkalmasak voltak. Így emelkedhettek az azonos csoportokon

eltérő szenzitivitással végzett vizsgálatok 20% prevalenciáról 80-90% körülire. A hagyományos

nested és heminested PCR-ek szenzitivitási határa kb. 102-103 genomi kópia/ml. [127, 128]

A real-time technológia bevezetésével az érzékenységi határ kitolódott, megvalósult a

kvantifikálás lehetősége 102-109 kópia/ml tartományban sikerült kvantitatív vírus-

meghatározásokat végezni. [103]

A vírus jelenlététét szinte az összes testfolyadékból és váladékból kimutatták, de

megtalálták torok és orrleoltásokon és az anyatejben is. [128-133]

- 40 -

B.2.2. TTV epidemológia

B.2.1. Földrajzi megoszlás

Világszerte magas prevalencia-adatokat mérnek. A legtöbb országban, melyben TTV

vizsgálatokat végeztek kiderült, hogy a probandok 60-80%-a vírushordozó. Különösen magas a

hordozók aránya Japánban, Szaudi-Arábiában és Szingapúrban, ahol szinte mindenki hordozni

látszik a vírust. Az észak-amerikai lakosság körében végzett vizsgálatok alapján az afro- és

asioamerikai népesség körében magasabb a fertőzöttség aránya, mint a kaukázusi eredetűekben.

[133]

Eltérő viszont a genocsoportok és genotípusok földrajzi megoszlása. Az 1. és 2. genotípus

világszerte előfordul, míg a többi viszonylagosan ritkább, bár földrajzi izoláltságot nem mutat.

Nem ismeretes minden esetben, hogy az alkalmazott metodikák mennyiben favorizálnak egy-egy

variánst, ami ezáltal módszertani műtermékhez vezethet ebben a kérdésben. [124, 134]

B.2.2. Transzfekció

A TTV felfedezése utáni közvetlen időkben az általános vélemény szerint a vírus fertőzött

vér és plazmakészítményeken keresztül kerülhet a humán szervezetbe. Ezt az elméletet akkor a

transzfúzion átesetett betegek és az intravénás drogokat használók körében tapasztalt magas

prevalencia értékek támasztották alá. [135-138]

Újabb adatok szerint a TTV cseppfertőzéssel is terjedhet. A fertőzés a különböző

genetikai állományú ágensekkel valószínűleg folyamatos, így a csoportok koinfekciója alakulhat

ki. Más szerzők szerint a TTV az enterális fertőzési stratégiát használhatja – megfigyelték

például, hogy magasabb prevalenciát észlelnek azoknál, akik hepatitis A ellen antitestekkel

rendelkeznek. Ezekre és hasonló adatokra alapozva felmerült a TTV, mint lehetséges jövőbeli

marker szerepe ivóvíz és élelmiszer készletek enterális kontamináltságának, szennyezettségének

kimutatására (pl. az Escherichia coli is egy ilyen bakteriális marker). [139-142]

Vizsgálták a vírus átvitelt anya és gyermeke közt. Az első vizsgálatok fertőzött anyák

esetében sem a köldökzsinór vérből, sem pedig az újszülött véréből nem mutatták ki a vírust –

amelyek kapcsán kizárták a fertőzés lehetőségét. A későbbi, szenzitívebb technológiák használata

- 41 -

azonban rácáfolt erre a kijelentésre: sikerült mind az intrauterális, mind a perinatális anya-

gyermek átvitel lehetőségét bizonyítani. A gyermekkorban az infekció veszélye úgy tűnik, hogy

a környezet fertőzöttségének függvénye, minthogy a gyermekkori fertőzések vizsgálatakor

sikerült az életkorral összefüggést kimutatni. [143-151]

A szexuális úton való terjedés lehetőségét az eddigi vizsgálatok kizárták. Mivel a TTV-t

előzőleg bőrben, a hajszálakban, a nyálban és a garat felületéről is kimutatták, megvizsgálták,

hogy a háztartási környezet kedvez-e a fertőzésnek, de nem találtak erre utaló jeleket. [138, 147]

Időközben felfedezték, hogy számos más gerinces is rendelkezik a TT vírus fajspecifikus

megfelelőjével. A zoonotikus transzfekció lehetőségét mégis elvetik a vizsgálatok, mivel a

különböző fajokban a vírus azonosított izolátumai nagyban eltérnek az eddig az embert fertőző

izolátumokétól, még inkább, mint azok egymástól. Az evolúciós léptékben közelálló fajok

párhuzamos vizsgálatának eredményei alapján feltételezhető, hogy a TT vírus és gazda-fajai

hosszabb időintervallumban együtt evolválódtak, és divergáltak. A közeli fajok esetében a

transspecifikus fertőzés lehetősége azonban nem kizárt. Egy specifikusan majom eredetű ún. s-

TTV (simian TTV) embereket is képes volt megfertőzni, a májbetegségekben és kontroll

személyeken történt vizsgálatakor 10,5%-os pozitivitást tapasztaltak a betegek és 1% körülit az

egészséges személyek körében. [152,153]

B.3. A TTV pathogenitás

B.3.1 Orphan virus?

A mai napig nem sikerült olyan klinikai manifesztációra rámutatni, melyek egyértelműen

a Torque Teno vírushoz köthetőek. Ez és a tény, hogy prevalenciája az egészséges populációban

is magas, sokakat arra enged következtetni, hogy a vírus pathogenitási hajlama roppant csekély.

Publikálásra került olyan hipotézis is, mely szerint a TTV a normális emberi mikroflóra része.

Megemlítendő azonban, hogy számos más vírussal kapcsolatban évekig állt fenn az „orphan

virus” teória, amíg valós szerepűket az általuk okozott betegségek pathomechanizmusában fel

nem ismerték, pl. bizonyos Adenovirusok, a Parvovirus B19, az EBV, a Herpesvirus 6 és a 7.

- 42 -

Sikerült azonban a TTV-hez hasonló PCV-hez a sertések PMWS (postweaning

multisystemic wasting syndrome) betegségét hozzárendelni, amelyben lymphadenopathia mellett

máj-, vese, gyomor-, szívizom és tüdőgyulladás is kialakulhat. [154-156]

B.3.2. Hepatitis kórokozó?

A vírust felfedezése óta emelkedett ALT szinttel járó krónikus Non-A-non-G (NANG)

hepatitis lehetséges kórokozójaként tartják számon, bár ennek teljeskörű bizonyítása nem történt

még meg. Fulmináns májelégtelenség mortalitásának vizsgálata során az elhunyt

májtranszplantált betegek 100%-a volt TTV pozitív (ezen betegek sok vérátömlesztésen estek át),

míg az egészségeseknek csupán 50%. [157, 158] Egyes szerzők szerint már a májenzimek

átmeneti és enyhe megemelkedése is TTV fertőzéssel összefüggésbe hozható jel lehet.

A következő tények szólnak a TTV: májgyulladás-ágens teória ellen:

• A TTV prevalencia nem csak a májbetegek körében, hanem a normál

populációban is igen magas.

• A vérzékenységben szenvedő betegek vizsgálatakor a pozitív és negatív betegek

nem mutattak az ALT szintben eltérést. [133, 159]

• A polytranszfundált betegekben nem volt korreláció a HV negatív májgyulladás

kialakulása, ill. nem volt különbség kimutatható az igazoltan TTV pozitív és a

TTV negatív betegek ALT szintje között. [160-165]

• Az állatkísérletekben TTV-vel művileg fertőzött csimpánzok esetében nem

találtak sem biokémiai, sem hisztológiai májgyulladás kialakulására utaló nyomot.

[93, 166]

• HCV és TTV koinfekció esetén az interferon terápiával a TTV-t eliminálni

lehetett, de az ALT szint nem normalizálódott egészen a HCV kimutathatósági

határ alá szorításáig. [165, 167-171]

• A TTV szaporodást mutató, genetikai formáit számos szövettípusból - a májból is

- de többek között a fehérvérsejtekből is kimutatták.

Mindezek összefoglalásaképpen elmondható, hogy a TTV valószínűleg képes a máj

gyulladását kiváltani, csakúgy, mint ahogy egyes Enterovírusok, Adenovírusok, CMV, EBV és

- 43 -

influenzavírusok is képesek az általuk megfertőzött betegek egy részében átmeneti, változó

mértékű májfunkciós zavarokat előidézni.

A májgyulladást potenciálisan kiváltó virális vagy gazdaspecifikus determinánsok

ismeretlenek, a májgyulladás autoimmun eredete sem kizárt. Bizonyos elméletek szerint a TTV-

nek csak néhány alcsoportja hepatotrop, míg mások véleménye szerint a májgyulladás vagy

bármilyen más pathogenitás kiváltásához a szervezetnek a TTV mellett egyéb vírussal való

felülfertőzése is szükséges. [93]

B.3.3. A TTV és az immunrendszer kapcsolata

B.3.3.1 A TTV – gazdaszervezet ill. a gazdaszervezet immunrendszerének kapcsolata

A vírust a szervezet a fertőzés után évekig hordozza. Olyan esetről is beszámoltak,

amelyben a gazda már valószínűleg 22 éve fertőzött volt. Valószínű, hogy a vírus a szervezet

nem tudja kellően eradikálni, és a hordozás egy életen át fennmarad. [161, 172]

A TTV virémiát HCV pozitív betegekben interferon kezeléssel vissza lehetett szorítani,

csupán a perifériális monocytasejtek izolátuma mutatott alacsony víruskoncentrációt. Ebből az

eredményről arra is lehet következteteni, hogy a virémia kvázi rezervoár-sejtjei a monocyták

lehetnek. [100, 111]

Az interferon terápia kapcsán vált ismertté az a tény is, hogy naponta kb. 1010 TTV virion

keletkezik. Bár a plazmából ennek 90%-a eliminálódik, rövid időn belül azonban újratermelődik.

Számos szerző beszámol a virémia önlimitáló voltáról: a betegség hetekkel, vagy

hónapokkal később vett mintákból már nem volt kimutatható. Művileg fertőzött csimpánzok

hónapok alatt eliminálták a TTV-t. Ezen eredmények értékelésekor azonban nem szabad

figyelmen kívül hagyni, hogy a tapasztaltak lehettek kis vírusszámmal történt fertőzés

következményei, vagy pedig a folyamatosan változó TTV genom mutációi okozhatták a vírus

„eltűnését” vagy kimutathatatlanná válását. [161]

A TTV elleni immunválasz nem ismert kellően. Mivel mindeddig immunogén virális

antigén kimutatása nem volt lehetséges, a TTV-immunitás vizsgálata nehézkes: számos - pl. a

viszonylagosan konzervált N22 régióból - rekombinánsan előállított fehérjével szemben a

fertőzött egyed széruma Western blotton negatív volt. [92]

- 44 -

Vizsgálták a TTV és a fehérvérsejtek kapcsolatát is. Régóta ismert tényező, hogy a vírus a

magában a csontvelőben, csontvelői eredetű sejtekben, a lymphoid szövetekben és a perifériális

vér monocytáiban és lymphocytáiban is – újabb eredmények szerint csak az aktivált sejtekben -

képes a szaporodásra. [100,117] Ez az eredmény többféle képpen is értelmezhető, egyesek a TTV

fertőzés és bizonyos ismeretlen eredetű immunszuppressziós állapotok kapcsolatának

tulajdonítanak szerepet, míg mások az autoimmunitás szerepével magyarázzák. Tény, hogy

számos szisztémás autoimmun betegségben (RA, SLE) figyelték meg a lymphocyták kóros

viselkedését, valamint a sejtaktivációt követő eltérő apoptotikus folyamatokat, melyek

hozzájárulhatnak az immunrendszer kóros túlműködéséhez ezekben a kórképekben. Emelkedett

TTV prevalenciát lymphoproliferációs zavarokban is kimutattak [173,174].

Érdekes, nem vizsgált kérdés, hogy a lymphocytákban is szaporodó TTV, apoptózist

generáló apoptotin homológ fehérjéjén keresztül mennyiben járulhat hozzá e

funkciómódosulásokhoz. [118-120]

Seropozitív betegek vizsgálata során a TTV-t IgG-immunkomplexek formájában is

kimutatták a vérben. Ennek ismeretében kiemelt fontosságúak lehetek azon kutatások, melyekben

a krónikus előfordulású immunkomplexek etiopathogenetikai szerepét vizsgálják

(glomerulonephritis, vasculitis, bizonyos autoimmun kórképek). A szérum TTV-IgG komplexek

vizsgálatakor az is kiderült, hogy a vírusrészecskék nagyobb számban kötődtek az

immunglobulinokhoz, de csak a krónikus vírushordozáskor, mivel a frissen fertőzött betegeknél

ez nem volt megfigyelhető. [177,178]

B.3.3.2 A TTV és az autoimmunitás lehetséges kapcsolatai

A közelmúlt prevalencia adatai mutattak rá a vírus és az autoimmunitás lehetséges

kapcsolatára. A feltételezett összefüggést alátámasztja a vírus fent már leírt kapcsolata az

immunrendszer sejtjeivel, másrészt a szaporodás kapcsán megfigyelt genom-heterogenitással.

A vírus hosszú perzisztenciájának egyik oka lehet, hogy sikeresen kivédi az

immunrendszer eradikációs kísérleteit. A vírusok több ismert mechanizmussal képesek

„megszökni” az immunrendszer elől. [150, 151]

B.3.3.2.1 Bystander aktiváció

- 45 -

Sospedra és mtsai. a sclerosis multiplexben szenvedő betegekben kialakuló CD4+ T-sejtes

autoimmunitás környezeti triggerelő faktorait vizsgálta. Vizsgálataik során a központi

idegrendszer szöveteit infiltráló, neurotropismust mutató specifikus T-sejt klónok specificitását

illetve keresztreakcióit is tanulmányozták. Ezen klónok felismertek bizonyos TTV vírus eredetű

peptideket.

A felismert peptidek 96.2%-a TTV genom ORF1 fehérjének N-terminális 74 aminosav

régiójának konzervált, arginin-gazdag régiójából származott. Ez a régió T-sejt aktivátornak

bizonyult. További fontos tény, hogy ezen arginin-gazdag régió a humán toll-like receptor 9

(TLR9) szubsztrátja lehet, amely szintén intenzíven kutatott feltételezett autoimmunitást indukáló

tényező. [179]

B.3.3.2.2 Molekuláris mimikri

Egy feltételezett módja az autoimmunitás kiváltásának a pathogének által az ún.

molekuláris mimikri alkalmazása, mely során a pathogén a gazdaszervezet saját molekuláihoz

válik hasonlatossá – ez különösen a gyors generációs turnoverű vírusok esetében alkalmazható –

mely a TTV-nél is megfigyelhető. A molekuláris mimikri az immunrendszer toleranciájának

megszűnéséhez vezethet a „lemásolt” fehérjével kapcsolatban. [180]

A TTV vírus a gyors ciklusú szaporodása és heterogenitása révén könnyen

„alkalmazkodhat” környezetéhez, ami gyors evolúciót tesz lehetővé. A „másolás” folyamatára

szelekciós nyomás nehezedik –. A fertőzőképesség és a funkció megtartása mellett a szekvenciák

változatossága plusz előny a vírus számára. Az immunrendszer elől legsikeresebben megszökő,

legfertőzőképesebb víruscsoportok szaporodnak tovább és gyorsabban.

A TTV prevalencia számos autoimmun eredetű betegségben meghatározásra került,

elsősorban olyan ismeretlen etiopathogenezisű betegségekben, melyekben környezeti faktorként

felmerül a vírusok triggerelő szerepe. [179-183]

Nemzetközi publikációkban a RA, osteoarthritis (OA), sclerosis multiplex (MS),

autoimmun hepatitis, SLE és idiopathiás myopathiák (dermatomyositis és a juvenilis

dermatomyositis) által érintett betegek kapcsán vizsgálták meg a TTV prevalenciát, melyek közül

az SLE kivételével egy esetben sem sikerült emelkedett prevalenciát kimutatni.

- 46 -

Kiemelendő, hogy bár a myopathiák vizsgálata során nem tapasztaltak emelkedett TTV

prevalencia értékeket, azon betegek körében, akiknél a betegség súlyossága immunszuppresszív

terápiát igényelt, a TTV pozitivitás szignifikánsan magasabb volt. Szintén megjegyzendő, hogy a

juvenilis dermatomyositis esetében, bár a betegszám (n=6) alacsony volt, 100%-os pozitivitást

észleltek. [181, 182]

- 47 -

III. BETEGANYAG ÉS MÓDSZEREK

III.1 BETEGEK

Az autoimmun hólyagos bőrbetegségekben szenvedő magyar betegek klinikai diagnózisát

a Semmelweis Egyetem Bőr-, Nemikórtani és Bőronkológiai Klinika orvosai állították fel.

A vizsgálatokhoz a magyar populációból kiszűrt bullosus pemphigoid (n = 40, átlagéletkor

74,3 ± 11.0 év, 11/40 ffi), pemphigus vulgaris (n = 33, átlagéletkor 56.8 ± 13.65 év, 12/33 ffi),

dermatitis herpetiformis (n = 20, átlagéletkor 48.3 ± 8.2 év, 10/20 ffi), valamint két egészséges,

önkéntes kontroll csoport (K1: n = 95, átlagéletkor 41.5 ± 11.2 év, 43/95 ffi; K2: n = 50, átlagéletkor

70,09 ± 9.65 év, 9/50 ffi) szérummintáit izoláltuk és tároltuk el.

Továbbá 4 BP beteg (n=4, (B1-4) átlagéletkor: 58 ± 6,2 év 4/1 ffi) és 3 kontroll személy (K1.3

átlagéletkor: 49.5 ± 11.2 év 3/0 ffi) limfocitáit izoláltuk további kísérletekhez. B3 személy esetében

a BP-n túl gyulladásos bélbetegség diagnózisa is fennáll.

A BP diagnózis felállítását a bőrminta rutin fénymikroszkópos szövettani, direkt

immunfluoreszcens vizsgálatával, valamint a vérben a basalis membrán ellen irányuló keringő

IgG típusú ellenanyagok jelenlétének indirekt immunfluoreszcenciával történő kimutatására

alapoztuk. Az autoantitestek molekuláris targetjeinek verifikáláshoz Western blott és ELISA

vizsgálatokat végeztünk japán kollaborációban.

A PV betegek diagnózisa hasonlóképpen a bőr rutin fénymikroszkópos hisztológia és

direkt immunfluoreszcens vizsgálataira alapozva került felállításra, melyet a vérben keringő, anti-

dezmoszómális ellenanyagok jelenlétével is igazoltunk.

A DH betegek diagnózisát a bőr rutin szövettani és direkt immunfluoreszcenciás

vizsgálataira, valamint a keringő endomysium ellenes antitestek kimutatására alapoztuk. A

keringő anti-gliadin és anti-TGc ellenanyagok jelenlétét ELISA módszerrel igazoltuk.

A kontroll szérum minták önkéntes donoroktól származnak. Két különböző kontroll

csoport mintáit vizsgáltuk – az első csoport (K1) korban és nemben a teljes, az összes autoimmun

beteget tartalmazó csoporthoz korban és nemben illesztett csoportként került összeállításra. A

második csoport (K2) kifejezetten a BP csoportnak megfelelő kor-, és nem illesztés szerint került

kialakításra, mivel a vizsgált BP betegcsoportban az átlagéletkor jóval magasabb volt a betegség

késői manifesztációja révén. Ebbe a csoportba 60 év feletti önkéntes donorokat válogattunk.

- 48 -

III.2 Direkt immunofluoreszcencia (DIF)

A direkt immunfluoreszcencia vizsgálatokat bőrbiopsziás minták 4-6 μm vastagságú fagyasztott

metszetein végeztük. A biposziás minták a perilesionális területről, lokál anaesztézia mellett

kerültek kimetszésre. A metszetek vizsgálata fluorescein-isothiocyanate (FITC) konjugálta

humán C3, IgA, IgG és IgM elleni kecske antitestek felvitelével és kötődésük vizsgálatával

történt. A vizsgálat során (kivéve a C3 esetében) a szövetben in vivo ellenanyagok kimutatását

végezzük, az antitest konstans FC része ellen irányuló másodlagos ellenanyaggal. A

leggyakrabban vizsgált bőrminta mellett ritkábban conjunctiva, szájnyálkahártya, továbbá bél

készült metszetekkel is dolgozunk. A bőrminták, illetve szubsztrátumok kimosására és a

reagensek hígítására alkalmazott NAIRN-féle módosított foszfát puffer (PBS) összetétele: 7,891

g NaCl, 1,282 g Na2HPO4, 0,386 g Na2PO4.2H2O, ad 1000 ml desztillált víz; (0,01 M; pH=7,4).

III.3 A keringő ellenanyagok kimutatása

Módszereink:

• Indirekt IF vizsgálat: A vizsgálandó szérumban jelenlévő, keringő ellenanyagok

kimutatását végezzük specifikus metszeten a vizsgálandó antitest ellenes,

flureszcens festékkel jelölt antihumán ellenanyag segítségével. Leggyakrabban

majom vagy nyúl esetleg tengerimalac nyelőcső metszeteket és normál humán bőrt

használhatunk.

Vizsgálatainkat minden esetben egészséges beteg savójával készített negatív, és az

igazoltan autoimmun bullosisban szenvedő beteg pozitív savójával kontrolláljuk.

III.3.1. Endomysium ellenes keringő antitestek vizsgálata

A kezeletlen DH betegekben keringő specifikus, IgA típusú antitestek kimutatását majom

nyelőcső metszetein mutatjuk ki. A majom nyelőcső simaizom rétegéhez kötődő ellenanyagok

vizualizálása FITC-cel jelzett, kecskében termelt antihumán IgA ellenanyagok (DAKO/Dánia)

segítségével történik.

- 49 -

III.3.2. Bazálmembrán elleni keringő ellenanyagok vizsgálata

Pemphigoid csoportba tartozó kórképek gyanúja esetén az IIF vizsgálatot általában

majom, néhány esetben nyúl nyelőcsövön és normál salt-split humán bőrön végezzük el. A BM

ellenes antitestek kimutatására FITC-cel jelzett kecske, antihumán IgG és IgA (DAKO/Dánia)

ellenanyagokat, a rutin vizsgálatok negatív eredménye esetén, illetve herpes gestationis

felmerülése során a megfelelő alcsoportú (IgG1, IgG4, IgA1), jelzett antitesteket is használjuk.

Az antigének specifikus azonosítására ELISA és immunoblot módszert is alkalmaztunk (lásd

később).

III.3.3. Dezmoszómák elleni keringő ellenanyagok vizsgálata

Az IIF vizsgálatot PV esetében majom, PF esetén majom és tengerimalac nyelőcsövön

végezzük. Az antitest ellen termelt, jelölt Ig FITC-cel jelzett, kecske IgG és IgA (DAKO/Dánia)

molekula.

III.3.4. Salt-split skin módszer

A Gammon és mtsai. [70] által leírt indirekt salt-split bőr módszer alkalmazása során

egészséges egyénből származó, 1 M-os NaCl oldattal hasított bőrmintához adjuk a hólyagos

beteg keringő antitesteket tartalmazó szérumának hígítási sorát. A módszer biokémiai alapja,

hogy az 1 M-os NaCl oldatban inkubált bőrben a basalmembránban (BM) a lamina lucida (LL)

mentén a kapcsolódásért felelős fehérjék destabilizálódnak, a bőrminta epidermális és dermális

részekre válik szét. A LL alkotóelemei szétválnak, részben a hólyagfedélen, részben a

hólyagalapon mutathatók ki, míg a lamina densa (LD) a hasadék dermális felszínén marad. Így

lehetővé válik a BM elleni antitestek kötődési helyének a lamina lucidához viszonyított

meghatározása. Az epidermalis oldalon (hólyagfedélen) mutathatók ki a basalis keratinocyták, a

sub-basalis dense plate (SPD), a BP180, BP230, az anchor filamentumok és az α6β4 integrin. A

dermális oldalon (hólyagalapon) marad a laminin 5, kollagén IV, kollagén VII (anchor rostok). A

módszer egyszerű, jól reprodukálható, hasznos az autoimmun bullosisok differenciálásában;

- 50 -

elsősorban a bullosus pemphigoid (BP), az epidermolysis bullosa acquisita (EBA) és az anti-

epiligrin ellenanyag indukálta bullosus dermatosis elkülönítésében használatos.

III.4. BP180 immunblot technika

Az immunoblott technológia alkalmazását, a vizsgálat kivitelezését a japán kollaboráns

partnerrel közösen végeztük. Az immunoblott metodikát, amely a BP180 részletek elleni speciális

reaktivitást hivatott igazolni, normál humán epidermális extraktumok és rekombináns, heterológ

termelésű BP180 NC16a ill. C-terminális domén peptidek felhasználásával készült a japán

kollaboráns partner segítségével, valamint mivel korábban publikálásra került, ezért ezt nem

részletezem.

III. 5. BP230 ELISA

Az ELISA érzékeny, aránylag egyszerűen végezhető, könnyen reprodukálható szerológiai

módszer. Műanyag (polisztirol) vagy üveg lemezek vájulataiba adszorbeáljuk a megfelelő

antigént, majd inkubáljuk a vizsgálandó savóval. Mosás után újabb inkubálás történik, ezúttal egy

enzimmel jelölt antihumán ellenanyaggal. Az eredményt színreakció leolvasásával kapjuk meg,

kvalitatív vizsgálatkor szabad szemmel, kvantitatív vizsgálat esetén spektrofotométerben. Pozitív

esetben az enzim a szubsztrátot az ellenanyag mennyiségének arányában bontja, és indikátor

jelenlétében ez adja a színreakciót.

Az ELISA rendszert, amely a BP180 ill. BP230 elleni speciális reaktivitást hivatott

igazolni, normál humán epidermális extraktumok és rekombináns, heterológ termelésű BP180 és

BP230 peptidek felhasználásával készült a japán kollaboráns partner segítségével, valamint mivel

korábban publikálásra került, ezért ezt nem részletezem.

III.6 TGc ELISA

A DHD-s és coeliákiás betegek vizsgálatakor alkalmazott TGc és TGe ELISA módszer

során egy 96 cellás ELISA lemezt (MaxiSorp, Nunc) inkubáltunk cellánként 100 μl, 1 μg human

TGc-t, illetve TGe-t, valamint 5 mM CaCl2-ot tartalmazó, 50 mM-os Tris/HCl oldattal (pH 7,5).

- 51 -

Blokkolást nem alkalmaztunk. A cellákat minden lépés után 10 mM EDTA-t és 0,1%-os Tween

20-t (TET) tartalmazó, 50 mM–os Tris/HCl (pH 7,5) pufferrel mostuk át háromszor. A savókat a

megfelelő hígítás (1:250) eléréséhez TET-tel hígítottuk, és 1,5 órán át szobahőn inkubáltuk. A

lemezhez kötött IgA-t peroxidázzal jelzett, TET-ben hígított (1:4000), humán IgA ellenes

antitestekkel (Dako/Dánia) detektáltuk, majd a színreakciót 100 μl, 60 μg/ml 3,3’, 5,5’-

tetramethylbenzidine szubsztrátot és 0.015% H2O2-t tartalmazó 100 mM nátrium acetáttal (pH

6,0) végeztük, szobahőmérsékleten. A folyamatot 100 μl 20% H2SO4 hozzáadásával állítottuk le,

a TGc kimutatása során 5 perc elteltével. Az abszorpciót 450 nm-nél olvastuk le.

III.7. Protein és epitóp hasonlóság vizsgálatok

A hólyagos autoimmun bőrbetegeségek molekuláris targetjeinek szekvenciáját internetes

elérhetőségű fehérje adatbázisokban azonosítottuk. A szekvenciák azon 200 és 700 aminosavnyi

részleteit használtuk, melyek ellen az irodalmi adatok alapján a leggyakoribb az autoimmun

reaktivitás. Ezen szekvencia-részleteket használtuk fel további BLAST kutatásainkhoz.

A BP180 nem kollagén szerkezetű doménjait, az NC16, a C-terminális domén, a BP230

C-terminális B és C aldomének, a desmoglein1 és 3 illetve az epidermális transzglutamináz

fehérjéinek antigén epitóp szerepű részleteiként azonosított szekvenciákat az ingyenes

hozzáférési rendszerű UniprotKB/Swiss-Prot szerverről töltöttük le.

A szekvenciákat a National Center for Biotechnology Information (NCBI) honlap Basic

Local Aligment Search Tool (BLAST) rendszerével vizsgáltuk meg, protein-protein homológia

ill. rövid, de nagyban egyező hasonlóságok kimutatásához. A megfigyelt egyezéseket a

Molecular Immunology Foundation antigén epitóp prediktáló rendszerének vetettük alá. [184-

186]

III.8 A TTV DNS kimutatása

A kontroll és beteg személyektől vett szérummintákat feldolgozásig -20 °C-ra

fagyasztottuk, ill. hosszabb időre -80 °C-on tároltuk. Az archivált mintákból a virus-nukleinsav

extrahálását párhuzamosan végeztük.

- 52 -

A vírus nukleinsav extraktum 200 μl szérum felhasználásával készült, az előállító által

megadott protokoll alapján a Roche High Pure Viral Nucleic Acid kittel (Roche Diagnostics,

Mannheim, Germany).

A TTV DNS kimutatása a korábban kidolgozott nested PCR/real-time PCR rendszer

felhasználásával történt. A módszer beállítása és alkalmazása korábban publikálásra került, a

pubikációt dolgozatomhoz csatoltam. [181]

13. ábra: TTV DNS jelenlétének real-time görbéi:

A – TTV DNS pozitív görbe (Tm = 80°C) B – TTV DNS negatív görbe (TM < 75°C)

III. 9. Peptid tervezés

Az LTT-hez használt, a TTV genom kódoló, konzervált N22 szakaszából kiemelt

részletet, mint peptid szekvenciát: H-RRRRRWRRWR-OH szintetizált szakaszt először Sospedra

és mtsai. irták le. [179] A peptidszekvencia előállítása szilárd fázison történő kémiai szintézissel

történt (BACHEM, Németország), az előálltás szintézis-tisztasága >95% volt.

III.10. Lymphocita transzformációs teszt (LTT)

A betegek és kontrollok perifériás vérének 10 ml-t zárt vérvételi rendszerben, citrát

antikoaguláns közegben vettük le. A frissen levett vérből a limfocitákat Phicoll-gradiens fugálás

módszerével izoláltuk.

A B

- 53 -

A limfocita preparátumok 96-s ELISA plate-ben kerültek tenyésztésre a peptid 10, 25 és

50 mg-nak jelenlétében, ill. proliferációs kontroll esetében mitogének (pokeweed mitogén ill.

konkavalin-A) mellett, negatív kontroll pozícióban pedig provokátor jelenléte nélkül.

A lemezeken kontroll pozíciókból 48 tenyésztést követően mintát vettünk a

peptidkoncentrációk melletti viabilitás vizsgálata céljából. A limfociták életképességét tripánkék

festéssel ellenőriztük. A tenyésztési folyamat lezajlását követően (96 h után) az esetleges

proliferációt timidin inkorporációs módszerrel mértük.

Az LTT körülményei megfeleltek a standardizált Pichler és mtsai. [187] által leírt

gyógyszerérzékenység igazolására szolgáló tesztnek, néhány módosítástól eltekintve:

1. A timidin inkorporáció mérése LKB RackBeta 1215 Liquid Scincillation Counter (LKB, US

Rockville) történt

2. A provokált és a spontán timidin count per minute (CPM) értékek hányadosát stimulációs

indexként számítottuk. A stimulációs indexet (SI) szignifikánsnak fogadtuk el, vagyis

reakciót sikerült kimutatni az adott provokátorral szemben, amennyiben a hányados értéke a

Pichler és mtsi. által megadott 2 értéke helyett 2,5 felett volt.

III.11 Statisztika

A beteg és kontroll csoportok közötti TTV prevalencia különbségek statisztikai

elemzésében a Fisher kalkulációt használtuk fel. A non-parametrikus adatok összehasonlításában

a Mann-Withney U tesztet alkalmaztuk. Szignifikáns különbségértékeket p < 0,05 értéknél

állapítottunk meg.

- 54 -

IV. EREDMÉNYEK

IV.1 Autoantigén és TTV szekvencia hasonlóság-analízis

In silico analízist végeztünk a következő felsorolt autoantigénként azonosított régiókra

o BP180 (BP)

NC16 régió (aa 1 – 566)

NC16A régió (aa 489-566)

C-terminális regió (aa 1252-1532)

o BP230 (BP)

C-terminális domén B és C subdoménjei (aa 1946 – 2649),

o Dsg3 részlete (PV)

aa 87-566

o Dsg1 részlete (PF)

aa 84-569

o teljes TG3 (DH)

A fehérje szekvenciák elemzése során az összevetés-illesztés (alignment) technikai

kivitelezésekor elvégeztük a rövid, exakt egyezések (SEM: Short, Exact Matches) valamint a

hosszabb, de kevésbé pontosan egyező, fehérje szintű egyezések illesztését (PPB: Protein-Protein

BLAST). A BLAST találatokat akkor fogadtuk el magas értékű egyezésnek, ha az E értékük

(Expected value) 10 alá esett. Átlagos értékű egyezésnek a találatokat E = 25 alatt tekintettük.

A PPB illesztés a PV és DH antigének esetében nem talált szignifikáns egyezést TTV

fehérjékkel, azonban minden BP antigénre sikerült fehérje szintű illesztést találni. A SEM

illesztés minden antigénre eredményesen zárult.

A BP180-NC16 régiója PPB elemzéssel 16 találatot eredményezett, 4 régióban, 0,29 – 7.9

közötti E értékekkel, S = 24,25 bit átlagérték mellett. ORF3 és ORF1 fehérjékkel találtunk

leginkább egyezést. A SEM elemzés során a találatok E értékei 0.9-től 9.0-ig valamint 13-tól 23-

ig terjedtek S = 24,25 bit-nél. A SEM analízis leggyakrabban az ORF2-vel mutatott egyezéseket.

(14. ábra)

- 55 -

14. ábra: BP180-NC16 régió (1-566) TTV fehérjékre végzett PPB (A) és SEM (B) BLAST analízis eredménye

grafikus ábrázolásban

- 56 -

A BP180 NC16A régió (aa 489-566) SEM BLAST vizsgálata során az irodalomban azonosított B

és T sejtes epitópokkal lévő esetleges átfedéseket vizsgáltuk. A vizsgálat eredményeképpen

számos epitóppal sikerült átfedést és hasonlóságot kimutatnunk. [188, 15. ábra]

15. ábra. BP180-NC16A T- és B-sejt epitóp helyek összehasonlítása a TTV BLAST SEM eredményekkel. A fenti epitópokat következő publikációkban közölték: by {1} Giudice et al, 1992{2} Lin et al, 1999 ; {3} Lin et

al, 2000; {4} Lin et al, 2002; {5} di Zenzo et al, 2004; {6} Hacker-Foegen et al, 2004; {7} Thoma-Uszynski et al, 2006.

csak T-sejt epitóp csak B-sejt epitóp B és T sejt epitóp

- 57 -

A BP180 C-terminális régiójának elemzése egy fehérje szintű kb. 200 aminosavnak

megfelelő hosszúságú régióra mutatott rá, amely TTV ORF1 szekvenciával mutatott átfedést (E =

7,5, S = 21,9 bit). A SEM egyezések leginkább az ORF2-vel jelentkeztek, de az ORF3 és ORF4

is mutatott hasonlóságokat (lsd. 16. ábra)

16. ábra: BP180-C terminális régió fehérére végzett PPB (A) és SEM (B) BLAST analízis eredménye grafikus

ábrázolásban

- 58 -

A BP230 C terminális régiójának PPB elemzése 4 hosszabban illeszkedő részt mutatott ki,

az utolsó 100 aminosavas régióban TTV ORF1 szekvenciákra (E = 5,8 - 8.4, S = 23,5). SEM

egyezéseket is az ORF1-el sikerült kimutatni (E = 5,0-8.9 és 12 – 22; S = 24,2). (lsd. 17. ábra)

17. ábra: BP230-C terminális régió fehérére végzett PPB (A) és SEM (B) BLAST analízis eredménye grafikus

ábrázolásban

- 59 -

A Dsg3 PV és Dsg 1 PF antigén esetében SEM hasonlóságokat főként az ORF1-el sikerült

kimutatni, bár ORF3 és ORF4 egyezéseket is megfigyelhettünk. Mindkét esetben azonos

(homológ fehérjék homológ régiójáról lévén szó) 8,1-es magas és 11-20 átlagos E értékű

egyezéseket kaptunk eredményül, S = 23,5 átlagérték mellett. (18. ábra)

18. ábra: Dsg3 SEM BLAST eredmények grafikus megjelenítése (a Dsg1 analízis képével megegyező)

A TGe SEM BLAST illesztés TTV ORF1 egyezéseket azonosított. Magas értékű

egyezéseket nem azonosítottunk, az E értékek 16 és 21 közötti értékeket mutattak, átlagosan 23.5

S score-ral. (19. ábra)

19. ábra: TG3 SEM BLAST eredmények grafikus megjelenítése

- 60 -

IV.2 A TTV fehérjékkel átfedést mutató fehérjerészletek antigenitás-predickiója

A BLAST vizsgálatok eredményeként TTV-fehérjékkel hasonlóságot mutató

szekvenciákat antigén-predikciós vizsgálatoknak vetettük alá. Az erősen immunogén

szekvenciarészleteket megjelöltük és a PPB és SEM BLAST átfedésekre illesztettük.

A BP180 NC16 régió antigén-predikciós analízise 18 lehetséges erősen immunogén

epitópra mutatott rá. A vizsgálat során a 566 aa hosszú szekvencia prediktált antigenitása

(antigenic propensity) 1.0072. 8 immunogén részletet fedett át a PPB eredményekkel, számos

SEM átfedéssel melyek közül 7 esetben a rövid részletben a szekvencia is azonos volt. A PPB,

SEM BLAST találatok ill. immunogén prediktálta részletek átfedését 5 pozícióban figyeltük meg

(20. ábra, A; 21. ábra).

A BP180 C-terminális doménban 7 erősen immunogén régiót azonosítottunk. A 245 aa

hosszú szekvencia átlagos antigenitás értéke 0.9960 volt. SEM BLAST és az antigén predikció

egy nagyobb átfedést mutatott (20. ábra, B).

A BP230 C-terminális B és C szubdoménjeinek antigén predikciója 30 azonosított régiót

Ezen 704 aa hosszú szakaszon 1.0312 értékű antigenitást prediktáltunk (20. ábra, C).

20. ábra: A BP autoantigénjeinek SEM BLAST eredménye ill. a prediktált antigentiás összevetésének

megjelenítése: BP180-NC16A (A) és C-terminális (B) és BP230 (D) vs. TTV-ORF1, ORF2, ORF3, ORF4

- 61 -

21. ábra: A BP-180 autoantigénjeinek PPB és SEM BLAST eredménye ill. a preduiktált antigentiás

összevetésének grafikus megjelenítése

A 479 aminosavnyi Dsg3 részlet 1.0275 antigenitás értéket mutatott. 21 lehetséges

determináns közül egy sem fedett át a SEM BLAST azonosította régiókkal.

A 692 aa-nyi TGe protein szekvencia átlagosasn 1,0197 antigenitás értéket mutatott. 28 a

szekvencia alapján 28 lehetséges determináns egyike sem illeszkedett a SEM BLAST TTV-

szekvencia egyezésekre.

- 62 -

IV.3 A TTV DNS kimutatása betegek és kontrollok szérumából

TTV DNS-t a hólyagos bőrbetegségekben szenvedő csoport esetében 72/93 (77,4 %)-ban,

míg 64/95 (67.4 %)-ban az első kontroll csoportnál és 31/50 (65.3 %; p>0.05)-ban a második

kontroll csoportnál sikerült kimutatni. Mindkét kontroll csoportban egészséges egyénektől

származó szérummintát vizsgáltunk. A kor, a nem ill. a betegség fennállásának ideje nem

korrelált a TTV DNS pozitivitásával.

A PV csoport külön vizsgálatakor semmilyen korreláció ill. tendencia nem mutatkozott

(19/33, 57,5% p>0,05). A DH betegek esetében (17/20, 85% p>0,05) kisebbfokú, nem

szignifikáns emelkedettség tendencia volt kimutatható.

A TTV DNS pozitivitás a BP betegcsoportban magasabb volt, mint a DH vagy PV

csoport esetében ill. szignifkánsan magasabbnak bizonyult mindkét kontroll csoporttal szemben

(BP: 36/40 vs. K2: 31/50, p < 0,032).

Összes beteg (%) TTV+ (%) TTV- (%) Betegek száma 93 (100) 72 (77,42) 21 (22,58) Kor (év ± SD) 62,49±11,30 64,22 59,81

Ffi/nő betegek száma 33/60 24/48 9/12 Diagnózis Kor

BP 40 36 4 PV 33 19 14 DH 20 17 3

Kontroll csoport 1 95 62 33

Kor (év ± SD) 41.52 ±7,11 37,63 43,74 Ffi/nő betegek száma 43/52 33/29 10/23

Kontroll csoport 2 50 31 19

Kor (év ± SD) 70,90±9.65 71,81 69,27 Ffi/nő betegek száma 9/41 4/27 5/14

Fisher-test: p < 0.030;

Fisher-test: p < 0.032;

TTV DNS+

TTV DNS- Össz:

Kontroll 1 (n) 62 33 95 BP (n) 36 4 40 Össz: 98 37 135

TTV DNS+

TTV DNS- Össz:

Kontroll 2 (n) 31 19 50 BP (n) 36 4 40 Össz: 67 23 90

- 63 -

IV.4 A szérum TTV DNS pozitivitás és a BP autoantitestek asszociációs vizsgálata

A TTV DNS pozitivitás lehetséges asszociációit statisztikai módszerekkel vizsgálatuk egy

vagy több, jellemzően a BP180-NC16a, BP180 C-terminális domén valamint a BP230 ellen

irányuló autoantitest pozitivitással. Az autoantitestek kimutatása Japánban immunoblott és

ELISA módszerrel kollaborációban történt.

28/40 BP beteg szérumából mutattunk ki BP180-NC16a elleni autoantitesteket, amelyek

közül 25/28 volt TTV DNS pozitív. 11/12 NC16a immunoblott negatív BP beteg volt TTV

positív (χ2, p > 0.8380). A BP180 C-terminális elleni antitesteket 8/40 BP beteg esetében

detektáltunk, amelyből 6/8 volt egyben TTV DNS pozitív is. 30/32 BP180 C-terminális

immunoblott negatív betegnél tapasztaltunk TTV DNS pozitivitást (Fisher, p > 0.3564).

A 40 vizsgált BP szérum minta 29 esetben volt vagy a BP180 NC16a, vagy a C-terminális

régió ellen irányuló autantitestekre immunoblottal pozitív. 25/29 esetben láttunk ezek között TTV

pozitivitást. Mind a 11 BP beteg, aki immunoblottal BP180 NC16a, illetve C-terminális negatív

volt, TTV DNA pozitív volt (Fisher, p > 0,5602). 6 esetben volt mindkét BP180 régió elleni

autoantitest jelenléte igazolható, ezen betegek szérumai mind TTV pozitivitást is mutattak

egyben (Fisher, p > 0,4648).

26/40 BP betegnél a BP180 ELISA pozitív lett, ezek közül 23 esetben volt TTV DNS

pozitivitás is igazolható (Fisher, p > 0.6585). Azon 6 beteg, aki mindkét BP180 immunoblottra

pozitívnak bizonyult, a BP180 ELISA és a TTV DNS vizsgálatokon is pozitivitást mutatott.

A BP230 antigén ELISA 20/40 BP beteg esetében mutatott pozitivitást, melyek között

18/ 20 TTV pozitivitást is kimutattunk. Hasonlóképpen 18/20 BP230 ELISA negatív beteg volt

TTV pozitív (Fisher, p > 1.390).

A TTV pozitív és BP negatív betegek körében az autoantitestek statisztikai elemzése nem

mutatott szignifikáns különbségeket. A vírus jelenlétének megoszlása majdhogynem egyforma

(p<1.0000) értéket mutatott szinte minden autoantitest-definiálta csoport esetében.

TTV + (n)

TTV + (%)

TTV - (n)

TTV – (%)

p

BP180/NC16a-IB + 25 62,50% 3 7,50% BP180/NC16a-IB - 11 27,50% 1 2,50%

p > 1.000

BP180/C-terminal-IB + 6 15,00% 2 5,00% BP180/C-terminal-IB - 30 75,00% 2 5,00%

p > 0.356

BP230-ELISA + 18 45,00% 2 5,00% BP230-ELISA - 18 45,00% 2 5,00%

p > 1.39

- 64 -

IV.5 LTT vizsgálatok

A kontroll limfocita izolátumok nem reagáltak a TTV ORF1/N22 peptiddel 50 és 25 ug

koncentrációkban és csupán 1 kontroll (K1) limfocitái reagáltak a peptiddel 10 ug-os

koncentrációban, amely eredményeképpen gyenge proliferáció volt detektálható. Ettől eltekintve

a kontroll spontán és provokált proliferáció SI eredményei nem mutattak szignifikáns

különbséget (p>0.05).

Mind a 4 TTV DNS pozitív BP beteg limfocita izolátuma magas proliferációs értékkel

reagált a TTV peptid expozícióra. A spontán és a provokált értékek különbségei szignifikánsnak

bizonyultak (p<0.01).

TTV peptid ORF1/N22 (CPM) TTV ORF1/N22 SI Spontán (CPM) 50 ug 25 ug 10 ug 10 ug 25 ug 10 ug

B1 154 1298 1389 726 8,43 9,02 4,71 B2 240 2670 428 456 11,13 1,78 1,90 B3 621 6972 2083 644 11,23 3,35 1,04 B4 89 4121 4596 404 46,30 51,64 4,54 K1 257 257 196 697 1,00 0,76 2,71 K2 97 168 103 288 1,73 1,06 1,94 K3 317 543 228 133 1,71 0,72 0,42 B1-4. bullous pemphigoid beteg LTT esszék 1-4 K1-3: kontroll LTT esszék CPM - thymidine count per minute SI = CPM (provokált)/CPM(spontán)

- 65 -

V. MEGBESZÉLÉS

Bár a TT vírust erdetileg ismereten etiológiájú NANG hepatitis betegekből izolálták,

pathogenitását sem ezekhez az esetekhez, sem pedig bármely más emberi betegséghez kötni nem

lehetett. Bár már sikerült alacsony felbontású képet készíteni a víruskoncentrátumról, kevés a

vizuális adat, valamint a szenzitív immunitás-alapú kimutató rendszerek hiánya is nagyban

hátráltatja a vírus tulajdonságainak pontosabb megismerését. A fent említett metodika hiányában

a vírusfertőzés kimutatása továbbra is PCR technológia-függő marad. Számos, igen eltérő

szenzitivitású módszert írtak le a TTV DNS kimutatására.

A TTV replikációja egy ismeretlen mechanizmus révén folyamatosan új szekvenciákat

generál, melyeknek továbbszaporodását csak a funkció megőrzése limitálja: a vírusfehérjék és

virális genomi DNS sikeres összekapcsolódását teljes és fertőzőképes virionokká. Ezen variáns-

utódok közül pozitív szelekcióban részesülnek azok, akik a legkönnyebben védik ki az

immunrendszer támadásait, melynek egyik módja lehet a „legkevésbé immunogénné válni”,

vagyis hasonulni a gazdaszervezet saját fehérjéihez. A molekuláris mimikri elmélet szerint ebben

az esetben a szervezet immunrendszere elvesztheti a toleranciát a saját fehérjéivel szemben, és

így megindulhatnak az autoimmunitás reakciói. [178]

A vírus szaporodik a csontvelőben illetve a csontvelői eredetű sejtvonalakban, a legújabb

felfedezések szerint csak az aktivált illetve osztódó sejtekben. Az immunválasz kulcselemeinek

és a szabályozásban is részt vevő sejtjeinek megtámadásával a vírus további hatással lehet az

immunválasz destabilizálására. [100,117]

Jelen munkámban a TTV lehetséges szerepét kivántam megvizsgálni a bőr specifikus

autoimmunitás kiváltásában, olyan modell-betegségek esetében, mint a BP, a PV vagy DH.

Ehhez megvizsgáltuk a betegségek ismert autoantigénjeinek, valamint a TTV fehérjéknek

az adatbázisokban szereplő szekvenciáit, mind a nagyobbfokú (PPB) fehérje-fehérje szintű

átfedéseket és hasonlóságokat, mind pedig a rövidebb, de pontos egyezéseket (SEM) kimutató

BLAST algoritmusokkal.

Míg a Dsg3 és TGe fehérjék esetében csupán limitált hasonlóságok mutatkoztak, addig a

BP autoantigénjeinél szignifikáns egyezéseket is tapasztaltunk mindkét vizsgálati módszer

esetében. A BP180 NC16 régió vizsgálata során a TTV-eredetű szekvenciák és az

immunogénnek prediktált részletek kiemelendő mértékű egyezést mutattak.

- 66 -

Ezzel párhuzamosan SYBR-Green I alapú melting-curve analízissel végzett PCR

kimutatást is végeztünk a prevalenciaértékek felméréséhez. A specificitás biztosítása érdekében a

néhány, random pozitívként azonosított terméket szekvenálással azonosítottunk.

Ezen módszerekkel, az autoimmun hólyagos bőrbetegségekben szenvedő betegeink illetve

a kontroll egyének szérum mintáiból készített extraktumok elemzését elvégezve, a három

betegségcsoport prevalenciaértékét együttesen értékelve nem találtunk eltérést a kontroll

csoporthoz képes. A PV és DH csoportoknál tapasztalt értékek összevethetőek a kontroll egyének

csoportjánál tapasztalt prevalenciaértékekkel, míg a BP esetében számottevő különbséget

tapasztaltunk – a prevalencia ebben a betegcsoportban szignifikánsan emelkedett volt.

Eredményeink egyeznek a korábban ezzel a metodikával vizsgált, az egészséges

populációt reprezentáló csoportként megadott kontroll prevalencia értékkel. Úgy a saját, mint

ezen publikáció értékei eltérnek a korábban a magyar populáció TTV prevalencia értékét

(hepatitis és vesetranszplantált betegek körében ill. ezekhez illesztett kontroll csoportokban)

felmérő vizsgálatok eredményeitől – ezek azonban eltérő szenzitivitású, a TTV genom más

régióját megcélzó módszerrel készültek.

A virális ágensek szerepe többször felmerült, de kellően soha nem bizonyult a BP, PV és

DH pathogenezisében. Különösen a hepatitis B és a herpesvirusok kerültek gyakran lehetséges

környezeti faktorként szóba ezen betegségek esetében: a ritka gyerkekkori BP forma kialakulását

hepatitis B immunizáció következtében is leírták illetve bemutattak hepatitis B vakkcinációt

követően kialakult pemphigus eseteket is. Időskori és juvenális BP esetek kialakulását szintén

megfigyelték antivirális vakkcinációt követően. Az intestinális adenovirusok szerepét a coeliakia,

majd később a DH esetében is felvetették, de ezt az összefüggést későbbi vizsgálatok cáfolták.

[189-196]

A munkában bemutatott, a TTV fehérjék és a betegségekben azonosított autoantigének

között fennálló szignifikáns hasonlóság alapjául szolgálhat a betegség-specifikus autoantitest

termelésnek. A T-sejtes hátteret a humorális autoimmunitás elősegítéséhez, amely minden

autoimmun bullosus dermatosis etiológiai hátterének fontos tényezője az ORF1 fehérje nem

specifikus T-klón aktiválásra képes konzervált Arg-gazdag régiója biztosíthatja.

A TTV pathogenezisben, az autoimmunitás kiváltásában betöltött pontos szerepe továbbra

sem tisztázott. Munkánk során az in silico és in vitro adatokkal csupán megvizsgálni és felvetni

kivántuk a TTV lehetséges szerepét a bőr autoimmun hólyagos megbetegedéseiben.

- 67 -

A TTV fertőzés szerepének elemzésekor a BP esetében egy második, magasabb

átlagéletkorú kontroll csoporttal szemben is megvizsgáltuk a prevalencia értékek különbségének

szignifikanciáját. Ismeretes, hogy a BP késői manifesztációjú betegség, illetve, hogy a TTV

fertőzés terjedését ismerve, szükségesnek tartottuk megvizsgálni, hogy a betegek kora független

faktor-e a prevalencia különbségek értékelésében. A prevalenciaértékek az idősebb, kontroll

populációval szemben történő vizsgálatkor is szignifikáns különbséget mutattak, ezzel igazoltuk,

hogy vizsgálatunkban a kor független faktor.

Az a tény, hogy a TTV pozitivitás nem korrelált egy autoantitest pozitvitással sem,

összhangban van in silico adatainkkal, melyek szerint gyakorta előforduló TTV szekvenciák

hasonlóságot mutattak a BP180 és a BP230 antigén doménjaival is.

Az in vitro kísérlet továbbá rámutatott arra, hogy a BP-s betegek limfocitái felismerik a

TTV eredetű szekvenciát. A kvázi kozervált, Arg gazdag peptid mind a 4 vizsgált beteg esetében

erős proliferációs választ indukált. A kontrollként választott egyénektől izolált limfociták ezzel

szemben nem reagáltak a peptidre, csupán egy koncentrációban és egy betegnél tapasztaltunk egy

gyengébb proliferációs választ. Az in vitro LTT assay kimenetele az in silico és PCR adatok

tükrében tehát további eredményekkel erősítette meg hipotézisünket.

Bár további szerológiai konfirmáció jelenleg nem elérhető, a szignifikánsan magas TTV

DNS előfordulása a BP betegek szérumában együttesen az in silico vizsgálataink eredményeivel

arra enged következtetni, hogy a vírusnak szerepe lehet a betegség pathomechanizmusában.

- 68 -

Irodalomjegyzék

1. Houben E., De Paepe K., and Rogiers V. A keratinocyte's course of life. Skin Pharmacol.Physiol. 20[3],

122-132. 2007.

2. Alberts et al. Cell Junctions, Cell Adhesion, and the Extracellular Matrix. Molecular Biology of the Cell.

New York, London: Garland Science, 2002.

3. Hertl M. Autoimmune Diseases of the Skin, Pathogenesis, Diagnosis, Management. 2005.

4. Dusek RL., Godsel LM, Green K. Discriminating roles of desmosomal cadherins: Beyond desmosomal

adhesion. Journal of Dermatological Science 2007;45:7-21.

5. Borradori L, Sonneberg A. Hemidesmosomes: roles in adhesion, signaling and human diseases. Curr Opin

Cell Biol, 1999;8:647-56.

6. Kárpáti S., Stolz W., Meurer M., Braun-Falco O., Krieg T. Ultrastructural basis for antigen mapping using

sodium chloride-separated skin. Arch Dermatol Res, 1991;283:529-32.

7. Zambruno G., Failla CM. Autoimmunity of the dermal-epidermal junction. Eur J Dermatol 1999;9 :437-42.

8. Bruckner-Tuderman L. Blistering skin diseases:models for studies on epidermal-dermal adhesion. Biochem

Cell Biol 1996;74:729-36.

9. Bruckner-Tuderman L. Hereditary skin diseases of anchoring fibrils. Journal of Dermatological Science

1999;20:122-33.

10. Bruckner-Tuderman L., Höpfner B., Hammami-Hauasli N. Biology of anchoring fibrils: lessons from

dystrophic epidermolysis bullosa. Matrix Biol 1999;18:43-54.

11. R.M. Vodegel: Immunofluorescence microscopy of subepidermal bullous autoimmune diseases, 2004 Univ.

Of Groningen

12. Bures DM, Goldsmith LA, Stone KR. Transglutaminase activity of cultured human prostatic epithelium.

Invest Urol 1980; 17:298-301

13. Folk JE, Finlayson JS. The å-(ã-glutamyl)-lysine crosslink and the catalytic role of transglutaminases. Adv

Protein Chem 1977; 31:1-133.

14. Folk JE. Mechanism and basis for specifity of transglutaminase catalyzed å-(ãglutamyl)-lysine bond

formation. Adv Enzymol 1983; 54:1-56.

15. Chung SI, Folk JE. Transglutaminase from hair follicle of guinea pig (crosslinkingfibrin-glutamyllysine-

isoenzymes-purified enzyme). Proc Natl Acad Sci USA 1972; 69:303-7.

16. Aeschlimann D, Koeller MK, Allen-Hoffmann BL, Mosher DF. Isolation of a cDNA encoding a novel

member of the transglutaminase gene family from human keratinocytes. Detection and

identification of transglutaminase gene products based on reverse transcription-polymerase chain

reaction with degenerate primers. J Biol Chem 1998; 273:3452-60.

17. Grenard P, Bates MK, Aeschlimann D. Evolution of transglutaminase genes: identification of a

transglutaminase gene cluster on human chromosome 15q15. Structure of the gene encoding

- 69 -

transglutaminase X and a novel gene family member, transglutaminase Z. J Biol Chem 2001;

276:33066-78.

18. Korsgren C, Lawler J, Lambert S, Speicher D, Cohen CM. Complete amino acid sequence and homologies

of human erythrocyte membrane protein band 4.2. Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87:613-7.

19. Lever, WF Pemphigus. Medicine 1953; 32: 1–123

20. Huilgol SC, Black MM Management of the immunobullous disorders. II. Pemphigus. Clin Exp Dermatol

1995;20: 283–293

21. Hertl M Humoral and cellular autoimmunity in autoimmune bullous skin disorders. Int Arch Allergy

Immunol 2000; 122: 91–100

22. Amagai M, Klaus-Kovtun V, Stanley JR Auto-Ab against a novel epithelial cadherin in pemphigus vulgaris,

a disease of cell adhesion. Cell 1991; 67: 869–877

23. Bedane C, Prost C, Thomine E, Intrator L, Joly P, Caux F, Blecker M, Bernard P, Leboutet MJ, Tron F,

Lauret P, Bonnetblanc JM, Dubertret L Binding of autoantibodies is not restricted to desmosomes

in pemphigus vulgaris: comparison of 14 cases of pemphigus vulgaris and 10 cases of pemphigus

foliaceus studied by western immunoblot and immunoelectron microscopy. Arch Dermatol Res

1996; 288: 343–352

24. Bhol K, Ahmed AR, Aoki V, Mohimen A, Nagarwalla N, Natarajan K (1995) Correlation of peptide

specificity and IgG subclass with pathogenic and nonpathogenic autoantibodies in pemphigus

vulgaris: a model for autoimmunity. Proc Natl Acad SciUSA92: 5239–5243

25. Tremeau-Martinage C, Bazex J, Oksman F (1995) Immunoglobulin G subclass distribution of anti-

intercellular substance antibodies in pemphigus. Ann Dermatol Venereol 122: 409–411

26. Späth S, Riechers R, Borradori L, Zillikens D, Bdinger L, Hertl M (2001) Detection of autoantibodies of

various subclasses (IgG1, IgG4, IgA, IgE) against desmoglein 3 in patients with acute onset and

chronic pemphigus vulgaris. Br J Dermatol 144:1183–1188

27. Braun-Falco O (ed): Dermatologie und Venerologie (2005) 5. edition, Pemphigus

28. Emery DJ, Diaz LA, Fairly JA, Lopez A, Taylor AF, Giudice GJ (1995) Pemphigus foliaceus and

pemphigus vulgaris autoantibodies react with the extracellular domain of desmoglein 1 J Invest

Dermatol 104: 323–328

29. Anhalt, GJ, Labib KS, Vorhees JS, Beals TF, Diaz LA (1982) Induction of pemphigus in neonatal mice by

passive transfer of IgG from patients with the disease. N Engl J Med 306: 1189–1192

30. Amagai M, Karpati S, Prussick R, Klaus-Kovtun V, Stanley JR (1992) Autoantibodies against the amino-

terminal cadherin-like binding domain of pemphigus vulgaris antigen are pathogenic. J Clin Invest

90: 919–926

31. Kljuic A, Bazzi H, Sundberg JP, Martinez-Mir A, O’Shaughnessy R, Mahoney MG, Levy M, Montagutelli

X, Ahmad W, Aita VM, Gordon D, Uitto J, Whiting D, Ott J, Fischer S, Gilliam TC, Jahoda CA,

Morris RJ, Panteleyev AA, Nguyen VT, Christiano AM (2003) Desmoglein 4 in hair follicle

differentiation and epidermal adhesion: evidence from inherited hypotrichosis and acquired

pemphigus vulgaris. Cell 113:249–260

- 70 -

32. Nishifuji K, Nagasaka T, Ota T, Whittock NV, Amagai M (2004) Is desmoglein 4 involved in blister

formation in pemphigus or impetigo? J Invest Dermatol 122: A33

33. Kowalczyk AP, Green KJ, Stanley JR, Hashimoto T, Borgwardt JE, Anderson JE (1995) Pemphigus sera

recognize conformationally sensitive epitopes in the amino-terminal region of desmoglein-1. J

Invest Dermatol 105: 147–152

34. Aoki-Ota M, Tsunoda K, Ota T, Iwasaki T, Koyasu S, Amagai M, Nishikawa T.A mouse model of

pemphigus vulgaris by adoptive transfer of naive splenocytes from desmoglein 3 knockout mice.

Br J Dermatol. 2004 Aug;151(2):346-54.

35. Anzai H, Fujii Y, Nishifuji K, Aoki-Ota M, Ota T, Amagai M, Nishikawa T. Conformational epitope

mapping of antibodies against desmoglein 3 in experimental murine pemphigus vulgaris. J

Dermatol Sci. 2004 Aug;35(2):133-42.

36. Nguyen VT, Ndoye A, Shultz LD, Pittelkow MR, Grando SA (2000a) Antibodies against keratinocyte

antigens other than desmogleins 1 and 3 can induce pemphigus vulgaris-like lesions. J Clin Invest

106: 1467–1479

37. Nguyen VT, Ndoye A, Grando SA (2000b) Pemphigus vulgaris antibody identifies pemphaxin. A novel

keratinocyte annexin-like molecule binding acetylcholine. J Biol Chem 275: 29466–29476

38. Nguyen VT, Ndoye A, Grando SA (2000c) Novel human alpha9 acetylcholine receptor regulating

keratinocyte adhesion is targeted by pemphigus vulgaris autoimmunity. Am J Pathol 157: 1377–

1391

39. Jordon RE, Beutner EH, Witebsky E, Blumental G, Hale WC, LeverWC(1967) Basement zone antibodies in

bullous pemphigoid. J Am Med Assoc 200: 751–756

40. Lever WF (1953) Pemphigus. Medicine 32: 1–123

41. Liu HH, Su DWP, Rogers RS III (1986) Clinical variants of pemphigoid. Int J Dermatol 25: 17–27

42. Korman NJ (1987) Bullous pemphigoid. J Am Acad Dermatol 16: 907–24

43. Bernard P, Vaillant L, Labeille B, Bedane C, Arbeille B, Denoeux JP, Lorette G, Bonnetblanc JM, Prost C

(1995) Incidence and distribution of subepidermal autoimmune bullous skin diseases in three

French regions. Bullous diseases French study group. Arch Dermatol 131: 48–52

44. Jung M, Kippes W, Messer G, Zillikens D, Rzany B (1999) Increased risk of bullous pemphigoid in male

and very old patients: a population based study on incidence. J Am Acad Dermatol 41: 266–268

45. Nemeth AJ, Klein AD, Gould EW, Schachner LA (1991) Childhood bullous pemphigoid. Clinical and

immunologic features, treatment, and prognosis. Arch Dermatol 127: 378–386

46. Taylor G, Venning V, Wojnarowska F, Welch K (1993) Bullous pemphigoid and autoimmunity. J Am Acad

Dermatol 29: 181–184

47. Venning VA, Wojnarowska F (1990) The association of bullous pemphigoid and malignant disease: a case

control study. Br J Dermatol 123:439–445

48. Bastuji-Garin S, Joly P, Picard-Dahan C, Bernard P, Vaillant L, Pauwels C, Salagnac V, Lok C, Roujeau JC

(1996) Drugs associated with bullous pemphigoid. A case-control study. Arch Dermatol 132: 272–

276

- 71 -

49. Buschmann KE, Seraly M, Thong HY, Deng JS, Drariam RP, Abernethy JL: Apred ominant IgG4 subclass

may be responsible for fals-negative direct immunofluorescence in bullous pemphigoid. J Cutan

Pathol, 2002, 29:282-286.

50. Dobránszky I, Hunyadi J: Salt-split skin technika alkalmazása bullosus pemphigoidban. Bőrgyógyászati és

Venerológiai Szemle, 1995, 71:197-201.

51. Schmidt E, Obe K, Brocker EB, Zillikens D: Serum levels of autoantibodies to BP180 correlate with disease

activity in patients with bullous pemphigoid. Arch Dermatol, 2000, 136:174-178

52. Giudice GJ, Emery DJ, Zelickson BD, Anhalt GJ, Liu Z, Diaz LA (1993) Bullous pemphigoid and herpes

gestationis autoantibodies recognize a common non-collagenous site on the BP180 ectodomain. J

Immunol 151: 5742–5750

53. Giudice GJ, Wilske KC, Anhalt GJ, Fairley JA, Taylor AF, Emery DJ, Hofman RG, Diaz LA (1994)

Development of an ELISA to detect anti-BP180 autoantibodies in bullous pemphigoid and herpes

gestationis. J Invest Dermatol 102: 878–881

54. Zillikens D, Mascaro JM, Rose PA, et al (1997a) A highly sensistive enzyme-linked immunosorbent assay

for the detection of circulating autoantibodies in patients with bullous pemphigoid. J Invest

Dermatol 109: 679–683

55. Zillikens D, Rose PA, Balding SD, Liu Z, Olague-Marchan M, Diaz LA, Giudice GJ (1997b) Tight

clustering of extracellular BP180 epitopes recognized by bullous pemphigoid autoantibodies. J

Invest Dermatol 109: 573–579

56. Perriard J, Jaunin F, Favre B, Büdinger L, Hertl M, Saurat J-H, Borradori L (1999) IgG autoantibodies from

bullous pemphigoid (BP) patients bind antigenic sites on both the extracellular and the intracellular

domain of the BP antigen 180. J Invest Dermatol 112: 141–147

57. Tanaka M, Hashimoto T, Dykes PJ, Nishikawa T (1996) Clinical manifestations in 100 Japanese bullous

pemphigoid cases in relation to autoantigen profiles. Clin Exp Dermatol 21:

58. Rico MJ, Korman NJ, Stanley JR, Tanaka T, Hall RP (1990):IgG antibodies from patients with bullous

pemphigoid bind to localized epitopes on synthetic peptides encoded bullous pemphigoid antigen

cDNA. J Immunol 145: 3728–3733

59. Skaria M, Jaunin F, Hunziker T, Riou S, Schumann H, Bruckner-Tuderman L, Hertl M, Bernard P, Saurat

JH, Favre B, Borradori L (2000) IgG autoantibodies from bullous pemphigoid patients recognize

multiple antigenic reactive sites located predominantly within the B and C subdomain of the

COOH-terminus of BP230. J Invest Dermatol 114: 998–1004

60. Vanderlugt CJ, Miller SD (1996) Epitope spreading. Curr Opin Immunol 8: 831–836 Vassileva S (1998)

Clin Dermatol 16: 379–387

61. Ishiura N, Fujimoto M, Watanabe R, Nakashima H, Kuwano Y, Yazawa N, Echigo T, Okochi H, Tamaki K.

Serum levels of IgE anti-BP180 and anti-BP230 autoantibodies in patients with bullous

pemphigoid. J Dermatol Sci. 2007 Oct 5; (epub)

- 72 -

62. Di Zenzo G, Grosso F, Terracina M, Mariotti F, De Pita O, Owaribe K, Mastrogiacomo A, Sera F,

Borradori L, Zambruno G (2004) Characterization of the anti-BP180 autoantibody reactivity

profile and epitope mapping in bullous pemphigoid patients. J Invest Dermatol; 122:103–10

63. Büdinger L, Borradori L, Yee C, Eming R, Ferencik S, Grosse-Wilde H, Merk HF, Yancey K, Hertl M

(1998) Identification and characterization of autoreactive T cell responses to bullous pemphigoid

antigen 2 in patients and healthy controls. J Clin Invest 102: 2082–2089

64. Lin MS, Gharia MA, Swartz SJ, Diaz LA, Giudice GJ (1999) Identification and characterization of epitopes

recognized by T lymphocytes and autoantibodies from patients with herpes gestationis J Immunol

162: 4999–4997

65. Chan LS, Yancey KB, Hammerberger C, Soong HK, Regezi JA, Johnson K, Cooper KD (1993). Immune-

mediated subepithelial blistering diseases of mucous membranes. Arch Dermatol 129: 448–455

66. Chan LS, Majmudar AA, Tran HH, Meier F, Schaumburg -Lever G, Chen M, Woodley DT, Marinkovich

PM (1997) Laminin-6 and laminin-5 are recognized by autoantibodies in a subset of cicatricial

pemphigoid. J Invest Dermatol 108: 848–853

67. Bernard P, Prost C, Lecerf V, Intrator L, Combemale P, Bedane C, Roujeau JC, Revuz J, Bonnetblanc JM,

Dubertret L (1990a) Studies of cicatricial pemphigoid autoantibodies using direct immunelectron

microscopy and immunoblot analysis. J Invest Dermatol 94: 630–635

68. Luke MC, Darling TN, Hsu R, Summers RM, Smith JA, Solomon BI, Thomas GR, Yancey KB (1999)

Mucosal morbidity in patients with epidermolysis bullosa acquisita. Arch Dermatol 135: 954–959

69. Briggaman RA, Gammon WR, Woodley DT (1985) Epidermolysis bullosa acquisita of the

immunopathological type (dermolytic pemphigoid). J Invest Dermatol. 85:79s-84s

70. Gammon WR, Kowalewski C, Chorzelski TP, Kumar V, Briggaman RA, Beutner EH (1990) Direct

immunofluorescence studies of sodium chloride-separated skin in the differential diagnosis of

bullous pemphigoid and epidermolysis bullosa acquisita. J Am Acad Dermatol 22: 664–670

71. Gammon WR, Briggaman RA (1993) Epidermolysis bullosa acquisita and bullous systemic lupus

erythematosus. Diseases of autoimmunity to type VII collagen. Dermatol Clin 11: 535–547

72. Woodley DT, Briggaman RA, O’Keefe EJ, Inman AO, Queen LL, GammonWR (1984) Identification of the

skin basement-membrane autoantigen in epidermolysis bullosa acquisita. N Engl J Med 310:1007–

1013

73. Duhring LA (1884) Dermatitis herpetiformis. JAMA 3: 225–229

74. Kárpáti S, Torok E, Kosnai I (1986) Discrete palmar and plantar symptoms in children with dermatitis

herpetiformis Duhring. Cutis 3: 184–187

75. Rütten A, GoosM(1989) Palmoplantar purpura in Duhring´s herpetiform dermatitis. Hautarzt 40: 640–643

76. Fraser NG, Kerr NW, Donald D (1973) Oral lesions in dermatitis herpetiformis. Br J Dermatol 89: 439–450

77. Marks J, Shuster S, Watson AJ (1966) Small bowel changes in dermatitis herpetiformis. Lancet II: 1280–

1282

78. Fry L, Keir P, McMinn RMH, Cowan JD, Hoffbrand AV (1967) Small-intestinal structure and function and

haematological changes in dermatitis herpetiformis. Lancet II: 729–734

- 73 -

79. Brow J, Parker F, Weinstein W, Rubin CE (1971) The small intestinal mucosa in dermatitis herpetiformis:

severity and distribution of the small intestinal lesion and associated malabsorption.

Gastroenterology 60: 355–361

80. Reunala T, Collin P (1997) Diseases associated with dermatitis herpetiformis. Br J Dermatol 136: 315–318

81. Schuppan D (2000) Current concepts of celiac disease pathogenesis. Gastroenterology 119: 234–242

82. Collin P, Pukkala E, Reunala T (1996) Malignancy and survival in dermatitis herpetiformis: a comparison

with coeliac disease. Gut 38: 528–530

83. Sachs JA, Awad J, McCloskey D, Navarrete C, Festenstein H, Elliot E, Walker-Smith JA, Griffiths CE,

Leonard JN, Fry L (1986) Different HLA associated gene combinations contribute to susceptibility

for coeliac disease and dermatitis herpetiformis. Gut 27: 515–520

84. Hall MA, Lanchbury JSS, Bolsover WJ, Ciclitira JP (1991) HLA association with dermatitis herpetiformis

is accounted for by a cis or trans-associated DQ-heterodimer. Gut 32: 487–490

85. Dieterich W, Ehnis T, Bauer M, Donner P, Volta U, Riecken EO, Schuppan D (1997) Identification of

tissue transglutaminase as the autoantigen of celiac disease. Nature Med 3: 797–801

86. Dieterich W, Laag E, Schöpper H, Volta U, Ferguson A, Gillett H, Riecken EO, Schuppan D (1998)

Autoantibodies to tissue transglutaminase as predictors of celiac disease. Gastroenterology 115:

1317–1321

87. Kárpáti S, Meurer M, Stolz W, Schrallhammer K, Krieg T, Braun-Falco O: Dermatitis herpetiformis bodies.

Ultrastructural study on the skin of patients using direct preembedding immunogold labelling.

Arch Dermatol, 1990, 126:1469-1474.

88. Sárdy M, Kárpáti S, Merkl B, Paulsson M, Smyth N: Epidermal transglutaminase (TGase 3) is the

autoantigen of dermatitis herpetiformis. J Exp Med, 2002, 195:747-757.

89. Nishizawa, T., H. Okamoto, K. Konishi, H. Yoshizawa, Y. Miyakawa, and M. Mayumi. 1997. A novel

DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of

unknown etiologie. Biochem. Biophys. Res. Commun. 241:92-97.

90. Hino S., 2002. TTV, a new human virus with single stranded circular DNA genome. Rev Med Virol 12

(3):151-158

91. Hino S, Miyata H. Torque teno virus (TTV): current status. Rev Med Virol. 2007 Jan-Feb;17(1):45-57.

92. Irshad M, Joshi YK, Sharma Y, Dhar I. Transfusion transmitted virus: A review on its molecular

characteristics and role in medicine. World J Gastroenterol. 2006 Aug 28;12(32):5122-34.

93. Mushahwar, I. K., J. C. Erker, A. S. Muerhoff, T. P. Leary, J. N. Simons, L. G. Birkenmeyer, M. L.

Chalmers, T. J. Pilot-Matais, and S. M. Desai.1999. Molecular and biophysical characterization of

TT virus: evidence for a new virus family infecting humans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3177-

3182.

94. Ukita, M., H. Okamoto, N. Kato, Y. Miyakawa, and M. Mayumu. 1999. Excretion into bile of a novel

unenveloped DNA virus (TT virus) associated with acute and chronic non-A-G hepatitis. Infect.

Des. 179:1245-1248.

- 74 -

95. Chen, B. P., M. G. Rumi, M. Colombo, Y. H. Lin, L. Ramaswamy, J. Luna, J. K. Liu, D. Prati, and P. M.

Mannucci. 1999 TT virus is present in a high frequency of Italian hemophilic patients transfused

with plasma-derived clotting factor concentrates, Blood 54: 4333 – 4336

96. Takayama, S., T. Miura, S. Matsuo, M. Taki, and S. Sugii. 1999. Prevalence and persistence of a novel

DNA TT virus (TTV) infection in Japanese haemophiliacs. Br. J. Haematol. 104:626-629.

97. Yokozaki, S., H. Toyoda, I. Nakano, Y. Katano, M. Ebata, Y. Fukuda, J. Takamatsu, H. Saito, and T.

Hayakawa. 1999. Infection with TT virus, a novel transfusion-transmissible DNA virus, in

haemophiliacs and in blood products. Br. J. Haematol. 105:1114-1119.

98. Okamoto, H., T. Nishizawa, N. Kato, M. Ukita, H. Ikeda, H. Iizuka, Y Miyakawa, and M. Mayumi. 1998.

Molecular cloning and characterization of a novel DNA virus (TTV) associated with

posttransfusion hepatitis of unknown etiologie. Hepatol. Res. 10:1-16.

99. Mayo MA, Ball LA. ICTV in San Francisco: a report from the Plenary Session. Arch Virol 2006 151:413-

422.

100. Maggi, F., C. Fornai, L. Zaccaro, A. Morsica, M. L. Vatteroni, P. Isola, S. Marchi, S. Ricciuti, M. Pistello,

and M. Bendinelli. TT virus (TTV) loads associated with different peripheral blood cell types and

evidence for TTV replication in activated mononuclear cells. J. Med. Virol. 2001. 69 113-115

101. Lukert, P. D., G. F. de Boer, J. I. Dale, P. Keese, M. S. McNulty, J. W. Randers, and I. Tisher. 1995. Family

Circoviridae, p. 166-168. In F. A. Murphy, C. M. Fauquet, D. H. L. Bishop, S. A. Ghabrial, A. W.

Jarvis, G. P. Martelli, M. A. Mayo, and M. D. Summers (ed.), Virus taxonomy. Classification and

nomenclature of viruses. Sixth of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Springer-

Verlag, New York, N. Y.

102. Bassami, M. R., D. Berryman, G. E. Wilcox, and S. R. Raidal. 1998. Psittacine beak and feather disease

virus nucleotide sequence analysis and its relationship to porcine circovirus, plant circoviruses, and

chicken anaemia virus. Virology 249:453-459.

103. Moen E. M., Sleboda J., Grinde B.. 2002. Real-time PCR methods for independent quantitation of TTV and

TLMV. J. Virol. Methods 104: 59-67.

104. Takahashi, K., Y. Iwasa, M. Hijikata, and S. Mishiro. 2000. Identification of a new human DNA virus

(TTV-like minivirus,TLMV) intermediately related to TT virus and chicken anemia virus. Arch.

Virol. 145: 979-993.

105. Erker, J. C., T.P. Leary, S.M. Desai, M.L. Chalmers, and I.K. Mushawar. 1999. Analyses of TT virus full-

length genomic sequences. J. Gen. Virol. 80 : 1743 – 1750

106. Ninomiya M, Takahashi M, Shimosegawa T, Okamoto H. Analysis of the entire genomes of fifteen torque

teno midi virus variants classifiable into a third group of genus Anellovirus. Arch Virol. 2007 Aug

23;

107. Miyata, H., H. Tsunoda, A. Kazi, A. Yamada, M. A. Khan, J. Muramaki, T. Kamahora, K. Shiraki, and S.

Hino.1999. Identification of a novel GC-rich 113-necleotide region to complete the circular,

single-stranded DNA menome of TT virus, the first human circovirus. J. Virol. 73:3582-3586.

- 75 -

108. Maggi, F., C. Fornai, A. Morrica, F. Casula, M. L. Vatteroni, S.Marchi, P. Ciccorossi, L. Riente, M.

Pistello, and M. Bendinelli. 1999. High prevalence of TT virus viremia in Italian patients,

regardless of age, clinical diagnosis, and previous interferon treatment. J. Infect. Dis. 180 :838-842.

109. Suzuki T, Suzuki R, Li J, Hijikata M, Matsuda M, Li TC, Matsuura Y, Mishiro S, Miyamura T.

Identification of basal promoter and enhancer elements in an untranslated region of the TT virus

genome. J Virol. 2004 Oct;78(19):10820-4.

110. Kamada K, Kamahora T, Kabat P, Hino S. Transcriptional regulation of TT virus promoter and enhancer

regions in the 1.2-kb noncoding region. Virology. 2004 Apr 10;321(2):341-8.

111. Meehan, B. M., J. L. Creelan, M. S. McNulty, and D. Todd. 1997. Sequence of porcine circovirus DNA:

affinities with plant circoviruses. J. Gen. Virol.78 :221-227.

112. Kamahora, Hino T., Miyata S.. 2000. Three spliced mRNAs of TT virus transcribed from a plasmid

containing the entire genome in COS1 cells. J. Virol. 74: 9980-9986.

113. Kakkola L, Tommiska J, Boele LC, Miettinen S, Blom T, Kekarainen T, Qiu J, Pintel D, Hoeben RC,

Hedman K, Soderlund-Venermo M. Construction and biological activity of a full-length molecular

clone of human Torque teno virus (TTV) genotype 6. FEBS J. 2007 Sep;274(18):4719-30.

114. Fenner, F.J., E.P.J. Gibbs, F.A. Murphy, R.Rott, M.J. Studdert, and D.O. White, 1993. Vetenary virology,

2nd ed. Academic Press, Inc., San Diego, Calif.

115. Fields, B. N. 1996. Virology, p. 2950. In B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howley, R. M. Chanock, J. L.

Melnick, T. P. Monath, B. Roizman, and S. E. Straus (ed.),Fields virology, 3rd ed. Lippincot-

Raven, Philadelphia, Pa. Finch JT and Klug A (1959) Nature 183:1709-1714

116. Gilbert, W., and D. Dressler. 1968. DNA replication: the rolling circle model. Cold Spring Harbor Symp.

Quant. Biol. 33:473-484.

117. Mariscal LF, Lopez-Alcorocho JM, Rodriguez-Inigo E, Ortiz-Movilla N, de Lucas S, Bartolome J, Carreno

V. TT virus replicates in stimulated but not in nonstimulated peripheral blood mononuclear cells.

Virology 2002 301:121-129.

118. Danen-Van Oorschot, A.A., A.J. van der Elb, and M.H. Noterborn. 1999. BCL-2 timulates apoptin-induced

apoptosis. Adv. Exp. Med. Biol. 457: 245 – 249

119. Danen-Van Oorschot, A.A., D.F. Fisher, J.M. Grimbergen, B. Klein, S. Zhuang, J.H. Falkenburg, C.

Backendorf, P.H. Quax, A.J. van der Eb, and M.H. Noteborn. 1997. Apoptin induces apoptosis in

human transformed and malignant cells but not in normal cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:

5843 – 5847.

120. Kooistra K, Zhang YH, Henriquez NV, Weiss B, Mumberg D, Noteborn MH. TT virus-derived apoptosis-

inducing protein induces apoptosis preferentially in hepatocellular carcinoma-derived cells. J Gen

Virol. 2004 Jun;85(Pt 6):1445-50.

121. Nishizawa T OH, Tsuda F, Aikawa T, Sugai Y, Konishi K, Akahane Y, Ukita M, Tanaka T, Miyakawa Y,

Mayumi M. Quasispecies of TT virus TTV with sequence divergence in hypervariable regions of

the capsid protein in chronic TTV infection. J Virol 1999 73:9604-9608.

- 76 -

122. Hijikata, M., K. Takahashi, and Mishiro. 1999. Complete circular DNA genome of a virus variant (isolate

name SANBAN) and 44 partial ORF2 sequences implicating a great degree of diversity beyond

gentypes. Virology 260:17-22.

123. Leppik L, Gunst K, Lehtinen M, Dillner J, Streker K, de Villiers EM. In vivo and in vitro intragenomic

rearrangement of TT viruses. J Virol. 2007 Sep;81(17):9346-56. Epub 2007 Jun 27.

124. Lemey P, Salemi M, Bassit L, Vandamme AM. Phylogenetic classification of TT virus groups based on the

N22 region is unreliable. Virus Res. 2002 Apr 23;85(1):47-59.

125. Shieh B, Chang MJ, Ko WC, Chen EJ, Wu JC, Lee CF, Chang TT, Li C. Effects of multiple virus

coinfections on disease progression in HIV-positive patients. Intervirology. 2003;46(2):105-13.

126. Manni F, Rotola A, Caselli E, Bertorelli G, Luca DD. 2002. Detecting Recombination in TT Virus: A

Phylogenetic Approach. J Mol Evol. 55(5):563-72

127. Itoh, K., M. Takahashi, M. Ukita, T. Nishizawa, and H. Okamoto.1999. Influence of primers on the

detection of TT virus DNA by polymerase chain reaction. J. Infect. Dis. 180 :1750-175

128. Kato, T., M. Mizokami, E. Orito, T. Nakano, Y. Tanaka, R. Ueda, N. Hirashima, Y. Iijima, T. Kato, F.

Sugauchi, M. Mukaide, K. Shimamatsu, M. Kage, and M. Kojiro.1999.High prevalence of TT

virus infection in Japanese patients with liver deseases and in blood donors. J. Hepatol.31:221-227

129. Ball, J. K., R. Curran, S. Berridge, A.M. Grabowska, C. L. Jameson, B. J. Thomson, W. L. Irving, and P. M.

Sharp. 1999. TT virus sequence heterogeneity in vivo: evidence for co-infection with multiple

genetic types. J. Gen. Virol. 80 :1759-1768.

130. Ishikawa, T., Y. Hamano, and H. Okamoto. 1999. Frequent detection of TT virus in throat swabs of pediatic

patients. Infection 27:298.

131. Pollicino T, Raffa G, Squadrito G, Costantino L, Cacciola I, Brancatelli S, Alafaci C, Florio MG, Raimondo

G. TT virus has a ubiquitous diffusion in human body tissues: analyses of paired serum and tissue

samples. J Viral Hepat. 2003 Mar;10(2):95-102.

132. Okamoto, H., Y. Akahane, M. Ukita, M. Fukuda, F. Tsuda, Y. Miyakawa, and M. Mayumi. 1998. Fecal

excretion of a nonenveloped DNA virus (TTV) associated with posttransfusion non A-G hepatitis

J. Med. Virol.56:128-132.

133. Ross, R.S., S. Viazov, V. Runde, U. W. Schaefer, and M. Roggendorf. 1999. Detection of TT virus DNA in

specimens other than blood. J. Clin. Virol. 13 :181-184.

134. Okamoto, H., T. Nishizawa, M. Ukita, M. Takahashi, M. Fukuda, H. Iizuka, Y. Miyakawa, and M. Mayumi.

1999. The entire sequence of a TT virus isolate from the United States (TUS01): comparison with

reported isolates and phylogenetic analysis. Virology 259:437-448.

135. Yokozaki, S., H. Toyoda, I. Nakano, Y. Katano, M. Ebata, Y. Fukuda, J. Takamatsu, H. Saito, and T.

Hayakawa. 1999. Infection with TT virus, a novel transfusion-transmissible DNA virus, in

haemophiliacs and in blood products. Br. J. Haematol. 105:1114-1119.

136. Chen, B. P., M. G. Rumi, M. Colombo, Y. H. Lin, L. Ramaswamy, J. Luna, J. K. Liu, D. Prati, and P. M.

Mannucci. 1999 TT virus is present in a high frequency of Italian hemophilic patients transfused

with plasma-derived clotting factor concentrates, Blood 54: 4333 – 4336

- 77 -

137. Utsonomiya, S., K. Yoshioka, T. Wakita, H. Seno, K. Takagi, M. Ishigami, M. Yano, K. Watanabe, M.

Kobayashi, K. Watanabe, H. Kishimoto, and S. Kakumu. 1999. TT virus infection in hemodialysis

patients. Am. J. Gastroenterol. 94:3567-3570.

138. MacDonald, D. M., G. R. Scott, D. Clutterbuck, and P. Simmonds. 1999. Infrequent detection of TT virus

infection in intravenous drug users, prostitudes, and homosexual men. J. Infect. Dis. 179 :686-689.

139. Saback, F. L., S. A. Gomes, V. S. de Paula, R.R.S. da Silva, L. L.Lewis-Ximenez, and C. Niel. 1999. Age-

specific prevalence and transnission of TT virus. J. Med. Virol. 59:318-322.

140. Vaidya SR, Chitambar SD, Arankalle VA. 2002. Polymerase chain reaction-based prevalence of hepatitis

A, hepatitis E and TT viruses in sewage from an endemic area. J. Hepatol. 37(1):131-6

141. Haramoto E, Katayama H, Oguma K, Yamashita H, Nakajima E, Ohgaki S. One-year monthly monitoring

of Torque teno virus (TTV) in wastewater treatment plants in Japan. Water Res. 2005

May;39(10):2008-13.

142. Verani M, Casini B, Battistini R, Pizzi F, Rovini E, Carducci A. One-year monthly monitoring of Torque

teno virus (TTV) in river water in Italy. Water Sci Technol. 2006;54(3):191-5.

143. Morrica, A., F. Maggi, M. L. Zatteroni, C. Fornai, M. Pistello, P. Ciccorossi, E. Grassi, A. Gennazzani, and

M. Bendinelli. 2000. TT virus: evidence for transplacental transmission. J. Infect. Dis. 181 : 803-

804.

144. Okamoto, H., M. Ukita, T. Nishizawa, J. Kishimoto, Y. Hoshi, H. Mizuo, T.Tanaka, Y. Miyakawa, and M.

Mayumi.2000. Circular double-stranded forms of TT virus DNA in the liver. J. Virol.74:5161-

5167.

145. Bagaglio S, Sitia G, Prati D, Cella D, Hasson H, Novati R, Lazzarin A, Morsica G. 2002. Mother-to child

transmission of TT virus: sequence analysis of non-coding region of TT virus in infected

motherinfant pairs. Arch Virol 147(4):803-12

146. Ohto H, Ujiie N, Takeuchi C, Sato A, Hayashi A, Ishiko H, Nishizawa T, Okamoto H. 2002. TT virus

infection during childhood. Transfusion. 42(7):892-8

147. Hsu HY, Ni YH, Chen HL, Kao JH, Chang MH. 2003. TT virus infection in healthy children, children after

blood transfusion, and children with non-A to E hepatitis or other liver diseases in Taiwan. Med

Virol 69(1):66-71

148. Xin X, Xiaoguang Z, Ninghu Z, Youtong L, Liumei X, Boping Z. Mother-to-infant vertical transmission of

transfusion transmitted virus in South China. J Perinat Med. 2004;32(5):404-6.

149. Komatsu H, Inui A, Sogo T, Kuroda K, Tanaka T, Fujisawa T. TTV infection in children born to mothers

infected with TTV but not with HBV, HCV, or HIV. J Med Virol. 2004 Nov;74(3):499-506.

150. Indolfi G, Moriondo M, Galli L, Azzari C, Poggi GM, Resti M, de Martino M. Mother-to-infant

transmission of multiple blood-borne viral infections from multi-infected mothers. J Med Virol.

2007 Jun;79(6):743-7.

151. Wiwanitkit V. New emerging blood-borne hepatitis viral pathogens and the feasibility of passing thorough

the placenta: an appraisal. Clin Exp Obstet Gynecol. 2006;33(4):213-4.

- 78 -

152. Leary, T. P., J. C. Erker, M. L. Chalmers, S. M. Desai, and I. K. Mushahwar. 1999. Optimized PCR assay

for the detection of TT virus. J. Virol. Methods 82:109-112.

153. Thom K, Morrison C, Lewis JC, Simmonds P. 2003. Distribution of TT virus (TTV), TTV-like minivirus,

and related viruses in humans and nonhuman primates. Virology 306(2):324-33

154. Ellis, J., S. Krakowka, M. Lairmore, D. Haines, A. Bratanich, E. Clark, G. Allan, C. Konoby, L. Hassard, B.

Meehan, K. Martin, J. Harding, S. Kennedy, and F. McNeilly. 1999. Reproduction of lesions of

postweaning multisystemic wasting syndrome in gnotobiotic piglets. J. Vet. Diagn. Investig. 11: 3

– 14.

155. Meehan, B. M., F. McNeilly, D. Todd, S. Kennedy, V. A. Jewhurst, J. A. Ellis, L. E. Hassard, E. G. Clark,

D. M. Haines, and G. M. Allan.1998. Characterization of novel circovirus DNAs associated with

wasting syndromes in pigs. J. Gen. Virol. 79:2171-2179.

156. Morozov, I., T. Sirinarumitr, S. D.Sorden, P. G. Halbur, M. K. Morgan, K. J. Yoon, and P. S. Paul.1998.

Detection of a novel strain of porcine circovirus in pigs with postweaning mulisystemic wasting

syndrome. J. Clin. Microbiol. 36: 2535-2541.

157. Irshad M, Sharma Y, Dhar I, Singh J, Joshi YK. Transfusion-transmitted virus in association with hepatitis

A-E viral infections in various forms of liver diseases in India. World J Gastroenterol. 2006 Apr

21;12(15):2432-6

158. Maggi F, Tempestini E, Lanini L, Andreoli E, Fornai C, Giannecchini S, Vatteroni M, Pistello M, Marchi S,

Ciccorossi P, Specter S, Bendinelli M. Blood levels of TT virus following immune stimulation

with influenza or hepatitis B vaccine. J Med Virol. 2005 Feb;75(2):358-65.

159. Hsieh, S.Y., Y.H.Wu, Y.P. Ho, K.C.Tsao, C.T. Yeh, and Y.F. Liaw. 1999. High prevalence of TT virus

infection in healthy children and adults and in patients with liver desease in Taiwan. J. Clin.

Microbiol. 37:1829-1831.

160. Gimenez-Barcons, M., X. Forns, S. Ampurdanes, M. Guilera, M. Soler, C. Soguero, A. Sanchez-Sueyo, A.

Mas, J. Bruix, J. M. Sanchez-Tapias, J. Rodes, and J. C. Saiz. 1999. Infection with a novel human

DNA virus (TTV) has a pathogenic significance in patients with liver diseases. J. Hepatol.

30:1028-1034.

161. Lefrère, J. J., F. Roudot-Thoraval, F. Lefrere, A. Kahfer, M. Mariotti, J. Lerable, M. Thauvin, G. Lefevre, P.

Rouger, and R. Girot. 1999. Natural history of the TT virus infection through follow-up of TTV

DNA-positive multiple-transfused patients. Blood 95:347-351.

162. Oguchi, T., E. Tanaka, K. Orii, M. Kobayashi, K. Hora, and K. Kiyosawa.1999. Transmission of and liver

injury by TT virus in patients of maintenance hemodialysis. J. Gastroenterol.34:234-240.

163. Shang, D., H. Lin, I. Rigopoulou, B. Chen, G. J. M. Alexander, and J.-P. Allain. 2000. Detection of TT

virus DNA in patients with liver disease and recipients of liver transplant. J. Med. Virol. 61:455-

461.

164. Vogt M, Rifai M, Braun S, Busch R, Hess J, Frosner G, Lang T. Epidemiology, risk factors and clinical role

of TT virus infection in polytransfused patients after cardiac surgery in childhood: impact of HCV

co infection. J Clin Virol. 2006 May;36(1):82-3.

- 79 -

165. Yamada T, Naitou H, Morita T. Influence of TT virus co-infection on IFN-beta therapy in patients with

chronic hepatitis C. Kansenshogaku Zasshi. 2002 Sep;76(9):747-53.

166. Verschoor, E.J., S. Langenhuijzen, and J. I. Heeney. 1999. TT viruses (TTV) of non human primates and

their relationship to the human TTV genotypes. J. Gen. Virol. 80 :2491-2499.

167. Akahane, Y., M. Sakamoto, Y. Miyazaki, S. Okada, T. Inoue, M. Ukita, H. Okamoto, Y. Miyakawa, and M.

Mayumi. 1999. Effect of interferon on a nonenveloped DNA virus (TT virus) associated with acute

and chronic hepatitis of unknown etiology. J. Med Virol.. 58:196-200

168. Chayama, K., M. Kobayashi, A. Tsubota, M. Kobayashi, Y. Arase, Y. Suzuki, S. Saitoh, N. Murashima, K.

Ikeda, K. Okamoto, M. Hashimoto, M. Matsuda, H. Koike, M. Kobayashi, and H. Kumada. 1999.

Susceptibility of TT virus to interferon therapy. J. Gen. Virol. 80 :631-634.

169. Hagiwara, H., N. Hayashi, E. Mita, M. Ospita, I. Kobayashi, S. Iio, N. Hiramatsu, Y. Sasaki, A. Kasahara,

K. Kakinuma, T. Yamauchi, and H. Fusamoto. 1999. Influence of transfusion-transmitted virus

infection on the clinical features and response to interferon therapy in Japanese patients with

chronic hepatitis C. J. Viral Hepatol. 6:463-469.

170. Moreno J, Moraleda G, Barcena R, Mateos M, del Campo S. Response of TT virus to IFN plus ribavirin

treatment in patients with chronic hepatitis C. World J Gastroenterol. 2004 Jan;10(1):143-6.

171. Lai YC, Hu RT, Yang SS, Wu CH. Coinfection of TT virus and response to interferon therapy in patients

with chronic hepatitis B or C. World J Gastroenterol. 2002 Jun;8(3):567-70.

172. Simmonds P. TT virus infection: a novel virus-host relationship. J Med Microbiol. 2002 Jun;51(6):455-8.

Review.

173. Zhong S, Yeo W, Tang M, Liu C, Lin XR, Ho WM, Hui P, Johnson PJ. Frequent detection of the

replicative form of TT virus DNA in peripheral blood mononuclear cells and bone marrow cells in

cancer patients. J Med Virol. 2002 Mar;66(3):428-34.

174. Fanci R, De Santis R, Zakrzewska K, Paci C, Azzi A. Presence of TT virus DNA in bone marrow cells from

hematologic patients. New Microbiol. 2004 Apr;27(2):113-7

175. Pisani,G., K. Cristiano, M. Wirz, G. Bisso, F. Bebeduce, G. Morace, M. Rapicetta, and G. Gentili. 1999.

Prevalence of TT virus in plasma pools and blood products. Br. J. Haematol. 106:431-435.

176. Tsuda, F., H. Okamoto, M. Ukita, T. Tanaka, Y. Akahane, K. Konishi, H. Yoshizawa, Y. Miyakawa, and M.

Mayumi. 1999. Determination of antibodies to TT virus (TTV) and application to blood donors and

patients with post-transfusion non-A to G hepatitis in Japan. J. Virol. Methods 77:199-206.

177. Smith SA, Kotwal GJ. Virokines: novel immunomodulatory agents. Expert Opin Biol Ther 2001 1:343-

357.

178. Fujinami RS, von Herrath MG, Christen U, Whitton JL. Molecular mimicry, bystander activation, or viral

persistence: infections and autoimmune disease. Clin Microbiol Rev 2006 19:80-94.

179. Sospedra M ZY, zur Hausen H, Muraro PA, Hamashin C, de Villiers EM, Pinilla C, Martin R. Recognition

of conserved amino acid motifs of Common viruses and its role in autoimmunity. PLoS Pathog 1

2005.

- 80 -

180. Garbuglia AR, Grasso F, Dona MG, Mochi S, Conti P, De Lutiis MA, Giorgi C, Iezzi T. TT virus infection:

role of interferons, interleukin-28 and 29, cytokines and antiviral proteins. Int J Immunopathol

Pharmacol. 2007 Apr-Jun;20(2):249-58.

181. Gergely P Jr, Blazsek A, Danko K, Ponyi A, Poor G. 2005 Detection of TT virus in patients with idiopathic

inflammatory myopathies. Ann N Y Acad Sci 1050:304-313.

182. Gergely P Jr, Pullmann R, Stancato C, Otvos L Jr, Koncz A, Blazsek A, Poor G, Brown KE, Phillips PE,

Perl A. Increased prevalence of transfusion-transmitted virus and cross-reactivity with

immunodominant epitopes of the HRES-1/p28 endogenous retroviral autoantigen in patients with

systemic lupus erythematosus. Clin Immunol 2005 116:124-134.

183. Maggi F, Andreoli E, Riente L, Meschi S, Rocchi J, Delle Sedie A, Vatteroni ML, Ceccherini-Nelli L,

Specter S, Bendinelli M. Torquetenovirus in patients with arthritis. Rheumatology (Oxford). 2007

May;46(5):885-6.

184. Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ. Gapped BLAST and PSI-

BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res 1997 25:3389-

3402.

185. Schäffer A, Aravind L, Madden TL, Shavirin S, Spouge JL, Wolf YI, Koonin EV, Altschul SF. Improving

the accuracy of PSI-BLAST protein database searches with composition-based statistics and other

refinements. Nucleic Acids Res 2001 29:3389-3402.

186. Kolaskar AS, Tongaonkar PC. A semi-empirical method for prediction of antigenic determinants on protein

antigens. FEBS Lett. 1990 Dec 10;2761-2:172-4.

187. Pichler WJ, Tilch J. The lymphocyte transformation test in the diagnosis of drug hypersensitivity. Allergy.

2004 Aug; 59(8):809-20

188. Thoma-Uszynski, S. et al. 2006. . Autoreactive T and B cells from bullous pemphigoid (BP) patients

recognized epitopes clustered in distinct regions of BP180 and BP230. J. Immunol. 176::2015-

2023.

189. Poovorawan Y Tangkijvanich P, Theamboonlers A, Hirsch P. Transfusion transmissible virus TTV and its

putative role in the etiology of liver disease. Hepatogastroenterology 2001 48:256-260.

190. Irshad M, Joshi YK, Sharma Y, Dhar I. Transfusion transmitted virus: A review on its molecular

characteristics and role in medicine. World J Gastroenterol 2006 12:5122-5134.

191. Ahmed AR, Rosen GB Viruses in pemphigus. Int J Dermatol 1989 28: 209-217.

192. Dahl MV, Katz SI, Scott RM, Binn LN. Viral studies in pemphigus. J Invest Dermatol 1974 62:96-99.

193. Drago F, Nozza P, Casazza S, Brusati C, Bandelloni R, Rebora A: Human Herpesviruses In Bullous

Pemphigoid Lesions J Br Dermatology 2005 152 2, 375-376.

194. Erbagci Z: Childhood bullous pemphigoid following hepatitis B immunization. J Dermatol 200229:781-785.

195. Baykal C, Okan G, Sarica R. Childhood bullous pemphigoid developed after the first vaccination. J Am

Acad Dermatol 2001 44:348-350.

196. Handley J, O'Neill H, Connolly J, Burrows D. Adenovirus 12 and dermatitis herpetiformis. Acta Derm

Venereol 1993 73:430-432.

- 81 -

Saját publikációk jegyzéke

Az értekezés témájában

1. Gergely P., Jr. Blazsek A. Dankó K., Ponyi A., Poór Gy.: Detection Of Tt Virus In Patients With Idiopathic Inflammatory Myopathies. Ann. N.Y. Acad. Sci.

2. Gergely P Jr, Pullmann R, Stancato C, Otvos L Jr, Koncz A, Blazsek A, Poor G, Brown Ke, Phillips Pe, Perl A.: Increased Prevalence Of Transfusion-Transmitted Virus And Cross-Reactivity With Immunodominant Epitopes Of The Hres-1/P28 Endogenous Retroviral Autoantigen In Patients With Systemic Lupus Erythematosus. Clin Immunol. 2005 May 12;

Elfogadott, de még nem közölt publikációk:

1. Blazsek, Antal; Sillo, Palma; Norito, Ishii; Gergely Jr., Peter; Poor, Gyula; Preisz, Klaudia; Hashimoto, Takashi; Medvecz, Márta; Kárpáti, Sarolta: Searching for foreign antigens as possible triggering factors of autoimmunity: Torque Teno Virus DNA prevalence is elevated in sera of patients with bullous pemphidoid Accepted for publication: J Exp Derm. 24-Sep-2007

Nem az értekezés témájában

1. Li Y., Brown Jh., Reshetnikova L., Blazsek A., Farkas L., Nyitray L., Cohen C.: Visualisation Of An

Unstable Coiled Coil From The Scsallop Myosin Rod. Nature, 2003 Jul..; 424 (6946):314-315 2. Gergely P. Jr, Blazsek A., Weiszhár Zs., Pazár B., Poór G.: Lack Of Genetic Association Of The Toll-Like

Receptor 4 Asp299gly And Thr399ile Polymorphisms With Seronegative Spondylarthropathies In A Hungarian Population. Oxford J. Rheumatology, 2006

Idézhető Absztraktok, Poszterek, Előadások Hazai És Nemzetközi Konferenciákon

1. Blazsek A., Farkas L., Nyitray L.: Miozin Rúd Fragmentumok Vizsgálata, Avagy Egy Molekuláris

Cipzárban Rejlő Lehetőségek. Xxvi. Biológus Otdk 2. Blazsek A., Ifj. Gergely P. , Zs. Weiszhár, K. Beke, G. Poór: Tt Vírus Kimutatása Autoimmun

Reumatológiai Megbetegedésekben. Mit Xxxiv. Vándorgyűlés 3. Zs. Weiszhár, Ifj. Gergely P. , Blazsek A.,K. Beke, G. Poór: A Toll-Like Receptor 4 Asp299gly És

Thr399ile Polimorfizmusai Spondylarthritis Ankylopoeticaban. Mit Xxxiv. Vándorgyűlés 4. Blazsek A., Ifj. Gergely P. , Zs. Weiszhár, K. Beke, G. Poór: Tt Vírus Kimutatása Autoimmun

Reumatológiai Megbetegedésekben. Mre Vándorgyűlés 2004 5. P. Gergely Jr., A. Blazsek, Z. Weiszhár, G. Poór [Op0025] Relationship Between Tt Virus Infection And

Autoimmune Rheumatic Diseases Europian Leauge Against Rheumatism Conference (Eular) 2004: Advances In Sle Basic Science – Oral Presentation;

6. P. Gergely Jr., Blazsek A., K. Beke, G. Poór: Detection Of Tt Virus In Patients With Autoimmune Rheumatic Diseases. 4th International Congress On Autoimmunity Budapest 2004

7. Zs. Weiszhár, Ifj. Gergely P. , Blazsek A., K. Beke, G. Poór: A Toll-Like Receptor 4 Asp299gly És Thr399ile Polimorfizmusai Spondylarthritis Ankylopoeticaban. I. Immunogenomikai Kongresszus 2004 Budapest.

8. P. Gergely Jr, A. Blazsek, K. Danko, A. Ponyi, G. Poór [Thu0488] Increased Prevalence Of Tt Virus Infection In Patients With Severe Idiopathic Inflammatory Myopathies Eular 2005: Myopathies And Soft Tissue Diseases Ann Rheum Dis 2005;64(Suppl Iii):255

9. Donáth J., Ifj. Gergely P., Blazsek A., Poór Gy.: Az Sqstm1 Gén Mutációinak Vizsgálata Hazai Paget-Kóros Betegekben. Vi. Mok Balatonfüred 2005

10. J. Csiki, P. Gergely Jr, A. Blazsek, I. Márkus, A. Czimbalmos, Z. Nagy, G. Poór [Sat0492] Hla Subtypes Containing The Shared Epitope Predispose To Worse Radiological Outcome But Not To Impaired Functioning, Disability And Health Status In Hungarian Patients With Rheumatoid Arthritis Eular 2005: Rehabilitation, Ann Rheum Dis 2005;64(Suppl Iii):558

11. Blazsek A, Gergely P, Balogh Zs, Szabó Zs, Miklós K, Németh J, Poór G: Serum Concentration Of Cartilage Oligomeric Matrix Protein In Ankylosing Spondylitis And Juvenile Idipathic Arthritis. Mit Xxxv. Vándorgyűlés

- 82 -

12. Blazsek A., Nagy B. Zs., Gergely P. Jr., Donáth J., Poór G: Új Sqstm1 Mutációk Sporadikus Paget-Kórban, Mre2005

13. Z. Schmidt, A. Blazsek, M. Brózik, P. Gergely Jr., G. Hittner, K. Merétey, G. Poór [Op0055] Lack Of Anti-Cyclic Citrullinated Peptide-Autoantibody And Hla Drb1*0401 Might Partly Explain The Benign Synovitis In Polymyalgia Rheumatica Eular 2006: Vasculitis And Aps, Ann Rheum Dis 2006;65(Suppl Ii):71 – Oral Presentation

14. P. Gergely Jr., J.S. Simon, Z. Nagy, I. Jonap, M. Areazza, A. Blazsek, G. Poor [Thu0328] Whole Genome Expression Analysis Of Peripheral Blood Mrna From Ankylosing Spondylitis Patients On Infliximab Therapy Eular 2006: Spondylarthropathies Including Psoriatic Arthritis, Ann Rheum Dis 2006;65(Suppl Ii):216

15. Szabó Z., Blazsek A, Miklós K,Gergely Jr. P, Brózik M, Balogh Z, Poór G, Németh J - Pc-2681 Investigation Of New Serological Markers In Ankylosing Spondylitis And Juvenile Idiopathic Arthritis, Eci 2006

16. Blazsek A, Kornséé Z, Lepesi-Benko R, Ishii N, Csikós M, Hashimoto T and Karpati S: Detection of Torque Teno Virus in Patients with Autoimmune Bullous Skin Disorders, European Society for Dermatological Research (ESDR) 2006; J. Inv. Derm (JID) 2006 Sept. Supl. I.

17. Lepesi-Benko R, Medvecz-Csikos M, Becker K, Sardy M, Bona A, Blazsek A, Sajo R, Hatvani Zs, Kornsee Z and Karpati S: Mutation Analysis of Patients with Comel-Netherton Syndrome in Hungary, ESDR 2006; JID 2006 Sept. Supl. I.

18. Blazsek1, M Németh2, Z Hatvani1, R Lepesi-Benko1, A Bóna1, S Kárpáti1, M Medvecz1 Multi-locus genetic analysis of monilethrix in a 3 generation Hungarian pedigree AZ 1Semmelweis University, Budapest, Hungary 2HAS-SU Molecular Medicin RG., Budapest, Hungary ESDR 2007, JID 2006 Oct. Supl. I.

19. AZ Blazsek, S Silló, Z Kornseé, R Lepesi-Benko, M Németh, Z Hatvani, I Kosnai, K Preisz, M Medvecz1, S Kárpáti: Evaluating the role of non-HLA genetic factors in gluten sensitive enteropathies - MBL2 polymorphisms in dermatitis herpetiformis Semmelweis University, Budapest, Hungary 2HAS-SU Molecular Medicin RG., Budapest, Hungary ESDR 2007, JID 2006 Oct. Supl. I.

- 83 -