(3)

ชื่อวิทยานิพนธ การศึกษาเอนไซมฟนอลออกซิเดสในกุงแชบวย ผูเขียน นางสาววิไลพร ธรรมรัตน สาขาวิชา ชีวเคม ีปการศึกษา 2551

บทคัดยอ

ระบบการปองกันตนเองของสัตวไมมีกระดูกสันหลัง ขึน้กับระบบภูมิคุมกันที่ไมจําเพาะ เอนไซมฟนอลออกซิเดสซึ่งเปนรูปแบบที่ active ของโปรฟนอลออกซิเดส เปนเอนไซมหลักของครัสเตเชียนที่มีบทบาทสําคัญในกลไกการปองกันตนเองตอการติดเชื้อกอโรค

การศึกษาภาวะที่เหมาะสมของการวัดแอคทิวทิีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสใน ฮีโมลิมฟของกุงแชบวย ทาํโดยการใช 5.7 mM L-DOPA เปนสับสเตรท ในบฟัเฟอร 10 mM cacodylate, pH 8-9 ณ อุณหภูมิหองหรือที่ 40°ซ และใชเอนไซมทริปซิน (0.5 มิลลิกรัมตอมิลลิลติร) หรือ SDS (0.5%) กระตุนแอคทิวทิีของเอนไซม

ไดทําใหเอนไซมฟนอลออกซิเดสบริสุทธิบ์างสวนจากฮีโมลิมฟของกุงแชบวยโดยโครมาโทกราฟดวยคอลัมน Sephadex G-200 และตามดวยการทําโพลอีะคริลาไมดเจล อิเล็กโทรฟอรีซิสแบบเตรียม 2 ครั้ง เอนไซมฟนอลออกซิเดสที่บริสุทธิ์บางสวนปรากฏแถบโปรตีน 2 แถบเขม ในโพลอีะคริลาไมดเจลอิเล็กโทรฟอรีซิสแบบไมแปลงสภาพ เอนไซมน้ีมี pH ที่เหมาะสมในการทํางานที่ 9.0 และเสถียรตออุณหภูมิจนถึง 40°ซ เอนไซมฟนอลออกซิเดสที่ บริสุทธิบ์างสวนมีจลนศาสตรแบบไฮเพอรโบลา ซ่ึงมีคา KM และ Vmax สําหรับ L-DOPA เปน 1.75 mM และ 0.0625 A490/min ตามลําดับ รวมทั้งมีความจําเพาะตอสับสเตรท L-DOPA และ dopamine แตไมมีความจาํเพาะตอ catechol พบแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสมากในฮีโมลิมฟและสารสกัดตับ พบเล็กนอยในสารสกัดจากกระเพาะและลําไส บงชี้วาเอนไซมฟนอลออกซิเดสที่พบในฮีโมลิมฟและในตับอาจจะเกี่ยวของกับการปองกันตนเองของกุง จากการเหนี่ยวนํากุงแชบวยดวยการฉีด Vibrio harveyi แบบ active พบการตอบสนองโดยมีระดับแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในฮีโมลิมฟเพ่ิมขึ้นตามเวลาและตามปริมาณเชื้อที่ใชเหน่ียวนํา เม่ือฉีดกุงดวย V. harveyi ปริมาณ 5 x 109 เซลลตอตัวกุง พบวาแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในฮีโมลิมฟเม่ือเทียบกับคาที่ชั่วโมง 0 (กอนฉีด) เพ่ิมขึ้นอยางมีนัยสําคัญที่ 6 ชั่วโมง และเพ่ิมสูงสุดเปน 1.88 เทา ที่ 12 ชั่วโมง หลังการฉีด ระดับแอค

(4)

ทิวิทีของเอนไซมที่เพ่ิมสูงขึ้นนี้มีคามากกวาแอคทิวิทีของกุงชุดควบคุมที่ฉีดดวยน้ําเกลืออยางมีนัยสําคัญ ณ เวลาเดียวกัน ในทํานองเดียวกัน การฉีดกุงดวยไวรัสที่กอโรคตัวแดงดวงขาว (white spot syndrome virus) ทําใหแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในฮีโมลิมฟเพ่ิมขึ้น 1.77 เทา ที่ 12 ชั่วโมงหลังการฉีด และเปนระดับที่สูงกวาของกุงชุดควบคุม ณ เวลาเดียวกัน ในทางกลับกัน การฉีดกุงแชบวยดวยจุลินทรียไมกอโรคกุง เชน Escherichia coli, V. cholerae หรือ V. harveyi แบบ inactive ไมทําใหแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในฮีโมลิมฟมีคาแตกตางไปจากของกุงชุดควบคุม ผลการทดลองเหลานี้บงชี้วาการเพิ่มขึ้นของระดับแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในฮีโมลิมฟอาจเปนการตอบสนองอยางจําเพาะตอการติดเชื้อกอโรคซึ่งเปนกลไกการปองกันตนเองของกุงแชบวย

(5)

Thesis Title Characterization of Phenoloxidase in Penaeus merguiensis Author Miss Wilaiporn Thammarat Major Program Biochemistry Academic Year 2008

ABSTRACT

The defense system of invertebrates is dependent on the innate immune response. Phenoloxidase, an active form of prophenoloxidase, is a key enzyme of crustaceans that plays important role in defense mechanism against pathogenic infection. Optimal conditions for assay of phenoloxidase activity in hemolymph of banana shrimps were studied by using 5.7 mM L-DOPA as a substrate in 10 mM cacodylate buffer, pH 8-9 and incubation at room temperature or 40°C. Trypsin (0.5 mg/ml) or SDS (0.5%) was used to activate the phenoloxidase activity in the assay. Phenoloxidase from the hemolymph of banana shrimps was partially purified by chromatography on Sephadex G-200 column, and subsequently by repetitive preparative polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). The partial purified enzyme showed two major protein bands in nondenaturing PAGE. The phenoloxidase reaction using L-DOPA as substrate has an optimum pH of 9.0. It was stable up to 40°C. The partial purified enzyme had hyperbolic kinetics with KM and Vmax for L-DOPA values of 1.75 mM and 0.0625 A490/min, respectively. It showed substrate specificity to L-DOPA and dopamine but not catechol. High activities of phenoloxidase were detected in the hemolymph and hepatopancrease extract whereas traces were found in the extract fractions from stomach and intestine of banana shrimps. These results suggest that these enzymes present in the hemolymph and hepatopancrease may involve in defense response.

The increase of phenoloxidase activities in the hemolymph of banana shrimps challenged by active Vibrio harveyi injection was time and dose response. After injection the shrimps by V. harveyi (5 x 109 cells/shrimp), phenoloxidase activities in the

(6)

hemolymph were significantly increased from hour 0 to hour 6 and reached the highest up to 1.88-fold at hour 12 of post-injection. These were significantly higher than that of controls which were injected with 0.85% NaCl at the same time. In the similar manner, phenoloxidase activities in the hemolymph of shrimps injected with white spot syndrome virus were 1.77-fold at hour 12 of post-injection, which were significantly higher than that of controls at the same time. In contrast, activities of the hemolymph phenoloxidase of banana shrimps injected by their nonpathogenic microorganisms such as Escherichia coli, V. cholerae, or inactive V. harveyi, were not different from that of controls. These results indicate that the increase of phenoloxidase activities in the hemolymph may respond specifically to the pathogenic infection as a defense mechanism in banana shrimps.

(7)

กิตติกรรมประกาศ

งานวิทยานิพนธฉบับน้ีสําเร็จลุลวงดวยดี ดวยความเสียสละเวลา กรุณาใหคําแนะนําแนวทางแกปญหา การถายทอดความรูและการติดตามชวยเหลือในการศึกษาคนควาวิจัย ตลอดจนการเขียนและแกไขวิทยานิพนธใหสําเร็จลุลวงดวยดี จากอาจารยที่ปรึกษาวิทยานิพนธ รองศาสตราจารย ดร. ประภาพร อุทารพันธุ ผูวิจัยขอกราบขอบพระคุณเปนอยางสูงไว ณ โอกาสนี้

ขอขอบคุณรองศาสตราจารย ดร. นันทา เชิงเชาว อาจารยที่ปรึกษาวิทยานิพนธรวม รองศาสตราจารย ดร. พรทิพย ประพันธพจน ประธานกรรมการสอบ และดร.จงรักษ อรรถรัฐ ผูแทนจากบัณฑิตวิทยาลัย ที่ไดใหคําแนะนําเพื่อแกไขวิทยานิพนธฉบับน้ีใหถูกตองสมบูรณยิ่งขึ้น ขอขอบคุณภาควิชาชีวเคมี คณะวิทยาศาสตร มหาวิทยาลัยสงขลานครินทร ที่ใหทุนการศึกษาและทุนสนับสนุนการวิจัยเพ่ือวิทยานิพนธจากโครงการสรางความเขมแข็งสูความเปนเลิศทางวิชาการ สาขาชีวเคมี ประจําป 2548 ขอขอบคุณคณาจารยและเจาหนาที่ภาควิชาชีวเคมีทุกทานที่ไดประสิทธิ์ประสาทความรูและใหความชวยเหลือในการศึกษาวิ จัยครั้ง น้ีสําเร็จลุลวง ขอขอบคุณ รองศาสตราจารย ดร.กิจการ ศุภมาตย และเจาหนาที่ศูนยวิจัยสุขภาพสัตวนํ้าที่อนุเคราะหเชื้อและสถานที่เลี้ยงกุงแชบวย ขอขอบคุณเจาหนาที่หนวยเรือนเลี้ยงสัตวทดลอง ที่ชวยอํานวยความสะดวกในการจัดหาและดูแลสัตวทดลองที่ใชในการศึกษาวิจัย ขอขอบคุณคุณพีรพงษ พ่ึงแยม ที่ชวยสอนบางเทคนิค และคุณอาจรีย เจียวกก ที่ชวยงานบางสวน ตลอดจนขอขอบคุณพ่ี ๆ และเพื่อน ๆ ในหองปฏิบัติการ วท. 414 โดยเฉพาะเพื่อนในภาควิชาชีวเคมีทุกคนที่เปนกําลังใจ ชวยเหลือและใหคําแนะนําในการทําวิจัยจนเสร็จสมบูรณ สุดทายนี้ขอกราบขอบพระคุณบิดา มารดา ที่อบรมสั่ งสอน สนับสนุนทุนการศึกษาและเปนกําลังใจที่ดีเสมอมา ผลสําเร็จและสิ่งที่เปนประโยชนของงานวิจัยน้ี ขออุทิศแดผูมีพระคุณที่กลาวมาทุกทานและสัตวทดลองทุกชีวิต วิไลพร ธรรมรัตน

(8)

สารบัญ

หนา สารบัญ (8) รายการตาราง (9) รายการรูป (10) สัญลักษณคํายอและตวัยอ (12) 1. บทนํา 1 บทนําตนเรื่อง 1 การตรวจเอกสาร 3 วัตถุประสงค 33 2. วัสดุ อุปกรณและวธิีการ 34 วัสด ุ 34 อุปกรณ 36 วิธีการ 36 3. ผลการทดลองและวิจารณ 47 4. สรุป 95 เอกสารอางอิง 97 ภาคผนวก ประวตัิผูเขยีน

(9)

รายการตาราง

ตารางที ่ หนา 1 สับสเตรทของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในพืช 18 2 สับสเตรทของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในสัตว 19 3 แอคทิวิทีและแอคทิวิทีจําเพาะของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในสารสกัด

เน้ือเยื่อของกุงแชบวย 57

4 การทําใหเอนไซมฟนอลออกซิเดสบริสุทธิ์บางสวนจากซีรัม ของกุงแชบวย

61

5 ความจําเพาะตอสับสเตรทของเอนไซมฟนอลออกซิเดสที่บริสุทธิ์ บางสวน

69

6 สมบัติของเอนไซมฟนอลออกซิเดสที่บริสุทธิ์บางสวนของกุงแชบวย 69 7 แอคทิวิทขีองเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัม ณ เวลาตางๆ หลัง

การฉีดดวยเชือ้ V. harveyi 72

8 แอคทิวิทขีองเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมของกุงที่ฉีดเชื้อ V. harveyi ปริมาณ 2-5 x 107 เซลล/ตวักุง

75

9 แอคทิวิทีจําเพาะของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมของกุงที่ฉีด เชื้อ V. harveyi ปริมาณ 2-5 x 107 เซลล/ตัวกุง

78

10 แอคทิวิทขีองเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมของกุงที่ฉีดเชื้อ V. harveyi ปริมาณ 5 x 106 - 5 x 109 เซลล/ตวักุง

81

11 แอคทิวิทีจําเพาะของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมของกุงที่ฉีด เชื้อ V. harveyi ปริมาณ 5 x 106 - 5 x 109 เซลล/ตวักุง

84

12 แอคทิวิทขีองเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมของกุงที่ฉีดแบคทีเรีย หรือ WSSV

88

13 แอคทิวิทีจําเพาะของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมของกุงที่ฉีด แบคทีเรียหรอื WSSV

89

(10)

รายการรูป รูปที ่ หนา 1 กุงแชบวย (banana shrimp, Penaeus merguiensis) 5 2 ระบบโปรฟนอลออกซิเดสในสัตวกลุมครสัเตเชียน 14 3 การเกิดปฏิกิริยา Hydroxylation และ Oxidation ของไดฟนอล

โดยเอนไซมฟนอลออกซิเดส 16

4 การสังเคราะหควิโนนโดยเอนไซม Diphenol oxidase 20 5 การสังเคราะหไดฟนอลโดยเอนไซม Monophenol oxidase 20 6 โครงสรางโดยทั่วไปของแบคทีเรียแกรมลบ 27 7 โครงสรางของเปปทิโดไกลแคน 28 8 ผนังเซลลของแบคทีเรียแกรมลบ 29 9 ปริมาณเอนไซมที่เหมาะสมในการวัดแอคทิวทิีของเอนไซม

ฟนอลออกซิเดสในซีรัม 48

10 pH ที่เหมาะสมในการเกิดปฏิกิริยาของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัม 49 11 ปริมาณสับสเตรท L-DOPA ที่เหมาะสมตอการเกิดปฏิกิริยาของ

เอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัม 50

12 ปริมาณเอนไซมทริปซินที่เหมาะสมตอการกระตุนการเกิดปฏิกิริยา ของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัม

51

13 ความเขมขนของ SDS ที่เหมาะสมตอการกระตุนการเกิดปฏิกิริยาของ เอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัม

52

14 อุณหภูมิที่เหมาะสมในการเกิดปฏิกิริยาของเอนไซมฟนอลออกซิเดส ในซีรัม

54

15 ความเสถียรตออุณหภูมิของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัม 55 16 แถบแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสจากซีรัมใน Nondenaturing PAGE 58 17 การแยกเอนไซมฟนอลออกซิเดสจากซีรัมดวยคอลัมน Sephadex G-200 60 18 แบบแผนโปรตีนใน Nondenaturing PAGE ของเอนไซมฟนอลออกซิเดส

ในขั้นตอนการทําบริสุทธิ์บางสวนซึ่งยอมเจลแบบซิลเวอร 62

19 pH ที่เหมาะสมตอการเกิดปฏิกิริยาของเอนไซมฟนอลออกซิเดส ที่บริสุทธิ์บางสวน

65

20 ความเสถียรตออุณหภูมิของเอนไซมฟนอลออกซิเดสที่บริสุทธิ์บางสวน 66

(11)

รายการรูป (ตอ)

21 จลนศาสตรแบบ Hyperbola (A) และแบบ Lineweaver-Burk (B) ของ เอนไซมฟนอลออกซิเดสที่บริสุทธิบ์างสวน

68

22 แอคทิวิทขีองเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัม ณ เวลาตางๆ หลัง การฉีดดวยเชือ้ V. harveyi

71

23 แอคทิวิทขีองเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมของกุงที่ฉีดเชื้อ V. harveyi ที่เลี้ยงบนอาหารแข็ง TSA ปริมาณ 2-5 x 107 เซลล/ตวักุง

74

24 แอคทิวิทีจําเพาะของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมของกุงที่ฉีดเชื้อ V. harveyi ที่เลี้ยงบนอาหารแข็ง TSA ปริมาณ 2-5 x 107 เซลล/ตวักุง

77

25 แอคทิวิทขีองเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมของกุงที่ฉีดเชื้อ V. harveyi ที่เลี้ยงบนอาหารแข็ง TSA ปริมาณ 5 x 106 - 5 x 109 เซลล/ตวักุง

80

26 แอคทิวิทีจําเพาะของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมของกุงที่ฉีดเชื้อ V. harveyi ที่เลี้ยงบนอาหารแข็ง TSA ปริมาณ 5 x 106 - 5 x 109 เซลล/ตวักุง

83

27 แอคทิวิที (A) และแอคทวิิทจํีาเพาะ (B) ของเอนไซมฟนอลออกซิเดสใน ซีรัมของกุงที่ฉีดเชื้อ V. harveyi แบบ inactive ที่เลี้ยงบนอาหารแข็ง TSA ปริมาณ 5 x 109 เซลล/ตวักุง

87

28 แอคทิวิที (A) และแอคทวิิทจํีาเพาะ (B) ของเอนไซมฟนอลออกซิเดส ในซีรัมของกุงที่ฉีด V. cholerae ที่เลี้ยงบนอาหารแข็ง TSA ปริมาณ 5 x 109 เซลล/ตัวกุง

92

29 แอคทิวิที (A) และแอคทวิิทจํีาเพาะ (B) ของเอนไซมฟนอลออกซิเดส ในซีรัมของกุงที่ฉีด E. coli ที่เลี้ยงบนอาหารแข็ง TSA ปริมาณ 5 x 109 เซลล/ตัวกุง

93

30 แอคทิวิที (A) และแอคทวิิทจํีาเพาะ (B) ของเอนไซมฟนอลออกซิเดส ในซีรัมของกุงที่ฉีด WSSV ตัวละ 5 x 10-5 เทาของหัวเชื้อ

94

(12)

สัญลักษณคํายอและตัวยอ

°ซ = องศาเซลเซียส A = absorbance BSA = bovine serum albumin CAC = cacodylate CM-cellulose = carboxymethyl-cellulose L-DOPA = 3,4-L-dihydroxyphenyl-L-alanine EDTA = ethylenediaminetetraacetic acid HEPES = N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid mA = milliampere mg = milligram min = minute ml = milliliter mM = millimolar mmole = millimole NAcMur หรือ NAM = N-acetyl muramic acid NAcGal = N-acetyl galactosamine NAcGlc = N-acetyl-D-glucosamine PAGE = polyacrylamide gel electrophoresis PCA = plate count agar pH = -log hydrogen ion concentration ppm = part per million ppt = part per ton SDS = sodium dodecyl sulphate TBS = 50 mM Tris-HCl, pH 7.4-0.15 M NaCl TEMED = N, N, N′, N′-tetramethylethylenediamine TSA = tryptic soy agar Tris = tris (hydroxymethyl) aminomethane µg = microgram µl = microliter

(13)

สัญลักษณคํายอและตัวยอ (ตอ)

α = alpha β = beta % = percent

1. บทนํา

บทนําตนเรื่อง กุงทะเลเปนสัตวเศรษฐกิจของประเทศ ที่ทํารายไดมากถึงหม่ืนลานบาทตอป (สถิติการประมงแหงประเทศไทย, 2548) สงผลใหมีเงินตราหมุนเวียนภายในประเทศ และนําเงินตราตางประเทศเขามาเปนจํานวนมาก ซ่ึงเปนการชวยพยุงเศรษฐกิจ และยังเปนการผลิตอาหารที่มีคุณภาพตอประชากร กอใหเกิดการเพาะเลี้ยงกุงทะเลเพื่ออุตสาหกรรมสัตวนํ้ากันอยางแพรหลาย จนในปจจุบันประเทศไทยไดรับการยอมรับวาเปนผูผลิตและสงออกผลิตภัณฑกุงเปนอันดับตนๆ ของโลก แตปญหาอุปสรรคที่สําคัญประการหนึ่งในระหวางการเพาะเลี้ยง อันไดแก การติดเชื้อกอโรคในกุง สงผลกระทบตอการเพาะเลี้ยงกุงทะเลเปนอยางมากทั้งในประเทศไทยและประเทศตางๆทั่วโลก โดยเฉพาะจากเชื้อแบคทีเรียที่เปนสาเหตุของการเกิดโรคหลายชนิด เชื้อ Vibrio harveyi เปนแบคทีเรียชนิดหนึ่ง ซ่ึงเม่ือกุงไดรับเชื้อชนิดนี้จะเกิดเปนโรคเรืองแสงและตาย ในจํานวนกุงทะเลหลายชนิด กุงแชบวย นับเปนกุงทะเลที่จับไดจากธรรมชาติเปนจํานวนมากและมีมูลคาทางเศรษฐกิจสูง ซ่ึงสงผลใหมีการทําประมงกุงแชบวยเกินกําลังผลิตที่สมดุลตอธรรมชาติ สงผลใหทรัพยากรกุงแชบวยมีปริมาณลดลงอยางรวดเร็ว และเน่ืองจากการเพาะเลี้ยงกุงแชบวยยังมีไมมาก ดังน้ันการศึกษาเกี่ยวกับระบบภูมิคุมกันนับเปนแนวทางหนึ่งที่จะชวยหาทางปองกันหรือลดการสูญเสียอันเนื่องมาจากโรคติดเชื้อในกุงได กลไกการปองกันตนเองเพื่อปองกันการบุกรุกของจุลินทรีย (microorganism) หรือ พาราไซท (parasite) ของสัตวจําพวกครัสเตเชียน (crustacean) หรือเรียกวาระบบภูมิคุมกันแบบไมจําเพาะ (non-specific innate immune response) (Zhang et al., 2004) แบงออกเปน 2 ชนิด คือ กลไกการปองกันตนโดยเซลลและสารน้ํา (cellular and humoral response) (Bachere, 2003; Witteveldt et al., 2003) โดยระบบภูมิคุมกันที่อาศัยเซลล มักจะใชเซลลเม็ดเลือดเปนหลักในการตอสูและกําจัดสิ่งแปลกปลอม ซ่ึงมีวิธีการหลายวิธีไดแก ความสามารถในการกลืนกินเซลลโดยวิธีฟาโกไซโทซิส (phagocytosis) การเกิดโนดูล (nodule formation) และการกักลอม (encapsulation) สิ่งแปลกปลอม นอกจากนี้เซลลเม็ดเลือดจะตอบสนองตอสวนประกอบของผนังเซลลของจุลินทรีย เชน เบตา-1,3-กลูแคน (β-1,3-glucan) ลิโพโพลีแซคคาไรด (lipopolysaccharide) และเปปทิโดไกลแคน (peptidoglycan) ดวยการสลายกรานูล (granule) ในเซลลเม็ดเลือดหลั่งสารในระบบโปรฟนอลออกซิเดส (prophenoloxidase system) ออกมา (Johansson et al., 1985) โดยเอนไซมฟนอลออกซิเดส (phenoloxidase, PO) มีบทบาทในการสังเคราะหเมลานิน (melanin) ซ่ึงชวยยับยั้งหรือปองกันการเจริญเติบโตของพวกเชื้อแบคทีเรีย 1

2

สารตอตานแบคทีเรีย (antibacterial substance) เปนสารประกอบขั้นสุดทายที่ไดจากระบบ ฟนอลออกซิเดส เชนเดียวกับเอนไซมฟนอลออกซิเดส รวมทั้งคุณสมบัติในการปองกันการเจริญเติบโตของพวกแบคทีเรียและฟงไจ (fungi) (Smith and Chisholm, 1992; Söderhäll and Cerenius, 1992; Bachere et al., 1995; http://www.talaythai.com, retrived May 16, 2008) นอกจากองคประกอบของผนังเซลลของจุลินทรียแลว ยังพบวาเปอโรซิเนคติน (peroxinectin) ยังเปนปจจัยหน่ึงในการกระตุนระบบโปรฟนอลออกซิเดสใหเพ่ิมขึ้นในบริเวณที่มีการติดเชื้อ (Johansson et al., 1989) อีกดวย สวนระบบภูมิคุมกันในนํ้าเลือด ประกอบไปดวยโปรตีนหรือเอนไซมตาง ๆ ดังตัวอยางเชน เลคติน (lectin) หนาที่สําคัญของเลคตินในระบบภูมิคุมกันจะมี 2 อยางคือทําหนาที่กําจัดเซลลที่ไมตองการทิ้งไปในระหวางการเปลี่ยนรูปราง (metamorphosis) และมีสวนรวมในปฏิกิริยาการปองกันการติดเชื้อ เอนไซมไลโซไซม (lysozyme) ทําใหผนังเซลลของแบคทีเรีย แกรมบวกแยกออก เอนไซมไลโซไซมมีฤทธิ์เล็กนอยไมสามารถทําใหเกิดการแยกของผนังเซลลของแบคทีเรียแกรมลบ แตชวยทําใหแบคทีเรียไวตอการกระทําของสารตอตานเชื้อแบคทีเรียชนิดอ่ืนมากขึ้น กุงแชบวยมีชื่อเรียกกันทั่วไปวา กุงขาว กุงแชบวย กุงหางแดง หรือกุงหางดอก มีชื่อสามัญวา banana shrimp มีชื่อวิทยาศาสตรวา Penaeus merguiensis (Perez-Farfante and Kensley, 1997) แชบวยเปนกุงเศรษฐกิจที่สําคัญของประเทศไทยเนื่องจากมีรสชาติดี เปนที่นิยมของผูบริโภคทั้งภายในและตางประเทศ โดยเฉพาะญี่ปุนและสหรัฐอเมริกามีความตองการกุงทะเลเพื่อการบริโภคในปริมาณมาก ลูกกุงแชบวยมีความตานทานตอการเปลี่ยนแปลงของสภาพแวดลอม ดูแลอนุบาลงายและโตเร็วกวาลูกกุงกุลาดํา (black tiger prawn, Penaeus monodon) ในชวงตนของการเลี้ยง (ศรีรัตน สอดสุข และพนม กระจางพจน, 2541) แตลูกกุงแชบวยที่เลี้ยงนานกวา 2 เดือน จะมีอัตราการเจริญชา และมีอัตราการรอดตายต่ํากวากุงกุลาดํา กุงแชบวยจึงเปนที่นิยมในการเพาะเลี้ยงนอยกวากุงกุลาดํา (ธวัช ศรีวีระชัย และฐานันดร ทัตตานนท, 2538) ปจจุบันกุงกุลาดําซึ่งนิยมเลี้ยงเปนอุตสาหกรรมไดประสบปญหาการขยายพื้นที่เลี้ยงไดนอยลงและพื้นที่เลี้ยงเดิมมีสภาพเสื่อมโทรมและมีปญหาสําคัญจากการเกิดโรคระบาดที่ไมสามารถควบคุมได เปนเหตุใหผลิตกุงกุลาดําไดไมตอเน่ืองและสงผลใหผลผลิตกุงกุลาดําของประเทศไทยลดนอยลงมาก รวมทั้งตนทุนการเลี้ยงกุงกุลาดําคอนขางสูงเพราะการผลิตกุงกุลาดําตองอาศัยแมพันธุจากธรรมชาติซ่ึงเปนที่ตองการในการเพาะเลี้ยงมาก จึงทําใหมีราคาสูง สงผลทําใหลูกกุงมีราคาสูงตามไปดวย กุงแชบวยจึงนาจะเปนอีกทางเลือกหน่ึงของอุตสาหกรรมการเลี้ยงกุง เน่ืองจากมีขอไดเปรียบเรื่องตนทุนการผลิตลูกกุงเพราะ กุงแชบวยสามารถเจริญพันธุไดรวดเร็วและสามารถใชพอแมพันธุที่เลี้ยงในบอดินในการผลิตลูกกุงได (สุพจน จึงแยมปน และชัยรัตน พุมชวย, 2543) หากสามารถเลี้ยงกุงแชบวยใหไดขนาดที่

3

ตองการแลวจะพบวากุงแชบวยมีราคาสูงกวากุงกุลาดําที่มีขนาดเทากัน (เมธี วัฒนสิงห, 2543) อยางไรก็ตามการเลี้ยงกุงแชบวยยังตองการหลักวิชา ที่ตางจากกุงกุลาดําหลายประการ เน่ืองจากกุงแชบวยมีพฤติกรรมการกินอาหารและนิสัยการวายน้ําตางจากกุงกุลาดํา ปจจุบันนักวิชาการและนักวิจัยจึงใหความสนใจศึกษาและหาทางที่จะพัฒนาการเพาะฟกและพัฒนาการเลี้ยงกุงแชบวยใหดียิ่งขึ้น การศึกษาเอนไซมที่มีบทบาทเกี่ยวของกับกลไกการปองกันตนเองจากเชื้อกอโรคของกุงจึงมีความสําคัญตอการเพาะเลี้ยงกุง

การศึกษาเอนไซมฟนอลออกซิเดส ซ่ึงอาจมีบทบาทเกี่ยวของกับการปองกันตนเองจากเชื้อกอโรคของกุง ยังไมเคยมีการศึกษาในกุงแชบวยมากอน และการศึกษาในกุง พีเนียด (penaeid) ยังมีรายงานไมมากนัก ดังนั้น งานวิทยานิพนธน้ีจึงสนใจศึกษาเอนไซม ฟนอลออกซิเดสเพื่อเปนการเตรียมความพรอมดานขอมูลที่จะเปนประโยชนตอการเพาะเลี้ยงกุงแชบวยตอไปในอนาคต การตรวจเอกสาร 1. กุงแชบวย กุงแชบวยมีชื่อวิทยาศาสตรวา Penaeus merguiensis มีชื่อสามัญวา banana shrimp โดยมีลําดับอนุกรมวิธานรายงานไวดังน้ี (Grey et al., 1983)

Phylum Arthropoda Superclass Crustacea

Order Decapoda Family Penaeidae

Genus Penaeus 1.1 ชีววิทยาและลักษณะทั่วไป อวัยวะของกุงแบงเปน 3 สวนใหญๆ (รูปที่ 1) คือ สวนหัวที่เชื่อมรวมกับอก (cephalothorax) สวนทอง (abdomen) และหาง (telson) อวัยวะภายใน ไดแก กระเพาะอาหาร หัวใจ เหงือก อวัยวะเพศจะอยูบริเวณสวนหัวและอก สําหรับสวนทองนั้นมีกลามเนื้อเปนสวนใหญ จากลําตัวมีรยางคยื่นออกมาเปนคูๆ ไดแก หนวด รยางคปาก ขาเดิน ขาวายน้ํา เปนตน มีจุดเดน คือ กรีมีฟนทั้งบนและลาง หนวดคูแรกสั้นกวาเปลือกหุมหัว (carapace) กุงแชบวยเปนกุงทะเลที่มีขนาดปานกลาง ในระยะวัยออนหรือระยะนอเพลียส (nauplius) จะไมมีเหงือกที่ยึดเกาะติดกับผนังขางตัวระหวางรยางค (pseudobranchiae) เม่ือถึงระยะโตเต็มวัย ลําตัวจะมีสีครีมหรือชมพูออน มีจุดสีนํ้าเงินหรือสีนํ้าตาลปนแดงประทั้งตัว ปลายหางยาวแหลม สวนปลายหางปกมีสีนํ้าตาลแดง สันกรีสูงและยาวเกือบถึงขอบหลังของเปลือกหัว ฟนกรีดานบนมี 6-7 ซ่ี ดานลางมี 4-5 ซ่ี สวนรองบนกรีมองเห็นไดชัด ยาวเกือบถึงกึ่งกลางของเปลือกหัว ดานบนเปน

4

รอง ดานลางไมมีหนามแหลม มีขนาดลําตัวยาว 10-25 เซนติเมตร นํ้าหนักตัวประมาณ 50-400 กรัม เปลือกหุมลําตัวเรียบเปนมันลักษณะเปลือกบาง เน้ือมาก มีเปลือกหัวหรือกรีสวนบนเปนรูปสามเหลี่ยม เปลือกคลุมหัวมีรองตามยาวและรองตามขวาง มีแพนหาง ดานขางของหางไมมีหนาม ลักษณะทั่วไปที่ตางจากกุงกุลาดําหรือกุงกุลาลาย (green tiger prawn, Penaeus semisulcatus) คือ ไมมีแถบสีนํ้าตาลเขมพาดขวางลําตัวและเปลือกหัว หนวดคูที่หน่ึงมีแถบสีนํ้าตาล หนวดคูที่สองสีนํ้าตาลไมมีแถบขวาง ขาเดินและขาวายน้ํามีสีเหลืองบางครั้งมีสีนํ้าตาลหรือสีชมพู (Grey et al., 1983) โดยมีลักษณะเดนที่เปนขอบงชี้ทางอนุกรมวิธาน (บุญศรี จารุธรรมโสภณ, 2537) คือ สันขางกรี (androstral carina) ยาวไมถึงฟนกรีซ่ีสุดทาย สันหนาหนามขางแกม (gastro orbital carina) ยาวประมาณ 1/3 ระหวางหนามขางแกม (hepatic spine) กับขอบหลังตา (orbital margin) maxilliped คูที่ 3 ของกุงเพศผูปลองสุดทาย (dactylus) ยาวประมาณครึ่งหน่ึงของปลองถัดมา (propodus) กลุมขนตรงปลายปลอง propodus ยาวประมาณครึ่งหน่ึงของปลองสุดทาย แผนบนของอวัยวะเพศเมีย (anterior plate of thelycum) เปนรูปครึ่งวงกลม มีติ่งเน้ือ (fleshy) เห็นชัดเจน และขอบดานขางของแผนลาง (margin of lateral plates or seminal receptacle) โคง 1.2 การแพรกระจายและพฤติกรรมการกินอาหาร กุงเปนสัตวหนาดิน ชอบอาศัยตามพื้นทะเลที่เปนดินโคลนหรือโคลนปนทราย (สุรินทร มัจฉาชีพ, 2535) พบกุงแชบวยมากบริเวณน้ําตื้น ปากอาวหรือปากแมนํ้าที่นํ้าคอนขางขุน บางครั้งจะพบอยูรวมกันเปนจํานวนมาก พบลูกกุงระยะหลังตัวออน (postlarvae) และ juvenile ไดทั่วไปตามชายฝงทะเลตรงที่มีพ้ืนดินเลนหรือพ้ืนดินโคลนปนทราย โดยอาศัยอยูตั้งแตชายฝงจนถึงทะเลลึก พบทั้งในทะเลและเขตน้ํากรอยที่มีความเค็มระหวาง 10-36 ppt สวน pH ที่เหมาะสมประมาณ 7.8-8.5 อุณหภูมิ 25-32°ซ ตัวเต็มวัยจะวางไขในทะเลที่มีความลึกประมาณ 10 เมตร ขึ้นไป การกระจายของกุงชนิดนี้อยูทางตะวันตกของมหาสมุทรแปซิฟกในบริเวณคาบสมุทรอินโดจีน (Grey et al., 1983) ตั้งแตอาวเปอรเซีย ชายฝงทะเลปากีสถาน อินเดีย มาเลเซีย ไทย ตอนใตของจีน อินโดนีเซีย ปาปวนิวกินี ฟลิปปนส และออสเตรเลีย (วิวัฒนชัย พรหมสาขา ณ สกลนคร และสมพร โลสวัสดิ์กุล, 2532) กุงแชบวยมีนิสัยการกินอาหารแบบกัดแทะโดยจับชิ้นอาหารแลววายน้ํา กัดกินไปเรื่อย ๆ ซ่ึงเปนพฤติกรรมที่ตางจากกุงกุลาดําที่จับอาหารแลวหยุดกัดกินอาหารนิ่งอยูกับที่ กุงแชบวยปราดเปรียวและวายน้ําอยูตลอดเวลาแมแตเวลาที่กินอาหาร อาหารธรรมชาติของ กุงแชบวยไดแก ตัวออนสัตวนํ้า แมลงน้ํา ซากพืช ซากสัตว สาหรายชนิดตาง ๆ หอย ปลา ลูกกุง พืชนํ้า (เมธี วัฒนสิงห, 2543)

5

รูปที่ 1 กุงแชบวย (banana shrimp, Penaeus merguiensis)

(www.users.bigpond.com, retrived April 20, 2008)

1.3 วงจรชีวิตของกุงแชบวย การเจริญพัฒนาของลูกกุงแชบวยตั้งแตแมกุงวางไขจนถึงระยะ first postlarva

ใชระยะเวลาประมาณ 10 วัน ประกอบดวย 4 ระยะ คือ nauplius, protozoea, mysis และ postlarva วงจรชีวิตของกุงแชบวยมีการแพรกระจายทั้งบริเวณชายฝงทะเลที่เปนน้ํากรอยและทะเลเปดโดยกุงระยะหลังตัวออน (postlarva) จะยายเขามาอาศัยพ้ืนที่ปาชายเลนประมาณ 1-2 เดือน ขึ้นกับสภาพแวดลอมของพ้ืนที่ จนถึงระยะ Juvenile อายุประมาณ 2-3 เดือนจะเคลื่อนยายออกสูบริเวณชายฝงนํ้าตื้นจนเจริญเขาสูระยะกอนวัยเจริญพันธุ (subadult) ซ่ึงมีอายุประมาณ 3-4 เดือน จึงเคลื่อนยายออกสูทะเลเปด และเจริญเติบโตเขาสูระยะเจริญพันธุเพ่ือแพรขยายพันธุตอไป (มัทนา บุญยุบล, 2539)

6

2. ระบบภูมิคุมกันในครัสเตเชียน ลักษณะเดนของระบบภูมิคุมกัน คือ มีความสามารถที่จะจํากัดหรือตอตานการติดเชื้อในระยะเวลาเพียงไมนาน เม่ือเกิดการติดเชื้อระบบภูมิคุมกันโรคของสิ่งมีชีวิตกลุม ครัสเตเชียนแบงออกไดเปน 2 แบบดวยกัน คือ ระบบภูมิคุมกันที่อาศัยเซลลและระบบภูมิคุมกันแบบสารน้ํา โดยระบบภูมิคุมกันที่อาศัยเซลล (cellular immunity) มักจะใชเซลลเม็ดเลือดเปนหลักในการตอสูและจํากัดสิ่งแปลกปลอม ซ่ึงมีวิธีการหลายวิธีไดแก ความสามารถในการกลืนกินเซลลโดยวิธีฟาโกไซโทซิส การเกิดโนดูลและการกักลอมสิ่งแปลกปลอม ถาสิ่งแปลกปลอมมีขนาดเล็กและมีจํานวนนอยจะถูกกําจัดโดยวิธีฟาโกไซโทซิส นับเปนดานแรกในการปองกันเม่ือมีพาราไซทหรือสิ่งแปลกปลอมบุกรุกผานชั้นผิวปกคลุมเขาสูรางกาย วิธีในการกลืนกินเซลลสิ่งแปลกปลอมจะมีการยื่นไซโทพลาซึม (cytoplasm) ไปลอมรอบส่ิงแปลก ปลอมแลวไลโซไซม (lysosome) จะหลั่งสารชวยยอยซ่ึงมีทั้งสารตอตานแบคทีเรียและ hydrolytic enzyme หลังจากยอยสลายแลวก็จะปลอยสวนที่ถูกทําลายแลวออกนอกเซลล สําหรับโนดูลจะเกิดเม่ือมีสิ่งแปลกปลอมเขามาเปนจํานวนมาก สวนการกักลอมสิ่งแปลกปลอมจะเกิดเม่ือสิ่งแปลกปลอมมีขนาดใหญ (http://www.talaythai.com, retrived May 20, 2008) หนาที่การทํางานของเซลลเม็ดเลือดแตละชนิดจะแตกตางกัน เชน หนาที่หลักของเซลลไฮยาลิน (hyalin cell) ซ่ึงเปนเซลลเม็ดเลือดที่มีรูปรางแบน กลม ผิวเรียบ เซลลจะมีนิวเคลียสขนาดใหญอยูกลางเซลล มีไซโทพลาซึมนอย ไมมีกรานูลภายในเซลล เปนเซลลเม็ดเลือดที่มีขนาดเล็กที่สุด (กิจการ ศุภมาตย, 2543) จะเกี่ยวของกับการเกิดฟาโกไซโทซิส ในขณะที่เซลลฮีโมไซทแบบเซมิกรานูล (semigranular hemocyte) เปนเซลลเม็ดเลือดที่พบลักษณะของเม็ดกรานูลขนาดเล็กอยูในเซลลในปริมาณที่ไมมาก ทําหนาที่โดยตรงในการเกิดโนดูลและการกักลอม รวมทั้งในระบบกระตุนโปรฟนอลออกซิเดสดวย (prophenoloxidase activating system) สวนเซลลฮีโมไซทแบบลารจกรานูล (large granular hemocyte) เปนเซลลเม็ดเลือดที่มีขนาดใหญที่สุดและมี กรานูลขนาดใหญจํานวนมากอยูในไซโทพลาซึม มีหนาที่หลักในการทํางานในระบบ โปรฟนอลออกซิเดส (Söderhäll and Cerenius, 1992) การปองกันตนเองของกุงจะเริ่มขึ้นทันทีที่ไดรับสิ่งแปลกปลอม โดยฮีโมลิมฟ (hemolymph) เกิดการแข็งตัวเปนการยับยั้งการสูญเสียเลือดเม่ือเกิดบาดแผลและปองกันการติดเชื้อผานบาดแผล การแข็งตัวของเลือดจะเกิดจากการทํางานของเซลลไฮยาลินและโคแอคกลูโลเจน (coagulogen) ถาสิ่งแปลกปลอมมีขนาดเล็กและมีจํานวนนอยจะถูกกําจัดโดยวิธีฟาโกไซโทซิส ซ่ึงเปนการปองกันเม่ือมีพาราไซทหรือสิ่งแปลกปลอมบุกรุกผานชั้นผิวปกคลุมเขาสูรางกาย โดยกลืนเซลลสิ่งแปลกปลอมดวยการยื่น ไซโทพลาซึมไปลอมสิ่งแปลกปลอม แลวไลโซโซมหลั่งสารชวยยอยซึ่งมีทั้งสารตอตานแบคทีเรียและ hydrolytic enzyme ตอมาจะมีการนําออกซิเจนเขาสูเซลลและออกซิเจนจะถูกรีดิวซ (reduce) ไปเปนซูเปอรออกไซดแอนไอออน (O2

-) ตอจากนั้นจะถูกเปลี่ยนไปเปนไฮโดรเจน

7

เปอรออกไซด (H2O2) ซูเปอรออกไซดแอนไอออนยังสามารถเปลี่ยนรูปไปเปนไฮดรอกซิล เรดิคัล (OH•) ซ่ึงทั้งซูเปอรออกไซดแอนไอออน (O-2) ไฮโดรเจนเปอรออกไซด (H2O2) และ ไฮดรอกซิลเรดิคัล (OH•) จะเปนตัวทําใหสิ่งแปลกปลอมที่ถูกกลืนกินเขาไปในเซลลถูกทําลาย หลังการยอยสลายแลวก็จะปลอยสวนที่ถูกทําลายแลวออกมาจากเซลล ในกรณีที่มีสิ่งแปลกปลอมหรือเชื้อกอโรคเขาสูรางกายในปริมาณมากจนเกินความสามารถของการกลืนกินสิ่งแปลกปลอมจะทําลายไดทัน ก็จะเกิดโนดูลโดยเม็ดเลือดกุงจะมารวมตัวกันมากขึ้นเพ่ือลอมรอบไมใหสิ่งแปลกปลอมนั้นแพรกระจายจนลุกลามไปทั่วรางกาย สวนการกักลอมสิ่งแปลกปลอมจะเกิดเม่ือมีสิ่งแปลกปลอมขนาดใหญ (กิจการ ศุภมาตย, 2543) ระบบภูมิคุมกันแบบที่สอง คือ แบบสารน้ํา (humoral immunity) ประกอบดวยโปรตีนและเอนไซมตาง ๆ อาทิเชน เลคติน สารประกอบตานจุลชีพ (antimicrobial compound) และ reactive oxygen intermediates (ROIs) หนาที่สําคัญของเลคตินในระบบภูมิคุมกันมี 2 อยาง คือ การกําจัดเซลลที่ไมตองการทิ้งไปในระหวางการเปลี่ยนรูปรางและมีสวนรวมในปฏิกิริยาการปองกันการติดเชื้อ เอนไซมไลโซไซมทําใหผนังเซลลของแบคทีเรียแกรมบวกแยกออก เอนไซมน้ีมีฤทธิ์เล็กนอยไมสามารถทําใหผนังเซลลของแบคทีเรียแกรมลบเกิดการแยก แตชวยทําใหแบคทีเรียมีความไวตอการกระทําของสารตอตานเชื้อแบคทีเรียตัวอ่ืนมากขึ้น สวน ROIs ไดแกอนุมูลของซุปเปอรออกไซดแอนไอออน ไฮโดรเจนเปอรออกไซด อนุมูลของไฮดรอกซิลไอออน ซ่ึงเปนสารที่เปนพิษกับเซลลโดยไปยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อโรคและทําลายโครงสรางเซลลของสิ่งแปลกปลอม จากการทดลองในหอยสองฝา (mollusk) พบวาปริมาณของ ROIs ที่ปลอยจากเม็ดเลือดจะสัมพันธกับความเครียด การเกิดบาดแผลและการติดเชื้อซ่ึงเปนกลไกที่ปองกันการฉวยโอกาสและลดการติดเชื้อโรค (Adema et al., 1991)

ระบบโปรฟนอลออกซิเดสจะทํางานโดยอาศัยองคประกอบของเอนไซมโปรฟนอลออกซิเดส (prophenoloxidase, proPO) ซ่ึงจะพบไดในเซลลฮีโมไซทชนิดเซมิกรานูลและกรานูล โดยมีการเก็บเอนไซมไวในกรานูลที่อยูในไซโทพลาซึม การทํางานของระบบจะเริ่มตนเม่ือเซลลฮีโมไซทที่มีกรานูลถูกกระตุนดวยลิโพโพลีแซคคาไรด เปปทิโดไกลแคน และ เบตา-1, 3-กลูแคน ซ่ึงเปนสวนประกอบของผนังเซลลของเชื้อแบคทีเรีย เปนผลใหเอนไซม ฟนอลออกซิเดสไปออกซิไดซ (oxidize) สารกลุมฟนอล (phenol) ใหเปนควิโนน (quinone) แลวเปลี่ยนไปเปนเมลานินตอไป ซ่ึงเมลานินจะชวยยับยั้งหรือปองกันการเจริญเติบโตของพวกเชื้อแบคทีเรีย สารตอตานแบคทีเรียเปนสารประกอบขั้นสุดทายที่ไดจากกระบวนการของระบบ โปรฟนอลออกซิเดส เชนเดียวกับเอนไซมฟนอลออกซิเดส รวมทั้งสมบัติในการปองกันการเจริญเติบโตของพวกแบคทีเรียและฟงไจ (Smith and Chisholm, 1992; Söderhäll and Cerenius, 1992; Bachere et al., 1995)

8

2.1 กลไกการปองกันตนเองของสัตวกลุมครัสเตเชียน ครัสเตเชียนเปนสัตวไมมีกระดูกสันหลัง ไมมีระบบภูมิคุมกันเหมือนสัตวชั้นสูงที่อาศัยแอนติบอดี (antibody) แตสัตวกลุมน้ีมีกลไกการปองกันตนเอง (defense mechanism)จากเชื้อโรคที่บุกรุก เม่ือสิ่งแปลกปลอมบุกรุกผานเขามาในรางกายของสัตวกลุมครัสเตเชียน เซลลเม็ดเลือดหรือเซลลฮีโมไซทเปนเซลลที่มีบทบาทสําคัญในการกําจัดสิ่งแปลกปลอมเหลานั้น โดยจะหลั่งสารออกมาหลายชนิด โปรตีนที่สําคัญชนิดหนึ่งที่มีการรายงาน คือ โปรตีนเปอรโรซิเนคตินซ่ึงเปนโปรตีนที่ถูกสรางและเก็บไวภายในกรานูลของเซลลเม็ดเลือดชนิดเซมิกรานูโลไซทและกรานูโลไซท เม่ือมีจุลินทรียเขามาบุกรุกจะมีการสลายกรานูลเพ่ือหลั่งสารชนิดนี้ออกมา (Johansson et al., 1988; Liang et al., 1992) ซ่ึงจะเกิดควบคูไปกับการกระตุนระบบโปรฟนอลออกซิเดส (Johansson et al., 1995) ทั้งสองกระบวนการนี้เกิดเนื่องมาจากการจดจําโมเลกุลที่เปนองคประกอบของผนังเซลลของจุลินทรีย (Johansson et al., 1988) ระบบภูมิคุมกันแบบไมจําเพาะจะมีโมเลกุลที่ชวยจดจําลิ่งแปลกปลอมที่เขามารุกราน โดยอาศัยตัวรับตางๆ บนผิวเซลล (recognition receptor) ซ่ึงจะจดจําโครงสรางที่ผนังเซลลของจุลินทรีย โดยสวนใหญจะมีโมเลกุลของคารโบไฮเดรตเปนองคประกอบ เชน เบตา-1,3-กลูแคนที่ผนังเซลลของเชื้อรา ลิโพโพลีแซคคาไรด (LPS) เปปทิโดไกลแคน (PG)และกรดลิโพทิโชอิค (lipoteichoic acid, LTA) ที่ผนังเซลลของแบคทีเรีย และอารเอ็นเอของไวรัส ดังน้ัน เม่ือโมเลกุลเหลานี้เขาสูรางกายสามารถชักนําใหเซลลเจาบานสงโมเลกุลจดจําที่มีความจําเพาะกับโมเลกุลเหลานั้นเพ่ือกระตุนระบบภูมิคุมกันอ่ืนที่เหมาะสมตอไป (Medzhitov and Janeway, 2000) จากการศึกษาของ Sritunyalucksana และคณะ (2002) ไดคนพบโปรตีนจับเบตา-1,3-กลูแคน (β-1,3-glucan-binding protein, BGBP) จากหองสมุดเซลลฮีโมไซท (haemocyte library) ของกุงกุลาดํา ซ่ึงมีความจําเพาะกับเบตา-1,3-กลูแคน เม่ือเปรียบเทียบ BGBP ของกุงกุลาดํากับของสิ่งมีชีวิตอ่ืนพบวามีความใกลเคียงกับโปรตีนที่จับจําเพาะกับลิโพโพลีแซคคาไรดและเบตา-1,3-กลูแคน (lipopolysaccharide-β-1,3-glucan-binding protein, LGBP) ของกุงนาง (crayfish, Pacifas-tacus leniusculus), coelomic catalytic factor-1 ของ earthworm (Eisenia foetida) หรือ gram negative bacteria binding protein ของยุง (mosquito, Anopheles gambiae) นอกจากนี้ยังมีความใกลเคียงกับเอนไซมเบตา-1,3-กลูคาเนส (β-1,3-glucanase) ของหอยเมนทะเล (sea urchin) ดวย (Sritunyalucksana et al., 2002) บงชี้วาโมเลกุลที่ใชในการจดจําสิ่งแปลกปลอมในสัตวกลุมครัสเตเชียนมีความแตกตางกันไมมากนัก 2.1 ปจจัยทีม่ีผลตอระบบภูมิคุมกันโรคของกุง กิจการ ศุภมาตย (2543) ไดรายงานถงึปจจัยที่สงผลทําใหระบบภูมิคุมกันโรคของกุงมีประสิทธิภาพต่ําลงไวดังน้ี 1. ปริมาณออกซิเจนในน้ํา โดยเฉพาะบรเิวณผิวหนาของดินซ่ึงเปนทีอ่ยูของ

9

กุงไมควรต่ํากวา 3.0 ppm หากมีนอยกวานั้นจะทําใหภูมิคุมกันต่ําลง 2. ปริมาณของเสีย โดยเฉพาะมีอาหารที่ตกคางมากเกินไปเกิดจากการคํานวณปริมาณอาหารที่ใหกุงไมแมนยํา 3. การตายของแพลงกตอน (plankton) ปริมาณมาก ๆ ในบอ 4. การเสียสมดุลของจุลินทรียในบอกุงทําใหเชื้อ Vibrio spp. มีจํานวนเพิ่มมากขึ้นเกิน 106 CFU

5. การเปลี่ยนแปลงสภาพตางๆ ในบอเลีย้งอยางรุนแรง ไมวาจะเกิดขึ้นเองหรือเกิดจากการใชยาและเคมีภัณฑในการเลี้ยงกุงโดยไมไดคํานึงถึงผลกระทบอื่นๆ ที่จะตามมา

3. เลคติน เลคตินเปนโปรตีนที่สามารถจดจําและจับจําเพาะกับคารโบไฮเดรตได คํานิยามน้ีถูกเสนอตอคณะกรรมการตั้งชื่อของ International Union of Biochemistry โดย Goidstein และคณะ (1980) โดยเลคตินสามารถจดจําตอคารโบไฮเดรตชนิดตางๆ ไดแก นํ้าตาลโมโนแซคคาไรด (monosaccharide) หรือโพลีแซคคาไรด (polysaccharide) ชนิดตางๆ รวมถึงนํ้าตาลที่เปนสวนประกอบของสารชีวโมเลกุลอ่ืนๆ (glycoconjugate) เชน ไกลโคลิพิด (glycolipid) และไกลโคโปรตีน (glycoprotein) เปนตน เลคตินมีแหลงจับจําเพาะกับนํ้าตาลอยางนอย 2 ตําแหนง (Kocourek and Horejsi, 1981) โดยทั่วไปเซลลเมมเบรน (cell membrane) หรือบริเวณผิวเซลล (cell surface) มีโครงสรางที่ประกอบดวยโปรตีนและไขมันหลายชนิด สวนใหญจับกับนํ้าตาลตางๆ ในกระบวนการไกลโคซิเลชัน (glycosylation) และนํ้าตาลเหลานี้จะเปนตําแหนงที่เลคตินสามารถจับกับเซลลหรือสิ่งแปลกปลอมได (Christiane et al., 2004) และทําใหเซลลเกิดการเกาะกลุม หรือสามารถตกตะกอน (precipitate) โดยจะจับกับนํ้าตาลอยางหลวมๆ ดวยพันธะที่ไมใชพันธะโควาเลนท (non-covalent bond) และสามารถผันกลับไดเชนเดียวกับการจับระหวางเอนไซม (enzyme) กับสับสเตรท (substrate) และการจับของแอนติเจน (antigen) กับแอนติบอดี (Sharon, 1977) เลคตินเกิดขึ้นเองตามธรรมชาติในสิ่งมีชีวิตไมไดสรางขึ้นจากการกระตุนจากสิ่งเราหรือสิ่งแปลกปลอมภายนอกรางกายเหมือนแอนติบอดี ในสิ่งมีชีวิตชนิดเดียวกันอาจมีเลคตินไดหลายชนิดหรือเลคตินชนิดเดียวกันอาจมีโครงสรางแตกตางกันในสิ่งมีชีวิตตางชนิดกัน

ไดมีการศึกษาเลคตินมากขึ้นในสัตวทะเลไมมีกระดูกสันหลังพบวาทําหนาที่เกี่ยวของในกลไกการปองกันตนเองซึ่งคลายกับอิมมูโนโกลบูลิน (immunoglobulin) ในสัตวมีกระดูกสันหลัง กลาวคือ มีสวนรวมในปฏิกิริยาการปองกันการติดเชื้อ โดยเลคตินซึ่งเปนโปรตีนที่สามารถจดจําโมเลกุลที่เปนองคประกอบโครงสรางเหลานี้ อาทิเชน ลิโพโพลีแซคคาไรด เปปทิโดไกลแคนจากผนังเซลลแบคทีเรีย เบตา-1,3-กลูแคนจากยีสตและรา (fungal cell) ดีเอ็นเอของ

10

แบคทีเรีย (bacterial DNA) อารเอ็นเอสายคู (double-stranded RNA) จากไวรัส และโมเลกุลที่ถูกหลั่งออกมานอกเซลล (Wang et al., 2007; Janeway and Medzhitov, 2002) โปรตีนที่สามารถจดจําโมเลกุลเหลานี้เรียกวา pattern recognition proteins (PRPs) โดยจดจําและจับกับโมเลกุลเหลานี้ ในสัตวไมมีกระดูกสันหลังมีทั้งหมด 6 กลุมคือ โปรตีนที่จดจําเปปทิโดไกลแคน (peptidoglycan recognition protein, PGRP) โปรตีนที่จับแบคทีเรียแกรมลบ (gram-negative binding protein, GNBP) ตัวรับที่เปนหลายโดเมน (multidomain scavenger receptor) S-locus Cys-rich (SCR) เลคตินชนิด C เลคตินชนิด S และโปรตีนที่มีหมูไธออลเอสเทอรเปนองคประกอบ (thioester-containing protein, TEP) (Christophides et al., 2002) สงผลใหเลคตินมีบทบาทสําคัญในการตอตานการเกิดโรคโดยแบคทีเรียหรือศัตรูที่มาจากธรรมชาติ เชน เลคตินจากแมงดาทะเล (Japanese horseshoe crab) และเลคตินจากแมลงสาบ (cock roach, Blaberus discoidalis) สามารถจับจําเพาะกับเบตา-1,3-กลูแคนจากยีสตและแบคทีเรียบางชนิดได จากน้ันจะกระตุนใหเกิดกระบวนการตอตานและทําลายโดยระบบโปรฟนอลออกซิเดส (Kilpatrick, 2002) ในสัตวบางชนิดอาศัยความเปนพิษของเลคตินเอง เชน เลคตินที่เปนพิษ (venom) ในหนาม (spine) ของหอยเมนทะเล (Toxopheustes pileolus) (Seike et al., 1992) มีรายงานวาเม่ือเลคตินจับกับเซลลแปลกปลอมจะกระตุนใหมีการจับของเซลลฟาโกไซท (phagocyte) ในกระบวนการออปโซไนซ (opsonization) เพ่ือทําลายเซลลแปลกปลอม เลคตินที่จับจําเพาะกับกรดไซอะลิค (sialic acid) จากแมงดาทะเล และเลคตินที่จับจําเพาะกับนํ้าตาลกาแลคโตส (galactose) จากปลิงทะเล (Acropora echinata) สามารถทําลายเซลลเมมเบรนและทําใหเม็ดเลือดแดงของคนและกระตายแตกได โดยเลคตินจับกับคารโบไฮเดรตดังกลาวบนผิวของเซลลเม็ดเลือดแดงทําใหเมมเบรนเกิดรูพรุน (pore) และทําใหเซลลแตก และกลาวไดวาการทําลายเซลลแปลกปลอมจะขึ้นกับชนิดของเซลลแปลกปลอมและปริมาณของเลคตินในฮีโมลิมฟของสัตวเจาบาน ซ่ึงเปนตัวชักนําใหเกิดการกําจัดเซลลแปลกปลอมไดดีและเร็วขึ้น (Hatakeyama et al., 1995)

จากคุณสมบัติที่เลคตินสามารถจับจําเพาะกับคารโบไฮเดรตและโครงสรางที่มีความซับซอนของผนังเซลลจุลินทรียชนิดตางๆ ได ในสัตวกลุมครัสเตเชียน เลคตินจึงเปนตัว การสําคัญในระบบการรับรูถึงการบุกรุกของสิ่งแปลกปลอม (Ratcliffe et al., 1985) ในสัตว จําพวกกุง เน่ืองจากเลคตินสามารถทําใหเซลลจุลินทรียเกิดการเกาะกลุม จึงไมสามารถแพร กระจายไปยังที่ตางๆ นอกจากนี้เลคตินยังจับระหวางจุลินทรียและเซลลเม็ดเลือดกอใหเกิดฟาโกไซโทซิสของจุลินทรียที่บุกรุกได (Sritunyalucksana et al., 2001) มีการศึกษาเลคตินที่เกี่ยว ของกับระบบภูมิคุมกันโรคในกุง เพ่ือใชในการควบคุมและแกไขปญหาโรคติดเชื้อในกุงอยางหลากหลาย เชน การพบเลคตินที่มีความจําเพาะกับกรดไซอะลิคในฮีโมลิมฟของกุงแชบวยที่เพ่ิมสูงขึ้นตอบสนองตอการติดเชื้อกอโรค V. harveyi (ปนนภา ลิ่มพานิช, 2550) นอกจากนี้ยัง

11

สามารถทําใหแบคทีเรียกอโรคกุงไดแก V. harveyi, Vibrio parahemolyticus และ Vibrio vulnificus เกาะกลุม แตไมทําใหแบคทีเรียไมกอโรคกุงคือ Vibrio cholerae, Escherichia coli และ Samonella typhi เกิดการเกาะกลุม (Utarabhand et al., 2007) Vazquez และคณะ (1996) พบวาเลคตินในกุงกามกราม สามารถทําใหเกิดการเกาะกลุมของแบคทีเรียแกรมลบ และแบคทีเรียแกรมบวก ดังที่กลาวมาขางตน โดยอธิบายวาเปนเพราะเลคตินสามารถจับจําเพาะตอ O- keto และ O-methyl ของน้ําตาลและอนุพันธของน้ําตาลที่มีหมูอะซิติล (acetyl group) จากโพลีแซคคารไรดบนผนังเซลลเหลานั้นได 4. เอนไซมเบตา-1,3- กลูคาเนส (β-1,3-glucanase) เอนไซมเบตา-1,3-กลูคาเนส [(1->3)-β-D-glucan glucanohydrolase (EC 3.2.1.39) หรือ endo-(1,3)-β-D-glucanase หรือ 1,3-β-D-glucan-3-glucanohydrolase (EC 3.2.1.6)] จัดอยูในกลุมของเอนไซมไฮโดรเลส (hydrolase) มีความสามารถในการยอยสลายพันธะไกลโคซิดิกแบบเบตา-1,3 (β-1,3-glycosidic bond) ของสับสเตรทชนิดตาง ๆ ไดแก ลามินาริน (laminarin จาก Laminaria digitata) พาไคแมน ( pachiman จาก Poria cocus) กลูแคนจากยีสต Saccharomyces cerevisiae แตไมสามารถยอยสลายสับสเตรทที่พันธะไมเปนแบบเบตา-1,3 ได เชน พัสทิวแลน (pustulan จาก Umbilicaria pustulan) ซ่ึงมีพันธะไกลโคซิดิกเปนแบบเบตา-1,6 หรือไลซินิน (licinin จาก Cetraria islandica) ที่มีพันธะเปนแบบเบตา-1,4 เปนตน เอนไซมเบตา-1,3-กลูคาเนสแบงไดเปน 3 กลุมดวยกัน คือ เอนโดเบตา-1,3-กลูคาเนส (endo-1,3-glucanase) เอกโซเบตา-1,3-กลูคาเนส (exo-1,3-glucanase) และเบตา- กลูโคซิเดส (β–glucosidases) บางชนิด (Young and Pegg, 1981) เอนไซมเบตา-1,3-กลูคาเนส ในพืชมีการศึกษาอยางกวางขวางเนื่องจากจัดเปน pathogenesis related protein ซ่ึงเปนโปรตีนที่พืชสรางขึ้นเพ่ือการปองกันอันตรายใหแก ตนพืชและตอบสนองตอการบุกรุกของเชื้อกอโรค สภาวะกดดันตาง ๆ สารเคมีและฮอรโมน โดยเอนไซมสามารถยอยสลายผนังเซลลของแบคทีเรีย รา และจุลินทรียในสวนของเบตา-ดี-กลูแคน ทําใหจุลินทรียไมสามารถเจริญเติบโตและเพิ่มจํานวนได (Kombrink, 1988) เอนไซม เบตา-1,3-กลูคาเนสที่แยกไดจากขาวบารเลยที่เพ่ิงงอกใหม มี 3 ไอโซไซม (isozyme) พบวามีปริมาณเพิ่มสูงขึ้นขณะที่มีการติดเชื้อ การที่ตนขาวบารเลยเพ่ิงงอกใหม ๆ มีการสรางน้ําตาล กรดอะมิโน (amino acid) และสารชีวโมเลกุลที่มีนํ้าหนักโมเลกุลขนาดเล็กชนิดตาง ๆ สะสมไวในเอนโดสเปรม (endosperm) ทําใหงายตอการถูกบุกรุกจากเชื้อกอโรค มีผลทําใหตนขาวอาจถูกทําลายได ดังนั้นการกระตุนการสรางเอนไซมเบตา-1,3-กลูคาเนสจึงเปนหนทางหนึ่งในการปองกันตนเองจากการบุกรุกจากเชื้อกอโรคตาง ๆ และการที่พบวามีเอนไซมเบตา-1,3-กลูคาเนสหลายไอโซไซมทําใหเอนไซมมีความแตกตางกันในดานความจําเพาะตอสับสเตรท

12

รูปแบบการทํางานและความสามารถในการยอยสลายพันธะแบบเบตา-1,3 ตอกับเบตา-1,6 ของกลูแคนชนิดตาง ๆ ซ่ึงเปนขอดีของการมีหลายไอโซไซมที่จะชวยยับยั้งการบุกรุกของเชื้อกอโรคที่มีเบตา-1,3-กลูแคนชนิดตาง ๆ ซ่ึงเปนองคประกอบหลักของผนังเซลลได (Wessels and Sietsma, 1987; Hrmova and Fincher, 1993) และจากการศึกษาในมะเขือเทศพบวาเอนไซมไคติเนส (chitinase) และเอนไซมเบตา-1,3-กลูคาเนสถูกกระตุนใหสรางมากขึ้นหลังจากไดรับเชื้อ Cladosporium fulvum และเชื้อ Fusarium oxysporum ในมะเขือเทศพันธุที่ตานทานโรคมากกวาพันธุที่ไมตานทานโรค (Hrmova and Fincher, 1993) ในสัตวกลุมอารโทรพอด (arthropod) ที่ถูกรุกรานจาก Rhagium inquisto พบวาเอนไซม เอนโดเบตา -1,3-กลูคาเนสมีการทํางานรวมกับเอนไซมลามินาริ เนส (laminarinase) เพ่ือยับยั้งการรุกราน (Brimacombe, 1975) และในไขหอยเมนเม่ือเกิดการผสมพันธุจะมีการหลั่งเอนไซมเบตา-1,3-กลูคาเนสออกมาโอบลอมผิวนอกไขเพ่ือเปนการปกปองไขไมใหถูกทําลายโดยจุลินทรีย (Epel et al., 1969) ระดับแอคทิวิทีจําเพาะ (specific activity) ของเอนไซมเบตา-1,3-กลูคาเนสใน ฮีโมลิมฟและสารสกัดตับ (hepatopancreas) ของกุงแชบวยที่กระตุนใหมีการติดเชื้อกอโรค V. harveyi แบบ active (5x109 เซลลตอตัวกุง) มีคาเพิ่มสูงขึ้นอยางมีนัยสําคัญเปน 2.57 และ 1.97 เทา ตามลําดับ เม่ือเทียบกับของกุงชุดควบคุมที่ฉีดดวย 0.85% NaCl ผลการทดลองนี้บงชี้วาระดับแอคทิวิทีจําเพาะของเอนไซมเบตา-1,3-กลูคาเนสที่เพ่ิมสูงขึ้นในฮีโมลิมฟและในตับ นาจะเกี่ยวของกับการปองกันตนเองจากการติดเชื้อกอโรคของกุงแชบวย แตจากการฉีดกุงดวยเชื้อ V. harveyi แบบ inactive หรือดวยเชื้อไมกอโรคในกุงแชบวย เชน E. coli, V. cholerae และไวรัสตัวแดงดวงขาว (white spot syndrome virus, WSSV) พบระดับแอคทิวิทีจําเพาะของเอนไซมเบตา-1,3-กลูคาเนสในฮีโมลิมฟและสารสกัดตับไมแตกตางจากกุงชุดควบคุม (อรัญญา คงแกว, 2549) 5. เอนไซมเอ็น-อะซิติลกลูโคซามินิเดส (N-Acetyl glucosaminidase) เอนไซมเอ็น-อะซิติลกลูโคซามินิเดส (N-acetyl glucosaminidase, NAGase) หรือไคโตไบเอส (chitobiase) เปนเอนไซมที่เรงปฏิกิริยาในขั้นตอนสุดทายของการสลายไคติน (chitin) โดยสลายไคโตไบโอส (chitobiose) ไปเปน N-acetyl glucosamine (NAG หรือ NAcGlc) 2 โมเลกุล (Shaikh and Deshpande, 1993) เอนไซม NAGase แบงไดเปน 2 ชนิด ตามรูปแบบการเรงปฏิกิริยา คือเปนชนิด endo-NAGase และ exo-NAGase โดย endo-NAGase ตัดสายโอลิโกแซคคาไรดที่พันธะไกลโคซิดิกระหวางโมเลกุลแบบสุม สวน exo-NAGase ตัดสายโอลิโกแซคคาไรดที่พันธะไกลโคซิดิกจากปลายน้ําตาลที่ไมรีดิวซ เขามาทีละหนวยจนไดผลผลิตเปน NAG

13

เอนไซมไกลโคซิเดสเปนเอนไซมที่ทําหนาที่สลายและควบคุม glycoconjugate เกี่ยวของกับการอักเสบและการปองกันตนเองจากเชื้อกอโรค โดยเอนไซมสามารถยอยสลายผนังเซลลของแบคทีเรียทําใหแบคทีเรียไมสามารถทํางานได (Zelck, 1999) เชนเดียวกับที่พบเอนไซมไคติเนสและ NAGase ปริมาณสูงในเลือดของปลาเรนโบวเทราท (rainbow trout) และปลาเทอรบอท (turbot) ที่มีการติดเชื้อ โดยเอนไซม NAGase ทําหนาที่สลายไคตินซึ่งเปนสวนประกอบของผนังเซลลของเชื้อรา (Lindsay, 1986; Manson et al., 1992) ระดับแอคทิวิทีจําเพาะของเอนไซม NAGase ในฮีโมลิมฟและสารสกัดตับของกุงแชบวยที่ติดเชื้อ V. harveyi มีคาเพิ่มสูงขึ้นอยางมีนัยสําคัญ เม่ือเทียบกับของกุงชุดควบคุมที่ฉีดดวย 0.85% NaCl (อรัญญา คงแกว, 2549; พงษธร ล้ําเลิศกิตติกุล, 2548) ทํานองเดียวกับระดับแอคทิวิทีของเอนไซมเบตา-1,3-กลูคาเนสของกุงที่ถูกเหนี่ยวนําใหติดเชื้อชนิดเดียวกันและดวยความเขมขนเดียวกัน โดยผลการทดลองนี้บงชี้วาระดับแอคทิวิทีจําเพาะของเอนไซม NAGase ที่เพ่ิมสูงขึ้นในฮีโมลิมฟและในตับ นาจะเกี่ยวของกับการปองกันตนเองตอการติดเชื้อกอโรคของกุงแชบวย แตจากการฉีดกุงดวยเชื้อ V. harveyi แบบ inactive หรือดวยเชื้อไมกอโรคในกุงแชบวย เชน E. coli, V. cholerae และไวรัส WSSV พบระดับแอคทิวิทีจําเพาะของเอนไซม NAGase ในฮีโมลิมฟและสารสกัดตับไมแตกตางจากกุงชุดควบคุม (อรัญญา คงแกว, 2549) 6. ระบบโปรฟนอลออกซิเดส (prophenoloxidase system; proPO system) ระบบโปรฟนอลออกซิเดส (proPO system) หรือระบบ proPO เปนระบบปองกันตัวที่สําคัญของสัตวกลุมอารโทรพอด ซ่ึงสามารถจดจําสิ่งแปลกปลอมที่เขามาสูรางกายได (Söderhäll and Cerenius, 1998) โดยจดจําสวนประกอบของผนังเซลลของจุลินทรีย เชน เบตา-1,3-กลูแคน ลิโพโพลีแซคคาไรด เปปทิโดไกลแคน และกรดลิโพทิโชอิค โดยอาศัยโมเลกุลสําหรับจดจําที่จําเพาะไดแก BGBP และ LGBP (Davic and Söderhäll, 1990; Lee et al., 2000) โมเลกุล BGBP สังเคราะหที่ตับ ในขณะที่โมเลกุล LGBP สังเคราะหที่เซลลฮีโมไซท เม่ือ BGBP จับกับเบตา-1,3-กลูแคน โปรตีนนี้จะไปจับตัวรับบนผิวเซลลของเซลลฮีโมไซท (Barracco et al., 1991; Davic and Söderhäll 1992) การที่ BGBP-glucan complex จับกับเซลลฮีโมไซทสามารถชักนําใหเกิดปฏิกิริยาตางๆ ตามมามากมาย เชน การแผขยายและการสลายแกรนูลของเซลลฮีโมไซท (Barracco et al., 1991) สนับสนุนใหเซลลไฮยาลินมีอัตราการกลืนกินเร็วขึ้น (Thornqvist et al., 1994) การสลายเซลลฮีโมไซทชนิดกรานูลทําใหเกิดการหลั่งสารที่เปนองคประกอบของระบบ proPO และสารอื่นๆที่สําคัญในการปองกันตัวออกมาจาก กรานูล ดังแสดงในรูปที่ 2

14

รูปที่ 2 ระบบโปรฟนอลออกซิเดสในสัตวกลุมครสัเตเชียน (Sritunyalucksana, 2001)

15

การกระตุนระบบ proPO ถูกควบคุมดวยเอนไซม serine proteinase (Söderhäll,1982; Söderhäll and Cerenius, 1998) และเรียกเอนไซมน้ีวา ppA (prophenol-oxidase activating enzyme) ในกุงนาง (crayfish) เอนไซม ppA เปน trypsin-like proteinase ซ่ึงถูกเก็บไวในรูป inactive ภายในกรานูล เม่ือมีการสลายกรานูล เอนไซมน้ีจะหลั่งออกมาพรอมกับเอนไซมโปรฟนอลออกซิเดส และเปลี่ยนไปเปนรูป active ที่สามารถเปลี่ยนเอนไซมโปรฟนอลออกซิเดสไปเปนฟนอลออกซิเดส (Aspan and Söderhäll, 1991; Aspan et al., 1995) เอนไซมฟนอลออกซิเดสเปนโปรตีนที่มีคอปเปอรเปนองคประกอบและเปนเอนไซมสําคัญในกระบวนการสังเคราะหเมลานิน (melanization) (Söderhäll and Cerenius, 1998) โดยจะเรงปฏิกิริยาการเติมหมูไฮดรอกซิล (O-hydroxylation) ของโมโนฟนอล (monophenol) ใหเปนไดฟนอล (diphenol) และออกซิไดซไดฟนอลไปเปนควิโนน เกิดเปนโพลิเมอรของ เมลานินซึ่งมีสีดํา เมลานินและสารตัวกลาง (ฟนอลและควิโนน) ในกระบวนการนี้เปนสารที่มีพิษสามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของจุลินทรียได เชน ในกุงนางพบวาสามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อรา Aphanomyces astaci (Söderhäll and Ajaxon, 1982) และเพื่อปองกันการกระตุนเอนไซม proPO ไมใหมากเกินไป ในระบบนี้จึงมีตัวควบคุม น่ันคือ ตัวยับยั้งเอนไซมโปรตีเนส (proteinase inhibitor) เชน pacifastin, แอลฟา 2-มาโครโกลบูลิน (α2-macro-globulin) (Hall et al., 1989; Aspan et al., 1990; Liang et al., 1977) นอกจากนี้ยังพบวา ตัวยับยั้งเอนไซมโปรตีเนสยังชวยปองกันการทํางานของเอนไซมโปรตีเนสของจุลินทรียในการยอยโปรตีนที่แข็งตัว (clotting protein) และการเจาะเพื่อการบุกรุก (penetrate) บริเวณที่เกิดบาดแผล ในกุงนางพบวาแอลฟา 2-มาโครโกลบูลินทําหนาที่ดังกลาว โดยแอลฟา 2-มาโครโกลบูลินสามารถจับกับโปรตีนที่แข็งตัวซ่ึงเกิดจากการเรงปฏิกิริยาโดยเอนไซมทรานสกลูตามิเนส (transglutaminase) (Hall and Söderhäll, 1994) 7. เอนไซมฟนอลออกซิเดส (Phenoloxidase, PO) เอนไซมฟนอลออกซิเดสแบบ monophenol oxidase เปนเอนไซมที่ทําหนาที่ในการเรงปฏิกิริยาการเติมหมูไฮดรอกซิลที่ตําแหนงออรโธ (ortho) ของสับสเตรทแบบฟนอล (phenolic substrate) และออกซิไดซไดฟนอลไปเปน o-benzoquinone โดย diphenol oxidase ปฏิกิริยาทั้งสองใชโมเลกุลของออกซิเจนเปนสับสเตรทรวม (Nicolas et al., 1994) ดังแสดงในรูปที่ 3 เอนไซมฟนอลออกซิเดสถูกคนพบเปนครั้งแรกในเห็ด โดยเอนไซมที่ถูกคนพบนี้จะมีจํานวนหนวยยอย (subunit) ที่แตกตางกันไปขึ้นอยูกับสมบัติทางเคมี ทางกายภาพ และทางจลนศาสตรของเอนไซม ความตางของจํานวนหนวยยอยเปนไปตามความจําเพาะที่มีตอ สับสเตรท (Marshall et al., 2000)

16

รูปที่ 3 การเกิดปฏิกิริยา Hydroxylation และ Oxidation ของไดฟนอล โดยเอนไซมฟนอลออกซิเดส (Marshall et al., 2000)

เอนไซมฟนอลออกซิเดสเปนเอนไซมที่มาจากระบบ proPO พบในการสราง เมลานินและตรวจพบไดในฮีโมลิมฟหรือใน coelom และยังพบไดในคิวติเคิล (cuticle) ของอารโทรพอด (Söderhäll and Cerenius, 1998) เอนไซมฟนอลออกซิเดสสามารถเรงปฏิกิริยาการเติมหมูไฮดรอกซิลที่ตําแหนง ortho ของโมโนฟนอลและเรงปฏิกิริยาออกซิเดชัน (oxidation) ของฟนอลไปเปนควิโนน รวมทั้งเอนไซมน้ีสามารถเปลี่ยนไทโรซีน (tyrosine) ไปเปน dihydroxyphenylalanine (DOPA) และเปลี่ยน DOPA ไปเปน DOPA-quinone (Sugumaran, 1996) โดยปฏิกิริยาเหลานี้เกิดในวิถีการสรางเมลานิน พบวาสวนประกอบของผนังเซลลของ จุลินทรียในปริมาณนอย ๆ (pg/l) ไดแกเบตา-1,3-กลูแคน ลิโพโพลีแซคคาไรด เปปทิโดไกลแคน หรือ zymosan ซ่ึงเปนคารโบไฮเดรตจากผนังเซลลของยีสต urea, Ca2+ เอนไซมทริปซิน (trypsin) และความรอน สามารถกระตุนใหเอนไซมฟนอลออกซิเดสมีแอคทิวิทีเพ่ิมสูงขึ้นได โดยทําหนาที่กระตุนในลักษณะเดียวกับ serine proteinase (Söderhäll, 1981; Leonard et al., 1985) ซ่ึงสามารถกระตุนเอนไซมโปรฟนอลออกซิเดสที่ไม active ไปเปนเอนไซมฟนอลออกซิเดสที่ active ได และทําใหเกิดการสรางเมลานิน โดยเห็นเปนจุดสีดําบริเวณคิวติเคิลของอารโทรพอด (Söderhäll and Ajaxon, 1982; Sugumaran and Kanost, 1993)

17

7.1 แหลงที่พบเอนไซมฟนอลออกซิเดส 7.1.1 ในพืช ในพืชพบเอนไซมฟนอลออกซิเดสไดหลากหลาย เชนพบในขาวโอต (Skoglund et al., 2007) รากและใบของขาวโพด (Zea mays) (Adamia et al., 2006) ในแครอท (Daucus carota) (Carlberg et al., 1985) และในลําไย (Dimocarpus longan Lour) (หทัยชนก ประไพพงษ, 2533) เปนตน 7.1.2 ในสัตว พบเอนไซมฟนอลออกซิเดสในสัตวไดทั้งในฮีโมลิมฟและเซลลเม็ดเลือด (Ashida et al., 1983; Saul et al., 1987; Hernandez-Lopez et al., 1996) ในสัตวชนิดตางๆ ดังน้ี เชน ใน Mytilus edulis, Perna viridis, ปลาหมึก Illex argentinus และ Perna perna (Coles and Pipe, 1994; Asokan et al., 1997; Hellio et al., 2007) และในหอยสองฝา เชน Ruditapes decussates, Mytilus galloprovincialis, Crassostrea gigas และ Nodipecten subnodosus (Coles and Pipe, 1994; Carballal et al., 1997; Lopez et al., 1997; Asokan et al., 1998; Luna-Gonzalez et al., 2003) พบในสัตวกลุมอารโทรพอด เชน Holotrichia diomphalia และกุงนาง P. leniusculus (Lee et al., 1998; Wang et al., 2001) และในสัตวไมมีกระดูกสันหลังชนิดอ่ืนๆ อาทิเชน tobacco hornworm (Manduca sexta), silkworm, (Bombyx mori), Zhikong scallop และ Chlamys farreri (Ma and Kanost, 2000; Ochiai and Ashida, 2000; Yu and Kanost, 2004; Qiu et al., 2007) ในเพรียงหัวหอม (ascidian) ชนิด Goniocarpa rustica, Halocynthia aurantium (Chaga, 1980) Ciona intestinalis (Jackson et al., 1993) Styela plicata (Arizza et al., 1995) Phallusia mammillata (Cammarata et al., 1999) colonial Botryllus schlosseri (Ballarin et al., 1994) 7.2 สมบัติของเอนไซมฟนอลออกซิเดส 7.2.1 สับสเตรทของเอนไซมฟนอลออกซิเดส เอนไซมฟนอลออกซิเดสมีสับสเตรทหลากหลายชนิด ทั้งเอนไซมในพืชและสัตว ดังแสดงในตารางที่ 1 และ 2

18

ตารางที่ 1 สับสเตรทของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในพืช

Source Phenolic substrates

Apple chlorogenic acid (flesh), catechol, catechin (peel), caffeic acid, 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA), 3,4-dihydroxy benzoic acid, p-cresol, 4-methyl catechol, leucocyanidin, p-coumaric acid, flavonol glycosides

Apricot isochlorogenic acid, caffeic acid, 4-methyl catechol, chlorogenic acid, catechin, epicatechin, pyrogallol, catechol, flavonols, p-coumaric acid derivatives

Avocado 4-methyl catechol, 3,4-dihydroxyphenylethylamine (dopamine), pyrogallol, catechol, chlorogenic acid, caffeic acid, DOPA

Banana dopamine, leucodelphinidin, leucocyanidin

Cacao catechins, leucoanthocyanidins, anthocyanins, complex tannins

Coffee beans chlorogenic acid, caffeic acid

Eggplant chlorogenic acid, caffeic acid, coumaric acid, cinnamic acid derivatives

Grape catechin, chlorogenic acid, catechol, caffeic acid, DOPA, tannins, flavonols, protocatechuic acid, resorcinol, hydroquinone, phenol

Lettuce tyrosine, caffeic acid, chlorogenic acid derivatives

Mango dopamine-HCl, 4-methyl catechol, caffeic acid, catechol, catechin, chlorogenic acid, tyrosine, DOPA, p-cresol

Mushroom tyrosine, catechol, DOPA, dopamine, adrenaline, noradrenaline

Peach

chlorogenic acid, pyrogallol, 4-methyl catechol, catechol, caffeic acid, gallic acid, catechin, dopamine

Pear

chlorogenic acid, catechol, catechin, caffeic acid, p-cresol, DOPA, 3,4-dihydroxy benzoic acid

19

Source Phenolic substrates

Plum chlorogenic acid, catechin, caffeic acid, catechol, DOPA

Potato chlorogenic acid, caffeic acid, catechol, DOPA, p-cresol, m-cresol, p-hydroxyphenyl propionic acid, p-hydroxyphenyl pyruvic acid

Sweet potato chlorogenic acid, caffeic acid, caffeylamide

ตารางที่ 2 สับสเตรทของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในสัตว

Crab catechol, L-DOPA

Clam L-DOPA, tyrosine, hydroquinine monomethyl ether

Shrimp tyrosine, L-DOPA, methyl catechol, catechol, tyramine, phenol, hydroquinone, resorcinol

Lobster tyrosine

Cock roach L-DOPA

7.2.2 การจําแนกชนิดของเอนไซมฟนอลออกซิเดส ความจําเพาะตอสับสเตรทของเอนไซมฟนอลออกซิเดสสามารถนํามาใชในการจําแนกเอนไซมออกเปน 3 ชนิด คือ monophenol oxidase (EC.1.14.18.1), catechol oxidase (EC.1.10.3.1.) และ laccase (EC.1.10.3.2.) เอนไซมฟนอลออกซิเดสในแมลงแบงไดเปน 3 ชนิด คือ ชนิด laccase (E.C.1.10.3.2; p-diphenol: O2 oxidoreductase) ชนิด catechol oxidase (E.C.1.10.3.1 diphenol: O2 oxidoreductase) และชนิด tyrosinase (E.C.1.14.18.1 monophenol, L-DOPA: O2 oxidoreductase) (Barrett, 1987) เอนไซมฟนอลออกซิเดสชนิด tyrosinase มีความสามารถในการออกซิไดซสารพวกโมโนฟนอลและไดฟนอล ในขณะที่ชนิด laccase และ catechol oxidase จะมีความจําเพาะสูงตอสับสเตรทไดฟนอล เอนไซมฟนอลออกซิเดสในคิวติเคิลของแมลงมีความสามารถในการออกซิไดซสารพวกไดฟนอลเทานั้น (รูปที่ 4) ไมสามารถออกซิไดซสารพวกโมโนฟนอลได แตเอนไซมฟนอลออกซิเดสในฮีโมลิมฟของแมลง

20

มีความสามารถในการออกซิไดซสารพวกโมโนฟนอล (รูปที่ 5) สวนเอนไซมในคิวติเคิลของสิ่งมีชีวิตจําพวกกุงสามารถออกซิไดซไดทั้งโมโนฟนอลและไดฟนอล

รูปที่ 4 การสังเคราะหควิโนนโดยเอนไซม Diphenol oxidase (Marshall et al., 2000) เอนไซมฟนอลออกซิเดสใน humoral fluid ของ amphioxus เปนชนิด tyrosinase ซ่ึงเปนชนิดเดียวกับเอนไซมฟนอลออกซิเดสในเซลลฮีโมไซทของกุง Penaeus californiensis ในกุงนางและในไขของทากน้ําจืด Biomphalaria glabrata (Bai et al., 1997; Gollas-Galvan et al., 1999; Asano and Ashida, 2001)

รูปที่ 5 การสังเคราะหไดฟนอลโดยเอนไซม Monophenol oxidase (Marshall et al., 2000)

21

7.2.3 นํ้าหนักโมเลกุลของเอนไซมฟนอลออกซิเดส นํ้าหนักโมเลกุลของเอนไซมฟนอลออกซิเดสที่ทําใหบริสุทธิ์จากสิ่งมีชีวิตหลายๆ แหลง มีนํ้าหนักโมเลกุลตาง ๆ กัน เชนในหอยนางรม (Crassostrea virginica) พบวาเอนไซมฟนอลออกซิเดสบริสุทธิ์มีนํ้าหนักโมเลกุล 133 kDa ในปลาหมึก (I. argentinus) มีนํ้าหนักโมเลกุล 70 kDa และในทากน้ําจืด B. glabrata มีนํ้าหนักโมเลกุล 35 kDa (Bai et al., 1997; Naraoka et al., 2003; Jordan and Deaton, 2005) พบวาในหอยสองฝา Ruditapes philippinarum มีนํ้าหนักโมเลกุล 77 kDa (Cong et al., 2005) เชนเดียวกับในกุง Penaeus chinensis (Fan and Wang, 2002) ในกุงนาง, เพรียงหัวหอม (Aspan et al., 1995) และ Halocynthia roretzi พบวาเอนไซมฟนอลออกซิเดสที่ทําใหบริสุทธิ์มีนํ้าหนักโมเลกุลเทากันคือ 62 kDa (Fan and Wang, 2002) ในขณะที่เอนไซมฟนอลออกซิเดสบริสุทธิ์จาก brown shrimp (P. californiensis) มีนํ้าหนักโมเลกุล 107 kDa (Gollas-Galvan et al., 1999) และจาก gastropod mollusk มีนํ้าหนักโมเลกุล 35 kDa (Bai et al., 1997) 7.2.4 จลนศาสตร (Kinetics) ของเอนไซม

เอนไซมฟนอลออกซิเดสจากแตละแหลงมีความจําเพาะกับสับสเตรทตางกัน เชนเอนไซมฟนอลออกซิเดสจากหอยนางรม (Saccostrea glomerata) มีความจําเพาะตอ สับสเตรท hydroquinine monomethyl ether (4HA) โดยมีคา KM ตอ 4HA เทากับ 4.45+1.46 mM และมีคา KM ตอ L-DOPA เทากับ 10.27+1.33 mM เอนไซมฟนอลออกซิเดส จากหอยสองฝา R. philippinarum มีคา KM ตอ L-DOPA เทากับ 2.2 mM และมีคา KM ตอสับสเตรทของ monophenolase หรือ tyrosine เทากับ 6.0 mM (Cong et al., 2005) เอนไซมในปู Charybdis japonica เม่ือใชสับสเตรท L-DOPA และ catechol มีคา KM เทากับ 3.41 และ 7.97 mM ตามลําดับ (Liu et al., 2006) ในกุง P. californiensis มีคา KM เทากับ 2.50, 2.53, 2.89 และ 4.15 mM ตอ L-DOPA, methylcatechol, catechol และ tyrosine ตามลําดับ (Gollas-Galvan et al., 1999) ในกุงลายเสือ Penaeus japonicus และ P. chinensis มีคา KM ตอ L-DOPA เทากับ 3.45 mM และ 1.99 mM ตามลําดับ (Fan and Wang, 2002) 8. การทําบริสุทธ์ิเอนไซมฟนอลออกซิเดส จากงานวิจัยที่ผานมาไดมีการทําบริสุทธิ์เอนไซมโปรฟนอลออกซิเดสในสัตวไมมีกระดูกสันหลังหลายชนิด (Söderhäll et al., 1996) แตสําหรับการทําบริสุทธิ์เอนไซมฟนอล ออกซิเดสนั้นยังมีรายงานนอยมาก เน่ืองมาจากเอนไซมฟนอลออกซิเดสมีความหนืดและเม่ือนํามาทําใหบริสุทธิ์โดยคอลัมนพบวาเอนไซมชนิดนี้มักถูกดูดซับติดกับคอลัมน (Söderhäll et al., 1996) ดังเชน การทําบริสุทธิ์เอนไซมฟนอลออกซิเดสจาก H. roretzi พบวามีการจับกับคอลัมนหลายชนิดและไมสามารถชะออกมาไดแมไดเปลี่ยนสภาวะแลวก็ตาม ไดมีการทําให

22

เอนไซมฟนอลออกซิเดสบริสุทธิ์จากฮีโมลิมฟของปู C. japonica โดยคอลัมนเจลฟลเทรชัน (gel filtration) ชนิด Sephacryl S-100 และตามดวยคอลัมน Q-Sepharose Fast flow ion-exchange (Liu et al., 2006) แตเอนไซมจากหอยสองฝา R. philippinarum สามารถทําใหบริสุทธิ์ไดโดยคอลัมน Q-Sepharose Fast flow ion-exchange และตามดวยคอลัมน Sephacryl S-100 (Cong et al., 2005) จาก amphioxus (Branchiostoma belcheri tsingtauense) สามารถทําใหเอนไซมบริสุทธิ์จากฮีโมลิมฟไดโดยวิธีการตกตะกอนดวยเกลือแอมโมเนียมซัลเฟต (ammonium sulphate) ตามดวยคอลัมน Sephadex G-200 และคอลัมน DEAE- Sepharose สวนในยุงลาย (Aedes aegypti) สามารถทําใหเอนไซมฟนอลออกซิเดสบริสุทธิ์บางสวนไดจากคอลัมน Butyl-Sepharose แลวตามดวยคอลัมน Sephacryl S-300 จากนั้นทําใหบริสุทธิ์มากขึ้นดวยคอลัมน DEAE-Sepharose (Burks and Fuchs, 1995) Gollas-Galvan และคณะ (1999) ทําบริสุทธิ์เอนไซมโปรฟนอลออกซิเดสจากกุง P. Californiensis ไดดวยวิธี ultracentrifugation และดวยคอลัมน Blue-Sepharose 9. ปจจัยทางกายภาพที่มีผลตอแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดส 9.1 ผลของ pH

เอนไซมฟนอลออกซิเดสจากแหลงตาง ๆ ทํางานไดดีและมีความเสถียรที่ pH เปนเบสและเปนกลาง เชน ในปู C. japonica และในกุง P. chinensis พบวาเอนไซมฟนอลออกซิเดสทํางานไดดีที่สุดที่ pH 6 (Liu et al., 2006; Fan and Wang, 2002) สวนในหอยสองฝา R. philippinarum ทํางานไดดีที่สุดที่ pH 7 (Cong et al., 2005) เอนไซมฟนอลออกซิเดสในทากนํ้าจืด B. glabrata และในหนอนกระทูกินยอด (Heliothis virescens) ทํางานไดดีที่สุดที่ pH 9.5 และ pH 9 ตามลําดับ (Bahgat et al., 2002; Lockey and Ourth, 1992) สวนเอนไซม ฟนอลออกซิเดสที่ทําใหบริสุทธิ์จากพืช อาทิเชน จากกลวย Musa sapientum L. ทํางานไดดีที่สุดที่ pH 7 (Yang et al., 2000) 9.2 ผลของอุณหภูมิ

ในหอยนางรม (S. glomerata) เอนไซมฟนอลออกซิเดสมีแอคทิวิทีสูงสุดที่อุณหภูมิ 37°ซ ในหอยสองฝา R. philippinarum เอนไซมทํางานไดดีสุดที่อุณหภูมิ 40°ซ เชนเดียวกับในปู C. japonica และ Pieris rapae ในระยะตัวออนพบวาเอนไซมทํางานไดดีที่สุดที่อุณหภูมิ 42°ซ สวนเอนไซมฟนอลออกซิเดสที่พบในหนอนกระทูกินยอดทํางานไดดีที่สุดที่ 45°ซ (Lockey and Ourth, 1992; Cong et al., 2005; Liu et al., 2006; Xue et al., 2006) และในแมลงหวี่ (Drosophila melanogaster) เอนไซมมีแอคทิวิทีสูงสุดที่ 30°ซ (Asada et al., 1993)

23

10. บทบาททางชีวภาพของเอนไซมฟนอลออกซิเดส 10.1 บทบาททางชีวภาพของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในพืช เอนไซมฟนอลออกซิเดสเรงปฏิกิริยาในพืชไดสารที่เกิดปฏิกิริยาออกซิเดชัน

ตอกับออกซิเจน และเกิดโพลีเมอร (polymerization) ไดเปนเมลานิน ซ่ึงทําใหเกิดสีนํ้าตาลในเน้ือเยื่อพืชที่ไมพึงประสงค เชน กลวย แอปเปล มันฝรั่ง และเห็ด และการเกิดสีนํ้าตาลหรือสีดําของชา กาแฟ ลูกพรุน ลูกเกด สารออรโท-เบนโซควิโนนจะทําปฏิกิริยากับหมู -amino ที่กรดอะมิโนไลซีน (lysine) ในโมเลกุลของโปรตีน ทําใหสูญเสียคุณคาทางโภชนาการของโปรตีน เพราะไลซีนเปนกรดอะมิโนจําเปนตอรางกาย นอกจากนี้ปฏิกิริยาการเกิดสีนํ้าตาลที่เรงดวยเอนไซมฟนอลออกซิเดสยังทําใหอาหารมีลักษณะเนื้อสัมผัสและรสชาติเปลี่ยนไปดวย ผลไมเขตรอนประมาณ 50% เสื่อมคาเนื่องจากปฏิกิริยาการเกิดสีนํ้าตาลที่เรงดวยเอนไซมน้ี ดังน้ันจึงตองหาวิธีปองกันไมใหเกิดปฏิกิริยาสีนํ้าตาล โดยการกําจัดออกซิเจนและฟนอล รวมทั้งใชสารตานออกซิเดชัน เชน วิตามินซี โซเดียมซัลไฟต (sodium sulphite) และสารประกอบที่มีหมูไธออล (-SH, thiol group) จะปองกันปฏิกิริยาไดโดยจะไปรีดีวซสารเริ่มตนและยับยั้งการทํางานของเอนไซมโพลีฟนอลออกซิเดส (polyphenoloxidase) โดยทําลายกรดอะมิโนฮิสติดีน (histidine) ที่บริเวณเรง (active site) ของเอนไซมดวยกรดแอสคอรบิค (ascorbic acid) หรือกําจัด Cu+2 ที่บริเวณเรงดวยโซเดียมไบซัลไฟต (sodium bisulphite) และหมูไธออล เปนตน (http://www. courseware.rmutl.ac.th, retrived May 5, 2008)

เม่ือห่ันมะเขือและปลอยทิ้งไวจะสังเกตเห็นการเกิดสีนํ้าตาลอยางรวดเร็ว สีนํ้า ตาลที่เกิดขึ้นเปนผลจากปฏิกิริยาออกซิเดชันของสารประกอบฟนอล ไดสารประกอบ o-quinone และเกิดปฏิกิริยาโพลีเมอไรซจนไดเปนสารประกอบสีนํ้าตาลในที่สุด (Martinez and Whitaker, 1995) ระยะเวลาในการเกิดสีนํ้าตาลของผลมะเขือแตละพันธุแตกตางกันไป ซ่ึงอาจขึ้นกับปจจัยหลายประการ เชน ชนิดและปริมาณสารประกอบฟนอลที่เปนสารตั้งตน หรือแอคทิวิทีของเอนไซมโพลีฟนอลออกซิเดส สารประกอบฟนอลเปนสารที่พบมากที่สุดในพืช (Robard et al., 1995) นอกจากจะเปนสารตั้งตนในการเกิดสารสีนํ้าตาลแลวยังมีสมบัติตานการเกิดปฏิกิริยาออกซิเดชัน (antioxidant) ซ่ึงมีบทบาทอยางมากในการตอตานการเกิดสารอนุมูลอิสระที่อาจเปนสาเหตุของโรคหัวใจและมะเร็ง เม่ือสารประกอบฟนอลในมะเขือถูกออกซิไดซไปเปนสาร ประกอบสีนํ้าตาล ความสามารถในการตานปฏิกิริยาออกซิเดชันจะลดลง (อุษาวดี ชนสุต และนิธิยา รัตนาปนนท, 2549)

10.2 บทบาททางชีวภาพของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในสัตว ในสิ่งมีชีวิตจําพวกกุงพบวาแอคทิวิทีของเอนไซมในระบบโปรฟนอลออกซิเดส

จะมีมากในเวซิเคิล (vesicle) ซ่ึงอยูภายในไซโทพลาซึมของเม็ดเลือดเชนใน Astacus astacus และในกุงนาง Procambarus clarkii (Smith and Söderhäll, 1983; Johansson and Söderhäll,

24

1985; Lanz et al., 1993) และมีบทบาทสําคัญในขั้นตอนการกําจัดสิ่งแปลกปลอมในรางกายกุง เชน เปนตัวเรงใหเลือดแข็งตัว มีความวองไวในการเกาะผิวของสิ่งแปลกปลอมและดึงดูดใหเซลลเม็ดเลือดมาจับกินไดเร็วขึ้น ในขณะที่การศึกษาของ Sung และคณะ (1996) และ Parazzolo และ Barracco (1997) พบวา เอนไซมโปรฟนอลออกซิเดสของกุงกุลาดํา กุงกามกราม (Macrobrachium rosenbergii) และกุงขาว (Penaeus Vannamai) สวนใหญจะอยูในไซโทพลาซึมของเซลลฮีโมไซทแบบกรานูลาร (granular hemocyte) ซ่ึงโดยทั่วไปแลวเอนไซมฟนอลออกซิเดสมีการแพรกระจายอยูในเนื้อเยื่อหลายสวนของตัวกุง (Hose et al., 1987; Söderhäll, 1982; Söderhäll et al., 1990) นอกจากนี้ยังพบวาเอนไซมชนิดนี้จะเกี่ยวของกับการรับรูถึงแอนติเจนของเชื้อโรคที่จะเขาสูรางกายดวย (Söderhäll, 1982)

ในกระบวนการสรางเปลือกแข็งของปูตองการเอนไซมฟนอลออกซิเดส ซ่ึงเปนเอนไซมที่มีอยูในตัวปู (endogenous enzyme) และมีทองแดงเปนองคประกอบ ในระหวางกระบวนการแข็งตัวของเปลือกปู ไดฟนอลจะถูกออกซิไดซโดยเอนไซมฟนอลออกซิเดสให กลายเปนควิโนน ซ่ึงจะทําใหเกิดการเชื่อมตอกัน เกิดการสรางเปลือกแข็งขึ้นมาได นอกจากนี้เอนไซมฟนอลออกซิเดสยังมีผลตอการเสื่อมคุณภาพของสัตวนํ้าที่มีเปลือก เน่ืองจากเปนเอนไซมที่ทําใหเกิดสีนํ้าตาล (enzymatic browning reaction) องคประกอบสําคัญในการเกิดปฏิกิ ริยาคือ ออกซิ เจน สับสเตรทและเอนไซมที่ เขาทําปฏิกิ ริยาเชน tyrosinase, catecholase, cresolase, phenolase และ polyphenolase ในปฏิกิริยาการเกิดสีนํ้าตาล เอนไซมฟนอลออกซิเดสจะเรงการเกิดปฏิกิริยา 2 แบบ คือ ปฏิกิริยาการเติมหมูไฮดรอกซิล (hydroxylation) ใหสารประกอบโมโนฟนอลไดเปนสารออรโท-ไดฟนอล (o-diphenol) ซ่ึงจะเกิดปฏิกิริยาดีไฮโดรจีเนชัน (dehydrogenation) ตอไปไดเปนออรโท-ควิโนน (o-quinone) สารควิโนนที่เกิดขึ้นจะเปลี่ยนแปลงและทําปฏิกิริยาตอกับสารประกอบฟนอล กรดอะมิโน และสารอ่ืนๆ โดยใหผลิตภัณฑสุดทายคือเมลานินซึ่งเปนสารสีนํ้าตาลดํา (http://naffi.trf.or.th, retrived May 6, 2008) 11. โรคติดเชื้อแบคทีเรียวิบริโอ (Vibriosis) ในสภาพการเลี้ยงกุงแบบหนาแนนในบอดิน พบวาการระบาดของโรคติดเชื้อแบคทีเรียสวนใหญมีสาเหตุมาจากแบคทีเรียกลุมวิบริโอ (Vibrio spp.) เปนหลัก อาจเรียกรวมกันวาโรควิบริโอซิส (vibriosis) โดยเฉพาะเชื้อ V. parahaemolyticus, Vibrio splendidus, V. vulnificus, Vibrio damsela และวิบริโอเรืองแสง V. harveyi ซ่ึงกอใหเกิดความเสียหายตอระบบการเพาะเลี้ยงกุงของไทยเปนอยางมาก นักวิจัยจึงไดพยายามคิดคนหาแนวทางในการปองกันการเกิดโรค (เพ็ญศรี บุญตามชวย และ อรอนงค คงทวี, 2548) ในสถานการณปจจุบันการเลี้ยงกุงทะเลยังเกิดปญหากุงติดเชื้ออยูเสมอ พบวาการระบาดของโรคติดเชื้อจากแบคทีเรีย

25

สวนใหญมีสาเหตุมาจากกลุมวิบริโอซึ่งพบบอยและเกิดไดตลอดป (Ruangpan and Kitao, 1991) เปนสาเหตุใหเกิดการตายของกุงในระดับตั้งแตคอนขางมากจนถึงระดับตาย 100% (Lightner, 1988) 11.1 การแพรระบาดของโรค การระบาดของโรคแบคทีเรียในกุงเลี้ยงมีรายงานมาตั้งแตป ค.ศ. 1981 โดยพบวากุงลายเสือ (Kuruma, P. japonicus) ที่เลี้ยงในประเทศญี่ปุน เกิดการติดเชื้อวิบริโอเปนจํานวนมาก (Takahashi et al., 1984 อางอิงโดย Lightner, 1993) ตอมาในป ค.ศ. 1989 ไดมีรายงานพบการติดเชื้อวิบริโอเรืองแสงเปนครั้งแรกในลูกกุงขาว (P. vannamei) จากโรงเพาะฟก ที่ประเทศเอกวาดอร หลังจากนั้นในป คศ.1989 พบการระบาดของโรคติดเชื้อวิบริโอที่รุนแรงในเขตพื้นที่การเลี้ยงของประเทศเอกวาดอร (Mohney et al., 1991) เชื้อแบคทีเรีย วิบริโอมีการแพรระบาดทั่วไป ทั้งลูกกุงภายในโรงเพาะฟกและกุงที่เลี้ยงในบอดิน พบวาปจจัยสําคัญที่มีผลตอการระบาดของโรค ไดแกระดับความเค็มของน้ํา การระบาดของโรคจะเกิดขึ้นมากในชวงที่นํ้ามีความเค็มสูง เน่ืองจากเชื้อวิบริโอสามารถเติบโตไดดีในระดับความเค็ม 20-30 ppt (Mohney et al., 1991) นอกจากนี้ปริมาณสารอินทรียที่สะสมอยูมากในน้ํามีผลใหเชื้อวิบริโอเจริญไดมากขึ้น (Lightner, 1993) ประกอบกับในสภาวะที่กุงเกิดความเครียด ทั้งที่มีสาเหตุมาจากคุณภาพน้ํา อาหาร การจัดการสิ่งแวดลอมที่ไมเหมาะสม มีการสะสมของสารอินทรียปริมาณสูงในบอเลี้ยง มีผลทําใหกุงออนแอและมีการทํางานของระบบภูมิคุมกันลดต่ําลง ทําใหเชื้อแบคทีเรียที่มีจํานวนมากในบอเลี้ยงสามารถเขาสูรางกายกุงไดงาย (กิจการ ศุภมาตยและคณะ, 2542) 11.2 โรคติดเชื้อวิบริโอในตัวกุง การติดเชื้อวิบริโอจะเกิดกระจายไปทั่วตัวกุง (systemic infection) ตับและตับออนเปนอวัยวะที่เกิดการติดเชื้อวิบริโอไดอยางรวดเร็ว อีกทั้งตอมนํ้าเหลือง หัวใจ antennal gland และกลามเนื้อลาย ก็พบวามีการติดเชื้อที่อวัยวะสวนนี้ดวย (Brock and Main, 1994) อาการของกุงที่เกิดการติดเชื้อแบคทีเรียวิบริโอที่สามารถสังเกตได คือ ลักษณะพฤติกรรมผิดปกติ เซ่ืองซึม หลบซอนตัวบริเวณขอบบอเลี้ยง ไมกินอาหาร กลามเน้ือลําตัวสวนทอง (abdomen) มีสีขาวขุน มีการกระจายของเม็ดสีตามลําตัวเขมมากขึ้น ปริมาณเซลลฮีโมไซทลดต่ําลงมาก ตับออนมีลักษณะลีบ ฝอ ซีด หรืออาจเปนสีเหลืองซีด ภายในมีของเหลวใส ในลูกกุงที่ติดเชื้อพบวาตับออนมีลักษณะขาวขุนและอาจสังเกตเห็นกอนโนดูลสีดํา (melanized hemocytic nodule) บริเวณภายในตับออน (Lightner, 1993; Brock and Main, 1994) ซ่ึงแตกตางจากตับและตับออนของกุงปกติที่มีสีนํ้าตาลเขมหรือสีเขียวและมีของเหลวภายในตับและตับออน

26

จากการศึกษาพบวาเชื้อวิบริโอที่พบในกุงปกติและกุงปวยสวนใหญเปนเชื้อชนิดเดียวกัน โดยเชื้อที่พบมากที่สุดในกุงปกติ คือกุงที่ไมแสดงอาการติดเชื้อ ไดแก V. damsela รองลงมา คือ V. parahemolyticus, Vibrio spp., V. harveyi ตามลําดับ สอดคลองกับการรายงานของ Leano และคณะ (1998) พบวามีปริมาณวิบริโอในตับและตับออนกุงปกติถึง 90.12% ซ่ึงเชื้อวิบริโอที่พบ เชน V. harveyi, V. splendidus, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. campbellii, V. Pelagius, V. orientalis, V. logei, V. damsela, V. ordalii, V. alginolyticus และ V. mediterranei ซ่ึง Leano และคณะ (1998 อางอิงจาก Harris, 1993) กลาววาเชื้อแบคทีเรียจากสิ่งแวดลอมเขาไปอยูในทางเดินอาหารของกุงโดยการกินอาหารหรือทางปาก แบคทีเรียสามารถเขาไปในทอตับและตับออนรวมกับอาหารได และเชื้อวิบริโอเหลานี้จะอยูเปน normal flora สวนใหญในตับและตับออนของกุง (Lightner, 1998 อางอิงโดย Leano et al., 1998) ในกรณีที่มีการติดเชื้อวิบริโอเรืองแสง V. harveyi อาจพบวากุงที่ตายเกิดเรืองแสงเมื่อสังเกตในหองมืด ปจจุปนนิยมตรวจสุขภาพกุงกรณีกุงติดเชื้อแบคทีเรีย โดยการใชลูป (loop) เพาะเชื้อวิบริโอในตับและตับออนลงบนอาหารเลี้ยงเชื้อ TCBS (thiosulphate citrate bile salts sucrose) agar ซ่ึงสามารถทําไดงายและมีโอกาสปนเปอนนอยกวาอวัยวะอื่นๆ (กิจการ ศุภมาตย, 2542) เน่ืองจากเชื้อกลุมน้ีเปนสาเหตุหลักในการกอโรคในกุง และอาหารเลี้ยงเชื้อ TCBS เปนอาหารที่จําเพาะตอเชื้อกลุมน้ีจะเติบโตไดดี แตผลการวินิจฉัยบางกรณีพบวาแมกุงปกติที่แข็งแรงก็สามารถพบเชื้อวิบริโอจํานวนหนึ่งไดเชนกัน (เพ็ญศรี บุญตามชวย และ อรอนงค คงทวี, 2548) อีกวิธีคือการศึกษาทางเนื้อเยื่อวิทยาในกุงที่ติดเชื้อ พบวากุงที่ติดเชื้อกลุมวิบริโอ อวัยวะภายในหลายสวนทั้งตับออนและตอมนํ้าเหลืองเกิดการตาย (necrosis) เซลลฮีโมไซทมีการรวมตัวกันเปนกอนลอมรอบกลุมเชื้อ เกิดการสรางเมลานินรอบกอนของเซลลฮีโมไซท ในสวนตับออนพบวาทอของตับออนถูกทําลาย เกิดการอักเสบ (inflamation) (กิจการ ศุภมาตยและคณะ, 2542)

12. แบคทีเรีย Vibrio harveyi

V. harveyi เปนแบคทีเรีย ในกลุม Vibrio โดยอยูในกลุมของแบคทีเรียแกรมลบ รูปทอน (รูปที่ 6) เติบโตไดทั้งในสภาพที่ใชออกซิเจนและไมใชออกซิเจน บางพวกตองการเกลือหรือเกลือมีสวนชวยกระตุนการเติบโต ผนังเซลล (cell wall) ของแบคทีเรียโดยทั่วไปเปนโครงสรางสวนที่อยูใตแคปซูล (capsule) หรือชั้นเมือกและอยูนอกเยื่อหุมเซลล (cell plasma membrane) ผนังเซลลเปนสวนประกอบ 20% ของเซลล ประกอบดวยเปปไทด (peptide) โพลีแซคคาไรดและลิพิด (lipid) ซ่ึงมีองคประกอบยอยแตกตางกันในแบคทีเรียแตละชนิด ผนังเซลลเปนสวนที่มีความแข็งแกรงเนื่องจากมีโครงสรางซึ่งเปนโพลีเมอรที่ประกอบดวยโพลีแซคคาไรด

27

หรือไกลแคน (glycan) และเปปไทดตอกันดวยพันธะโควาเลนท (covalent bond) ซ่ึงมีชื่อเรียกวาเปปทิโดไกลแคน ดังเเสดงในรูปที่ 7

รูปที่ 6 โครงสรางโดยทั่วไปของแบคทีเรียแกรมลบ (http://www.bact.wisc.edu, retrived May 3, 2008 )

28

รูปที่ 7 โครงสรางของเปปทิโดไกลแคน M = N-Acetyl muramic acid (NAM) G = N-Acetyl glucosamine (NAG)

(www.biologie.uni-hamburg.de, retrived May 9, 2008)

เปปทิโดไกลแคนเปนโพลิเมอรขนาดใหญประกอบดวย 3 สวน คือ สวนแรกเปน

แกนกลาง (back bone) หรือสายไกลแคน (glycan strand) เปนโพลีแซคคาไรดที่ประกอบดวยโมโนแซคคาไรดสองชนิดคือ N-acetyl glucosamine (NAG, G) และ N-acetylmuramic acid (NAM, M) ตอกันดวยพันธะไกลโคซิดิกแบบ β (1-4) สลับกันตลอดสาย สวนที่สองเปน เททระเปปไทด (tetrapeptide) ซ่ึงจะตออยูกับ NAM และสวนที่สามเปนเปปไทดอีกชุดหนึ่ง ซ่ึงจะเชื่อมสายของโพลีแซคคาไรดที่ทอดขนานกัน โดยที่สวนที่เปนแกนกลางจะเหมือนกันหมดใน

29

แบคทีเรียทุกชนิด สวนที่เปนเททระเปปไทดและเปปไทดที่เชื่อมระหวางโพลีแซคคาไรดจะแตกตางกันในแตละชนิด เน่ืองจากเปปทิโดไกลแคนทุกสายจะถูกเชื่อมกันทางขวาง ทําใหเปป ทิโดไกลแคนชั้นตางๆ ของแบคทีเรียเชื่อมตอกันเปนโมเลกุลใหญโมเลกุลเดียว สําหรับในผนังเซลลของ V. harveyi ซ่ึงเปนแบคทีเรียแกรมลบมีโครงสรางประกอบดวยเยื่อบุชั้นนอกซึ่งมีโครงสรางเชนเดียวกับเยื่อหุมเซลล แตมีฟอสโฟลิพิด (phospholipid) และโปรตีนนอยกวา นอกจากนี้ยังพบวามีลิโพโพลีแซคคาไรดอีกดวย สวนที่ถัดเขามาจากเยื่อบุชั้นนอก คือ ชั้นเปปทิโดไกลแคน ซ่ึงอยูในชองวางระหวางเยื่อบุชั้นนอกและเยื่อหุมเซลล ซ่ึงเรียกวาเพอริพลาส มิคสเปซ (periplasmic space) สวนสุดทายที่ถัดเขามาจากชั้นเพอริพลาสมิคสเปซ คือเยื่อหุมเซลลซ่ึงประกอบไปดวยไขมันและโปรตีน (รูปที่ 8)

รูปที่ 8 ผนังเซลลของแบคทเีรียแกรมลบ

(http://www.bv229.k12.ks.u, retrived May 9, 2008)

30

แบคทีเรีย V. harveyi ที่พบในประเทศไทยเปนสาเหตุสําคัญที่กอใหเกิดโรคเรืองแสงในกุงกุลาดํา (มณเฑียร สงเสริม และคณะ, 2533) และในลูกกุงแชบวย (ดารุณี แซอุย และคณะ, 2530) เชื้อชนิดนี้ยังกอใหเกิดความเสียหายตอกุงกุลาดําในโรงเพาะฟกในประเทศฟลิปปนส (Lavilla-Pitogo et al., 1990) และในไตหวัน (Chen et al., 1992) โดยเชื้อ V. harveyi กอใหเกิดความเสียหายตอลูกกุงพีเนียด (penaeid) ในโรงเพาะฟกในระยะตัวออน (larvae) และหลังตัวออน (postlarvae) (Lightner, 1988) และในกุงขนาดใหญที่เลี้ยงอยูในบอเลี้ยง (Nash et al., 1992; Jiravanichpaisal and Miyazaki, 1994) จากการทดลองของ Le Groumellec และคณะ (1995) ซ่ึงทําการแยกเชื้อแบคทีเรียจากลูกกุงพีเนียดในโรงเพาะฟกที่เลี้ยงในประเทศไทยและประเทศเอควาดอร พบวาเปน V. harveyi ที่เปนสาเหตุใหเกิดการตายจํานวนมากของลูกกุงในโรงเพาะฟก โดยพบวาเชื้อ V. harveyi ที่พบในประเทศไทยเปนสายพันธุที่มีความรุนแรงมากกวาที่พบในประเทศเอควาดอร และยังตรวจพบเชื้อ V. harveyi ในน้ําที่ใชเลี้ยงกุงกุลาดําอยางหนาแนน (Ruangpan et al., 1995)

แบคทีเรียกลุม Vibrio เปนสาเหตุใหเกิดการตายของกุงในระดับตั้งแตคอนขางมากจนถึงระดับตาย 100% (Lightner, 1988) เชื้อแบคทีเรียสวนใหญที่แยกมาจากกุงที่เปนโรคมักจะพบเชื้อสกุล Vibrio หลายชนิด เชน V. alginolyticus, V. parahaemolyticus, V. splendidus, V. vulnificus, V. damsela และ V. harveyi (Lavilla-Pitogo, 1990) จากการศึกษาของ ดารุณี แซอุย และคณะ (2530) ถึงสาเหตุการตายของลูกกุงแชบวยในโรงเพาะฟกพบวาการตายของลูกกุงมักจะเกิดขึ้นทุกครั้งเม่ือสังเกตเห็นการเรืองแสงชวงกลางคืนในน้ําทะเลและพบอยูตามซากลูกกุงและลูกกุงที่มีชีวิต หลังจากทําการแยกเชื้อจากลูกกุงแชบวยที่ตายพบวามีสาเหตุมาจากเชื้อ V. harveyi โดย มณเฑียร สงเสริม และคณะ (2533) พบวาอาการที่เกิดจากการติดเชื้อ V. harveyi คือในระยะแรก ๆ ลูกกุงจะมีการเคลื่อนไหวชาลง ลําตัวสีขาวขุน ตอมากุงจะเบื่ออาหารและตาย

เน่ืองจากเชื้อ V. harveyi เปนสาเหตุใหเกิดโรคเรืองแสงและทําความเสียหายใหแกการเพาะเลี้ยงกุงพีเนียด ซ่ึงเปนการสูญเสียทางเศรษฐกิจที่สําคัญ การศึกษาผลของเชื้อ V. harveyi ตอเอนไซมฟนอลออกซิเดส จึงมีความสําคัญในการเขาใจการตอบสนองของ กุงแชบวยตอเชื้อกอโรคกุงไดตอไป 13. แบคทีเรีย Vibrio cholerae V. cholerae เปนแบคทีเรียแกรมลบ รูปแทงสั้น ปลายโคงเล็กนอย ไมสรางสปอร (spore) เจริญไดดีในที่มีออกซิเจน ที่อุณหภูมิ 16-42°ซ แตเจริญไดดีที่สุดที่ 37°ซ และที่ pH 6.4-9.6 (Wolin, 1973) พบ V. cholerae แพรกระจายทั่วไปในแหลงนํ้าทั้งนํ้าจืดและน้ํากรอย บริเวณปากแมนํ้าหรือแถบชายฝงทะเล (Colwell et al., 1977) นอกจากนี้ยังมีรายงาน

31

พบในอาหารทะเลหรือสัตวทะเลที่มีเปลือกหุม (Dalsgarrd et al., 1995) จากการศึกษาใน copepod ซ่ึงเปนแพลงกตอนสัตวพบวาเปนแหลงที่พบเชื้อ V. cholerae ไดมากที่สุดโดยจะสะสมอยูที่บริเวณปากและรังไข (Huq et al., 1983) นอกจากนี้อาจพบไดในสวนของทางเดินอาหาร เชื้อสามารถแทรกเขาไปอยูใตไคตินซึ่งเปนสวนประกอบของเปลือกสัตวทะเล ไคตินยังชวยปองกันเชื้อในสภาวะแวดลอมที่เปนกรด เชนในระบบทางเดินอาหารของคน และ V. cholerae สามารถสรางเอนไซมไคติเนสชวยยอยสลายไคตินเพ่ือเกาะติดกับระบบทางเดินอาหารของคน (Nalin et al., 1979) V. cholerae เปนสาเหตุใหเกิดโรคอหิวาตกโรคในคน การติดเชื้อเกิดจากการรับประทานอาหารหรือด่ืมนํ้าที่ปนเปอนเชื้อทําใหเกิดอาการทองรวงอยางรุนแรง ถารางกายสูญเสียนํ้าและเกลือแรมากผูปวยอาจเสียชีวิตได 14. แบคทีเรีย Escherichia coli E. coli เปนแบคทีเรียที่พบมากที่สุดในลําไสใหญหรืออุจจาระของคนและสัตวหลายชนิด E. coli เปนแบคทีเรียแกรมลบ เจริญไดบนอาหารเลี้ยงเช้ือธรรมดา ปกติเปน normal flora อยูในลําไส หากเชื้ออยูในลําไสจะไมกอใหเกิดโรค แตเม่ือเขาไปอยูในอวัยวะสวนอ่ืนที่ไมใชลําไสเชื้อจะกอใหเกิดโรคได เชน ในปอด ในชองทอง ในเยื่อหุมสมอง โดยเชื้อจะกอใหเกิดการอักเสบกับอวัยวะดังกลาว E. coli บางสายพันธุทําใหเกิดโรคทองรวงได เน่ือง จาก E. coli อยูในลําไสและออกมากับอุจจาระ ดังน้ันในการตรวจคุณภาพของอาหาร นํ้าและเครื่องด่ืม จึงใช E. .coli เปนตัวกําหนดมาตรฐาน (บุณทา วรินทรรักษ, 2524) 15. ไวรัสตัวแดงดวงขาว (White spot syndrome virus, WSSV) โรคตัวแดงดวงขาว (WSSV) ในกุงพบการระบาดในประเทศจีนและญี่ปุนตั้งแตป พ.ศ. 2536 ในประเทศไทยพบการระบาดตอนปลาย พ.ศ. 2537 บริเวณที่รุนแรงคือ ภาคตะวันออกแถบ จ.จันทบุรี จ.ตราด และภาคใตฝงตะวันออก จ.นครศรีธรรมราช จ.ปตตานี ฝงตะวันตก จ.ตรัง (Wongteerasupaya et al., 1995) เปนโรคที่กอใหเกิดความเสียหายอยางมากในกุงสกุลพีเนียส (Penaeus) ซ่ึงเปนกุงที่สําคัญทางเศรษฐกิจ และสามารถแพรกระจายไดในบริเวณกวาง ลักษณะอาการภายนอกของกุงที่ติดโรค คือผิวใตเปลือกตลอดทั้งลําตัวซีดในชวงแรก ๆ แลวเปลี่ยนเปนสีชมพูหรือแดงเร่ือ ๆ จนถึงแดงเขม บางครั้งจะพบออกเปนสีสมและพบจุดขาวเสนผาศูนยกลาง 0.1-2 มิลลิเมตร ที่ใตเปลือกบริเวณสวนหัวและลําตัว กุงที่เปนโรคจะวายอยูบริเวณผิวน้ํา หรือเกยขอบบอไมมีแรงดีดตัว กินอาหารลดลง บางครั้งพบกุงมีอาการลอกคราบไมออก หรือลอกคราบแลวไมแข็งตัว ตัวน่ิม และทยอยตายเพิ่มขึ้นเรื่อย ๆ อาจตายมากถึง 100% ภายใน 3-10 วัน หลังจากการตรวจพบการติดเชื้อ รายงานโรคชนิดนี้ครั้งแรก

32

พบในกุงลายเสือที่เลี้ยงในประเทศญี่ปุน โดยพบวาเกิดขึ้นในฟารมที่นําลูกกุงมาจากประเทศจีน (Nakano et al., 1994; Takahashi et al., 1994) หลังจากนั้นก็มีรายงานการระบาดของโรคดังกลาวอีกหลายภูมิภาคโดยมีชื่อเรียกที่แตกตางกันออกไป นอกจากในกุงที่กลาวมายังพบการระบาดในกุง greasy back (Metapeneaus ensis) และในครัสเตเชียนหลายชนิด ทั้งในธรรมชาติ บอเลี้ยงและหองปฏิบัติการ แตระดับความรุนแรงอาจไมสูงมาก (Momoyama et al., 1997) และนอกจากประเทศในแถบเอเชียแลว การระบาดของโรคดังกลาวยังพบไดในบางประเทศของทวีปอเมริกาใต เชน ปานามา เอควาดอร ชิลี และในทวีปอเมริกาเหนือ (Pantoja and Lightner, 2003) จากการศึกษาวิจัยทางชีวโมเลกุลและเนื้อเยื่อวิทยาพบวาเชื้อ WSSV เปนไวรัสชนิดดีเอ็นเอ (DNA virus) ที่จัดอยูในกลุม Baculovirus รูปรางของเชื้อเปนแทง โดยมีความยาว 270-300 นาโนเมตร เสนผาศูนยกลางของเชื้อประมาณ 110-125 นาโนเมตร โดยมีสวน ประกอบที่สําคัญคือ กรดนิวคลีอิค (nucleic acid) และโปรตีน อวัยวะเปาหมายของเชื้อน้ีคือเน้ือเยื่อใตเปลือก เน้ือเยื่อเกี่ยวพัน เน้ือเยื่อบุผิวเหงือก กระเพาะอาหาร ตอมนํ้าเหลือง แองเลือด และหัวใจ (Takahashi et al., 1994)

33

วัตถุประสงค 1. เพ่ือหาภาวะที่เหมาะสมในการวัดแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัม ของกุงแชบวย 2. เพ่ือทําใหเอนไซมฟนอลออกซิเดสบริสุทธิ์จากซีรัมของกุงแชบวย 3. เพ่ือศึกษาสมบัติของเอนไซมฟนอลออกซิเดสที่ทําบริสุทธิ์บางสวน

4. เพ่ือศึกษาผลของการฉีดจุลินทรียที่มีตอระดับของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมของกุงแชบวย

2. วัสดุ อุปกรณและวิธีการ

วัสดุ 1. กุงตัวอยาง

กุงที่ใชในการศึกษาคือ กุงแชบวยที่มีขนาดลําตัวยาว 10-14 เซนติเมตร นํ้าหนักประมาณ 30 - 40 กรัม และอยูในระยะคราบแข็ง (ไมอยูในระยะลอกคราบ) จับจากทะเลอันดามัน แลวเลี้ยงในถังพลาสติกขนาด 500 ลิตร โดยใหอาหารเม็ดทุก 8 ชั่วโมง ที่ศูนยวิจัยสุขภาพสัตวนํ้า มหาวิทยาลัยสงขลานครินทร 2. สารเคมี สารเคมีที่ใชในการทดลองเปนชนิด analytical grade สั่งซ้ือจากบริษัทตาง ๆ ดังน้ี สารเคมีที่ใช บริษัทผูผลิต Acetic acid Merck Acrylamide Fluka Agar BD-Biosciences Ammonium persulphate Merck Ammonium sulphate Fluka Bisacrylamide (N, N′-methylene diacrylamide) Fluka Blue dextran Sigma Bovine serum albumin Sigma Bromophenol blue Merck Carboxymethyl-cellulose Sigma Calcium chloride APS Ajax Finechem. Calcium hypochlorite Carlo Erba Catechol Sigma Coomassie brilliant blue R-250 Sigma Coomassie plus protein assay reagent kit Pierce

34

35

สารเคมีที่ใช บริษัทผูผลิต 3,4-Dihydroxyphenyl-L-alanine Sigma Dopamine Sigma Ethanol BDH Ethylenediaminetetraacetic acid Fluka Glacial acetic acid Merck Glycerol Sigma Glycine Fluka Hydrochloric acid Merck Magnesium chloride Ajax Chemicals β-Mercaptoethanol Fluka Methanol Merck Ortho-phosphoric acid Merck Plate count agar Difco Laboratories Sephadex G-200 Pharmacia Silver staining kit Bio-Rad Sodium acetate Carlo Erba Sodium cacodylate Sigma Sodium carbonate Carlo Erba Sodium chloride Fluka Sodium dodecyl sulphate Riedel-de Haen Sodium hydroxide Fluka Superdex 200 Pharmacia N, N, N′, N′-Tetramethylethylenediamine Sigma Thiosulphate citrate bile salt sucrose agar HiMedia Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma Trypsin Merck Tryptic soy agar BD-Biosciences Tryptic soy broth BD-Biosciences

36

3. อุปกรณ อุปกรณที่ใช รุน บริษัทผูผลิต เครื่องชั่ง 3 ตําแหนง GT410 Ohaus เครื่องชั่ง 4 ตําแหนง AB204-5 Mettler Autoclave - Hirayama Centrifuge 5415C, 5804R Eppendorf Centrifuge Avanti J-30I Beckman Coulter Hot plate - EGD Incubator 1510E Shel lab Micropipette - Eppendrof, Gilson Microtube pump MP-3 MP-3N Eyela Orbital shaker OS 20 Boeco pH meter Accumet 15 Fisher Scientific Power supply 1000/500 Bio-Rad Slab gel electrophoresis apparatus AE-6400 Atto UV-VIS spectrophotometer 160A Shimadzu Vortex G-560E Scientific Industries Water bath WB-170M Optima

วิธีการ 1. การเตรียมตัวอยางจากกุงแชบวย

1.1 การเตรียมซีรัมจากฮีโมลิมฟ ดูดฮีโมลิมฟจากกุงแชบวยทันทีหลังจับขึ้นมาดวยกระบอกฉีดยาขนาด 1 มิลลิลิตร และเข็มขนาด 24G ความยาว 1 น้ิว จากบริเวณ pericadium หรือขาเดินคูที่ 3 เก็บ ฮีโมลิมฟที่อุณหภูมิ 4°ซ นาน 24 ชั่วโมง เพ่ือใหฮีโมลิมฟแข็งตัว นําไปเซนตริฟวจ (centrifuge) ที่ความเร็ว 12,000 รอบตอนาที ที่อุณหภูมิ 4°ซ นาน 20 นาที เก็บสวนใสหรือซีรัมไวที่ -20°ซ เพ่ือใชศึกษาตอไป 1.2 การเตรียมสารสกัดจากเน้ือเยื่อของกุง

ตัดเนื้อเยื่อจากกุง ลางดวยน้ํากลั่น จากนั้นชั่ง นํ้าหนักแลวนําใสหลอด homogenizer เติม 50 mM Tris-HCI, pH 7.5 ที่มี 0.85% NaCI (TBS) โดยใชอัตราสวนเน้ือเยื่อ 1 กรัม : TBS 2 มิลลิลิตร หลังจากนั้นทําการโฮโมจีไนซ (homogenize) ดูดใสหลอด

37

eppendorf ขนาด 2 มิลลิลิตร และนําไปเซนตริฟวจที่ความเร็ว 13,000 รอบตอนาที ที่อุณหภูมิ 4°ซ เปนเวลา 1 ชั่วโมง แยกตะกอนและไขมันทิ้งไป นําสวนใสซึ่งเปนสารสกัดเนื้อเยื่อแบงใสหลอด หลอดละ 200 ไมโครลิตร เก็บไวที่ -20°ซ เพ่ือใชวัดแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออก ซิเดสตอไป 2. การหาปริมาณโปรตีน หาปริมาณโปรตีนของสารตัวอยางดวยชุดหาโปรตีน (Coomassie plus protein assay reagent kit) จากบริษัท Pierce ซ่ึงดัดแปลงตามวิธีของ Bradford (1976) ดังน้ี ดูดสารตัวอยางในปริมาณที่เหมาะสม แลวปรับปริมาตรดวยน้ํากลั่นจนครบ 50 ไมโครลิตร เติมสารละลายชุดหาโปรตีน 1 มิลลิลิตร โดยทําควบคูไปกับ BSA (bovine serum albumin) จากบริษัท Pierce ซ่ึงใชเปนโปรตีนมาตรฐาน โดยเจือจาง BSA ใหมีปริมาณโปรตีน 2-10 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร เขยาใหเขากัน นําไปวัดคาการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 595 นาโนเมตร (A595) ดวยเครื่อง UV-VIS spectrophotometer 3. การหาภาวะที่เหมาะสมในการวัดแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดส วัดแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดส โดยหาภาวะที่เหมาะสมของการวัดแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในสารผสมปฏิกิริยาปริมาตรรวม 320 ไมโครลิตร โดยใช L-DOPA (3,4-dihydroxyphenyl-L-alanine) เปนสับสเตรท ใน CAC buffer (10 mM cacodylate ที่มี 20 mM CaCl2 และ 50 mM MgCl2) ที่มี pH ที่เหมาะสม และมี 2 mg/ml trypsin และปริมาณเอนไซมฟนอลออกซิเดสที่เหมาะสมตอการเกิดปฏิกิริยา จากนั้นเติม CAC buffer, pH 8 ใหมีปริมาตรครบ 800 ไมโครลิตร แลววัดคาการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 490 นาโนเมตร (A490) ทุกนาที นานประมาณ 5 นาที 3.1 การหาปริมาณเอนไซมที่เหมาะสมในการวัดแอคทิวิท ี หาปริมาณเอนไซมในซีรัมที่เหมาะสม โดยนําซีรัมปริมาตรตาง ๆ กัน ปรับปริมาตรแตละหลอดดวยน้ํากลั่นใหมีปริมาตรเปน 120 ไมโครลิตร นําไปทําปฏิกิริยากับ 2 mg/ml trypsin ปริมาตร 80 ไมโครลิตร และ 3 mg/ml L-DOPA ปริมาตร 120 ไมโครลิตร ในสารผสมปฏิกิริยาที่มี CAC buffer, pH 8 ปริมาตรรวม 320 ไมโครลิตร บมปฏิกิริยาที่อุณหภูมิหอง พรอมกับเขยา เปนเวลา 5 นาที แลวเติม CAC buffer, pH 8 ใหมีปริมาตรครบ 800 ไมโครลิตร จากนั้นวัดคา A490 ทุกนาที นานประมาณ 5 นาที 3.2 การศึกษา pH ที่เหมาะสมในการเกิดปฏิกิริยา นําสารละลายเอนไซมในปริมาณที่เหมาะสม (จากขอ 3.1) ซ่ึงปรับใหมีปริมาตรรวมเปน 40 ไมโครลิตร ดวยน้ํากลั่น ไปทําปฏิกิริยากับ 2 mg/ml trypsin 80 ไมโครลิตร และ

38

3 mg/ml L-DOPA ปริมาตร 120 ไมโครลิตร ใน 40 mM CAC buffer (ที่มี 80 mM CaCl2 และ 200 mM MgCl2) pH ตาง ๆ กันในชวง pH 4-11 ปริมาตร pH ละ 80 ไมโครลิตร บมปฏิกิริยาที่อุณหภูมิหอง เปนเวลา 5 นาที แลวเติม 10 mM CAC buffer, pH เดียวกัน ที่มี 20 mM CaCl2 และ 50 mM MgCl2 ใหมีปริมาตรครบ 800 ไมโครลิตร จากนั้นวัดคา A490 ทุกนาที 3.3 การหาปริมาณสับสเตรทที่เหมาะสมในการเกิดปฏิกิริยา นําสารละลายเอนไซมในปริมาณที่เหมาะสมไปทําปฏิกิริยากับ 2 mg/ml trypsin 80 ไมโครลิตร และ 3 mg/ml L-DOPA ปริมาตรตาง ๆ ตั้งแต 0-180 ไมโครลิตร ปรับดวยน้ํากลั่น ใหมีปริมาตรครบ 320 ไมโครลิตร ใน CAC buffer, pH ที่เหมาะสม (จากขอ3.2) บมปฏิกิริยาที่อุณหภูมิหอง พรอมกับเขยา เปนเวลา 5 นาที แลวเติม CAC buffer, pH 8 ใหมีปริมาตรครบ 800 ไมโครลิตร จากนั้นวัดคา A490 ทุกนาที นานประมาณ 5 นาที 3.4 การหาปริมาณเอนไซมทริปซินที่เหมาะสมในการกระตุนปฏิกิริยา นําสารละลายเอนไซมในปริมาณที่เหมาะสมไปทําปฏิกิริยากับ 2 mg/ml trypsin ปริมาตรตาง ๆ ตั้งแต 0-140 ไมโครลิตรและ 3 mg/ml L-DOPA ปริมาตร 120 ไมโครลิตร ปรับดวยน้ํากลั่น ใหมีปริมาตรครบ 320 ไมโครลิตร ใน CAC buffer, pH ที่เหมาะสม บมปฏิกิริยาที่อุณหภูมิหอง พรอมกับเขยา เปนเวลา 5 นาที แลวเติม CAC buffer, pH 8 ใหมีปริมาตรครบ 800 ไมโครลิตร จากนั้นวัดคา A490 ทุกนาที 3.5 การหาปริมาณ SDS ที่เหมาะสมในการกระตุนปฏิกิริยา นําสารละลายเอนไซมในปริมาณที่เหมาะสมไปทําปฏิกิริยากับ 2% SDS ปริมาตรตาง ๆ ตั้งแต 0-140 ไมโครลิตรและ 3 mg/ml L-DOPA ปริมาตร 120 ไมโครลิตร ปรับดวยน้ํากลั่น ใหมีปริมาตรครบ 320 ไมโครลิตร ใน CAC buffer, pH ที่เหมาะสม บมปฏิกิริยาที่อุณหภูมิหอง พรอมกับเขยา เปนเวลา 5 นาที แลวเติม CAC buffer, pH 8 ใหมีปริมาตรครบ 800 ไมโครลิตร จากนั้นวัดคา A490 ทุกนาที 3.6 การศึกษาอุณหภูมิที่เหมาะสมตอการเกิดปฏิกิริยา ทําการวัดแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดส ในสารผสมปฏิกิ ริยาที่ประกอบดวยสารละลายเอนไซมในปริมาณที่เหมาะสม 0.2% SDS ปริมาตร 80 ไมโครลิตร และ 3 mg/ml L-DOPA ปริมาตร 120 ไมโครลิตร ปรับดวยน้ํากลั่น ใหมีปริมาตรครบ 320 ไมโครลิตร บมปฏิกิริยาที่อุณหภูมิ 25, 30, 40, 50 และ 60°ซ นาน 1-5 นาที แลวเติม CAC buffer, pH 8 ใหมีปริมาตรครบ 800 ไมโครลิตร จากนั้นวัดคา A490 4. การหาแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดส วัดแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดส ตามภาวะที่เหมาะสมจากขอ 3 โดยใชซีรัมปริมาตรไมเกิน 20-60 ไมโครลิตร แลวปรับปริมาตรแตละหลอดใหเทากันดวยน้ํากลั่นให

39

มีปริมาตรเปน 120 ไมโครลิตร นําไปทําปฏิกิริยากับ 2 mg/ml trypsin ปริมาตร 80 ไมโครลิตร หรือ 0.2% SDS ปริมาตร 80 ไมโครลิตร และ 3 mg/ml L-DOPA ปริมาตร 120 ไมโครลิตร ใหมีปริมาตรครบ 320 ไมโครลิตร ใน 10 mM CAC buffer, pH 8 (ที่มี 20 mM CaCl2 และ 50 mM MgCl2) บมปฏิกิริยาที่อุณหภูมิหอง พรอมกับเขยา เปนเวลา 5 นาที แลวเติม CAC buffer, pH 8 ชนิดเดิม ใหมีปริมาตรครบ 800 ไมโครลิตร จากนั้นวัดคา A490 ทุกนาที นานประมาณ 5 นาที กําหนดใหแอคทิวิทีของเอนไซม 1 หนวย (unit) มีคาเทากับจํานวน A490 ที่เปลี่ยนไป 0.001 หนวย ในเวลา 1 นาที 5. การศึกษาความสเถียรตออุณหภูมิของเอนไซมฟนอลออกซิเดส ศึกษาความสเถียรตออุณหภูมิของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัม โดยนําซีรัมไปบมที่อุณหภูมิ 0, 25, 30, 40, 50, 60, 70 และ 80°ซ นาน 30 นาที จากนั้นนําไปแชในน้ําแข็ง แลววัดแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดส ตามวิธีการในขอ 4 เปรียบเทียบแอคทิวิทีกับของเอนไซมที่บมที่ 0°ซ 6. การทําโพลีอะคริลาไมดเจลอิเล็กโทรฟอรีซิสแบบไมแปลงสภาพ (Nondenaturing

polyacrylamide gel electrophoresis, Nondenaturing PAGE) โพลีอะคริลาไมดเจลที่ใชในการศึกษาเปนเจลแผน (slab gel) ขนาด 10 x 12 เซนติเมตร หนา 1 มิลลิเมตร ประกอบดวยเจล 2 สวน คือเจลสวนบน (stacking gel) มีความสูงประมาณ 3 เซนติเมตร และเจลสวนลาง (separating gel) มีความสูง 7 เซนติเมตร เตรียม โพลีอะคริลาไมดเจล 6-12% ตามวิธขีอง Davis (1964) ซ่ึงมีสวนประกอบของเจลเปนดังน้ี

Separating gel Composition Stacking gel 3% (5 ml) 6% (3 ml) 12% (3 ml)

30% Acrylamide-0.8% bisacrylamide 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 10% Ammonium persulphate TEMED Distilled water

0.50 ml 0.63 ml

- 50 µl 5 µl

3.82 ml

0.60 ml -

1.50 ml 30 µl 3 µl

0.87 ml

1.20 ml -

1.50 ml 30 µl 3 µl

0.27 ml

40

6.1 การเตรียมสารตัวอยางและโปรตีนมาตรฐาน เตรียมสารตัวอยางและโปรตีนมาตรฐาน โดยผสมสารตัวอยาง 3 สวน กับบัฟเฟอรตัวอยาง (sample buffer) 1 สวน ซ่ึงประกอบดวย 0.2 M Tris-HCl, pH 6.8, 8 mM EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), 40% กลีเซอรอล (glycerol) และ 0.4% โบรโมฟนอลบลู (bromophenol blue) เตรียมโปรตีนมาตรฐานเหมือนกับการเตรียมสารตัวอยาง 6.2 การทําอิเล็กโทรฟอรีซิส นําสารละลายตัวอยางและสารละลายโปรตีนมาตรฐานใสในแตละชองเจลสวน บน ทําอิเล็กโทรฟอรีซิสในบัฟเฟอร 0.025 M Tris-0.192 M glycine, pH 8.3 เปดกระแสไฟฟาคงที่ ที่ 15 mA นาน 2 ชั่วโมง จนกระทั่งสีของโบรโมฟนอลบลูเคลื่อนที่ไปจนสุดขอบลาง ปดกระแสไฟฟา แลวนําเจลไปยอมสี 6.3 การยอมสีโปรตีนดวยสีคูมาซีบล ู การยอมสีโปรตีนในเจลดวยสีคูมาซีบลู (Coomassie brilliant blue R-250) หลังการทําอิเล็กโทรฟอรีซิส โดยแชเจลในสารละลาย 0.08% คูมาซีบลู - 50% เมธานอล (methanol) - 7.5% กรดน้ําสม (acetic acid) นาน 5 ชั่วโมง แลวนําเจลไปลางสีที่ไมตองการออกดวยสารละลาย 18% เมธานอล - 7.5% กรดน้ําสม จนเห็นแถบโปรตีนสีนํ้าเงินชัดเจน 6.4 การยอมสีโปรตีนแบบซิลเวอร (Silver staining) หลังการทําอิเล็กโทรฟอรีซิส นําเจลไปตรึงโปรตีนดวย 40% เมธานอล - 10% กรดน้ําสม นาน 30 นาที หลังจากนั้นแชเจลในสารละลาย 10% เอธานอล (ethanol) - 5% กรดนํ้าสม นาน 15 นาที 2 ครั้ง จากนั้นใชชุดยอมซิลเวอร (silver staining kit) ของบริษัท Bio-Rad โดยเติมสารละลายออกซิไดเซอร (oxidizer solution) เขยานาน 10 นาที ลางเจลดวยน้ําปราศจากไอออน (deionized water) ครั้งละ 5 นาที จนกระทั่งสีเหลืองในเจลหมดไป จากนั้นแชเจลในน้ํายาซิลเวอร (silver reagent) นาน 20 นาที ลางดวยน้ําปราศจากไอออน นาน 1 นาที จากนั้นเติมสารละลายดีวีโลเปอร (developer) เขยาและเปลี่ยนสารละลายเมื่อสีของสารละลายเปลี่ยนเปนสีเทาดําและเมื่อปรากฏแถบของโปรตีน หยุดปฏิกิริยาดวย 5% กรดน้ําสม 6.5 การยอมแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสใน Nondenaturing PAGE หลังการทําอิเล็กโทรฟอรีซิส นําเจลไปแชใน 0.1 M phosphate buffer, pH 6.5 ปริมาตร 10 มิลลิลิตร เติม 10% SDS ปริมาตร 400 ไมโครลิตร บมปฏิกิริยาที่อุณหภูมิหองนาน 30 นาที จากนั้นเติม 10 mM L-DOPA ปริมาตร 1.2 มิลลิลิตร บมปฏิกิริยาตอนาน 60 นาที เม่ือเห็นแถบโปรตีนของเอนไซมชัดเจน นําเจลไปลางและแชในน้ํากลั่น

41

7. การทําใหเอนไซมฟนอลออกซิเดสบริสุทธ์ิจากซีรัมของกุงแชบวย 7.1 โดยคอลัมน Sephadex G-200 ลางและปรับคอลัมน Sephadex G-200 (1.6 × 84 เซนติเมตร) ซ่ึงมีปริมาตร เรซิน 35 มิลลิลิตร ใหสมดุลดวย 50 mM Tris-HCl, pH 8.0 (TB) ปริมาตร 150 มิลลิลิตร นําซีรัมปริมาตร 8 มิลลิลิตร (โปรตีน 735.52 มิลลิกรัม) ไปแยกดวยคอลัมน Sephadex G-200 ปรับใหมีอัตราการไหล 8 มิลลิลิตรตอชั่วโมง เก็บสารละลายหลอดละ 0.5 มิลลิลิตร นําสารละลายที่ไดแตละหลอดไปวัดคาการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 280 นาโนเมตร (A280) หาปริมาณโปรตีนดวยชุดหาโปรตีน (Coomassie plus protein assay reagent kit) จากบริษัท Pierce ซ่ึงดัดแปลงตามวิธีของ Bradford (1976) และหาแอคทิวิทีของเอนไซม รวมสารละลายหลอดที่มีแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสสูงเขาดวยกัน จากนั้นทําใหเขมขนในถุง ไดแอไลซ (dialysis bag) ดวย CM-cellulose จนสารละลายในถุงไดแอไลซเหลือเพียงเล็กนอย แลวนําไปหาแอคทิวิที หาปริมาณโปรตีนและทดสอบความบริสุทธิ์โดยวิธี nondenaturing PAGE และนําสารละลายที่ไดไปแยกตอดวยการทํา preparative PAGE 7.2 โดย Preparative PAGE preparative PAGE เปน nondenaturing PAGE แตมีการเตรียมเจลใหมีขนาด 10 x 12 เซนติเมตร หนา 1 มิลลิเมตร มีความเขมขนของโพลีอะคริลาไมดเจลสวนบน 3% และเจลสวนลาง 4-10% เจลสวนบนเตรียมใหมีชองใสสารตัวอยาง 12 ชอง จากนั้นผสมสารละลายเอนไซมที่แยกไดจากคอลัมน Sephadex G-200 กับบัฟเฟอรตัวอยาง นําสารละลายที่ไดเติมลงในชองใสสารตัวอยางทุกชอง แลวเปดกระแสไฟฟาคงที่ ที่ 15 mA นาน 2 ชั่วโมง จนกระทั่งสีโบรโมฟนอลบลูเคลื่อนที่ไปจนสุดขอบลางของเจล ปดกระแสไฟ จากนั้นตัดเจลตรงกลาง เปนแถบกวาง 0.5 เซนติเมตร และตัดเจลดานซายกับขวาเปนแถบกวาง 1 เซนติเมตร ยาวตลอดแผนเจล นําชิ้นเจลที่ตัดไดไปยอมดวยสารละลาย Bradford (0.01% Coomassie brilliant blue G-250 - 4.7% ethanol - 8.5% phosphoric acid) นาน 5-10 นาที เม่ือปรากฏแถบโปรตีนนําไปเทียบกับเจลสวนที่ไมยอมสี แลวตัดเจลที่ไมไดยอมตามขวางเฉพาะตรงตําแหนงของแถบเอนไซมฟนอลออกซิเดส จากนั้นทําการชะเอนไซมฟนอลออกซิเดสออกจากชิ้นเจล โดยนําชิ้นเจลที่ตองการใสในถุงไดแอไลซ แลวนําไปวางตามขวางในเครื่องอิเล็กโทรฟอรีซิสตามแนวนอน ซ่ึงมีบัฟเฟอร 0.025 M Tris-0.192 M glycine, pH 8.3 ทวมทุกถุงแบบใตนํ้า (submarine) เปดกระแสไฟฟาคงที่ที่ 15 mA เม่ือครบ 8 ชั่วโมง นําสารละลายที่ไดไปไดแอไลซ (dialyze) ในบัฟเฟอร 50 mM Tris-HCl, pH 8.0 ทําใหเขมขนดวย CM-cellulose หาปริมาณโปรตีน หาแอคทิวิทีและทดสอบความบริสุทธิ์ของเอนไซมฟนอลออกซิเดส โดยวิธี nondenaturing PAGE

42

ในกรณีที่เอนไซมฟนอลออกซิเดสยังไมบริสุทธิ์ นําสารละลายเอนไซมที่ไดจากการทํา preparative PAGE ครั้งที่ 1 ไปทํา preparative PAGE ครั้งที่ 2 อีกครั้ง โดยทําตอในทํานองเดียวกัน 8. การศึกษาสมบัติของเอนไซมฟนอลออกซิเดสที่ทําบริสุทธ์ิบางสวน เน่ืองจากงานวิทยานิพนธน้ีไดทําใหเอนไซมฟนอลออกซิเดสบริสุทธิ์ไดบางสวนจากซีรัม ดังน้ันจึงขอกลาวถึงเอนไซมฟนอลออกซิเดสที่ทําบริสุทธิ์บางสวนวา partial purified phenoloxidase หรือเอนไซม ppPO 8.1 การหา pH ที่เหมาะสมตอการเรงปฏิกิริยาของเอนไซม ทําการวัดแอคทิวทิีของเอนไซม ppPO ในสารผสมปฏิกิริยาทีป่ระกอบดวยสารละลายเอนไซม 40 ไมโครลิตร 0.2% SDS ปริมาตร 80 ไมโครลิตร และ 3 mg/ml L-DOPA ปริมาตร 120 ไมโครลิตร ใน 40 mM CAC buffer (ที่มี 80 mM CaCl2 และ 200 mM MgCl2), pH ตาง ๆ กันในชวง pH 4-11 ปริมาตร 80 ไมโครลติร บมที่อุณหภูมิที่เหมาะสม เปนเวลา 5 นาที แลวเติม 10 mM CAC buffer, pH เดียวกัน (ที่มี 20 mM CaCl2 และ 50 mM MgCl2) ใหมีปริมาตรครบ 800 ไมโครลิตร จากนั้นวัดคา A490 ทุกนาที นานประมาณ 5 นาที 8.2 การศึกษาความเสถียรตออุณหภูมิของเอนไซม บมสารละลายเอนไซม ppPO ปริมาตร 40 ไมโครลิตร ที่อุณหภูมิ 0 - 80°ซ นาน 30 นาที แลวทําใหเย็นโดยแชบนน้ําแข็ง จากนั้นวัดแอคทิวทิีของเอนไซม ppPO ในสารผสมปฏิกิริยาที่ประกอบดวย 0.2% SDS ปริมาตร 80 ไมโครลิตร 3 mg/ml L-DOPA ปริมาตร 120 ไมโครลติร และ 40 mM CAC buffer, pH 8 (ที่มี 80 mM CaCl2 และ 200 mM MgCl2)ปริมาตร 80 ไมโครลิตร จากนั้นเติม CAC buffer, pH 8 ใหมีปริมาตรครบ 800 ไมโครลิตร แลววัดคา A490 และเปรียบเทียบกับเอนไซมซ่ึงแชบนน้ําแข็ง 8.3 การศึกษาจลนศาสตรของเอนไซม ศึกษาจลนศาสตรของเอนไซมฟนอลออกซิเดสตอสับสเตรท โดยทําการวัดแอคทิวิทีของเอนไซม ppPo ในสารผสมปฏิกิริยาที่ประกอบดวยสารละลายเอนไซมปริมาตร 40 ไมโครลิตร 0.2% SDS ปริมาตร 80 ไมโครลิตร และ 80 mM CAC buffer, pH 8 (ที่มี 160 mM CaCl2 และ 400 mM MgCl2) ปริมาตร 40 ไมโครลิตร โดยใช L-DOPA เปนสับสเตรท ความเขมขนตาง ๆ กันในชวง 0-20 mM ปริมาตร 160 ไมโครลิตร บมที่อุณหภูมิหอง นาน 5 นาที จากนั้นเติม CAC buffer, pH 8 ใหมีปริมาตรครบ 800 ไมโครลิตร แลววัดคา A490 และคํานวณหาคา KM และ Vmax จากการเขียนกราฟแบบ Lineweaver-Burk ระหวางคา 1/V และ1/[S]

43

8.4 การศึกษาความจําเพาะตอสับสเตรทของเอนไซม ศึกษาความจําเพาะของเอนไซมฟนอลออกซิเดสตอสับสเตรท โดยทําการวัดแอคทิวิทีของเอนไซม ppPo ในสารผสมปฏิกิริยาที่ประกอบดวยสารละลายเอนไซมปริมาตร 40 ไมโครลิตร 0.2% SDS ปริมาตร 80 ไมโครลิตร และ 80 mM CAC buffer, pH 8 (ที่มี 160 mM CaCl2 และ 400 mM MgCl2) ปริมาตร 40 ไมโครลิตร โดยใช L-DOPA, dopamine หรือ catechol เปนสับสเตรท ที่ความเขมขน 3.5 และ 10 mM ปริมาตรอยางละ 160 ไมโครลิตร บมที่อุณหภูมิหอง นาน 1-5 นาที จากนั้นเติม CAC buffer, pH 8 ใหมีปริมาตรครบ 800 ไมโครลิตร แลววัดคา A490

9. การเตรียมจุลินทรีย เพ่ือศึกษาผลของการฉีดกุงแชบวยดวยแบคทีเรียและไวรัสที่มีตอระดับแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดส จุลินทรียที่ใชศึกษาไดแกแบคทีเรียกอโรคกุง V. harveyi แบบ active และ inactive แบคทีเรียที่ไมกอโรคกุง E. coli และ V. cholerae และไวรัสที่กอใหเกิดโรคตัวแดงดวงขาว (WSSV) โดยทําการฉีดจุลินทรียเหลานี้ในกุงแชบวยที่คัดขนาดเทาๆ กัน ดวยปริมาณเซลลจุลินทรียเทากัน โดยศึกษาปริมาณเชื้อ V. harveyi ที่เหมาะสมที่มีผลทําใหระดับของเลคตินในฮีโมลิมฟเปลี่ยนแปลงอยางมีนัยสําคัญ (ปนนภา ลิ่มพานิช, 2550) เพ่ือเปนตัวกําหนดปริมาณเชื้อแบคทีเรียชนิดอ่ืน ๆ ที่ จะใชในการศึกษาครั้งน้ี แบคทีเรียที่ใชในการศึกษาไดเลี้ยงบนอาหารแข็ง Tryptic soy agar (TSA) ซ่ึงมีการเตรียมดังน้ี 9.1 การเตรียม V. harveyi แบคทีเรียกอโรคที่ใชในการทดลองคือ V. harveyi ซ่ึงไดรับความอนุเคราะหจากศูนยวิจัยสุขภาพสัตวนํ้า มหาวิทยาลัยสงขลานครินทร โดยเลี้ยงแบคทีเรียบนอาหารแข็ง TSA ที่มี 1.5% NaCl ที่อุณหภูมิ 37°ซ เปนเวลา 15 ชั่วโมง เพ่ิมปริมาณเชื้อโดยเลี้ยงในอาหารชนิดเดิม โดยนําเชื้อที่เลี้ยงไว 1 โคโลนี (single colony) เกลี่ยดวยไมพันสําลีลงบนอาหารจนทั่วเพลท บมที่อุณหภูมิ 37°ซ เปนเวลา 15 ชั่วโมง ชะเชื้อออกจากเพลทโดยเขี่ยดวยไมพันสําลี ลางเซลลแบคทีเรียในน้ําเกลือ (0.85% NaCl) นําไปเซนตริฟวจที่ความเร็ว 3,000 รอบตอนาที นาน 30 นาที ที่อุณหภูมิ 4°ซ ลางตะกอนสามครั้ง และเตรียมแบคทีเรียในนํ้าเกลือใหมีคาการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 640 นาโนเมตร อยูในชวง 1.6-2.0 หนวย นับจํานวนโคโลนี ใหอยูในชวงปริมาณเชื้อที่ตองการ โดยเจือจางเชื้อในน้ําเกลือดวยอัตราสวน 1:10 ตามลําดับ ดูดสารแขวนลอยที่ไดอยางละ 100 ไมโครลิตร แลวนําไปเกลี่ย (spread) บนจานอาหารที่มี plate count agar (PCA) บมที่อุณหภูมิ 37 °ซ เปนเวลา 15 ชั่วโมง จากนั้นนับจํานวนเชื้อ จากจาน

44

อาหารที่มีจํานวนโคโลนี 30-300 โคโลนี หลังจากทราบจํานวนโคโลนีที่แนนอนแลว สามารถคํานวณหาปริมาณเชื้อที่ตองการฉีดเขาตัวกุงได ทําให V. harveyi inactive โดยนําสารแขวนลอย V. harveyi แบบ active ที่มีปริมาณเชื้อ 5x1010 เซลล/มิลลิลิตร ไปเซนตริฟวจที่ความเร็ว 10,000 รอบตอนาที นาน 10 นาที ที่อุณหภูมิ 4°ซ แลวแขวนลอยตะกอนแบคทีเรียใน TBS ที่มี 0.1% thimerosal บมที่อุณหภูมิ 37°ซ คางคืน และลางตะกอนแบคทีเรียในน้ําเกลือ แลวละลายกลับใหมีปริมาตรเทากับเริ่มตน หลังเตรียมเชื้อสามารถเก็บเชื้อไวใชไดภายในเวลา 3 วัน แตในการทดลองครั้งน้ีนําเชื้อที่เตรียมไดฉีดเขาตัวกุงทันที 9.2 การเตรียม V. cholerae แบคทีเรีย V. cholerae ที่ใชในการทดลอง ไดรับความอนุเคราะหจากภาควิชาจุลชีววิทยา โดยเลี้ยงแบคทีเรียบนอาหารแข็ง TSA ที่มี 1.5% NaCl ที่อุณหภูมิ 37°ซ นาน 15 ชั่วโมง แลวทําตอเชนเดียวกับ V. harveyi ที่ active

9.3 การเตรียม E. coli แบคทีเรีย E. coli ที่ใชในการทดลองไดรับความอนุเคราะหจากภาควิชา จุลชีววิทยา โดยเลี้ยงแบคทีเรียบนอาหารแข็ง TSA ที่มี 1.5% NaCl ที่อุณหภูมิ 37°ซ นาน 15 ชั่วโมง แลวทําตอเชนเดียวกับ V. harveyi ที่ active 9.4 การเตรียมไวรัส WSSV WSSV ที่นํามาทดลองไดรับความอนุเคราะหจากศูนยวิจัยสุขภาพสัตวนํ้า มหาวิทยาลัยสงขลานครินทร ซ่ึงมีวิธีการเตรียมหัวเชื้อ WSSV โดยดัดแปลงจาก กิจการ ศุภมาตย และคณะ (2542) คือ ตัดเนื้อเยื่อตับของกุงกุลาดําที่ติดเชื้อ WSSV มาบดใหละเอียดใน TBS ในอัตราสวน 1: 2 (นํ้าหนักเนื้อเยื่อ: ปริมาตร TBS) แลวเซนตริฟวจที่ความเร็ว 12,000 รอบตอนาที นาน 30 นาที ที่อุณหภูมิ 4°ซ เก็บสารละลายสวนใสกรองผานกระดาษกรอง (0.45 ไมครอน) เพ่ือกําจัดแบคทีเรียและสิ่งแปลกปลอมอ่ืน ๆ ที่ปนเปอนออกไป แลวเก็บ WSSV ไวที่ -70°ซ จนกวาจะนํามาใช WSSV ที่ใชฉีดกุงเตรียมโดยเจือจางเชื้อ WSSV จากที่กลาวขางตนใหมีความเขมขน 1x10-5 เทาของหัวเชื้อใน TBS เพ่ือใชฉีดกุงตอไป

45

10. การหาปริมาณ V. harveyi และเวลาที่มีผลทําใหระดับแอคทิวิทีของเอนไซม ฟนอลออกซิเดสในซีรัมเปลี่ยนแปลง

10.1 การศึกษาระดับเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัม ณ เวลาตางๆ หลังการ ฉีด V. harveyi

เลี้ยงกุงแชบวยในถังพลาสติคกลมความจุ 25 แกลลอน (gallon) ที่ผานการฆาเชื้อไวเรียบรอยแลว มีนํ้าทะเลประมาณครึ่งถัง ใหอากาศตลอดเวลา ทิ้งไวประมาณ 1 สัปดาหโดยนํากุงที่คัดขนาดใกลเคยีงกันซึ่งมีนํ้าหนักประมาณตัวละ 30-40 กรัม ลงเลีย้งในถัง ถังละ 4-5 ตัว ใหอาหารทุก 8 ชั่วโมง ปลอยใหกุงปรับตวัเขากับสภาพแวดลอมในถังประมาณ 3 วัน โดยสังเกตวากุงแข็งแรงไมมีอาการออนเพลีย วายน้ําและกินอาหารเปนปกติ จากนั้นนําเชื้อ V. harveyi ทีเ่ลี้ยงบนอาหารแข็ง TSA ความเขมขน 5 x 1010 เซลลตอมิลลลิติร ปริมาตร 100 ไมโครลิตร ฉีดเขากุงแชบวยทีบ่ริเวณกลามเนื้อโคนหางเพื่อกระตุนใหติดโรค โดยดัดแปลงวิธ ีการของ Martin และคณะ (1993) สําหรับกุงชุดควบคุมฉีดดวยน้าํเกลือปริมาตรเทากัน แลวเจาะฮีโมลิมฟจากกุงแตละตวัที่เวลาตางๆ คือ 0, 6, 12, และ 18 ชั่วโมง หลังการฉีด นําฮีโมลิมฟไปหาแอคทิวทิีของเอนไซมฟนอลออกซิเดส เพ่ือศึกษาระยะเวลาทีแ่อคทิวิทขีองเอนไซมเปลี่ยน แปลงหลังการฉีด

10.2 การศึกษาระดับแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมเมื่อฉีดดวย V. harveyi ปริมาณตางๆ

ในการหาปริมาณเชื้อ V. harveyi ที่เหมาะสมที่ทําใหระดับแอคทิวิทีของ เอนไซมฟนอลออกซิเดสในฮีโมลิมฟของกุงแชบวยเพิ่มขึ้นอยางมีนัยสําคัญ ในขั้นตนไดทดลองใชเชื้อจากการเลี้ยงบนอาหารแข็ง TSA ดังน้ี เตรียมกุงสําหรับฉีดเชื้อในทํานองเดียวกันกับวิธีขอ 10.1 โดยเลี้ยงใวในถังพลาสติคกลม จากนั้นนําเชื้อ V. harveyi ที่เลี้ยงบนอาหารแข็ง TSA ความเขมขนตาง ๆ คือ 2 x 108, 3 x 108, 4 x 108, และ 5 x 108 เซลลตอมิลลิลิตร ปริมาตรอยางละ 100 ไมโครลิตร ฉีดเขากุงแชบวยที่บริเวณกลามเนื้อโคนหาง สําหรับกุงชุดควบคุมฉีดดวยน้ําเกลือปริมาตรเทากัน แลวเจาะฮีโมลิมฟจากกุงแตละตัวที่เวลาตาง ๆ คือ เก็บฮีโมลิมฟของกุงกอนการฉีด (เวลา 0 ชั่วโมง) ที่ 6 และ 12 ชั่วโมง หลังการฉีด นําฮีโมลิมฟไปหาแอค ทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดส พบวาการฉีด V. harveyi ปริมาณ 5 x 107 เซลลตอตัวกุง มีผลทําใหแอคทิวิทีของเอนไซมเพ่ิมขึ้นสูงที่สุดที่ชั่วโมงที่ 12 จากนั้นทําการฉีดกุงอีกชุดดวยเชื้อ V. harveyi ที่เลี้ยงบนอาหารชนิดเดิม ความเขมขนดังน้ีคือ 5 x 107, 5 x 108, 5 x 109 และ 5 x 1010 เซลลตอมิลลิลิตร ปริมาตร 100 ไมโครลิตร และฉีดกุงดวยนํ้าเกลือเปนชุดควบคุม จากนั้นเจาะฮีโมลิมฟของกุงแตละตัวที่เวลา 0, 6 และ 12 ชั่วโมง หลังการฉีด เปรียบเทียบระดับแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมของกุงแชบวยทั้งสองชุดการทดลอง เพ่ือหาความ

46

เขนขนของเช้ือที่เหมาะสมที่ทําใหกุงติดเชื้อไดดี ไมทําใหกุงตายภายใน 12 ชั่วโมง และมีการเปลี่ยนแปลงระดับเอนไซมในซีรัมที่เห็นชัดเจน

11. การศึกษาผลของการฉีดจุลินทรียชนิดตางๆ ที่มีตอระดับแอคทิวิทีของเอนไซม

ฟนอลออกซิเดส เพ่ือทดสอบความจําเพาะของเอนไซมฟนอลออกซิเดสที่ตอบสนองตอจุลินทรียตางชนิด จุลินทรียที่ใชในการฉีดกุง ไดแกแบคทีเรียกอโรคกุง V. harveyi แบบ active และ inactive แบคทีเรียที่ไมกอโรคกุงคือ V. cholerae และ E. coli ที่เลี้ยงบนอาหารแข็ง TSA รวมทั้งไวรัสที่กอใหเกิดโรคตัวแดงดวงขาว WSSV โดยทําการทดลองทํานองเดียวกับ V. harveyi แบบ active คือฉีดแบคทีเรียปริมาณ 5x1010 เซลลตอมิลลิลิตร ซ่ึงเปนความเขมขนที่เหมาะสมที่ทําใหระดับเอนไซมฟนอลออกซิเดสเปลี่ยนแปลงมาก สวนไวรัส WSSV ใชความเขมขน 1x10-5 เทาของหัวเชื้อ ปริมาตรอยางละ 100 ไมโครลิตร ฉีดที่บริเวณกลามเนื้อโคนหาง จากนั้นนํากุงไปเลี้ยงตอตามปกติ เก็บฮีโมลิมฟของกุงกอนการฉีด (เวลา 0 ชั่วโมง) และหลังการฉีดที่ 6 และ 12 ชั่วโมง และตรวจวัดแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัม เปรียบเทียบระดับแอคทิวิทีของเอนไซมของกุงที่ถูกฉีดดวยเชื้อจุลินทรียแตละชนิดกับของชุดควบคุม 12. สถิติที่ใชในการวิเคราะห วิเคราะหความแตกตางของขอมูลในขอ 11 ในรูปคาเฉลี่ย + คาผิดพลาดมาตรฐาน (mean + S.E.) โดยใชการวิเคราะหแบบ T-test จากโปรแกรม simple interactive statistical analysis (SISA) (Steel and Torrie, 1980)

47

ไมใช นอกจากน้ีไดวัดแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในสารสกัดเน้ือเยื่อตับควบคูกับซีรัม เพื่อศึกษาแอคทิวิทีของเอนไซมในเน้ือเยื่อตับที่เปลี่ยนไปในกุงที่ฉีดจุลินทรียชนิดตางๆ เปรียบเทียบกับของกุงชุดควบคุมที่ไมฉีดจุลินทรีย 6.2 โพลีอะคริลาไมดเจลอิเล็กโทรฟอรีซิสแบบมีเอสดีเอส (SDS-PAGE) ทําโพลีอะคริลาไมดเจลอิเล็กโทรฟอรีซิสแบบมีเอสดีเอส (SDS, sodium dodecyl sulphate) ตามวิธีของ Laemmli (1970) เตรียมโพลีอะคริลาไมดเจล (6-18%) ซ่ึงมีสวนประกอบของเจลเปนดังน้ี

Separating gel Composition Stacking gel 3% (5 ml) 6% (3 ml) 18% (3 ml)

30% Acrylamide-0.8% bisacrylamide 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 0.2 M EDTA 10% SDS 10% Ammonium persulphate TEMED Distilled water

0.50 ml 1.25 ml

- 50 µl 50 µl 50 µl

5 µl 3.10 ml

0.60 ml -

0.75 ml 30 µl 30 µl 30 µl 3 µl

1.56 ml

1.80 ml -

0.75 ml 30 µl 30 µl 30 µl 3 µl

0.36 ml 6.2.1 การเตรียมสารตัวอยางและโปรตีนมาตรฐาน เตรียมสารตวัอยางและโปรตีนมาตรฐาน โดยผสมสารตัวอยาง 3 สวนกับบัฟเฟอร 1 สวน ซ่ึงประกอบดวย 0.2 M Tris-HCl, pH 6.8, 8 mM EDTA, 40% กลีเซอรอล, 4% SDS และ 0.4% โบรโมฟนอลบลู ในกรณีที่ทํา SDS-PAGE สภาพรีดิวซ (reduce) ทําโดยผสมสารตัวอยาง 3 สวน กับบัฟเฟอรตวัอยาง 1 สวน ดังขางตน แตมี 1% เบตา-เมอรแคปโทเอธานอล (β-mercaptoethanol) ดวย จากนั้นตมในน้ําเดือดนาน 5 นาที 6.2.2 การทําอิเล็กโทรฟอรีซิส นําสารละลายตัวอยางและสารละลายโปรตีนมาตรฐานใสในแตละชองเจลสวนบน ใช 0.025 M Tris-0.192 M glycine-0.1% SDS, pH 8.3 เปนบัฟเฟอรในการทําอิเล็กโทรฟอรีซิส เปดกระแสไฟคงที่ ที่ 15 mA นาน 2 ชั่วโมง จนกระทั่งสีโบรโมฟนอลบลูเคลื่อนที่ไปจนสุดขอบลางของเจล ปดกระแสไฟ นําเจลไปยอมสี

48

8.2 การหาอุณหภูมิที่เหมาะสมตอการเรงปฏิกิริยาของเอนไซม ทําการวัดแอคทิวทิีของเอนไซม ppPO ในสารผสมปฏิกิริยาทีป่ระกอบดวยสารละลายเอนไซม 40 ไมโครลิตร 0.2% SDS ปริมาตร 80 ไมโครลิตร 3 mg/ml L-DOPA ปริมาตร 120 ไมโครลิตร และ 40 mM CAC buffer, pH 8 (ที่มี 80 mM CaCl2 และ 200 mM MgCl2)ปริมาตร 80 ไมโครลิตร บมปฏิกิริยาที่อุณหภูมิ 25, 30, 40, 50 และ 60°ซ นาน 1-5 นาที จากนั้นเติม CAC buffer, pH 8 ใหมีปริมาตรครบ 800 ไมโครลิตร แลววัดคา A490 ทุกนาที นานประมาณ 5 นาที 8.1 การหาน้ําหนักโมเลกุลโดยวิธี SDS-PAGE หาน้ําหนักโมเลกุลของเอนไซมฟนอลออกซิเดส ใน SDS-PAGE โดยการทําควบคูกับโปรตีนมาตรฐาน 8 ชนิด ไดแก myosin (Mr 203,646) β-galactosidase (Mr 116,134) BSA (Mr 92,266) ovalbumin (Mr 50,400) carbonic anhydrase (Mr 36,800) soybean trypsin inhibitor (Mr 28,920) lysozyme (Mr 20,081) และ aprotinin (Mr 6,936) หลังการทําอิเล็กโทรฟอรีซิสและยอมสีโปรตีนแลว วัดระยะการเคลื่อนที่ของแถบโปรตีนตัวอยาง โปรตีนมาตรฐาน และแถบสีโบรโมฟนอลบลู แลวคํานวณหาคาการเคลื่อนที่สัมพัทธ (relative mobility, Rf) ของโปรตีนมาตรฐานและโปรตีนตัวอยาง จากความสัมพันธ ดังน้ี

ระยะการเคลื่อนที่ของโปรตีน การเคลื่อนที่สมัพัทธ =

ระยะการเคลื่อนที่ของโบรโมฟนอลบลู จากนั้นเขียนกราฟมาตรฐานระหวางคา log ของน้ําหนักโมเลกุลกบัคา Rf ของโปรตีนมาตรฐาน นําคา Rf ไปคํานวณหาน้ําหนักโมเลกุลของเอนไซมฟนอลออกซิเดสจากกราฟมาตรฐานได 8.2 การหาน้ําหนักโมเลกุลโดยวิธีเจลฟลเทรชัน หาน้ําหนักโมเลกุลของเอนไซมฟนอลออกซิเดส โดยใชคอลัมน Superdex 200 HR (1 x 40 เซนติเมตร) ซ่ึงมีปริมาตรเรซิน 24 มิลลิลติร ที่เชื่อมตอกับเครื่อง FPLC ซ่ึงปรับคอลัมนใหสมดุลยกอนดวย 50 mM Tris-HCl, pH 8.0 แลวเติมสารละลายเอนไซมเขมขนปริมาตร 500 ไมโครลิตร บลูเด็กซแตรน (blue dextran, Mr 2,000,000) K2Cr2O7 (Mr 294) และโปรตีนมาตรฐาน ไดแก เฟอรริติน (ferritin, Mr 440,000) คาทาเลส (catalase, Mr 232,000) อัลโดเลส (aldolase, Mr 158,000) และ BSA (Mr 67,000) ลงในคอลัมน แลวชะดวยบัฟเฟอรชนิดเดิมดวยอัตราไหล 30 มิลลลิิตรตอชั่วโมง เก็บสารละลายหลอดละ 0.5 มิลลิลติร

49

จากนั้นหาปริมาตรภายนอกเม็ดเจล (void volumn, Vo) จากคาปริมาตรชะของบลูเด็กซแตรนที่ไดจากการวัดคาการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 620 นาโนเมตร และปริมาตรทั้งหมด (total volumn, Vt) ของคอลัมนจากคาปริมาตรชะของ K2Cr2O7 ที่ไดจากการวัดคาการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลืน่ 480 นาโนเมตร นําสารละลายแตละหลอดไปวดัคา A 280 หาปริมาตรชะ (elution volumn, Ve) ของแตละโปรตีน แลวคํานวณหาคา distribution coefficient (Kav) ของโปรตีนแตละชนิดจากสมการ

(Ve – Vo) Kav = (Vt–Vo)

นําคาที่ไดเขียนกราฟความสัมพันธระหวางคา log ของน้ําหนักโมเลกุลกับคา Kav ของโปรตีนมาตรฐาน และคํานวณหาน้ําหนักโมเลกุลของเอนไซมฟนอลออกซิเดส 9. การศึกษาการเปลี่ยนแปลงแอคทิวิทขีองเอนไซมฟนอลออกซิเดสจากการฉีดกุง

ดวยจลุชีพ ศึกษาผลของการฉีดกุงแชบวยดวยแบคทีเรียและไวรัสบางชนิดที่มีตอระดับแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในฮีโมลิมฟ แบคทีเรียกอโรคกุงที่ใชฉีด คือ V. harveyi แบบ active และ inactive แบคทีเรียที่ไมกอโรคกุง ไดแก E. coli และ V. cholerae และใชไวรัสที่กอใหเกิดโรคตัวแดงดวงขาว (WSSV) โดยทําการฉีดจุลชีพเหลานี้ในกุงที่คัดขนาดเทา ๆ กัน ดวยปริมาณเซลลจุลชีพเทากัน โดยใชปริมาณเชื้อ V. harveyi ที่สามารถกระตุนใหระดับ เลคตินในฮีโมลิมฟเพ่ิมขึ้นอยางมีนัยสําคัญ (ปนนภา ลิ่มพานิช, 2550) เปนตัวกําหนดปริมาณจุลชีพชนิดอ่ืน ๆ ที่ใชฉีด

9.1 การเตรียมแบคทเีรีย 9.1.1 V. harveyi

แบคทีเรียกอโรคที่ใชในการทดลองคือ V. harveyi ซ่ึงไดรับความอนุเคราะหจากศูนยวิจัยสุขภาพสัตวนํ้า มหาวิทยาลยัสงขลานครนิทร โดยเลี้ยงแบคทีเรียบนอาหาร tryptic soy agar ที่มี 1.5% NaCl ที่อุณหภูมิ 37°ซ เปนเวลา 15 ชั่วโมง เพ่ิมปริมาณเชื้อโดยเลี้ยงในอาหารเหลว (tryptic soy broth, TSB) เปนเวลา 15 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิ 37°ซ นําเชื้อไปเซนตริฟวจที่ความเรว็ 3,000 รอบตอนาที นาน 30 นาที ที่อุณหภูมิ 4°ซ หรือเลี้ยงบน tryptic soy agar ที่มี 1.5 % NaCl ทีอุ่ณหภูมิ 37°ซ เปนเวลา 15 ชั่วโมง จากนั้นลางเซลลแบคทีเรียใน

50

นํ้าเกลือ (0.85% NaCl) นําไปเซนตริฟวจ ลางตะกอนสามครั้ง และเตรียมแบคทีเรียในน้ําเกลือใหมีคาการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 640 นาโนเมตร อยูในชวง 1.6-2.0 หนวย นับจํานวนโคโลนี (colony) ใหอยูในชวง 5x107, 5x108, 5x109 และ 5x1010 เซลล/มิลลิลติร เพ่ือใชฉีดกุงตอไป ทําให V. harveyi inactive โดยนําสารแขวนลอยV. harveyi active ที่มีปริมาณเชื้อ 5x1010 เซลล/มิลลิลิตร ไปเซนตริฟวจที่ความเรว็ 10,000 รอบตอนาที นาน 10 นาที ที่อุณหภูมิ 4°ซ แลวแขวนลอยตะกอนแบคทีเรียใน TBS ที่มี 0.1% thimerosal บมที่อุณหภูมิ 37°ซ คางคืนและลางตะกอนแบคทีเรยีในน้ําเกลือและละลายกลับใหมีปริมาตรเทากับเริ่มตน เก็บไวที่ 4°ซ เพ่ือใชฉีดกุงตอไป 9.1.2 V. cholerae แบคทีเรีย V. cholerae ที่ใชในการทดลอง ไดรับความอนุเคราะหจากภาควิชาจุลชีววิทยา โดยเลี้ยงแบคทีเรียในอาหารเหลว tryptic soy broth ที่อุณหภูมิ 37°ซ นาน 14-16 ชั่วโมง แลวทําตอเชนเดียวกับ V. harveyi ที่ active 9.1.3 E. coli แบคทีเรีย E. coli ที่ใชในการทดลองไดรับความอนุเคราะหจากภาควิชาจุลชีววิทยา โดยเลี้ยงแบคทีเรียในอาหารเหลว TSB หรือ Luria-Bertani ที่อุณหภูมิ 37°ซ นาน 14-16 ชั่วโมง แลวทําตอเชนเดียวกับ V. harveyi ที่ active 9.2 การเตรียมไวรัส WSSV WSSV ไดรับความอนุเคราะหจากศูนยวิจัยสุขภาพสัตวนํ้า มหาวิทยาลัยสงขลา นครินทร ซ่ึงมีวิธีการเตรียมหัวเชื้อ (stock) WSSV โดยดัดแปลงจากกิจการ ศุภมาตยและคณะ (2542) คือ ตัดเอาเนื้อเยื่อตับของกุงที่ติดเชื้อ WSSV มาบดใหละเอียดใน TBS ในอัตราสวน 1: 2 (นํ้าหนักเนื้อเยื่อ: ปริมาตร TBS) แลวเซนตริฟวจที่ความเร็ว 12,000 รอบตอนาที นาน 30 นาที ที่อุณหภูมิ 4°ซ เก็บสารละลายสวนใสกรองผานกระดาษกรอง 0.45 ไมครอน เพ่ือกําจัดแบคทีเรียและสิ่งแปลกปลอมอื่น ๆ ที่ปนเปอนออกไป แลวเก็บ WSSV ไวที่ -70°ซ จนกวาจะนํามาใช WSSV ที่ใชฉีดกุงเตรียมโดยเจือจางหัวเชื้อ WSSV จากที่กลาวขางตนใหมีความเขมขน 1x10-3 เทาใน TBS เพ่ือใชฉีดกุงตอไป

9.3 การวัดระดับแอคทิวทิีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในกุงที่ฉีดดวยจลุชีพ ชนิดตาง ๆ

เลี้ยงกุงแชบวยในถังพลาสติคกลมความจุ 25 แกลลอน (gallon) โดยเตรียมถังกอนเลี้ยงกุงดังน้ี ลางถังฆาเชื้อดวยคลอรีนและทิ้งใหแหงอยางนอย 2 วัน จากนั้นใสนํ้าทะเลที่มีคลอรีนฆาเชื้อปริมาตรประมาณครึ่งถัง ลงในถัง ใหอากาศตลอดเวลา ทิ้งไวประมาณ 1

51

สัปดาห แลวนํากุงที่คัดขนาดใกลเคียงกันซ่ึงมีนํ้าหนักประมาณตัวละ 30-40 กรัม ลงเลี้ยงถังละ 4-5 ตัว โดยใหอาหารเม็ดทุก 8 ชั่วโมง ปลอยใหกุงปรับตัวเขากับสภาพแวดลอมในถังประมาณ 3 วัน โดยสังเกตวากุงแข็งแรงไมมีอาการออนเพลีย วายน้ําและกินอาหารเปนปกติ จากนั้นนําเชื้อ V. harveyi ปริมาณ 2 x 108, 3 x 108, 4 x 108, และ 5 x 108 เซลลตอมิลลิลิตร ปริมาตรอยางละ 100 ไมโครลิตร ฉีดเขากุงแชบวยที่บริเวณกลามเนื้อโคนหาง สําหรับกุงชุดควบคุมฉีดดวยน้ําเกลือปริมาตรเทากัน แลวเจาะฮีโมลิมฟจากกุงแตละตัวที่เวลาตาง ๆ คือ เก็บฮีโมลิมฟของกุงกอนการฉีด (เวลา 0 ชั่วโมง) ที่ 6, และ 12 ชั่วโมง หลังการฉีด นําฮีโมลิมฟไปหาแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดส พบวาการฉีด V. harveyi ปริมาณ 5 x 107 เซลลตอตัวกุง มีผลทําใหแอคทิวิทีของเอนไซมเพ่ิมขึ้นสูงที่สุด จากนั้นทําการฉีดกุงอีกชุดดวยเชื้อ V. harveyi ที่ ความเขมขนดังน้ีคือ 5 x 107, 5 x 108, 5 x 109 และ 5 x 1010 เซลลตอมิลลิลิตร ปริมาตร 100 ไมโครลิตร ฉีดกุงที่บริเวณกลามเนื้อโคนหาง สําหรับกุงที่เปนชุดควบคุมฉีดดวยน้ําเกลือปริมาตรเทากัน จากนั้นนํากุงไปเลี้ยงตอตามปกติ เก็บฮีโมลิมฟของกุงกอนการฉีด (เวลา 0 ชั่วโมง) และหลังการฉีดที่ 6 และ 12 ชั่วโมง นําฮีโมลิมฟไปเตรียมตามวิธีขอ 1 แลววัดแอค ทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดส เปรียบเทียบระดับแอคทิวิทีของเอนไซมในฮีโมลิมฟของกุงทั้ง 2 กลุม สําหรับจุลชีพชนิดอ่ืน ๆ คือ V. harveyi แบบ inactive, V. cholerae และ E. coli ทําการทดลองเชนเดียวกับ V. harveyi แบบ active คือฉีดเชื้อปริมาณ 5x109, 5x108, 5x107 และ 5x106 เซลลตอมิลลิลิตร สวน WSSV ใชปริมาณ 1x10-5 เทาของหัวเชื้อปริมาตรอยางละ 100 ไมโครลิตร ที่บริเวณกลามเนื้อโคนหาง จากนั้นนํากุงไปเลี้ยงตอตามปกติ เก็บฮีโมลิมฟของกุงกอนการฉีด (เวลา 0 ชั่วโมง) และหลังการฉีดที่ 6 และ 12 ชั่วโมง เม่ือครบ 12 ชั่วโมง นอกจากดูดฮีโมลิมฟแลวเก็บตับนําไปเตรียมเปนสารสกัดตามวิธีการขอ 2 แลววัดแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในฮีโมลิมฟที่เวลาตางๆและในสารสกัดตับ วัดระดับแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสของกุงที่ถูกฉีดดวยจุลชีพเปรียบเทียบกับของชุดควบคุม 9.4 สถิติที่ใชในการวิเคราะห วิเคราะหความแตกตางของขอมูล ในรูปคาเฉลี่ย ± คาผิดพลาดมาตรฐาน (mean ± S.E.) โดยใชการวิเคราะหแบบ ANOVA (one way analysis of variance) จากโปรแกรม statistical package for the social science (SPSS) (Steel and Torrie, 1980)

52

โดยคอลัมน Superdex 200 HR ที่เชื่อมตอกับเครื่อง FPLC (fast protein liquid chromatography) หรือดวยการทํา preparative PAGE 7.2 โดยคอลัมน Superdex 200 HR ลางและปรับคอลัมน Superdex 200 HR (1 x 40 เซนติเมตร) ซ่ึงมีปริมาตรเรซิน 24 มิลลิลิตร ที่เชื่อมตอกับเครื่อง FPLC ซ่ึงปรับคอลัมนใหสมดุลยกอนดวย TBS (50 mM Tris-HCl, pH 7.5 ที่มี 150 mM NaCl) เติมสารละลายเอนไซมเขมขนปริมาตร 100 ไมโครลิตร (14.30 มิลลิกรัม) ลงในคอลัมน แลวชะดวยบัฟเฟอรชนิดเดิมดวยอัตราไหล 30 มิลลิลิตรตอชั่วโมง เก็บสารละลายหลอดละ 0.5 มิลลิลิตร นําสารละลายแตละหลอดไปวัดคา A280 และหาคาแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดส รวมสารละลายหลอดที่มีแอคทิวิทีของเอนไซมสูงเขาดวยกัน ทําใหเขมขน จากนั้นนําไปทดสอบความบริสุทธิ์โดยวิธี nondenaturing PAGE และนําสารละลายที่ไดไปแยกตอดวยการทํา preparative PAGE 9.2 การเลี้ยง V. harveyi ในอาหารเหลว Tryptic soy broth (TSB) แบคทีเรีย V. harveyi ที่ใชทดลอง ไดรับความอนุเคราะหจากศูนยวิจัยสุขภาพสัตวนํ้า มหาวิทยาลัยสงขลานครินทร โดย streak แบคทีเรียดวยลูปสําหรับเขี่ยเชื้อบนอาหารTSA ที่มี 1.5% NaCl บมที่อุณหภูมิ 37°ซ เปนเวลา 15 ชั่วโมง จากนั้นนําเชื้อที่เลี้ยงไว 1 โคโลนี เลี้ยงตอในอาหารเหลว TSB ที่มี 1.5% NaCl ปริมาตร 5 มิลลิลิตร ที่อุณหภูมิ 37°ซ เปนเวลา 15 ชั่วโมง เพ่ือใชเปนหัวเชื้อ (stock) แลวเพ่ิมปริมาณเชื้อโดยดูดสารแขนลอยของ หัวเชื้อใสในอาหารเหลวชนิดเดิม ปริมาตร 50 มิลลิลิตร บมเปนเวลา 15 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิ 37°

ซ จากนั้นลางเซลลแบคทีเรียที่ได และนับจํานวนเซลลเพ่ือเตรียมความเขมขนที่ตองการ

53

สวนการทดลองโดยใชเชื้อ V. harveyi ที่เลี้ยงในอาหารเหลว TSB ทําการทดลองวิธีเดียวกับวิธีขางตน โดยนําเชื้อมาเตรียมใหมีความเขมขนตางๆ คือ 5 x 105, 5 x 106, 5 x 107 และ 5 x 108 เซลลตอมิลลิลิตร นําไปฉีดเขาตัวกุง ปริมาตร 100 ไมโครลิตร และฉีดกุงดวยน้ําเกลือเปนชุดควบคุม หลังจากนั้นเจาะฮีโมลิมฟของกุงแตละตัวที่เวลาตาง ๆ คือ 0, 6, 12, และ 18 ชั่วโมง และนํามาหาแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสเพื่อหาความเขมขนที่เหมาะสมที่ทําใหระดับแอคทิวิทีของเอนไซมเปลี่ยนแปลง

3. ผลการทดลองและวิจารณ 1. การหาภาวะที่เหมาะสมในการวัดแอคทิวทิีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัม เอนไซมเปนสารประกอบพวกโปรตีนโดยทําหนาที่เรงปฏิกิริยาทางชีวภาพ การทํางานของเอนไซมขึ้นอยูกับปจจัยหลายอยาง เชน ความเขมขนของสับสเตรท ความเขมขนของเอนไซม ความเปนกรด-เบสของสารละลาย อุณหภูมิในการทําปฏิกิริยา การใชเอนไซมหรือสับสเตรทในปริมาณที่พอเหมาะจะทําใหมีสารเริ่มตนเพียงพอในการเกิดปฏิกิริยา pH ของสารละลายจะมีผลตอโครงสรางโมเลกุลของเอนไซม โดยสงผลตอประจุและกระทบตอการจับกับสับสเตรท ที่ pH ต่ําหรือสูงเกินไปมักทําใหประจุเปลี่ยนไปจนไมเหมาะสมที่จะทําปฏิกิริยากัน นอกจากนี้ที่ pH สูงมากหรือต่ํามากอาจทําใหโครงสรางของเอนไซมแปลงสภาพ (denature) ไปดวย อุณหภูมิจะชวยเพิ่มพลังงานจลนทําใหอัตราของปฏิกิริยาเกิดเร็วขึ้น อีกทั้งยังจับกับสับสเตรทไดเร็วขึ้น ถาอุณหภูมิสูงเกินไปอัตราของปฏิกิริยาจะลดลงเปนผลจากการที่เอนไซมแปลงสภาพ ดังน้ันการทํางานของเอนไซมจะเรงปฏิกิริยาไดเต็มที่และดีที่สุด ถาเอนไซมไดทํางานในภาวะที่เหมาะสม 1.1 ปริมาณเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมที่เหมาะสมตอการเรงปฏิกิริยา ในการหาแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดส โดยใชปริมาณของสับสเตรทคงที่ ตองใชปริมาณเอนไซมที่เหมาะสมตอปริมาณสับสเตรทที่ใช จากการนําซีรัมปริมาตรตาง ๆ กัน ตั้งแต 0-120 ไมโครลิตร ไปทําปฏิกิริยากับ 3 mg/ml L-DOPA ปริมาตร 120 ไมโครลิตร และ 2 mg/ml trypsin ปริมาตร 80 ไมโครลิตร ในสารผสมปฏิกิริยาปริมาตรรวม 320 ไมโครลิตร พบวาแอคทิวิที (%) ของเอนไซมเพ่ิมขึ้นแปรผันเปนเสนตรงสัมพันธกับปริมาตรซีรัมที่ใชในชวง 0-110 ไมโครลิตร และเพิ่มสูงสุดและคงที่เม่ือใชซีรัมตั้งแต 110 ไมโครลิตร เปนตนไป ดังแสดงผลในรูปที่ 9 ดังน้ันในการวัดแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในการทดลองตอๆ ไป จึงเลือกใชซีรัมปริมาณที่เหมาะสมคือในชวงประมาณ 20-60 ไมโครลิตร หรือมีปริมาณโปรตีนในชวงประมาณ 2-8 ไมโครกรัม

47

48

0

20

40

60

80

100

120

0 20 40 60 80 100 120 140

Serum (µl)

Act

ivity

(%)

รูปที่ 9 ปริมาณเอนไซมที่เหมาะสมในการวัดแอคทิวทิีของ เอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัม

49

0

20

40

60

80

100

120

0 2 4 6 8 10 12

pH

Act

ivity

(%)

1.2 pH ที่เหมาะสมในการเกิดปฎิกิริยา ความเปนกรด-เบสเปนอีกปจจัยหน่ึงที่สําคัญที่มีผลตอโครงสรางโมเลกุลของเอนไซม ซ่ึงมีผลกระทบตอการทํางานของเอนไซม จากการวัดแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัม ปริมาตร 40 ไมโครลิตร ทําในสารผสมปฏิกิริยาที่มีบัฟเฟอร pH ในชวง 4-11 พบวาแอคทิวิที (%) ของเอนไซม ฟนอลออกซิเดสมีคาต่ําและใกลเคียงกันในชวง pH 4-6 จากน้ันแอคทิวิทีของเอนไซมมีคาเพิ่มขึ้นอยางมากเมื่อทําปฏิกิริยาที่ pH ในชวง 7-8 โดยมีแอคทิวิทีสูงสุดที่ pH 9 จากนั้นเอนไซมฟนอลออกซิเดสเริ่มทํางานลดลงที่ pH 10 และมีแอคทิวิทีคงที่ที่ pH 11 (รูปที่ 10) ผลการทดลองนี้แสดงใหเห็นวาเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมของกุงแชบวยทํางานไดดีที่สุดที่ pH 9 แตในงานวิทยานิพนธน้ีเลือกวัดแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสของกุงแชบวยในบัฟเฟอรที่ pH 8 สําหรับการทดลองตอ ๆ ไป เพ่ือไมใหภาวะการวัดแอคทิวิทีของเอนไซมมีความเปนเบสมากจนเกินไป และเพื่อปองกันไมใหเกิด auto-oxidation ของ L-DOPA ซ่ึงมีโอกาสเกิดขึ้นในภาวะที่เปนเบสมากๆ แมจะไมเกิดขึ้นในการทดลองนี้ก็ตาม ผลการทดลองของเอนไซมน้ีในกุงแชบวยคลายกับเอนไซมฟนอลออกซิเดสในหนอนกระทูกินยอด H. virescens ที่ทํางานไดดีที่ pH 9 (Jordan and Deaton, 2005) คลายกับเอนไซมฟนอลออกซิเดสจากทากน้ําจืด B. glabrata ที่ทํางานไดดีที่ pH 9.5 (Bahgat et al., 2002) สวนเอนไซมฟนอลออกซิเดส ของหอยนางรม S. glomerata ทํางานไดดีที่สุดที่ pH 8 (Aladaileh et al., 2007) ในขณะที่เอนไซมของหอยนางรม C. virginica และหอยสองฝา R. philippinarum ทํางานไดดีที่สุดที่ pH 6-7.5 (Lockey and Ourth, 1992) และที่ pH 7 (Bahgat et al., 2002) ตามลําดับ

50

0

20

40

60

80

100

120

0 50 100 150 200

L-DOPA (3 mg/ml, µl)

Act

ivity

(%)

รูปที่ 10 pH ที่เหมาะสมในการเกิดปฏิกิริยาของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัม 1.3 ความเขมขนของสับสเตรท (L-DOPA) ที่เหมาะสมในการเกิดปฏิกิริยา

ในการหาแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัม โดยใชซีรัมปริมาตรคงที่ที่ 30 ไมโครลิตร แตใชสับสเตรท L-DOPA ที่ความเขมขน 3 mg/ml ปริมาตรตาง ๆ กัน ตั้งแต 0-180 ไมโครลิตร พบวาในชวงแรกแอคทิวิทีของเอนไซม (%) มีคาเพิ่มขึ้นแปรผันเปนเสนตรงสัมพันธกับปริมาตร L-DOPA ที่ใชในชวง 0-120 ไมโครลิตร และแอคทิวิทีมีคาคงที่เม่ือใช 3 mg/ml L-DOPA ปริมาตรมากกวา 120 ไมโครลิตร (รูปที่ 11) ในงานวิทยานิพนธน้ีจึงเลือกใชสับสเตรท 3 mg/ml L-DOPA ปริมาตร 120 ไมโครลิตร หรือที่ความเขมขน 5.7 mM ในการวัดแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัม ซ่ึงใหคาแอคทิวิที (%) สูงที่สุดและยังอยูในชวงแปรผันเปนเสนตรง ซ่ึงใกลเคียงกับการวัดแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในเพรียงหัวหอม (Styela plicata) ที่ใช L-DOPA ความเขมขน 7.13 mM (Arizza et al., 1995) สวนในสิ่งมีชีวิตชนิดอ่ืน อาทิเชน แมลงสาบ (B. discoidalis) (Durrant et al., 1993) และกุงมังกร (spiny lobster, Panulirus argus) (Perdomo-Morales et al., 2007) ที่ใช L-DOPA ความเขมขน 5 และ 2.17 mM ตามลําดับ ในการวัดแอคทิวิทีของเอนไซม การวัดแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสใน Nasonia vitripennis (Abt and Rivers, 2007) และในหอยนางรม (S. glomerata) (Aladaileh et al., 2007) ใช L-DOPA ที่ความเขมขน 5 และ 10 mM ตามลําดับ

รูปที่ 11 ปริมาณสับสเตรท L-DOPA ที่เหมาะสมตอการเกิดปฏิกิริยา ของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัม

51

0

20

40

60

80

100

120

0 50 100 150

Trypsin (2 mg/ml, µl)

Act

ivity

(%)

1.4 ปริมาณเอนไซมทริปซินที่เหมาะสมตอการกระตุนปฏิกิริยา

จากการศึกษาผลของเอนไซมทริปซินในการกระตุนการเกิดปฏิกิริยาของเอนไซมฟนอลออกซิเดส โดยวัดแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมปริมาตร 30 ไมโครลิตร และใชสับสเตรท 3 mg/ml L-DOPA ปริมาตร 120 ไมโครลิตร แตใช 2 mg/ml trypsin ปริมาตรตาง ๆ กัน ในชวง 0-140 ไมโครลิตร พบวาการเกิดแอคทิวิที (%) ในชวงแรกมีคาเพิ่มขึ้นแปรผันเปนเสนตรงสัมพันธกับปริมาตรที่ใช จนมีคาเพิ่มขึ้นสูงสุดเม่ือใช 2 mg/ml trypsin ปริมาตร 120 ไมโครลิตร (รูปที่ 12) แตเม่ือใชทริปซินมากกวา 120 ไมโครลิตร แอค ทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสเริ่มลดลง ในงานวิทยานิพนธน้ีจึงเลือกใช 2 mg/ml trypsin ปริมาตร 80 ไมโครลิตร หรือที่ความเขมขน 0.5 mg/ml ซ่ึงใหคาแอคทิวิทีอยูในชวงที่เปนเสนตรงเพื่อใชกระตุนและวัดแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมสําหรับการทดลองตอไป ซ่ึงใกลเคียงกับการวัดแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในกุงมังกร P. argus ที่ใชเอนไซมทริปซินที่ความเขมขน 0.57 mg/ml (Perdomo-Morales et al., 2007) สวนในสิ่งมีชีวิตชนิดอ่ืน อาทิเชน กุง P. californiensis (Gollas-Galvan et al., 1999) และแมลงสาบ (B. discoidalis) (Durrant et al., 1993) ใชเอนไซมทริปซินที่ความเขมขน 0.5 และ 0.33 mg/ml ตามลําดับ ในการกระตุนแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดส

รูปที่ 12 ปริมาณเอนไซมทริปซินที่เหมาะสมตอการกระตุนการ เกิดปฏิกิริยาของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัม

52

0

20

40

60

80

100

120

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

SDS (%)

Act

ivity

(%)

1.5 ปริมาณ SDS ที่เหมาะสมตอการกระตุนปฏิกิริยา

นอกเหนือจากเอนไซมทริปซินแลว ยังมีรายงานการใช SDS ในการกระตุนการเปลี่ยนเอนไซมโปรฟนอลออกซิเดสไปเปนฟนอลออกซิเดส (Jaenicke and Decker, 2008) จากการศึกษาผลของ SDS ในการกระตุนการเกิดปฏิกิริยาของเอนไซมฟนอลออกซิเดส โดยวัดแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมปริมาตร 30 ไมโครลิตร และใชสับสเตรท 3 mg/ml L-DOPA ปริมาตร 120 ไมโครลิตร แตใช 2% SDS ปริมาตรตาง ๆ กัน ในชวง 0-140 ไมโครลิตร พบวาในชวงแรกที่ความเขมขนของ SDS ต่ํา คาแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดส (%) แปรผันตามความเขมขนของ SDS (รูปที่ 13) แตที่ความเขมขนของ SDS ในชวง 0.0375-0.05% แอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสเพิ่มสูงขึ้นอยางมาก และมีคาคงที่ที่ความเขมขนของ SDS ตั้งแต 0.05% ถึง 0.4% ในงานนี้จึงเลือกใช SDS ที่ความเขมขน 0.05% หรือ 1.73 mM ซ่ึงกระตุนใหแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสมีคาสูงที่สุด เพ่ือใชวัดแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมตอไป จากงานวิจัยของ Jaenicke and Decker (2008) ศึกษาความเขมขนของ SDS ที่มีผลตอระดับแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสจากแมงมุม (tarantula Eurypelma californicum) โดยทําการทดลองที่ความเขมขนของ SDS ตั้งแต 0-7 mM พบวา SDS ที่ความเขมขน 5 mM เปนความเขมขนนอยที่สุดที่กระตุนแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสไดมากที่สุด ในขณะที่ SDS ที่ความเขมขน 0.025% หรือ 0.87 mM ถูกใชกระตุนแอคทิวิทีของเอนไซมน้ีในกุง P. californiensis (Gollas-Galvan et al., 1999)

รูปที่ 13 ความเขมขนของ SDS ที่เหมาะสมตอการกระตุนการ

53

เกิดปฏิกิริยาของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัม 1.6 อุณหภูมิที่เหมาะสมในการเกิดปฏกิิริยา อุณหภูมิเปนปจจัยที่สําคัญที่ชวยใหเอนไซมเรงปฏิกิริยาไดอยางสมบูรณ โดยเพ่ิมพลังงานจลนชวยทําใหเอนไซมจับกับสับสเตรทและเรงปฏิกิริยาไดเร็วขึ้น แตอุณหภูมิที่สูงเกินไปจะทําใหเอนไซมแปลงสภาพได และทําใหความสามารถในการเรงปฏิกิริยาของเอนไซมลดลง ซ่ึงจากการหาแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมที่อุณหภูมิตาง ๆ กันในชวง 25-60°ซ (รูปที่ 14) พบวาเอนไซมฟนอลออกซิเดสมีแอคทิวิที (75%) เม่ือทําปฏิกิริยาที่อุณหภูมิ 25°ซ (อุณหภูมิหอง) และมีคาแอคทิวิทีเพ่ิมขึ้นที่ 30°ซ (85%) จนมีคาสูงสุดเปน 100% ที่อุณหภูมิ 40°ซ จากนั้นการทํางานของเอนไซมลดลงตามลําดับที่อุณหภูมิ 50 และ 60°ซ บงชี้ ใหเห็นวาการทําปฏิกิริยาที่ 40°ซ เอนไซมฟนอลออกซิเดสจะเรงปฏิกิริยาไดดีที่สุด ซ่ึงเหมือน กับเอนไซมฟนอลออกซิเดสที่พบในปู C. japonica (Liu et al., 2006) จากกุง P. chinensis (Fan and Wang, 2002) หรือจากหอยสองฝา R. philippinarum (Cong et al., 2005) ที่ทํางานไดดีที่สุดที่อุณหภูมิ 40°ซ และใกลเคียงกับเอนไซมฟนอลออกซิเดสในหนอนผีเสื้อ (Pieris rapae) ที่มีแอคทิวิทีสูงสุดที่อุณหภูมิ 42°ซ (Xue et al., 2006) ในขณะที่เอนไซมจากกุง Penaeus setiferus, หอย Chlamys farreri และจากหนอนกระทูกินยอด H. virescens มีแอคทิวิทีสูงสุดที่อุณหภูมิ 45°ซ (Simpson et al., 1987; Sun and Li, 1999; Lockey and Ourth, 1992) แตเน่ืองจากแอคทิวิทีของกุงแชบวย เม่ือวัดที่อุณหภูมิหองไมตางจากการวัดที่ 40°ซ มากนัก และเพื่อความสะดวกในงานวิทยานิพนธน้ีจึงทําการวัดแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสที่อุณหภูมิหอง

54

0

20

40

60

80

100

120

0 20 40 60

Temperature (°C)

Act

ivity

(%)

รูปที่ 14 อุณหภูมิที่เหมาะสมในการเกิดปฏิกิริยาของ เอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัม

55

0

20

40

60

80

100

120

0 20 40 60 80

Temperature (°C)

Act

ivity

(%)

2. การศึกษาความเสถียรตออุณหภูมิของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัม

จากการทดสอบความเสถียรตออุณหภูมิของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัม โดยการบมเอนไซมฟนอลออกซิเดสที่อุณหภูมิ 25-80°ซ นาน 30 นาที แลวทําใหเย็นโดยแชบนนํ้าแข็ง หลังจากนั้นนําไปหาแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสที่เหลืออยูเปรียบเทียบกับเอนไซมซ่ึงเก็บไวที่ 0°ซ นาน 30 นาที พบวาเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมมีความเสถียรตออุณหภูมิในชวง 0-40°ซ มีแอคทิวิทีเร่ิมลดลงเมื่อบมที่อุณหภูมิ 50°ซ (86.2%) และมีแอคทิวิทีลดลงอยางรวดเร็วเม่ือบมที่อุณหภูมิ 60-70°ซ จนเสียแอคทิวิทีอยางสมบูรณที่อุณหภูมิ 80°ซ (รูปที่ 15) ซ่ึงคลายกับในกุง P. setiferus และกุงมังกร P. argus ที่เอนไซมฟนอลออกซิเดสมีความเสถียรตออุณหภูมิลดลงที่อุณหภูมิมากกวา 50 และ 40°ซ ตามลําดับ (Simpson et al., 1987; Ali et al., 1994) สวนเอนไซมฟนอลออกซิเดสของกุงกุลาดํา กุง Penaeus duorarum และกุงลายเสือ มีความเสถียรลดลงที่อุณหภูมิสูงกวา 35°ซ (Rolle et al., 1991; Simpson et al., 1988; Montero et al., 2001)

รูปที่ 15 ความเสถียรตออุณหภูมิของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัม

56

3. แอคทิวิทขีองเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมและในเนื้อเยือ่บางชนิด จากการหาแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัม และในสารสกัดจากตบั หัวใจ ลําไส กระเพาะและกลามเนื้อของกุงแชบวยตัวอยางชุดเดียวกันที่จับจากธรรมชาติ พบแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในเนื้อเยื่อ 4 ชนิด คือ ในซีรัม ตับ ลําไสและกระเพาะ ไมพบแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในหัวใจและกลามเน้ือ โดยพบแอคทิวิทีรวมของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมมากที่สุด (1,091.24 หนวย หรือ 100%) รองลงมาไดแก ตับ (71.16 หนวย หรือ 6.52%) ลําไส (30.67 หนวย หรือ 2.81%) และกระเพาะ (28.02 หนวย หรือ 2.56%) ตามลําดับ ดังแสดงผลในตารางที่ 3 เม่ือคิดเปนคาแอคทิวิทีจําเพาะพบวาสารสกัดจากลําไสกลับมีคาแอคทิวิทีจําเพาะของเอนไซมฟนอลออกซิเดสมากที่สุด (23.18 + 8.45 หนวย/มก.โปรตีน) รองลงมาไดแก กระเพาะ (13.61 + 5.26 หนวย/มก.โปรตีน) ซีรัม (7.51 + 1.25 หนวย/มก.โปรตีน) และตับ (5.28 + 1.49 หนวย/มก.โปรตีน) ตามลําดับ (ตารางที่ 3) การไมพบแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในหัวใจและกลามเนื้อ บงบอกไดวาหัวใจและกลามเน้ืออาจไมใชเน้ือเยื่อเปาหมายของการทํางานของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในกุงแชบวย และเอนไซมน้ีอาจไมไดถูกสังเคราะหโดยกลามเน้ือและหัวใจ การพบเอนไซมในกระเพาะและลําไสอาจเนื่องมาจากการที่กุงกินอาหารที่มีเอนไซมอยู สวนการพบแอคทิวิทีรวมของเอนไซม ฟนอลออกซิเดสในสารสกัดตับมากเปนอันดับ 2 รองจากซีรัม (คิดเปน 6.52% ของเอนไซม ฟนอลออกซิเดสในซีรัม) อาจเปนไดวาตับซ่ึงเปนอวัยวะสําคัญทําหนาที่ในการสรางโปรตีนชนิดตาง ๆ เปนแหลงหน่ึงที่สังเคราะหเอนไซมฟนอลออกซิเดสไดดวยเชนกัน แลวหลั่งเอนไซมน้ีออกสูฮีโมลิมฟที่ทําหนาที่เสมือนกระแสเลือดเพ่ือใชในกระบวนตาง ๆ เชนการปองกันตนเองของกุงตอสิ่งแปลกปลอมที่มาบุกรุก

57

58

4. การศึกษาแถบโปรตีนของเอนไซมฟนอลออกซิเดสใน Nondenaturing PAGE

เพ่ือหาวาแถบโปรตีนของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมปรากฎ ณ ตําแหนงใดในโพลีอะคริลาไมดเจลอิเล็กโทรฟอรีซิสแบบไมแปลงสภาพ (nondenaturing PAGE) ไดทําการแยกโปรตีนในซีรัมดวยวิธีnondenaturing PAGE จากนั้นยอมเจลดวยสับสเตรท L-DOPA พบวาปรากฏแถบแอคทิวิทีของเอนไซมเพียงแถบเดียวตรงตําแหนงลูกศรชี้ ดังแสดงผลใน รูปที่ 16

รูปที่ 16 แถบแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสจากซีรัม ใน Nondenaturing PAGE แถวที ่1 โปรตีนมาตรฐาน ยอมสีคูมาซี แถวที่ 2 ซีรัมโปรตีน ยอมสีคูมาซี แถวที่ 3 ซีรัมโปรตีน ยอมแอคทิวิท ี

432 232

140

67

669

kDa

1 2 3

PO

59

5. การทําใหเอนไซมฟนอลออกซิเดสบริสุทธ์ิบางสวนจากซีรัม

งานวิทยานิพนธน้ีทําบริสุทธิ์เอนไซมฟนอลออกซิเดสบางสวนจากซีรัมของกุงแชบวยตามขัน้ตอนตาง ๆ ดังน้ี

5.1 โดยคอลมัน Sephadex G-200 จากการนําซีรัมที่เตรียมตามวิธีการขอ 1.1 ปริมาตร 8 มิลลิลิตร มีปริมาณ

โปรตีนรวม 735.52 มิลลิกรัมและมีแอคทิวิทีและแอคทิวิทีจําเพาะของเอนไซมฟนอลออกซิเดส เทากับ 5,032 หนวยและ 6.84 หนวย/มิลลิกรัม ตามลําดับ ผานลงในคอลัมน Sephadex G-200 ที่ผานการลางและปรับคอลัมนใหสมดุลกอนดวย 50 mM Tris-HCl, pH 8.0 (TB) จากนั้นชะคอลัมนตอดวยบัฟเฟอรชนิดเดิม จนคา A280 เขาใกลศูนย พบวามีแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอล ออกซิเดสถูกชะออกมา 1 พีค (peak) คือพีค S1 (หลอดที่ 25-70) โปรตีนสวนมากถูกชะออกมา ในพีค S2 ดังแสดงผลในรูปที่ 17 เม่ือรวมสารละลายหลอดที่ 30-50 ที่มีแอคทิวิทีของเอนไซม ฟนอลออกซิเดสสูงและคา A280 ต่ําเขาดวยกัน ไดแอไลซและทําใหเขมขน หาปริมาณโปรตีนและหาแอคทิวิที พบวาสารละลายเอนไซมเขมขนมีปริมาณโปรตีนรวม 88.80 มิลลิกรัม คิดเปน 12.07% ของซีรัมโปรตีนเริ่มตน มีแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดส 2,558 หนวย และมีแอคทิวิทีจําเพาะเปน 28.81 หนวย/มก.โปรตีน คิดเปน 50.83% และมีความบริสุทธิ์เพ่ิมขึ้น 4.21 เทา ของซีรัมเริ่มตน (ตารางที่ 4) แตเม่ือทดสอบความบริสุทธิ์โดยการทํา nondenaturing PAGE ปรากฏแถบโปรตีนหลายแถบแสดงวายังมีโปรตีนอ่ืนปนเปอนอยู ดังแสดงผลในรูปที่ 18 แถวที่ 3 บงชี้วาเอนไซมฟนอลออกซิเดสที่แยกไดโดยคอลัมนน้ียังไมบริสุทธิ์

60

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

0 5 10 15 20 25 30 35 40 43 45 46 50 52 53 54 55 56 60 65 70 80 90

Fraction number

OD

280

0

50

100

150

200

250

300

Act

ivity

(U/m

l)

รูปที่ 17 การแยกเอนไซมฟนอลออกซิเดสจากซีรัมดวยคอลัมน Sephadex G-200 นําซีรัมปริมาตร 8 มิลลิลิตร (โปรตีน 735.52 มิลลิกรัม) ผานลงใน

คอลัมน Sephadex G-200 ลางคอลัมนดวยบัฟเฟอร TB อัตราไหล 8 มิลลิลิตรตอชั่วโมง เก็บสารละลายหลอดละ 0.5 มิลลิลิตร จนคา A280 เขาใกลศูนย

S1 S2

62

รูปที่ 18 แบบแผนโปรตีนใน Nondenaturing PAGE ของเอนไซมฟนอลออกซิเดส ในข้ันตอนการทําบริสุทธ์ิบางสวนซึ่งยอมเจลแบบซิลเวอร แถวที่ 1 โปรตีนมาตรฐาน แถวที่ 2 ซีรัม แถวที ่3 สารละลายเอนไซมพีค S1 จากคอลัมน Sephadex G-200 แถวที ่4 สารละลายเอนไซมที่ไดจากการทํา preparative PAGE ครั้งที่ 1 แถวที ่5 สารละลายเอนไซมที่ไดจากการทํา preparative PAGE ครั้งที่ 2

kDa

432

232

67

1 2 3 4 5

669

140

63

5.2 โดยวิธี Preparative PAGE ครั้งที่ 1 จากการนําสารละลายเอนไซมเขมขนที่แยกไดจากคอลัมน Sephadex G-200

ไปแยกตอโดย preparative PAGE โดยตัดเฉพาะแถบโปรตีนของเอนไซมฟนอลออกซิเดสเพียงแถบเดียว (แถบโปรตีนที่ชี้ดวยลูกศร ในรูปที่ 18) แลวชะโปรตีนออกจากเนื้อเจลตามวิธีการขอ 7.2 นําสารละลายที่ไดไปทําใหเขมขนและไดแอไลซ หาปริมาณโปรตีนและหาแอคทิวิที พบวาสารละลายเอนไซมเขมขนมีปริมาณโปรตีนรวม 0.0768 มิลลิกรัม คิดเปน 0.0104% ของซีรัมโปรตีนเริ่มตน โดยมีแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดส 689 หนวย และมีแอคทิวิทีจําเพาะเปน 8,964.65 หนวย/มก.โปรตีน คิดเปน 13.69% และมีความบริสุทธิ์เพ่ิมขึ้น 1,310.62 เทา ของซีรัมเริ่มตน (ตารางที่ 4) แตเม่ือทดสอบความบริสุทธิ์โดยการทํา nondenaturing PAGE ยังปรากฏแถบโปรตีนอ่ืนอีก 2 แถบ แสดงวายังมีโปรตีนอ่ืนปนเปอนอยู ดังแสดงผลในรูปที่ 18 แถวที่ 4 บงชี้วาเอนไซมฟนอลออกซิเดสที่แยกไดโดยวิธีการนี้ยังไมบริสุทธิ์

5.3 โดยวิธี Preparative PAGE ครั้งที่ 2 เม่ือนําสารละลายเอนไซมเขมขนที่แยกไดจาก preparative PAGE ครั้งที่ 1 ไป

แยกตอโดย preparative PAGE ครั้งที่ 2 โดยตัดเฉพาะแถบโปรตีนในชวงแถบของเอนไซม ฟนอลออกซิเดสเพียงแถบเดียวอีกครั้ง แลวชะโปรตีนออกจากเนื้อเจลในทํานองเดียวกัน พบวาสารละลายเอนไซมเขมขนมีปริมาณโปรตีนรวม 0.0115 มิลลิกรัม คิดเปน 0.0016% ของซีรัมโปรตีนเริ่มตน มีแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสเปน 154 หนวย และมีแอคทิวิทีจําเพาะเปน 13,391.3 หนวย/มก.โปรตีน คิดเปน 3.06% และมีความบริสุทธิ์เพ่ิมขึ้น 1,957.79 เทา ของซีรัมเริ่มตน (ตารางที่ 4) แตเม่ือทดสอบความบริสุทธิ์โดยการทํา nondenaturing PAGE ปรากฏแถบโปรตีน 3 แถบ (รูปที่ 18 แถวที่ 5) ที่มีแบบแผนโปรตีนคลายกับการแยกดวย preparative PAGE ครั้งที่ 1 บงชี้วายังไมสามารถแยกไดเอนไซมที่บริสุทธิ์ โดยเอนไซมฟนอลออกซิเดสที่แยกไดมีความบริสุทธิ์บางสวน หรืออาจเปนเพราะเอนไซมฟนอลออกซิเดสที่ผานกระบวนการทําบริสุทธิ์มีการแตกของ aggregated form จึงปรากฏโปรตีนหลายแถบในเจลอิเล็กโทรฟอรีซิส ผลที่แทจริงเปนเชนไร ตองมีการศึกษาโดยละเอียดตอไป เน่ืองจากยังไมเคยมีรายงานเกี่ยวกับมวลโมเลกุลของเอนไซมน้ีในรูป native form แตพบวาเอนไซมฟนอลออกซิเดสบริสุทธิ์ของกุง P. californiensis ปรากฏ aggregated form และ monomer ขนาด 205 และ 114 kDa ตามลําดับ ใน SDS-PAGE (Gollas-Galvan et al., 1999) ทั้งน้ีเอนไซมฟนอลออกซิเดสที่ทําใหบริสุทธิ์จากครัสเตเชียนสวนใหญปรากฏโปรตีนเพียงแถบเดียวหรือเปน monomer ที่มีมวลโมเลกุลในชวง 60-77 kDa ใน SDS-PAGE (Hara et al., 1993; Fujimoto et al., 1993; Liu et al., 2006)

เน่ืองจากในการทําบริสุทธิ์ 3 ขั้นตอน สามารถแยกไดเอนไซมฟนอลออกซิเดส ที่บริสุทธิ์บางสวนและไดปริมาณที่นอยมาก จึงเปนการยากที่จะทําใหไดเอนไซมบริสุทธิ์ งาน

64

วิทยานิพนธน้ีจึงไมไดทําใหเอนไซมฟนอลออกซิเดสบริสุทธิ์ตอ แตศึกษาสมบัติของเอนไซม ฟนอลออกซิเดสที่บริสุทธิ์บางสวนแทน

6. การศึกษาสมบัติทางชีวเคมีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสที่บริสุทธ์ิบางสวน เพ่ือใหการเขียนวิทยานิพนธกระชับและเขาใจไดงาย ในงานนี้จึงขอเขียนถึงเอนไซมฟนอลออกซิเดสที่บริสุทธิ์บางสวนวาเปนเอนไซม ppPO (partial purified PO) 6.1 ผลของ pH จากการศึกษาผลของ pH ตอการทํางานของเอนไซม ppPO พบวาเอนไซมเรงปฏิกิริยาไดแตกตางกันในสารผสมปฏิกิริยาที่มี pH แตกตางกันในชวง pH 6-11 โดยเอนไซม ppPO ไมมีแอคทิวิทีที่ pH 6 แตมีแอคทิวิทีต่ําสุดที่ pH 6.5 (25.7%) และมีแอคทิวิทีเพ่ิมขึ้นตามลําดับเม่ือทําปฏิกิริยาที่ pH 7 (42.8%) และสูงที่สุดที่ pH 9 (100%) จากนั้นแอคทิวิทีลดลงเม่ือ pH มีคาเพิ่มขึ้น ดังแสดงผลในรูปที่ 19 จากผลการทดลองพบวาเอนไซม ppPO ของกุงแชบวยมีแอคทิวิทีสูงสุดที่ pH 9 ใกลเคียงกับเอนไซมฟนอลออกซิเดสที่พบจากแหลงอ่ืน ๆ เชนเอนไซมฟนอลออกซิเดสที่ทําใหบริสุทธิ์จากหนอนกระทูกินยอด H. virescens และจากทากน้ําจืด B. glabrata มีแอคทิวิทีสูงสุดที่ pH 9.5 ในกุง P. californiensis และจากหอยนางรม S. glomerata มีแอคทิวิทีสูงสุดที่ pH 8.0 (Gollas-Galvan et al., 1999; Aladaileh et al., 2007) เอนไซมฟนอลออกซิเดสของกุง P. setiferus มีแอคทิวิทีสูงสุดที่ pH 7.5 (Simpson et al., 1987) คลายกับเอนไซมฟนอลออก ซิเดสบริสุทธิ์จากเพรียง Botryllus schlosseri ทํางานไดดีที่สุดที่ pH 7.0-7.5 สวนในกุงนางและหอยสองฝา R. philippinarum มีแอคทิวิทีสูงสุดที่ pH 7.0 (Opoku-Gyaumfua et al., 1992; Cong et al., 2005) เอนไซมฟนอลออกซิเดสจากกุงมังกร P. argus มีแอคทิวิทีสูงสุดที่ pH 6.5 (Chen et al., 1991) ในกุงกุลาดํา ปู C. japonica และกุง P. chinensis เอนไซมทํางานไดดีที่สุดที่ pH 6.0 (Rolle et al., 1991) จึงกลาวไดวาเอนไซมฟนอลออกซิเดสสามารถทํางานไดดีที่ pH เปนกลางและเปนเบส การที่เอนไซมฟนอลออกซิเดสทํางานไดดีที่สุดที่ pH แตกตางกันไปในสิ่งมีชีวิตแตละชนิด อาจเปนไดเน่ืองจากสิ่งมีชีวิตตางกันในแตละชนิด (species) และการมีชีวิตในสภาวะที่แตกตางกัน (Liu et al., 2006)

65

0

20

40

60

80

100

120

4 6 8 10 12

pH

Act

ivity

(%)

รูปที่ 19 ผลของ pH ตอแอคทิวทิีของเอนไซมฟนอลออกซิเดส

ที่บริสุทธ์ิบางสวน

66

0

20

40

60

80

100

120

0 20 40 60 80

Temperature (°C)

Act

ivity

(%)

6.2 ความเสถียรตออุณหภูมิ จากการทดสอบความเสถียรตออุณหภูมิของเอนไซม ppPO โดยการบม

เอนไซมที่อุณหภูมิ 25-80°ซ นาน 30 นาที แลวทําใหเย็นโดยแชบนน้ําแข็ง หลังจากนั้นนําไปหาแอคทิวิทีที่เหลือเปรียบเทียบกับเอนไซมซ่ึงเก็บไวที่ 0°ซ นาน 30 นาที พบวาเอนไซม ppPO มีความเสถียรตออุณหภูมิในชวง 0-40°ซ และเริ่มมีแอคทิวิทีลดลงอยางรวดเร็วเม่ือบมที่อุณหภูมิ 60-70°ซ จนเสียแอคทิวิทีอยางสมบูรณที่ 80°ซ (รูปที่ 20) ในทํานองเดียวกับเอนไซม ฟนอลออกซิเดสจากกุง Pink ที่สูญเสียแอคทิวิทีที่อุณหภูมิมากกวา 40 °ซ (Simpson et al., 1988) และคลายกับเอนไซมฟนอลออกซิเดสที่ทําใหบริสุทธิ์จากกุงลายเสือและกุง P. setiferus ที่สูญเสียแอคทิวิทีที่อุณหภูมิมากกวา 50 °ซ (Benjakul, 2005; Simpson et al., 1987) จะเห็นไดวาเอนไซมฟนอลออกซิเดสมีโครงสรางเปนโปรตีนซ่ึงถูกทําใหแปลงสภาพไดเม่ือบมที่อุณหภูมิสูงทําใหสูญเสียแอคทิวิที

รูปที่ 20 ความเสถียรตออุณหภูมิของเอนไซมฟนอลออกซิเดสที่บริสุทธ์ิบางสวน

67

6.3 จลนศาสตร จากการศึกษาผลของสับสเตรท L-DOPA ตอแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออก

ซิเดสที่บริสุทธิ์บางสวน โดยการทําปฏิกิริยากับ L-DOPA ที่ความเขมขนตาง ๆ คือ 0.33, 0.4, 0.5, 0.67, 0.8, 1.0, 1.33, 2.0, 3.0, 5.0 และ 10.0 mM พบวาเอนไซม ppPO มีจลนศาสตรแบบ hyperbola (รูปที่ 21A) และจากการหาคา KM และ Vmax โดยการเขียนกราฟแบบ Lineweaver-Burk (รูปที่ 21B) พบวาเอนไซม ppPO มีคา KM สําหรับ L-DOPA เทากับ 1.75 mM และ คา Vmax เทากับ 0.0625 A490/min ซ่ึงมีคาใกลเคียงกับเอนไซมฟนอลออกซิเดส บริสุทธิ์ที่แยกจากกุง P. chinensis โดยมีคา KM เทากับ 1.99 mM (Fan and Wang, 2002) เอนไซมฟนอลออกซิเดสที่ทําใหบริสุทธิ์จากหอยสองฝา R. philippinarum จากหนอนกระทูกินยอด H. virescens และจาก brown shrimp มีคา KM เทากับ 2.2, 2.25 และ 2.5 mM ตามลําดับ (Cong et al., 2005; Lockey and Ourth, 1992; Gollas-Galvan et al., 1999) สวนในปู C. japonica และกุง P. japonicus พบวาเอนไซมฟนอลออกซิเดสบริสุทธิ์มีคา KM เทากับ 1.70 และ 1.73 mM ตามลําดับ (Liu et al., 2006; Zhao et al., 1997) ซ่ึงมีคา KM ใกลเคียงกับของเอนไซม ppPO ของกุงแชบวย

68

A

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0 2 4 6 8 10 12

L-DOPA (mM)

V (A

490/

min

)

B

0

20

40

60

80

100

120

-1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

1/[L-DOPA] (mM-1)

1/V

(A49

0/m

in-1

)

รูปที่ 21 จลนศาสตรแบบ Hyperbola (A) และแบบ Lineweaver-Burk (B) ของเอนไซมฟนอลออกซิเดสที่บรสิุทธ์ิบางสวน

69

6.4 ความจําเพาะตอสับสเตรท เม่ือนําสารละลายเอนไซมฟนอลออกซิเดสที่ทําใหบริสุทธิ์บางสวน ไปตรวจหาความจําเพาะตอสับสเตรท เม่ือใชสับสเตรทที่แตกตางกัน ไดแก catechol, L-DOPA และ dopamine โดยใชความเขมขนของ L-DOPA และ dopamine ที่ 2 ความเขมขน คือ 1.75 mM (คา KM) และ 5 mM สวน catechol ใชที่ความเขมขน 5 mM พบวา เอนไซม ppPO มีความจําเพาะตอสับสเตรท 2 ชนิดคือ L- DOPA และ dopamine ในระดับไมแตกตางกัน และไมพบแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสของกุงแชบวยตอ catechol ดังแสดงในตารางที่ 5 ในกุง P. californiensis พบวาเอนไซมฟนอลออกซิเดสมีความจําเพาะตอสับสเตรท L-DOPA (KM 2.5 mM) มากกวา catechol (KM 2.89 mM) (Gollas-Galvan et al., 1999) แตในรากของกลวย (Musa acuminate Grand naine) พบวาเอนไซมฟนอลออกซิเดสมีความจําเพาะตอสับสเตรท dopamine มากที่สุด รองลงมาคือ L-DOPA และ catechol ตามลําดับ (Wuyts et al., 2006) ตารางที่ 5 ความจําเพาะตอสับสเตรทของเอนไซมฟนอลออกซิเดสที่บริสุทธ์ิบางสวน

L-DOPA Dopamine Catechol

1.75 mM 5 mM 1.75 mM 5 mM 5 mM Activity (U/ml) 138 212 110 224 0 Activity (%) 65.09 100 51.88 105.66 0

จากการศึกษาสมบัติของเอนไซมฟนอลออกซิเดสบริสุทธิ์บางสวนที่แยกจากซีรัมของกุงแชบวยในงานวิทยานิพนธน้ี สรุปสมบัติตาง ๆของเอนไซม ไดดังแสดงในตารางที่ 6 ตารางที่ 6 สมบัติของเอนไซมฟนอลออกซิเดสทีบ่ริสุทธ์ิบางสวนของกุงแชบวย

Properties Phenoloxidase

Optimal pH 9.0 Temperature stability 0-40 °C

Kinetics Hyperbola KM 1.75 mM

Vmax 0.0625 A490/min

70

7. การศึกษาระดับของเอนไซมฟนอลออกซิเดสตอการติดเชือ้กอโรค V. Harveyi ที่เลีย้งบนอาหารแข็ง TSA

7.1 การเปลี่ยนแปลงระดับแอคทิวิทีและแอคทิวิทีจําเพาะของเอนไซมฟนอล ออกซิเดสตามเวลาหลังการฉีดกุงดวย V. harveyi

จากการติดตามแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมของกุงแชบวยที่ฉีดดวย V. harveyi ปริมาณ 5 x 109 เซลลตอตัวกุง แลวเก็บฮีโมลิมฟที่เวลากอนฉีดและที่เวลาตางๆ หลังการฉีด พบวาแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสเพิ่มขึ้นตามเวลาตอบสนองตอการติดเชื้อ (รูปที่ 22) โดยมีคาแอคทิวิทีเพ่ิมขึ้นจากชั่วโมงที่ 0 เปน 1.59 เทา ณ ชั่วโมงที่ 6 และเพ่ิมขึ้นเปน 1.88 เทา ณ ชั่วโมงที่ 12 จากนั้นมีคาเพิ่มสูงสุด ณ ชั่วโมงที่ 18 เปน 2.00 เทา ดังแสดงผลในตารางที่ 7 เม่ือเปรียบเทียบกับแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมของกุงชุดควบคุมที่ฉีดดวยน้ําเกลือพบวามีระดับเปลี่ยนแปลงไมแตกตางกันมากนัก ดังแสดงผลในรูปที่ 22 และตารางที่ 7 ในทํานองเดียวกัน เม่ือติดตามแอคทิวิทีจําเพาะของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมของกุงแชบวยที่ฉีดดวย V. harveyi ชุดเดียวกัน พบวาแอคทิวิทีจําเพาะของเอนไซมเพ่ิมขึ้นตามเวลาตอบสนองตอการติดเชื้อ โดยมีคาแอคทิวิทีจําเพาะเพิ่มขึ้นจากชั่วโมงที่ 0 (7.27 + 1.64 หนวย/มก.โปรตีน) เปน 13.87 + 2.71 หนวย/มก.โปรตีน ณ ชั่วโมงที่ 6 และเพิ่มขึ้นเปน 20.57 + 3.75 หนวย/มก.โปรตีน ณ ชั่วโมงที่ 12 จากนั้นมีคาเพิ่มสูงสุด ณ ชั่วโมงที่ 18 (26.27 + 3.70 หนวย/มก.โปรตีน) (ตารางที่ 7) และเนื่องจากพบวาปริมาณโปรตีนในซีรัมของกุงมีคาคอย ๆ ลดลงตามเวลา (ไมไดแสดงผลไว) จึงสงผลทําใหคาแอคทิวิทีจําเพาะของเอนไซมฟนอล ออกซิเดสมีคาเพิ่มขึ้น การที่โปรตีนในซีรัมของกุงชุดควบคุมที่ฉีดดวยน้ําเกลือมีปริมาณลดลงตามเวลา ไมสามารถบอกสาเหตุที่แทจริงไดซ่ึงกําลังอยูในระหวางการศึกษาตอไป สวนหนึ่งอาจเปนเพราะกุงกินอาหารนอยกวาปกติตลอดชวงเวลาที่ทดลองจึงไมไดสังเคราะหโปรตีนเพ่ิมเติมและอาจเปนผลจากการเจาะฮีโมลิมฟทุก 6 ชั่วโมง ประกอบดวย ในทํานองเดียวกัน พบวาโปรตีนในซีรัมของกุงชุดทดลองที่ฉีดดวยเชื้อ V. harveyi มีปริมาณลดลงตามเวลาในอัตราที่ไมตางจากของชุดควบคุม บงชี้วาการฉีดเชื้อไมไดเปนสาเหตุที่ทําใหปริมาณโปรตีนในซีรัมของกุงแชบวยลดลงตามเวลาที่ศึกษา ซ่ึงสงผลทําใหคาแอคทิวิทีจําเพาะของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในกุงเหลานี้มีคาเพิ่มสูงกวาระดับแอคทิวิทีของเอนไซม เม่ือเปรียบเทียบการเปลี่ยนแปลงที่ชั่วโมงอ่ืนๆ กับชั่วโมงที่ 0 (กอนฉีด) พบระดับแอคทิวิทีจําเพาะของเอนไซมในซีรัมของกุงที่ฉีดเชื้อเพ่ิมขึ้นเปน 1.91 และ 2.83 เทา ที่ชั่วโมง 6 และ 12 ตามลําดับ และเพิ่มมากสุดเปน 3.61 เทา ที่ชั่วโมง 18 (ตารางที่ 7) สวนแอคทิวิทีจําเพาะของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมของกุงชุดควบคุมที่ฉีดดวยน้ําเกลือพบวามีระดับเปลี่ยนแปลงไมแตกตางกันมากนัก ดังแสดงผลในตารางที่ 7

71

ผลการทดลองนี้แสดงใหเห็นวาระดับเอนไซมฟนอลออกซิเดสในฮีโมลิมฟถูกกระตุนใหเพ่ิมขึ้นจากแบคทีเรียกอโรค โดยกุงมีการตอบสนองตอเชื้อกอโรคที่รุกรานในชวงหลังฉีดแบคทีเรียดวยการหลั่งหรือสังเคราะหเอนไซมเพ่ิมขึ้นใน 6-18 ชั่วโมง เพ่ือชวยในการยับยั้งการรุกรานของแบคทีเรีย สังเกตไดจากหลังการฉีดเชื้อ 6 ชั่วโมง เปนตนไป กุงจะไมกินอาหาร แสดงอาการออนเพลีย เร่ิมวายน้ํานอยลง บางตัวจะนอนนิ่ง ๆ และตายหลัง 24 ชั่วโมง เน่ืองจาก ณ ชั่วโมงที่ 18 และ 24 กุงมักออนแอมาก ดูดฮีโมลิมฟไดไมมากพอ งานวิทยานิพนธน้ีจึงไมไดวัดแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสที่ชั่วโมงดังกลาวในการทดลองตอ ๆ ไป

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

0 6 12 18

Hour after injection

Activ

ity (U

/ml)

Control

V.harveyi

รูปที่ 22 แอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัม ณ เวลาตางๆ หลังการฉีดดวยเชื้อ V. harveyi

กุงฉีดดวยเชื้อ V. harveyi ตวัละ 5x109 เซลล (n = 3) กุงชุดควบคุมฉีดดวยน้ําเกลือ (n = 3)

73

7.2 การเปลี่ยนแปลงระดับแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสตามปริมาณ เชื้อ V. Harveyi ที่ฉีดในชวง 2-5 x 107 เซลลตอตัวกุง

จากการเหนี่ยวนําใหกุงแชบวยติดเชื้อโดยการฉีดกุงดวยเชื้อ V. harveyi แบบ active และเลี้ยงบนอาหารแข็ง TSA ปริมาณตางๆ ดังน้ี คือ 2 x 107, 3 x 107, 4 x 107 และ 5 x 107 เซลลตอตัวกุง เพ่ือหาปริมาณเชื้อที่เหมาะสมในการกระตุนใหกุงตอบสนองไดอยางชัดเจน แลวติดตามระดับแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมที่เวลากอนการกระตุน คือ ที่ 0 ชั่วโมง และที่เวลาหลังการกระตุน คือ ที่ 6 และ 12 ชั่วโมง จากการทดลองพบผลเปนดังน้ีคือจํานวนเชื้อ V. harveyi ที่ใชฉีดปริมาณ 2 x 107 เซลลตอตัวกุง ทําใหแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมซ่ึงคิดเปนหนวยตอมิลลิลิตรของซีรัม มีคาลดลงเล็กนอยในชั่วโมงที่ 6 (0.92 เทา) และมีแอคทิวิทีของเอนไซมที่ 12 ชั่วโมงคงที่ (1 เทา) เม่ือเทียบกับชั่วโมงที่ 0 (กอนฉีด) ดังแสดงผลในรูปที่ 23A และตารางที่ 8 แสดงวาปริมาณเชื้อ 2 x 107 เซลลตอตัวกุง ไมมีผลใหระดับแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสเพิ่มสูงขึ้นหรืออีกนัยหน่ึงก็คือไมสามารถกระตุนใหกุงตอบสนองตอการติดเชื้อได เม่ือเพ่ิมปริมาณเชื้อที่ใชฉีดกุงเปน 3 x 107 และ 4 x 107 เซลลตอตัวกุง พบวาปริมาณเชื้อดังกลาวสามารถกระตุนระดับแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมมีแนวโนมใกลเคียงกันเปน 1.27 และ 1.31 เทา ตามลําดับ ที่ 6 ชั่วโมงหลังการฉีด และเพ่ิมสูงสุดเปน 1.35 และ 1.44 เทา ตามลําดับ ที่ 12 ชั่วโมงหลังการฉีด เม่ือเทียบกับของกุงชุดเดียวกัน ณ ชั่วโมงที่ 0 (รูปที่ 23B และ 23C และตารางที่ 8) สําหรับปริมาณเชื้อ 5 x 107 เซลลตอตัวกุง ซ่ึงเปนปริมาณเชื้อมากที่สุดในชุดการทดลองนี้ ทําใหแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสเพิ่มขึ้นเปน 1.40 เทา ที่ 6 ชั่วโมงหลังการฉีด และเพ่ิมสูงสุดเปน 1.57 เทา ที่ 12 ชั่วโมงหลังการฉีด (รูปที่ 23D และตารางที่ 8) เม่ือเทียบกับของกุงชุดเดียวกัน ณ ชั่วโมงที่ 0 จะเห็นไดวาการเพิ่มของแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมมีแนวโนมแปรผันตามปริมาณเชื้อ V. harveyi แบบ active ที่ใชฉีดและเพ่ิมสูงสุดเม่ือใชเชื้อ 5 x 107 เซลลตอตัวกุง สวนแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมของกุงชุดควบคุมที่ฉีดดวยน้ําเกลือมีระดับลดลงเล็กนอยเปน 0.90 และ 0.80 เทา ที่ 6 และ 12 ชั่วโมงหลังการฉีด ตามลําดับ ดังแสดงผลในตารางที่ 8 และรูปที่ 23E

74

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 6 12Hour after injection

Activ

ity (f

old of

U/m

l)

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 6 12Hour after injection

Activ

ity (f

old of

U/m

l)

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 6 12Hour after injection

Activ

ity (f

old o

f U/m

l)

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 6 12Hour after injection

Activi

ty (fo

ld of

U/ml

)

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 6 12Hour after injection

Activ

ity (f

old of

U/m

l)

รูปที่ 23 แอคทิวทิีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมของกุงที่ฉดีเชื้อ V. harveyi ที่เลีย้งบนอาหารแข็ง TSA ปริมาณ 2-5 x 107 เซลล/ตัวกุง

A 2x107 cells/shrimp N=3 B 3x107 cells/shrimp N=2

C 4x107 cells/shrimp N=3 D 5x107 cells/shrimp N=2

E Control N=3

76

ในการคํานวณหาคาแอคทิวิทีจําเพาะของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในกุงเหลานี้ขางตน โดยเปรียบเทียบคาในกุงแตละชุดทดลองกับคากอนฉีด (0 ชั่วโมง) พบวาในกุงชุดควบคุมคาแอคทิวิทีจําเพาะของเอนไซมมีคาคอนขางคงที่เปน 0.97 และ 1 เทา ที่ 6 และ 12 ชั่วโมงหลังการฉีด ตามลําดับ เม่ือเทียบกับคาของกุงชุดเดียวกัน ณ ชั่วโมงที่ 0 (รูปที่ 24E และตารางที่ 9) ทั้งน้ีเพราะพบวาปริมาณโปรตีนในซีรัมของกุงชุดควบคุมที่ฉีดดวยน้ําเกลือมีคาคอยๆ ลดลงตามเวลา (ไมไดแสดงผลไว) เน่ืองจากแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดส (หนวย/มล.ซีรัม) ของตัวอยางเดียวกันลดลงเล็กนอยตามเวลา (ตารางที่ 8) จึงสงผลทําใหคาแอคทิวิทีจําเพาะของเอนไซมฟนอลออกซิเดสมีคาคงที่ ณ 6 และ 12 ชั่วโมงหลังการฉีด เชน เดียวกัน พบวาโปรตีนในซีรัมของกุงชุดทดลองทุกชุดที่ฉีดดวยเชื้อ V. harveyi มีปริมาณลดลงตามเวลาในอัตราที่ไมตางจากของชุดควบคุม บงชี้วาการฉีดเชื้อไมไดเปนสาเหตุที่ทําใหปริมาณโปรตีนในซีรัมของกุงแชบวยลดลงตามเวลาที่ศึกษา ในทํานองเดียวกันการลดลงของปริมาณโปรตีนในซีรัมของกุงที่ฉีด V. harveyi ทุกปริมาณ สงผลทําใหคาแอคทิวิทีจําเพาะ (หนวย/มก.โปรตีน) ของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในกุงเหลานี้มีคาเพิ่มสูงกวาระดับแอคทิวิที (หนวย/มล.ซีรัม) ของเอนไซม ดังแสดงผลในตารางที่ 9 กลาวคือ แอคทิวิทีจําเพาะของกุงที่ฉีดดวยเชื้อปริมาณ 2 x 107 เซลลตอตัวกุง มีคาเพิ่มขึ้นเปน 1.16 และ 1.44 เทา ณ ชั่วโมงที่ 6 และ 12 ตามลําดับ เม่ือเทียบกับชั่วโมงที่ 0 (กอนฉีด) ดังแสดงผลในรูปที่ 24A และตารางที่ 9 เม่ือ เพ่ิมปริมาณเชื้อที่ใชฉีดกุงเปน 3 x 107 และ 4 x 107 เซลลตอตัวกุง พบวาปริมาณเชื้อดังกลาวสามารถกระตุนระดับแอคทิวิทีจําเพาะของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมมีแนวโนมใกลเคียงกันเปน 1.37 และ 1.38 เทา ตามลําดับ ที่ 6 ชั่วโมงหลังการฉีด และเพิ่มสูงสุดเปน 1.69 และ 1.77 เทา ตามลําดับ ที่ 12 ชั่วโมงหลังการฉีด เม่ือเทียบกับของกุงชุดเดียวกัน ณ ชั่วโมงที่ 0 (รูปที่ 24B และ 24C และตารางที่ 9) สําหรับปริมาณเชื้อ 5 x 107 เซลลตอตัวกุง ซ่ึงเปนปริมาณเชื้อมากที่สุดในชุดการทดลองนี้ เหน่ียวนําใหแอคทิวิทีจําเพาะของเอนไซมฟนอลออกซิเดสเพ่ิมขึ้นเปน 1.60 เทา ที่ 6 ชั่วโมง และเพิ่มสูงสุดเปน 2.30 เทา ที่ 12 ชั่วโมง หลังการฉีด (รูปที่ 24D และตารางที่ 9) เม่ือเทียบกับของกุงชุดเดียวกัน ณ ชั่วโมงที่ 0 จะเห็นไดวาการเพิ่มของแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมมีแนวโนมแปรผันตามปริมาณเชื้อ V. harveyi แบบ active ที่ใชฉีดและเพิ่มสูงสุดเม่ือใชเชื้อ 5 x 107 เซลลตอตัวกุง

77

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 6 12Hour after injection

Spec

ific ac

tivity

(fold

of U

/mg)

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 6 12Hour after injection

Spec

ific ac

tivity

(fold

of U

/mg)

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 6 12Hour after injection

Spec

ific ac

tivity

(fold

of U

/mg)

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 6 12Hour after injection

Spec

ific ac

tivity

(fold

of U/

mg)

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

0 6 12Hour after injection

Spec

ific ac

tivity

(fold

of U

/mg)

รูปที่ 24 แอคทิวทิีจําเพาะของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมของกุงทีฉ่ีดเชื้อ V. harveyi ที่เลีย้งบนอาหารแข็ง TSA ปริมาณ 2 - 5 x 107 เซลล/ตัวกุง

A 2x107 cells/shrimp N=3 B 3x107 cells/shrimp N=2

C 4x107 cells/shrimp N=3 D 5x107 cells/shrimp N=2

E Control N=3

79

7.3 การเปลี่ยนแปลงระดับแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสตามปริมาณเชื้อ V. Harveyi ที่ฉีดในชวง 5 x 106 – 5 x 109 เซลลตอตัวกุง

จากการฉีดกุงดวย V. harveyi แบบ active ที่ไดจากการเลี้ยงบนอาหารแข็ง TSA ในปริมาณดังน้ี คือ 2 x 107, 3 x 107, 4 x 107 และ 5 x 107 เซลลตอตัวกุง พบวาแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมมีแนวโนมแปรผันตามปริมาณเชื้อ V. harveyi ที่ใชฉีดและเพ่ิมสูงสุดเม่ือใชเชื้อปริมาณ 5 x 107 เซลลตอตัวกุง (รูปที่ 23D และตารางที่ 8) เพ่ือหาปริมาณเชื้อ V. harveyi ที่มากกวาปริมาณดังกลาวในการกระตุนใหกุงตอบสนองไดมากขึ้น จึงไดลองฉีดกุงดวย V. harveyi ชนิดเดิม แตใชปริมาณในชวง 5 x 106, 5 x 107, 5 x 108 และ 5 x 109 เซลลตอตัวกุง ไดผลดังแสดงในตารางที่ 10 โดยพบวาการฉีดกุงดวยเชื้อ V. harveyi 5 x 106 เซลลตอตัวกุง ทําใหแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมซ่ึงคิดเปนหนวยตอมิลลิลิตรของซีรัม มีคาเพิ่มขึ้นเล็กนอยในชั่วโมงที่ 6 (1.17 เทา) และเพิ่มมากขึ้นที่ 12 ชั่วโมง เปน 1.26 เทา เม่ือเทียบกับชั่วโมงที่ 0 (กอนฉีด) (รูปที่ 25A และตารางที่ 10) เม่ือเพ่ิมปริมาณเชื้อที่ใชฉีดกุงเปน 5 x 107 และ 5 x 108 เซลลตอตัวกุง พบวาปริมาณเชื้อดังกลาวสามารถกระตุนระดับแอค ทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมมีแนวโนมใกลเคียงกันเปน 1.40 และ 1.50 เทา ตามลําดับ ที่ 6 ชั่วโมง และเพ่ิมสูงสุดเปน 1.57 และ 1.76 เทา ตามลําดับ ที่ 12 ชั่วโมง หลังการฉีด เม่ือเทียบกับของกุงชุดเดียวกัน ณ ชั่วโมงที่ 0 (รูปที่ 25B และ 25C และตารางที่ 10) สําหรับปริมาณเชื้อ 5 x 109 เซลลตอตัวกุง ซ่ึงเปนปริมาณเชื้อมากที่สุดในชุดการทดลองนี้ ทําใหแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสเพิ่มขึ้นเปน 1.59 เทา ที่ 6 ชั่วโมง และเพิ่มสูงสุดเปน 1.88 เทา ที่ 12 ชั่วโมง หลังการฉีด (รูปที่ 25D และตารางที่ 10) เม่ือเทียบกับของกุงชุดเดียวกัน ณ ชั่วโมงที่ 0 จะเห็นไดวาการเพิ่มของแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมแปรผันตามปริมาณเชื้อ V. harveyi แบบ active ที่ใชฉีดและเพิ่มสูงสุดเม่ือใชเชื้อ 5 x 109 เซลลตอตัวกุง

80

0

0.5

1

1.5

2

0 6 12Hour after injection

Activ

ity (f

old of

U/m

l)

0

0.5

1

1.5

2

0 6 12Hour after injection

Activ

ity (f

old of

U/m

l)

0

0.5

1

1.5

2

0 6 12Hour after injection

Activ

ity (f

old of

U/m

l)

0

0.5

1

1.5

2

0 6 12Hour after injection

Activ

ity (f

old of

U/m

l)

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 6 12Hour after injection

Activ

ity (f

old of

U/m

l)

รูปที่ 25 แอคทิวทิีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมของกุงที่ฉดีเชื้อ V. harveyi ที่เลีย้งบนอาหารแข็ง TSA ปริมาณ 5 x 106 - 5 x 109 เซลล/ตัวกุง

E Control N=3

A 5x106 cells/shrimp N=3 B 5x107 cells/shrimp N=2

C 5x108 cells/shrimp N=3 D 5x109 cells/shrimp N=8

82

ในทํานองเดียวกัน เม่ือคํานวณหาคาแอคทิวิทีจําเพาะของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในกุงเหลานี้ พบวาแอคทิวิทีจําเพาะของกุงที่ฉีดดวยเชื้อปริมาณ 5 x 106 เซลลตอตัวกุง ทําใหแอคทิวิทีจําเพาะของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัม (หนวย/มก.โปรตีนของซีรัม) มีคาเพ่ิมขึ้นในชั่วโมงที่ 6 (1.33 เทา) และที่ 12 ชั่วโมง (1.51 เทา) เม่ือเทียบกับชั่วโมงที่ 0 (กอนฉดี) ดังแสดงผลในรูปที่ 26A และตารางที่ 11 แสดงวาปริมาณเชื้อ 5 x 106 เซลลตอตัวกุง มีผลทําใหระดับแอคทิวิทีจําเพาะของเอนไซมฟนอลออกซิเดสเพิ่มขึ้นไมมากนัก เม่ือเพ่ิมปริมาณเชื้อที่ใชฉีดกุงเปน 5 x 107 และ 5 x 108 เซลลตอตัวกุง พบวาปริมาณเชื้อดังกลาวสามารถกระตุนระดับแอคทิวิทีจําเพาะของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมใหเพ่ิมขึ้นเปน 1.60 และ 1.72 เทา ตามลําดับ ที่ 6 ชั่วโมงหลังการฉีด และเพ่ิมสูงสุดเปน 2.30 และ 2.38 เทา ตามลําดับ ที่ 12 ชั่วโมงหลังการฉีด เม่ือเทียบกับคา ณ ชั่วโมงที่ 0 (รูปที่ 26B และ 26C และตารางที่ 11) สําหรบัปริมาณเชื้อ 5 x 109 เซลลตอตัวกุง ซ่ึงเปนปริมาณเชื้อมากที่สุดในชุดการทดลองนี้ ทําใหแอค ทิวิทีจําเพาะของเอนไซมฟนอลออกซิเดสเพิ่มขึ้นเปน 1.91 เทา ที่ 6 ชั่วโมงหลังการฉีด และเพิ่มสูงสุดเปน 2.83 เทา ที่ 12 ชั่วโมงหลังการฉีด (รูปที่ 26D และตารางที่ 11) เม่ือเทียบกับของกุงชุดเดียวกัน ณ ชั่วโมงที่ 0 จะเห็นไดวาการเพิ่มของแอคทิวิทีจําเพาะของเอนไซมฟนอลออก ซิเดสในซีรัมมีแนวโนมแปรผันตามปริมาณเชื้อ V. harveyi แบบ active ที่ใชฉีดและเพิ่มสูงสุดเม่ือใชเชื้อ 5 x 109 เซลลตอตัวกุง ดังจะเห็นไดวาคาแอคทิวิทีจําเพาะของเอนไซมฟนอลออก ซิเดสในซีรัมของกุงชุดนี้มีการเพิ่มขึ้นมากกวาชุดอ่ืน ณ ที่ 6 และ 12 ชั่วโมงหลังการฉีด ดังน้ันการฉีดกุงดวย V. harveyi ที่เลี้ยงบนอาหารแข็ง TSA ปริมาณ 5 x 109 เซลลตอตัวกุง จึงเปนปริมาณที่เหมาะสมที่ทําใหกุงติดเชื้อและตอบสนองไดดี

83

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

0 6 12Hour after injection

Spec

ific ac

tivity

(fold

of U

/mg)

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

0 6 12Hour after injection

Spec

ific ac

tivity

(fold

of U

/mg)

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

0 6 12Hour after injection

Spec

ific ac

tivity

(fold

of U

/mg)

00.5

11.5

2

2.5

3

0 6 12Hour after injection

Spec

ific ac

tivity

(fold

of U

/mg)

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

0 6 12Hour after injection

Spec

ific ac

tivity

(fold

of U

/mg)

รูปที่ 26 แอคทิวทิีจําเพาะของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมของกุงทีฉ่ีดเชื้อ V. harveyi ที่เลีย้งบนอาหารแข็ง TSA ปริมาณ 5 x 106 - 5 x 109 เซลล/ตัวกุง

A 5x106 cells/shrimp N=3 B 5x107 cells/shrimp N=2

C 5x108 cells/shrimp N=3 D 5x109 cells/shrimp N=8

E Control N=3

85

คาแอคทิวิทีจําเพาะของเอนไซมฟนอลออกซิเดสเมื่อเปรียบเทียบที่เวลาเดียวกันหลังการฉีด มีแนวโนมที่จะมีคาเพิ่มขึ้นตามปริมาณเชื้อที่ใชฉีด ซ่ึงแสดงผลในตารางที่ 11 ดังเชน ณ ชั่วโมงที่ 6 หลังการฉีด กุงที่ฉีดดวยเชื้อปริมาณ 5 x 106, 5 x 107, 5 x 108 และ 5 x 109 เซลลตอตัวกุง มีแอคทิวิทีจําเพาะเพิ่มขึ้นเปน 1.33, 1.60, 1.72 และ 1.91 เทา ตามลําดับ เม่ือเทียบกับชั่วโมงที่ 0 ในขณะที่ ณ ชั่วโมงที่ 12 มีแอคทิวิทีจําเพาะเพิ่มขึ้นเปน 1.51, 2.30, 2.38 และ 2.83 เทา ตามลําดับ เม่ือเทียบกับชั่วโมงที่ 0 (ตารางที่ 11)

ในแตละชุดทดลองของกุงที่ฉีดเชื้อแตละปริมาณ คาแอคทิวิทีจําเพาะของเอนไซมฟนอลออกซิเดสมีรูปแบบแผนที่เหมือนกัน คือมีคาเพิ่มมากขึ้นที่ 6 ชั่วโมง และเพิ่มมากที่สุดที่ 12 ชั่วโมง เชนการฉีดกุงปริมาณ 5 x 109 เซลลตอตัวกุง จะมีแอคทิวิทีจําเพาะ ณ ชั่วโมงที่ 0, 6, 12 เปน 7.27 + 1.64, 13.87 + 2.71 และ 20.57 + 3.75 หนวย/มก.โปรตีน ตามลําดับ หรือคิดเปนปริมาณแอคทิวิทีจําเพาะที่เพ่ิมขึ้นเปน 1, 1.91 และ 2.83 เทา ตามลําดับ และในกรณีที่ฉีดกุงดวยปริมาณ 5 x 109 เซลลตอตัวกุง ซ่ึงไดวัดแอคทิวิทีที่ 18 ชั่วโมง ดวย พบวามีคาแอคทิวิทีจําเพาะเพิ่มขึ้นมากกวาที่ 6 และ 12 ชั่วโมง โดยมีคาเปน 26.27 + 3.50 หนวย/มก.โปรตีน หรือเพ่ิมเปน 3.61 เทา ของกอนฉีด (รูปที่ 22 และตารางที่ 7) บงชี้วาการเหน่ียวนําใหกุงแชบวยติดโรคโดยการฉีดดวยเชื้อกอโรค V. harveyi กุงจะปองกันตนเองดวยการตอบสนองโดยการหลั่งเอนไซมฟนอลออกซิเดสออกสูฮีโมลิมฟโดยพบแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัม (ฮีโมลิมฟ) เพ่ิมขึ้นตามเวลาที่ 6, 12 และ 18 ชั่วโมง และ/หรือกุงมีการตอบสนองการติดโรคดวยการสังเคราะหเอนไซมฟนอลออกซิเดสในชวงเวลา 6-18 ชั่วโมงหลังการฉีด ทั้งนี้เพราะพบวาแอคทิวิทีจําเพาะของเอนไซมฟนอลออกซิเดสมีคาเพิ่มขึ้นในชวงเวลาดังกลาว ในขณะที่โปรตีนอ่ืนในฮีโมลิมฟมีปริมาณลดลงอันเนื่องมาจากการอดอาหารมากกวาเปนผลมาจากการติดเชื้อ หรือกุงอาจหยุดสรางโปรตีนอ่ืนที่ใชในการดํารงชีวิตชั่วคราว รูปแบบการเพิ่มขึ้นของระดับแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสตามเวลาจากการเหน่ียวนําใหติดเชื้อโดย V. harveyi จะคลายกับการพบระดับแอคทิวิทีของเลคตินที่เพ่ิมขึ้นใน ฮีโมลิมฟตามเวลา ที่ 6 และ 12 ชั่วโมง และตามปริมาณเชื้อ V. harveyi ที่ใชฉีด แตระดับแอค ทิวิทีของเลคตินกลับลดลง ณ ชั่วโมงที่ 18 และ 24 (ปนนภา ลิ่มพานิช, 2550) เปนไปไดที่สวนประกอบของผนังเซลลของจุลินทรีย อาทิเชน เบตา-กลูแคนจากฟงไจ ลิโพโพลีแซคคาไรดจากแบคทีเรียแกรมลบและเปปทิโดไกลแคนจากแบคทีเรียแกรมบวกสามารถกระตุนระบบโปรฟนอลออกซิเดสในสัตวไมมีกระดูกสันหลังได โดยในกุงที่มีการติดเชื้อเกิดการเกาะกลุมของเซลลฮีโมไซทในบริเวณที่เกิดบาดแผลอยางรวดเร็ว เปนผลทําใหเอนไซมฟนอลออกซิเดสถูก หลั่งจากเซลลฮีโมไซทออกสูพลาสมา (Axelsen et al., 1975) เพ่ือไปจับกับจุลินทรียบุกรุกนําไปสูการสังเคราะหสารตัวกลางคือฟนอลซ่ึงเปนพิษตอจุลินทรีย โดยฟนอลจะเปนสารหลักในการปองกันการบุกรุกของจุลินทรียไมใหเขาสูรางกายของสัตวไมมีกระดูกสันหลังได (Song et al., 2003)

86

7. การศึกษาระดับแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมของกุงที่ฉีดดวย จุลินทรียชนิดตางๆ

จากผลการทดลองขางตน พบวาการฉีดกุงดวยเช้ือ V. harveyi ที่เลี้ยงบนอาหารแข็งปริมาณ 5x109 เซลลตอตัวกุง จะกระตุนแอคทิวิทีจําเพาะของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมไดดีกวาปริมาณอื่น ๆ จึงเปนปริมาณที่เหมาะสมในการกระตุนการติดเชื้อของกุงแชบวย ดังน้ันเพ่ือทดสอบความจําเพาะของเอนไซมฟนอลออกซิเดสตอจุลินทรียชนิดอ่ืน ไดทดลองฉีดแบคทีเรียชนิดอ่ืนซึ่งเลี้ยงบนอาหารแข็ง TSA ที่ปริมาณเดียวกันนี้ โดยใชกุงทดลองตัวผูขนาดกลางจํานวน 2-3 ตัว ตอเชื้อแตละชนิด แลวเปรียบเทียบแอคทิวิทีจําเพาะของเอนไซมฟนอลออกซิเดสที่เปลี่ยนแปลงไปหลังการฉีดเชื้อกับของกุงชุดที่ฉีดดวย V. harveyi แบบ active จากผลทดลองในตารางที่ 12 พบวาเ ม่ือฉีดกุ งแชบวยดวยเชื้อกอโรค V. harveyi แบบ active แอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมมีคาเพิ่มขึ้นอยางมีนัยสําคัญที่ความเชื่อม่ัน 95% ทั้งชั่วโมงที่ 6 และ 12 เปน 1.59 และ 1.88 เทา ตามลําดับ เม่ือเทียบกับคากอนการฉีด (0 ชั่วโมง) ซ่ึงตางจากการฉีดกุงดวย V. harveyi แบบ inactive ที่พบแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมเปลี่ยนแปลงนอยกวา โดยมีแอคทิวิทีลดลง ณ ชั่วโมงที่ 6 (0.89 เทา) และเพิ่มขึ้นเล็กนอย ณ ชั่วโมงที่ 12 เปน 1.26 เทา (รูปที่ 27A และตารางที่ 12) เม่ือเทียบกับชั่วโมงที่ 0 ในทํานองเดียวกันแอคทิวิทีจําเพาะของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมของกุงที่ฉีดดวยเชื้อกอโรค V. harveyi แบบ active มีคาเพิ่มขึ้นอยางมีนัยสําคัญที่ความเชื่อม่ัน 95% ทั้งชั่วโมงที่ 6 และ 12 เปน 1.91 และ 2.83 เทา ตามลําดับ เม่ือเทียบกับคากอนการฉีด (0 ชั่วโมง) ซ่ึงตางจากการฉีดกุงดวย V. harveyi แบบ inactive ที่พบแอคทิวิทีจําเพาะของเอนไซมในซีรัมมีคาเพิ่มขึ้นนอยกวา โดยมีแอคทิวิทีจําเพาะเพิ่มขึ้นเล็กนอย ณ ชั่วโมงที่ 6 และ 12 เปน 1.09 และ 1.71 เทา ตามลําดับ (รูปที่ 27B และตารางที่ 13) เม่ือเทียบกับชั่วโมงที่ 0 อาจเปนไดเน่ืองจากสวนประกอบของผนังเซลลของ V. harveyi แบบ inactive มีผลไปกระตุนใหระบบโปรฟนอลออกซิเดสหลั่งเอนไซมฟนอลออกซิเดสออกมาในปริมาณที่ผันแปรตามชั่วโมงหลังการติดเชื้อ แอคทิวิทีจึงเพ่ิมขึ้นเพ่ือกําจัดเซลลแบคทีเรียที่บุกรุก แตเน่ืองจากเชื้อชนิดนี้ถูกทําให inactive ไมสามารถเพิ่มปริมาณใหมากขึ้นไดเม่ือถูกฉีดเขาไปในตัวกุง ตางจากเชื้อ V. harveyi แบบ active ที่สามารถเพิ่มปริมาณใหมากขึ้นไดหลังจากถูกฉีดเขาไปแลว จึงเปนผลเหน่ียวนําใหแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมของกุงที่ฉีดเชื้อ V. harveyi แบบ inactive มีคาเพิ่มขึ้นนอยกวาการฉีด V. harveyi แบบ active ซ่ึงคลายกับรูปแบบการเพิ่มของเลคตินในกุงที่ฉีดเชื้อชนิดเดียวกัน (ปนนภา ลิ่มพานิช, 2550)

87

0

0.5

1

1.5

2

0 6 12Hour after injection

Activ

ity (f

old of

U/m

l)

00.5

11.5

22.5

33.5

0 6 12Hour after injection

Spec

ific a

ctivit

y (fol

d of

U/mg

)

รูปที่ 27 แอคทิวิที (A) และแอคทวิทิีจําเพาะ (B) ของเอนไซมฟนอลออกซิเดส ในซีรัมของกุงทีฉ่ีดเชื้อ V. harveyi แบบ inactive ที่เลี้ยงบนอาหารแข็ง

TSA ปริมาณ 5 x 109 เซลล/ตวักุง

A V. harveyi inactive N=5

B V. harveyi inactive N=5

90

เม่ือฉีดกุงดวยแบคทีเรียไมกอโรคกุงคือเชื้ออหิวาตในคน V. cholerae พบวาแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมมีคาลดลงหลังการฉีด โดยมีคาลดลงเปน 0.83 และ 0.81 เทา ณ ชั่วโมงที่ 6 และชั่วโมงที่ 12 ตามลําดับ เม่ือเทียบกับคากอนฉีด (0 ชั่วโมง) (รูปที่ 28A และตารางที่ 12) โดยมีแนวโนมใกลเคียงกับคาแอคทิวิทีจําเพาะของเอนไซมที่มีคาลดลงเล็กนอย ณ ชั่วโมงที่ 6 (0.96 เทา) และแทบจะไมเพ่ิมสูงขึ้นเลย ณ ชั่วโมงที่ 12 (1.17 เทา) เม่ือเทียบกับคากอนการฉีด (0 ชั่วโมง) (รูปที่ 28B และตารางที่ 13) ซ่ึงคลายกับคาที่พบในกุงชุดควบคุมที่มีคาคอนขางคงที่เปน 0.97 และ 1 เทา ณ ชั่วโมงที่ 6 และ 12 ตาม ลําดับ เม่ือเทียบกับคากอนฉีด (รูปที่ 24E และตารางที่ 9) จากการฉีดกุงแชบวยดวยแบคทีเรียไมกอโรคกุงและไมไดอยูในสกุล วิบริโอ คือ E. coli ในขั้นตอนการเลี้ยงเซลลแบคทีเรียพบวาขนาดโคโลนีของ E. coli ใหญกวาขนาดโคโลนีของ V. harveyi ประมาณ 2 เทา และเม่ือเตรียม E. coli ใหมีความเขมขนเปน 5x1010 เซลลตอมิลลิลิตร พบวามีความขุนมากกวาเชื้อ V. harveyi ที่ความเขมขนเดียวกันมาก ดังน้ันหลังจากฉีดพบวากุงมีอาการออนแอลงอยางเห็นไดชัด คือนอนตะแคงนิ่ง ไมวายน้ํา และบางตัวตายกอนชั่วโมงที่ 12 เม่ือนําซีรัมไปทดสอบแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดส พบวามีคาลดลง ณ ชั่วโมงที่ 6 และชั่วโมงที่ 12 เปน 0.75 และ 0.80 ตามลําดับ (รูปที่ 29A และตารางที่ 12) เม่ือเทียบกับคากอนการฉีด (0 ชั่วโมง) สวนแอคทิวิทีจําเพาะของเอนไซมมีคาลดลงเล็กนอย ณ ชั่วโมงที่ 6 (0.98 เทา) และเพ่ิมสูงขึ้นเล็กนอย ณ ชั่วโมงที่ 12 (1.27 เทา) (รูปที่ 29B และตารางที่ 13) เม่ือเทียบกับคากอนการฉีด (0 ชั่วโมง) การฉีดกุงดวยเชื้อไมกอโรคในกุงคือ V. cholerae และ E. coli ใหผลใกลเคียงกัน คือ ระดับแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสคอนขางไมเปลี่ยนแปลง อาจเปนเพราะไมใชแบคทีเรียกอโรคในกุงแชบวย ปริมาณของ E. coli ที่ใชฉีดอาจไมเหมาะสมในการทดลองนี้เพราะ E. coli มีขนาดใหญกวา V. harveyi มาก และจากงานของ Utarabhand และคณะ (2007) ที่พบวาเลคตินในฮีโมลิมฟของกุงแชบวยสามารถทําใหเฉพาะแบคทีเรียกอโรคกุงคือ V. harveyi, V. parahemolyticus และ V. vulnificus เกาะกลุมได แตไมทําใหแบคทีเรียไมกอโรคกุงคือ E. coli หรือ V. cholerae เกาะกลุม ซ่ึงบงบอกถึงความจําเพาะของเลคตินตอชนิดของแบคทีเรียและสอดคลองกับงานวิทยานิพนธของ ปนนภา ลิ่มพานิช (2550) ที่พบแอคทิวิทีของเลคตินเม่ือกระตุนดวย E. coli หรือ V. cholerae มีการเปลี่ยนแปลงไมมากเมื่อเทียบกับ V. harveyi แสดงใหเห็นวาเลคตินมีบทบาทเกี่ยวของกับการปองกันตนเองของกุงแชบวยโดยตอบสนองอยางจําเพาะตอเชื้อกอโรคที่รุกราน เชน V. harveyi แบบ active แตไมมีผลจากแบคทีเรียไมกอโรคในกุงแชบวย เชน E. coli และ V. cholerae ซ่ึงคลายกับการเพ่ิมขึ้นของคาแอคทิวิทีของเอนไซมที่มีบทบาทปองกันตนเองในกุงแชบวย 2 ชนิดคือเอนไซม เบตา-1,3-กลูคาเนสและเอนไซม NAGase (N-acetyl glucosaminidase) ที่อรัญญา คงแกว (2549) รายงานวามีคาแอคทิวิทีจําเพาะของเอนไซมเบตา-1,3-กลูคาเนส และเอนไซม NAGase ในซีรัมเพ่ิมขึ้นตามเวลาและเพิ่มขึ้นสูงสุดอยางมีนัยสําคัญที่ความเชื่อม่ัน 95% เปน 2.57 และ

91

1.99 เทา ตามลําดับ ณ เวลา 12 ชั่วโมง หลังกระตุนใหกุงติดเชื้อดวยการฉีดดวย V. harveyi แบบ active ปริมาณ 5x109 เซลล/ตัวกุง เม่ือเทียบกับคาแอคทิวิทีจําเพาะในซีรัมกอนฉีด สวนการกระตุนดวยการฉีดกุงดวย E. coli และ V. cholerae มีผลทําใหแอคทิวิทีจําเพาะของเอนไซมทั้งสองชนิดในซีรัมมีคาเปลี่ยนแปลงนอยมาก

สวนการฉีดดวยไวรัสกอโรคตัวแดงดวงขาว WSSV (Lightner, 1999) ในกุงแชบวยดวยปริมาณตัวละ 1x10-5 เทาของปริมาณหัวเชื้อ ซ่ึงเปนปริมาณที่ใชในการกระตุนใหกุงกุลาดําเกิดโรค (กิจการ ศุภมาตย และคณะ, 2542) พบวาแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออก ซิเดสเพิ่มขึ้นอยางมีนัยสําคัญที่ความเชื่อม่ัน 95% เปน 1.67 และ 1.77 เทา ที่ 6 และ 12 ชั่วโมง หลังการฉีด ตามลําดับ เม่ือเทียบกับคาแอคทิวิทีของกุงชุดเดียวกัน ณ ชั่วโมงที่ 0 (ตารางที่ 12 และรูปที่ 30A) สวนคาแอคทิวิทีจําเพาะของเอนไซมฟนอลออกซิเดสเพิ่มขึ้นอยางมีนัยสําคัญที่ความเชื่อม่ัน 95% เปน 2.18 และ 3.13 เทา ที่ 6 และ 12 ชั่วโมง หลังการฉีด ตามลําดับ เม่ือเทียบกับคาแอคทิวิทีจําเพาะของกุงชุดเดียวกัน ณ ชั่วโมงที่ 0 (ตารางที่ 13 และรูปที่ 30B) แสดงใหเห็นวาเอนไซมฟนอลออกซิเดสของกุงแชบวยตอบสนองตอไวรัสกอโรคกุง เน่ืองจากแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสมีคาเพิ่มขึ้นมากกวากุงที่ฉีด V. harveyi แบบ active จากผลการทดลองแสดงใหเห็นวากุงแชบวยตอบสนองตอการกระตุนดวยเชื้อ WSSV มากที่สุดโดยมีระดับแอคทิวิทีเพ่ิมขึ้นมากที่สุด รองลงมาไดแก V. harveyi แบบ active, V. harveyi แบบ inactive, V. cholerae และ E. coli ตามลําดับ บงชี้วาเอนไซมฟนอลออก ซิเดสมีบทบาทเกี่ยวของกับการปองกันตนเองของกุงแชบวยโดยตอบสนองอยางจําเพาะตอเชื้อกอโรคที่รุกราน เชน V. harveyi แบบ active และ WSSV สอดคลองกับงานวิจัยของ Song และคณะ (2003) ที่พบวากุงขาว P. vannamei ที่ติดเชื้อ Taura syndrome virus (TSV) มีแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสเพิ่มสูงขึ้น 7.5 เทา เม่ือเปรียบเทียบกับชุดควบคุมที่ไมติดเชื้อ และจากวิทยานิพนธของปนนภา ลิ่มพานิช (2550) ที่พบแอคทิวิทีของเลคตินเม่ือกระตุนดวย E. coli หรือ V. cholerae มีการเปลี่ยนแปลงไมมากเมื่อเทียบกับ V. harveyi แบบ active แสดงใหเห็นวาทั้งเอนไซมฟนอลออกซิเดสและเลคตินมีบทบาทเกี่ยวของกับการปองกันตนเองของกุงแชบวยโดยตอบสนองอยางจําเพาะตอเชื้อกอโรคที่รุกราน เชน V. harveyi แบบ active แตไมมีผลจากแบคทีเรียไมกอโรคในกุงแชบวย เชน E. coli และ V. cholerae ซ่ึงคลายกับการเพ่ิมขึ้นของคาแอคทิวิทีของเอนไซมที่มีบทบาทปองกันตนเองในกุงแชบวย 2 ชนิดคือเอนไซม เบตา-1,3-กลูคาเนสและเอนไซม NAGase ตอการฉีดเชื้อเหลานี้ที่รายงานโดย อรัญญา คงแกว (2549)

92

0

0.5

1

1.5

2

0 6 12Hour after injection

Activ

ity (f

old o

f U/m

l)

00.5

11.5

22.5

33.5

0 6 12Hour after injection

Spec

ific a

ctivit

y (fol

d of

U/mg

)

รูปที่ 28 แอคทิวทิี (A) และแอคทวิิทจีําเพาะ (B) ของเอนไซมฟนอล ออกซิเดสในซีรัมของกุงทีฉ่ดี V. cholerae ที่เลี้ยงบนอาหาร แข็ง TSA ปริมาณ 5 x 109 เซลล/ตวักุง

A V. cholerae N=3

B V. cholerae N=3

93

0

0.5

1

1.5

2

0 6 12Hour after injection

Activ

ity (f

old of

U/m

l)

00.5

11.5

22.5

33.5

0 6 12Hour after injection

Spec

ific ac

tivity

(fold

of U

/mg)

รูปที่ 29 แอคทิวทิี (A) และแอคทวิิทจีําเพาะ (B) ของเอนไซมฟนอล ออกซิเดสในซีรัมของกุงทีฉ่ดี E. coli เลีย้งบนอาหารแข็ง TSA ปริมาณ 5 x 109 เซลล/ตัวกุง

A E. coli N=2

B E. coli N=2

94

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

0 6 12

Hour after injection

Activ

ity (f

old

of U

/ml)

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

0 6 12

Hour after injection

Spec

ific a

ctiv

ity (f

old

of U

/mg)

รูปที่ 30 แอคทิวทิี (A) และแอคทวิิทจีําเพาะ (B) ของเอนไซมฟนอล ออกซิเดสในซีรัมของกุงทีฉ่ดี WSSV ตัวละ 1 x 10-5 เทาของ หัวเชื้อ

A WSSV N=3

B WSSV N=3

95

4. สรุป

จากการศึกษาหาภาวะที่เหมาะสมในการวัดแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออก ซิเดสในซีรัม การทําใหเอนไซมบริสุทธิ์จากซีรัมและศึกษาสมบัติของเอนไซมฟนอลออกซิเดส ที่บริสุทธิ์บางสวนของกุงแชบวย รวมทั้งศึกษาผลของการฉีดเชื้อ V. harveyi และจุลินทรียชนิดอ่ืนๆ ที่มีตอการเปลี่ยนแปลงระดับแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัม ในงานวิทยานิพนธน้ีสรุปผลไดเปนดังน้ี

1. ภาวะที่เหมาะสมในการวัดแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมคือใชซีรัม 20-60 ไมโครลิตร หรือมีปริมาณโปรตีนในชวงประมาณ 2-8 ไมโครกรัม กระตุนแอค ทิวิทีของเอนไซมดวย 2 mg/ml trypsin ปริมาตร 80 ไมโครลิตร และใชสับสเตรท L-DOPA ที่ความเขมขน 3 mg/ml ปริมาตร 120 ไมโครลิตร โดยทําปฏิกิริยาใน CAC buffer, pH 8.0 ที่อุณหภูมิหอง

2. เอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมมีความเสถียรตออุณหภูมิในชวง 0-40°ซ 3. พบแอคทิวิทีรวมของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในซีรัมมากที่สุด รองลงมาใน

ตับ ลําไสและกระเพาะ ตามลําดับ ไมพบแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในกลามเนื้อและ หัวใจ

4. ทําใหเอนไซมฟนอลออกซิเดสบริสุทธิ์บางสวนจากซี รัมดวยคอลัมน Sephadex G-200 ตามดวยวิธี preparative PAGE ครั้งที่ 1 และ ครั้งที่ 2 ตามลําดับ แยกไดเอนไซมที่มีความบริสุทธิ์เพ่ิมขึ้นเปน 4.21, 1,310.62 และ 1,957.79 เทา ของเอนไซมในซีรัมเริ่มตน ตามลําดับ

5. เอนไซมฟนอลออกซิเดสที่บริสุทธิ์บางสวนหรือเอนไซม ppPO มีแอคทิวิทีสูงสุดที่ pH 9.0 มีความเสถียรตออุณหภูมิในชวง 0-40°ซ รวมทั้งมีจลนศาสตรแบบ hyperbola โดยมีคา KM สําหรับ L-DOPA เปน 1.75 mM และคา Vmax เปน 0.0625 A490/min และเอนไซม ppPo มีความจําเพาะตอสับสเตรท L-DOPA และ dopamine แตไมจําเพาะตอ catechol

6. จากการฉีดกุงแชบวยดวยเชื้อ V. harveyi แบบ active ที่เลี้ยงบนอาหารแข็ง TSA ปริมาณ 5 x 109 เซลลตอตัวกุง เพ่ือศึกษาระยะเวลาการตอบสนองของเอนไซมฟนอลออกซิเดส พบวาทั้งแอคทิวิที (หนวย/มล.ซีรัม) และแอคทิวิทีจําเพาะ (หนวย/มก.โปรตีน) ของเอนไซมในซีรัมมีคาเพิ่มขึ้นตามเวลาจากชั่วโมงที่ 0 (กอนฉีด) ณ ชั่วโมงที่ 6, 12 และเพิ่มสูงสุด ณ ชั่วโมงที่ 18 ในขณะที่แอคทิวิทีของเอนไซมในซีรัมของกุงชุดควบคุมที่ฉีดดวยน้ําเกลือมีระดับไมแตกตางกัน ณ เวลาตางๆ บงชี้วาแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในฮีโมลิมฟของกุงแชบวยถูกกระตุนใหเพ่ิมขึ้นตามเวลาตอบสนองตอการติดเชื้อกอโรค

96

7. จากการฉีดกุงดวยเชื้อ V. harveyi แบบ active ที่เลี้ยงบนอาหารแข็ง TSA ปริมาณตางๆ ในชวง 2-5 x 107 และ 5 x 106 ถึง 5 x 109 เซลลตอตัวกุง พบวาการฉีดกุงดวยปริมาณ 5 x 109 เซลลตอตัวกุง จะเหนี่ยวนําใหแอคทิวิทีและแอคทิวิทีจําเพาะของเอนไซม ฟนอลออกซิเดสในซีรัมเพ่ิมขึ้นสูงสุดกวาปริมาณอ่ืน ๆ โดยมีแบบแผนการเพิ่มของแอคทิวิทีในทุกปริมาณที่ใชในทํานองเดียวกัน คือมีคาแอคทิวิทีเพ่ิมขึ้นตามเวลาหลังการฉีดเชื้อ เม่ือเทียบกับระดับกอนฉีด (0 ชั่วโมง) และแอคทิวิทีของเอนไซมเพ่ิมขึ้นตามปริมาณเชื้อที่ใชฉีด การฉีดกุงดวย V. harveyi ปริมาณ 5 x 109 เซลลตอตัวกุง จัดเปนปริมาณที่เหมาะสมที่ทําใหกุงติดเชื้อไดดี และไมทําใหกุงตายภายในเวลาที่ศึกษา

8. ระดับแอคทิวิทีและแอคทิวิทีจําพาะของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในกุงที่ฉีดดวยจุลินทรียชนิดตางๆ ซ่ึงเปนทั้งเชื้อกอโรคและไมกอโรคกุง ดวยปริมาณเดียวกับ V. harveyi แบบ active พบวา V. harveyi แบบ inactive เหน่ียวนําใหมีระดับแอคทิวิทีของเอนไซมเพ่ิมเพียงเล็กนอย ในขณะที่การฉีดดวยแบคทีเรียไมกอโรค V. cholerae และ E. coli ไมมีผลกระตุนแอคทิวิทีในซีรัมและกลับมีคาลดลงเล็กนอย ตางจากการฉีดดวยไวรัสกอโรคกุง WSSV ที่เหน่ียวนําใหมีแอคทิวิทีของเอนไซมเพ่ิมขึ้นอยางมีนัยสําคัญเชนเดียวกับการฉีดดวย V. harveyi แบบ active บงชี้วาเอนไซมฟนอลออกซิเดสของกุงแชบวยนาจะมีบทบาทเกี่ยวของกับการปองกันตนเองโดยตอบสนองตอเชื้อกอโรคที่รุกราน เชน V. harveyi หรือ WSSV แตไมมีผลกับแบคทีเรียไมกอโรคในกุงแชบวย เชน E. coli และ V. cholerae

97

และสอดคลองกับงานวิจัยของ Song และคณะ (2003) ที่พบวากุงขาวที่ติดเชื้อ Taura syndrome virus (TSV) มีแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสเพิ่มสูงขึ้น 7.5 เทา เม่ือเปรียบเทียบกับชุดควบคุมที่ไมติดเชื้อ

ในกุงนางระบบโปรฟนอลออกซิเดสถูกกระตุนโดยตรงจากการลดลงของระดับแคลเซียม 20% ในพลาสมา อันเปนผลมาจากการที่กุงติดเชื้อ Taura syndrome virus การติดเชื้อไวรัสในสัตวจําพวกครัสเตเชียนจะไปมีผลตอ Oxidative stress ซึ่งเปนสาเหตุหลักที่ทําใหแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสลดลง (Le Moullac et al., 1998; Cheng et al., 2002) สวนสาร Polychlorinated biphenyls (PCB) ไดมีรายงานไววามีผลตอระดับแอคทิวิทีของเอนไซมฟนอลออกซิเดสในสัตวกลุมครัสเตเชียนที่ลดลง (Le Moullac and Haffner, 2000)

รายการเอกสารอางอิง

กิจการ ศุภมาตย และคณะ. 2542. เทคนิคการตรวจวินิจฉัยโรคติดเชื้อแบคทีเรียและไวรัสในกุงกุลาดํา. เอกสารประกอบการฝกอบรมเชิงปฏิบัติการ. ศูนยวิจัยสุขภาพสัตวนํ้า มหาวิทยาลัยสงขลานครินทร, 24-25 เมษายน 2542.

กิจการ ศุภมาตย. 2543. ระบบภูมิคุมกันและการกระตุนภูมิคุมกันโรคในกุงกุลาดํา. วารสารสงขลานครินทร ฉบับวิทยาศาสตรและเทคโนโลยี ปที่ 22 ฉบับพิเศษ : [ออนไลน] เขาถึงไดจาก: http://www.kungthai.com (retrived 26/5/2008).

ดารุณี แซอุย, อนันต ตันสุตะพานิช และ ลิลา เรืองแปน. 2530. Vibrio harveyi สาเหตุของโรคแบคทีเรียเรืองแสงของลูกกุงแชบวย (Penaeus merguiensis). ว. การประมง. 40(2), 177-182.

ธวัช ศรีวีระชัย และฐานนันดร ทัตตานนท. 2538. การเลี้ยงกุงแชบวยแบบพัฒนาในบอดิน.เอกสารวิชาการ ฉบับที่ 44/2538 สถานีเพาะเลี้ยงสัตวนํ้าชายฝงจังหวัดนราธิวาสกองเพาะเลี้ยงสัตวนํ้าชายฝง กรมประมง กระทรวงเกษตรและสหกรณ.

บุญศรี จารุธรรมโสภณ. 2537. ชีววิทยากุงแชบวย (Penaeus merguiensis) ในบริเวณอาวพังงา. รายงานสัมมนาวิชาการประจําป 2537 กรมประมง กระทรวงเกษตรและสหกรณ.

ปนนภา ลิ่มพานิช. 2550. การตอบสนองของเลคตินกุงแชบวยตอเชื้อกอโรคและไมกอโรค. วิทยานิพนธวิทยาศาสตรมหาบัณฑิต มหาวิทยาลัยสงขลานครินทร.

เพ็ญศรี บุญตามชวย และ อรอนงค คงทวี. 2548. การจําแนกเชื้อวิบริโอในตับและตับออนของกุงกุลาดําปกติและกุงปวยจากบอเลี้ยงในจังหวัดสงขลา. สัมมนาวิชาการดานการเพาะเลี้ยงสัตวนํ้าชายฝงประจําป 2548. สถาบันวิจัยสุขภาพสัตวนํ้าชายฝง, 16 พฤษภาคม 2548.

มัทนา บุญยุบล. 2539. ชีววิทยาและวงจรชีวิตของกุงแชบวยในอาวบานดอน จังหวัดสุราษฎรธานี. เอกสารวิชาการฉบับที่ 28/2539, กลุมชีวประวัติสัตวทะเล. ศูนยพัฒนาประมงทะเลอาวไทยตอนบน, กรุงเทพฯ. 61 น.

มณเฑียร สงเสริม, บัญญัติ สุขศรีงาม และ ประภาศิริ ศรีโสภาภรณ. 2533. การศึกษาแบคทีเรียที่เปนสาเหตุของโรคเรืองแสงในกุงกุลาดํา. ว. ศรีนครินทรวิโรฒวิจัยและพัฒนา. 4(1), 15-24.

97

98

เมธี วัฒนสิงห. 2543. การเลี้ยงกุงแชบวยแบบพัฒนา ภูมิปญญาคนไทย ตลาดในและนอกยังเปดกวาง. วารสารสัตวนํ้า 11(131), 5-16.

วิวัฒนชัย พรหมสาขา ณ สกลนคร และสมพร โลสวัสดิ์กุล. 2532. การแพรกระจายและความชุกชุมของทรัพยากรกุงทะเลในอาวไทย. รายงานการสัมมนาวิชาการประจําป 2532 กรมประมง กระทรวงเกษตรและสหกรณ.

ศรีรัตน สอดสุข และพนม กระจางพจน. 2541. ความหลากหลายทางพันธุกรรมของกุงแชบวยจาก 3 แหลงในประเทศไทย. เอกสารวิชาการ ฉบับที่ 19/2541 สถาบันวิจัยและพัฒนาพันธุกรรมสัตวนํ้า กรมประมง กระทรวงเกษตรและสหกรณ.

สถิติการประมงแหงประเทศไทย พ.ศ. 2546, 2548. กรมประมง กระทรวงเกษตรและสหกรณ. กรุงเทพฯ: กรมประมง.

สุพจน จึงแยมปน และชัยรัตน พุมชวย. 2543. ผลงานชิ้นโบแดงสถานีเพาะเลี้ยงสัตวนํ้าชายฝงจังหวัดตรังเลี้ยงพอแมแชบวยในบอดินสําเร็จ. วารสารสัตวนํ้า 11(132), 37-44.

สุรินทร มัจฉาชีพ. 2535. สัตวนํ้าจากทองทะเลไทย. กรุงเทพฯ: สํานักพิมพแพรวิทยา.

หทัยชนก ประไพพงษ, 2533 การเกิดสีนํ้าตาลในลําไยโดยปฏิกิริยาเอนไซม [ออนไลน] เขาถึงไดจาก: http://www.geocities.com (retrived 20/5/2008).

อรัญญา คงแกว. 2549. การศึกษาสมบัติของเอนไซมเบตา-1,3-กลูคาเนสและเอนไซมเอ็น- อะซิติลกลูโคซามินิเดสในการตอบสนองตอเชื้อกอโรค Vibrio harveyi ของกุงแชบวย. วิทยานิพนธวิทยาศาสตรมหาบัณฑิต คณะวิทยาศาสตร มหาวิทยาลัยสงขลานครินทร สงขลา.

อุษาวดี ชนสุต และนิธิยา รัตนาปนนท. 2549. การตานปฏิกิริยาออกซิเดชันของสารประกอบ ฟนอลและกิจกรรมของเอนไซมพอลีฟนอลออกซิเดสของผลมะเขือ 16 สายพันธุหลังการเก็บเกี่ยว. วารสารวิทยาศาสตรการเกษตร 37, 15-18.

Abt, M. and Rivers, B.D. 2007. Characterization of phenoloxidase activity in venom from the ectoparasitoid Nasonia vitripennis (Walker) (Hymenoptera: Pteromalidae). J. Invertebr. Pathol. 94, 108-118.

Adamia, G., Ghoghoberidze, M., Graves, D., Khatisashvili, G., Kvesitadze, G., Lomidze, E., Ugrekhelidze, D. and Zaalishvili, G. 2006. Absorption, distribution, and transformation of TNT in higher plants. Ecotoxicol. Environ. Saf. 64, 136-145.

99

Adema, C.M., van der Knapp, W.P.W. and Aminia, T. 1991. Molluscan hemocyte mediated cytotoxicity: The role of reactive oxygen intermediates. Rev. Aquat. Sci. 4, 201-223.

Aladaileh, S., Rodney, P., Nair, V.S. and Raftos, A.D. 2007. Characterization of phenoloxidase activity in Sydney rock oysters (Saccostrea glomerata). Comp. Biochem. Physiol. 148, 470-480.

Ali, M.T., Marshall, M.R., Wei, C.I. and Gleeson, R.A. 1994. Monophenol oxidase activity from the cuticle of Florida spiny lobster (Panulirus argus). J. Agri. Food Chem. 42, 53-58.

Arizza, V., Cammarata, M., Tomasino, M.C. and Parrinello, N. 1995. Phenoloxidase characterization in vacuolar hemocytes from the solitary ascidians Styela plicata. J. Inv. Pathol. 66, 297-302.

Asada, N., Fukumitsu, T., Fujimoto, K. and Masuda, K.-I. 1993. Activation of prophenol- oxidase with 2-propanol and other organic compounds in Drosophila melanogas- ter. Insect Biochem. Mol. Biol. 23, 515-520.

Asano, T. and Ashida, M. 2001. Cuticular pro-phenoloxidase of the silkworm, Bombyx mori. J. Biol. Chem. 276, 11100-11112.

Ashida, M., Ishizaki, Y. and Iwahana, H. 1983. Activation of pro-phenoloxidase by bacterial cell walls or β-1,3-glucans in plasma of the silkworm, Bombyx mori. Biochem. Biophys. Res, Commun. 113, 562–568.

Asokan, R., Arumugam, M. and Mullainadhan, P. 1997. Activation of prophenoloxidase in the plasma and haemocytes of the marine mussel, Perna viridis Linnaeus. Dev. Comp. Immunol. 21, 1-12.

Asokan, R., Arumugam, M. and Mullainadhan, P. 1998. Functional analysis of plasma prophenoloxidase system in the marine mussel Perna viridis. Comp. Biochem. Physiol. 120, 753-762.

Aspan, A., Huang, T.S., Cerenius, L. and Söderhäll, K. 1995. cDNA cloning of prophenol-oxidase from the freshwater crayfish Pacifastacus leniusculus and its activation. Proc. Natl. Acad. Sci. 192, 939-943.

100

Aspan, A. and Söderhäll, K. 1991. Purification of prophenoloxidase from crayfish blood cells, and its activation by an endogenous serine proteinase. Insect biochemistry 21, 363-373.

Aspan, A., Sturtevant, J., Smith, V.J. and Söderhäll, K. 1990. Purification and characterization of a prophenoloxidase activating enzyme from crayfish blood cells. Insect Biochem. 20, 709-718.

Aspan, A., Huang, T., Cerenius, L. and Söderhäll, K. 1995. cDNA cloning of prophenol-oxidase from the freshwater crayfish Pacifastacus leniusculus and its activation. Proc. Natl. Acad. Sci. 92, 939–943.

Axelsen, N.H., Kroll, J. and Weeke, B. 1975. A manual of quantitative immunoelectrophoresis. Scand. J. Immunol. 2, 230.

Bachère, E. 2003. Anti-infectious immune effectors in marine invertebrates: Potential tools for disease control in larviculture. Aquaculture 227, 427-438.

Báchere, E., Mialhe, E., Nöel, D., Boulo, V., Morum, A. And Rodriguez, L. 1995. Knowledge and prospects in marine mollusks and crustacean immunology. Aquaculture 132, 17-32.

Bahgat, M., Doenhoff, M., Kirschfink, M. and Ruppel, A. 2002. Serine protease and phenoloxidase activities in hemocytes of Biomphalaria glabrata snails with varying susceptibility to infection with the parasite Schistosoma mansoni. Parasitol. Res. 88, 489-494.

Bai, G., Brown, J.F., Watson, C. and Yoshino, T.P. 1997. Isolation and characterization of phenoloxidase from egg masses of the gastropod mollusc, Biomphalaria glabrata. Comp. Biochem. Phys. 118, 463-469.

Ballarin, L., Cima, F. and Sabbadin, A. 1994. Phenoloxidase in the colonial ascidian Botryllus schlosseri (Urochordata, Ascidiacea). Anim. Biol. 3, 41-48.

Banana shrimp, Penaeus merquiensis. [online] Available : http://www.users.bigpond.com (retrived 20/4/2008).

101

Barrett, F.M. 1987. Phenoloxidases from larval cuticle of the sheep blowfly, Lucilia cuprina: Characterization, developmental changes, and inhibition by antiphenoloxidase antibodies. Arch. Insect Biochem. Physiol. 5, 99-118.

Barracco, M.A., Duvic, B. and Söderhäll, K. 1991. The β-1,3-glucan-binding protein from the crayfish Pacifastacus leniusculus, when reacted with a β-1,3-glucan, induces spreading and degranulation of crayfish granular cells. Cell Tissue Res. 266, 491-497.

Benjakul, S., Visessanguan, W. and Tanaka, M. 2005. Properties of phenoloxidase isolated from the cephalothorax of kuruma prawn (Penaeus japonicus). J. Food Biochem. 29, 470-485.

Bradford, M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248 -254.

Brimacombe, J.S. 1975. Carbohydrate chemistry. In: The Chemical Society, Burlington House, London 8, 282-293.

Brock, A.J. and Main, K.L. 1994. A guide to the common ploblems and diseases of cultured Penaeus vannamei. Oceanic Institute, Hawaii, 242.

Burks, C.S. and Fuchs, M.S. 1995. Partial purification of plasma phenol-oxidase of the yellow fever mosquito Aedes aegypti L. (Diptera: Culicidae). Comp. Biochem. Physiol. 110, 641-647.

Carlberg, I. and Söderhäll, K. 1985. Phenoloxidase activity in Daucus carota is restricted to embryogenic cultures. FEBS Letters 187, 295-298.

Cammarata, M., Arizza, V., Savona, B., Vazzana, M. and Parrinell, D. 1999. Prophe- nolxidase in the hemocyte of Phallusia mamaillata. Anim. Biol. 8, 15-17.

Carballal, M.J., Lopez, C., Azevedo, C. and Villalba, A. 1997. Enzymes involved in defense functions of hemocytes of mussel Mytilus galloprovincialis. J. Invertebr. Pathol. 70, 96-105.

Chaga, O.Y. 1980. Ortho-diphenoloxidase system of ascidians. Tsitologia 22, 619-625.

Chen, S.N., Huang, S.L. and Kou, G.H. 1992. Studies on epizootiology and pathogen-nicity of bacterial infections in cultured giant tiger prawns, Penaeus monodon, in

102

Taiwan. In: Disease of Cultured Penaeid Shrimp in Asia and the United State, Hawaii, Fulks, W. and Main, K.L., Eds. The Oceanic Institute 195-208.

Cheng, W., Liu, C.H., Hsu, J.P. and Chen, J. 2002. Effect of hypoxia on the immune response of giant freshwater shrimp Macrobrachium rosenbergii and its susceptibility to pathogen Enterococcus. Fish Shellfish Immunol. 13, 351-365.

Christophides, G.K., Zdobnov, E., Barillas-Mury, C., Birney, E., Blandin, S., Blass, C., Brey, P.T., Collins, F.H., Danielli, A., Dimopoulos, G., Hetru, C., Hoa, N.T., Hoffmann, J.A., Kanzok, S.M., Letunic, I., Levashina, E.A., Loukeris, T.G., Lycett, G., Meister, S., Michel, K., Moita, L.F., Muller, H.M., Osta, M.A., Paskewitz, S.M., Reichhart, J.M., Rzhetsky, A., Troxler, L., Vernick, K.D., Vlachou, D., Volz, J., von Mering, C., Xu, J., Zheng, L., Bork, P. and Kafatos, F.C. 2002. Immunity-related genes and gene families in Anopheles gambiae. Science 298, 159-165.

Coles, J.A. and Pipe, R.K. 1994. Phenoloxidase activity in the haemolymph and haemocytes of the marine mussel Mytilus edulis. Fish Shellfish Immunol. 4, 337-352.

Colwell, R.R., Kaper. J. and Joseph, S.W. 1977. Vibrio cholerae, Vibrio parahaemo-lyticus and Other Vibrios: Occurrence and distribution in Chesapeake Bay. Science 198, 394-396.

Cong, R.S., Sun, W.J., Liu, G.X., Fan, T.J., Meng, X.H., Yang, L.L. and Zhu, L.Y. 2005. Purification and characterization of phenoloxidase from clam Ruditapes philippinarum. Fish Shellfish Immunol. 18, 61-70.

Dalsgarrd, A., Albert, M.J., Taylor, D.N., Shimada, T., Meza, R., Serichantalerg, O. and Echeverria, D. 1995. Characterization of Vibrio cholerae non-01 serogroups obtained form and outbreak of diarrhea in Lima. Peru. J. Clin. Microbiol. 33, 2715-2722.

Davis, B.J. 1964. Disc electrophoresis II. Methode and application to human serum protein. Ann. N.Y. Acad. Sci. 121, 404-427.

Durrant, H.J., Ratcliffe, N.A., Hipkin, C.R., Aspan, A. and Söderhäll, K. 1993. Purification of the pro-phenol oxidase enzyme from haemocytes of the cockroach Blaberus discoidalis. Biochem. J. 289, 87-91.

103

Duvic, B. and Söderhäll K. 1990. Purification and characterization of a β-1,3-glucan binding protein from the plasma of the crayfish Pacifastacus leniusculus. J. Biol. Chem. 256, 27-32.

Epel, D., Muchmore, A.V., Weaver, A.M. and Schimke, R.T. 1969. β-1,3-Glucanase of sea urchin eggs: Release from particles at fertilization. Science 163, 294-296.

Fan, T.J. and Wang, X.F. 2002. Purification and partial biochemical characterization of phenoloxidase from Penaeus chinensis. Acta Biochim. Biophys. Sinica 34, 589-594.

Fujimoto, K., Masuda, K., Asada, N. and Ohnishi, E. 1993. Purification and characterization of prophenoloxidase from pupae of Drosophila melanogaster. J Biochem. 113, 285-291

Goldstein, I.J., Huges, R.C., Monsigny, M., Osawa, T. and Sharon, N. 1980. What should be called a lectin? Nature 285, 66.

Gollas-Galvan, T., Hernandez-Lopez, J. and Vargas-Albores, F. 1999. Prophenoloxidase from brown shrimp (Penaeus californiensis) hemocytes. Comp. Biochem. Physiol. 122, 77-82.

Grey, D., Dall, W. and Baker, A. 1983. A guide to the Australian penaeid prawn. p 140.

Hall, M. and Söderhäll, K. 1994. Crayfish α-macroglobulin as a substrate for transglutaminases. Comp. Biochem. Physiol. 108, 65-72.

Hall, M., Söderhäll, K. and Jensen, S.L. 1989. Amino acid sequence around the thiolester of α2-macroglobulin from plasma of the crayfish, Pacifastacus leniusculus. FEBS LETT. 254, 111-114.

Hara, T., Miyoshi, T. and Tsukamoto, T. 1993. Comparative studies on larval and pupal phenoloxidase of the housefly, Musca domestica L. Comp. Biochem. Physiol. 106, 287-292.

Hatakeyama, T., Ouchi, K., Kuroki, M. and Yamasaki, N. 1995. Amino acid sequence of a C-type lectin CEL-IV from the marine invertebrate Cucumaria echinata. Biosci. Biotech. Biochem. 59, 1314-1317.

104

Hellio, C. Nilles, A.B., Gagnaire, B., Renault, T. and Guyon, H.T. 2007. Demonstration of a true phenoloxidase activity and activation of a proPO cascade in Pacific oyster, Crassostrea gigas (Thunberg) in vitro. Fish Shellfish Immunol. 22, 433-440.

Hernandez-Lopez, J., Gollas-Galvan, T. and Vargas-Albores, F. 1996. Activation of the prophenoloxidase system of the brown shrimp Penaeus californiensis Holmes. Comp. Biochem. Physiol. 113, 61-66.

Hose, J.E., Martin, G.G., Nguyen, V.A., Lucas, J. and Rosenstein, T., 1987. Cyto-chemical features of shrimp hemocytes. Biol. Bulletin 173, 178-187.

Hrmova, M. and Fincher, G.B. 1993. Purification and properties of three (1,3)-β-1,3-glucanase isozymes from young leaves of barley (Hordeum vulgare). Biochem. J. 289, 453-461.

Huq, A., Snall, E.B., West, P.A., Huq, M.I., Rahman R. and Colwell, R.R. 1983. Ecological relationships between Vibrio cholerae and planthonic crustacean copepods. Appl. Environ. Microbiol. 45, 275-283.

Jackson, A.D., Smith, V.J. and Peddie, C.M. 1993. In vitro phenoloxidase activity in the blood of Ciona intestinalis and other ascidians. Dev. Comp. Immunol. 17, 97-108.

Janeway Jr., C.A. and Medzhitov, R. 2002. Innate immune recognition. Ann. Rev. Immunol. 20, 197-216.

Jaenicke, E. and Decker, H. 2008. Kinetic properties of catecholoxidase activity of tarantula hemocyanin. FEBS. J. 275, 1518-1528.

Jiravanichpaisal, P. and Miyazaki, T. 1994. Histopathology, biochemistry, and pathogenicity of Vibrio harveyi infecting black tiger prawn, Penaeus monodon. J. Aquat. Anim. Health. 6, 27-35.

Johansson, M.W., Lind, M., Holmblad, T., Thornqvist, P.O. and Söderhäll, K., 1995. Peroxinectin, a novel cell adhesion protein from crayfish blood. Biochem. Biophys. Res. Commun. 216, 1079-1087.

Johansson, M.W. and Söderhäll, K. 1985. Cellular immunity in crustaceans and the proPO system. Parasitol. Today 5, 171-176.

105

Johansson, M.W. and Söderhäll, K. 1988. Isolation and purification of a cell adhesion factor from crayfish blood cells. J Cell Biol. 106, 1795-1803.

Johansson, M.W. and Söderhäll, K. 1989. Cellular immunity in crustaceans and the ProPO system. Parasit. Today 5, 171-176.

Jordan, P.J. and Deaton, L.E. 2005. Characterization of phenoloxidase from Crasso- strea virginica hemocytes and the effect of Perkinsus marinus on phenoloxidase activity in the hemolymph of Crassostrea virginica and Geukensia demissa. J. Shellfish Res. 24, 477-482.

Kilpatrick, D.C. 2002. Animal Lectins: A historical introduction and overview. Biochim. Biophys. Acta 1572, 187-197.

Kocourek, J. and Horejsi, V. 1981. Defining a lectin. Nature 290, 188. Kombrink, E. 1988. Several “pathogenesis-related” proteins in potato are 1,3-β-D-

glucanases and chitinases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 782-786.

Lanz, H., Tsutsumi, V. and Arechiga, H. 1993. Morphological and biochemical charac-terization of Procambarus clarki blood cells. Dev. Comp. Immunol. 17, 389-397.

Lavilla–Pitogo, C.R., Baticados, M.C.L., Lruz-Lalierda, E.R. and de la Pena, L.D. 1990. Occurrence of luminous bacterial disease of Penaeus monodon larvae in the Philippines. Aquaculture 91, 1-13.

Leano, E.M., Lavilla-Pitogo, C.R. and Paner, M.G., 1998. Bacterial flora in the hepatopancreas of pond-reared Penaeus monodon juveniles with luminous vibriosis. Aquaculture 164, 367-374.

Le Groumellec, M., Haffner, P., Martin, B. and Martin, C. 1995. Comparative study of bacteria infections responsible for mass mortality in penaeid shrimp hatcheries of the Pacific zone. In: Diseases in Asian Aquaculture II, Shariff, M., Arthur, J.R. and Subasinghe, R.P., Eds. Fish Health Section, Asian Fisheries Society, Manila, 163-173.

Le Moullac, G. and Haffner, P. 2000. Environmental factors affecting immune responses in Crustacea. Aquaculture 191, 121-131.

106

Le Moullac, G., Soyez, C., Saulnier, D., Ansquer, D., Avarre, J. C. and Levy, P. 1998. Effect of hypoxic stress on the immune response and the resistance to vibriosis of the shrimp Penaeus stylirostris. Fish Shellfish Immunol. 8, 621-629.

Lee, S.Y., Cho, M.Y., Hyun, J.H., Lee, K.M., Homma, K.I., Natori, S., Kawabata, S.I., Iwanaga, S. and Lee, B.L. 1998. Molecular cloning of cDNA for prophenol-oxidase-activating factor I, a serine protease is induced by lipopolysaccharide or 1,3-β-glucan in coleopteran insect, Holotrichia diomphalia larvae. Eur. J. Biochem. 257, 615-621.

Lee, S.Y, Wang, R, and Söderhäll, K.A. 2000. Lipopolysaccharide- and β-1,3-glucan-binding protein from hemocytes of the freshwater crayfish Pacifastacus lenius- culus purification, characterization, and cDNA cloning. J. Biol. Chem. 275,1337-1343.

Leonard, C., Söderhäll, K. and Ratcliffe, N.A. 1985. Studies on prophenoloxidase and

protease activity of Blaberus craniifer haemocytes. Insect Biochemistry 15, 803-810.

Liang, Z., Lindblad, P., Beauvais, A., Johansson, M.W., Latge, J.-P., Hall, M., Cerenius, L. and Söderhäll, K. 1992. Crayfish α2-macroglobulin and 76 kD protein; their biosynthesis and subcellular localization of the 76 kD protein. J. Insect Physiol. 38, 987-995.

Lightner, D.V. 1993. Diseases of cultured penaeid shrimp. In CRC handbook of mariculture: Crustacean aquaculture, McVey, J.P., Ed. CRC Press, Boca Raton, 455-474.

Lightner, D.V. 1999. The Penaeid shrimp viruses TSV, IHHNV, WSSV and YHV: Current status in the Americas, available diagnostic methods and management strategies. J. Applied Aquaculture 9, 27-52.

Lightner, D.V. 1988. Vibrio Disease of Penaeid Shrimp. In: Disease diagnosis and control in north American marine aquaculture, Sindermann, L.J. and Lightner, D.V., Eds. Elsevier Science Publishing Company Inc., New York, 42-47.

Lindsay, G.J.H. 1986. The significance of chitinolytic enzymes and lysozyme in rainbow trout (Salmo gairdneri) defence. Aquaculture 51, 169-173.

107

Liu, G., Yang, L., Fan, T., Cong, R., Tang, Z., Sun, W., Meng, X. and Zhu, L. 2006. Purification and characterization of phenoloxidase from crab Charybdis japonica. Fish Shellfish Immunol. 20, 47-57.

Lockey, T.D. and Ourth, D.D. 1992. Isolation and characterization of haemolymph phenoloxidase from Heliothis virescens larvae. Comp. Biochem. Physiol. 102, 891-896.

Lopez, C., Carballal, M.J., Azevedo, C. and Villalba, A. 1997. Enzyme characterisation of the circulating haemocytes of the carpet shell clam, Ruditapes decussatus (Mollusca: bivalvia). Fish Shellfish Immunol. 7, 595-608.

Luna-Gonzalez, A., Maeda-Martinez, A.N., Vargas-Albores, F., Ascencio-Valle, F. and Robles-Mungaray, M. 2003. Phenoloxidase activity in larval and juvenile homogenates and adult plasma and haemocytes of bivalve molluscs. Fish Shellfish Immunol. 15, 275-282.

Ma, C. and Kanost, M.R. 2000. A β-1,3-glucan recognition protein from an insect,

Manduca sexta, agglutinates microorganisms and activates the phenoloxidase

cascade. J. Biol. Chem. 275, 7505-7514.

Manson, F.D.C., Fletcher, T.C. and Gooday, G.W. 1992. Localization of chitinolytic enzyme in blood of turbot, Scophthalmus maximus and posible roles in defence. J. Fish Biol. 40, 919-927.

Marshall, M.R., Kim, J. and Wei, C.I. 2000. Enzymatic browning in fruits, vegetables and seafoods. [ออนไลน] เขาถึงไดจาก: http://www.fao.org. (retrived 26/5/2008).

Martin, G.G., Poole, D., Poole, C., Hose, J.E., Arias. M., Reynolds, L., Mckrell, N. and Whang, A. 1993. Clearance of bacteria injected into the hemolymph of the penaeid shrimp, Sicyonia ingentis. J. Inver. Pathol. 62, 308-315.

Martinez, M.V. and Whitaker, R.J. 1995. The biochemistry and control of enzymatic browning. Trends in Food Sci. Technol. 6, 195-200

Medzhitov, R. and Janeway, C.A. 2002. Decoding the patterns of self and non-self by the innate immune system. Science 296, 298–300

108

Mohney, L.L., Lightner, D.V. and Bell, T.A. 1991. An epizootic due to Vibrio spp. in pondreard Penaeus vannamei in ecuador. Abstract in World Aquaculture Meeting. San Juan, Puerto Rico, June 16-20, 45.

Momoyama, K., Hiraoka, M., Inouye, K., Kimura, T. and Nakano, H. 1995. Diagnostic techniques of the rod-shaped nuclear virus infection in the kuruma shrimp, Penaeus japonicus. Fish Pathol. 30, 263-269.

Montero, P., Avalos, A. and Mateos, M.P. 2001. Characterization of polyphenoloxidase of prawns (Penaeus japonicus). Alternatives to inhibition: Additive and high-pressure treatment. Food Chem.. 75, 317-324.

Morales, P.R., Alejo M.V., Perera, E., Ruiz, P.Z. and Jimenez, A.E. 2007. Phenol-oxidase activity in the hemolymph of the spiny lobster Panulirus argus. Fish Shellfish Immunol. 23, 1187-1195.

Munoz, P., Meseguer, J. and Esteban, M.A. 2006. Phenoloxidase activity in three commercial bivalve species. Changes due to natural infestation with Perkinsus atlanticus. Fish Shellfish Immunol. 20, 12-19.

Nakano H., Koube H., Umezawa S., Momoyama K., Hiaoka M., Inouye K. and Oseko, S. 1994. Mass mortalities of cultured kuruma shrimp Penaeus japonicus in Japan in 1993: Epizootiological survey and infection trials. Fish Pathol. 29, 135-139.

Nalin, D.R., Daya, V., Reid, A., Levine, M.M. and Cisnero. L. 1979. Adsorption and growth of Vibrio cholerae on chitin. Infect. Immun. 25, 768-770.

Naraoka, T., Uchisawa, H., Mori, H., Matsue, H., Chiba, S. and Kimura, A., 2003. Purifi- cation, characterization and molecular cloning of tyrosinase from the cephalopod mollusk, Illex argentinus. Eur. J. Biochem. 270, 4026-4038.

Nash, G., Nithimathachoke, C., Tungmandi, C., Arkarjamorn, A., Prathanpipat, P. and Ruamthaveesub, P. 1992. Vibriosis and its control in pond-reared Penaeus monodon in Thailand. In: Disease in Asian aquaculture I. Shariff, M., Subasinghe R.P. and Arthur J.R.,Eds. Fish Health Section, Asian Fisheries Society, The Philippines, 143-155.

109

Nicolas, J.J., Richard-Forget, F.C., Goupy, P.M., Amiot, M.J. and Aubert, S.J. 1994. Enzymatic browning reaction in apple an apple products. Food Sci. Nutrition 34, 109-157.

Ochiai, M. and Ashida, M., 2000. A pattern-recognition protein for β-1,3-glucan. The binding domain and the cDNA cloning of β-1,3-glucan recognition protein from the silkworm, Bombyx mori. J. Biol. Chem. 275, 4995-5002.

Opoku-Gyaumfua, A., Simpson, B.K. and Squires, J.E. 1992. Comparative studies on the polyphenol oxidase fraction from lobster and tyrosinase. J. Agric. Food Chem. 40, 772-775.

Pantoja, C.R. and Lightner, D.V. 2003. Similarity between the histopathology of white spot syndrome virus and yellow head syndrome virus and its relevance to diagnosis of YHV disease in the America. Aquaculture 218, 47-54.

Peptidoglycan. [online] Available: www.biologie.uni-hamburg.de (retrived 9/5/2008).

Perazzolo, L.M. and Barracco, M.A. 1997. The prophenoloxidase activating system of the shrimp, Penaeus paulensis and associated factors. Developmental & Comparative Immunology 21, 385-395.

Pérez Farfante, I. and Kensley, B., 1997. Penaeoid and Sergestoid Shrimps and Prawns of theWorld (Keys and Diagnoses for the Families and Genera). Muséum National d'Histoire Naturelle, Paris.

Qiu, L., Song, L., Xu, W., Ni, D. and Yu, Y. 2007. Molecular cloning and expression of a toll receptor gene homologue from Zhikong scallop, Chlamys farreri. Fish Shellfish Immunol. 22, 451-466.

Ratcliffe, N.A., Rowley, A.F., Fitzgerald. S.W. and Rhodes, C.P. 1985. Invertebrate Immunity: Basic concepts and recent advances. Int. Rev. Cytol. 97, 183-350.

Robards, K., Prenzler, P.D., Tucker, G., Swatsitang, P. and Glover, W. 1999. Phenolic compounds and their role in oxidative processes in fruits. Food Chemistry 66, 401-436.

Rolle, R.S., Guizani, N., Chen, J.S., Marshall, M.R., Yang, J.S. and Wei, C.I. 1991. Purification and characterization of phenoloxidase from Taiwanese black tiger shrimp (Penaeus monodon). J. Food Biochem. 15, 17-32.

110

Ruangpan, L. and Kitao, T. 1991. Invertebrate Zoology. Oxford University Press, New York, 623.

Ruangpan, L., Tabkaew, R. and Sangrugruang, K. 1995. Bacterial Flora of Pounds with Different Stocking Densities of Black Tiger Shrimp, Penaeus monodon. In: Deseases in Asian aquaculture II, Shariff, M., Arthur, J. R. and Subasinghe, R.P., Eds. Fish Health Section, Asian Fisheries Society, Manila, 141-149.

Saul, S.J., Bin, L. and Sugumaran, M. 1987. The majority of prophenoloxidase in the

hemolymph of Manduca sexta is present in the plasma and not in the hemocytes. Dev. Comp. Immunol. 11, 479-486.

Seike, Y., Shibata, H. and Suyemitsu, T. 1992. Purification of a sperm lectin extracted from spermatozoa of the sea urchin Hemicentrotus pulcherrimus. Dev. Growth Differ. 34, 285-291.

Shaikh, S.A. and Deshpande, M.V. 1993. Chitinolytic enzymes: Their contribution to basic and applied research. World J. Micro. Biotech. 9, 468-475.

Sharon, N. 1977. Lectins. Sci. American 236, 108-119

Simpson, B.K., Marshall, M.R. and Otwell, W.S. 1987. Phenoloxidase from shrimp (Penaues setiferus): Purification and some properties. J. Agri. Food Chem. 35, 918-921.

Simpson, B.K., Marshall, M.R. and Otwell, W.S. 1988. Phenoloxidases from pink and white shrimp: Kinetic and other properties. J. Food Biochem. 12, 205-217.

Skoglund, M., Peterson, D.M., Andersson, R., Nilsson, J. and Dimberg, L.H. 2007.

Avenanthramide content and related enzyme activities in oats as affected by steeping and germination. J. Cereal Sci. 1-10.

Smith, V.J. and Söderhäll, K. 1983. Induction of degranulation and lysis of haemocytes in the freshwater crayfish, Astacus astacus, by components of the prophenoloxidase activating system in vitro. Cell Tissue Res. 233, 295-303.

Söderhäll, K. 1981. Fungal cell wall β-1, 3-glucans induce clotting and phenoloxidase

attachment to foreign surfaces of crayfish hemocyte lysate. Dev. Comp. Immunol. 5, 565–573.

111

Söderhäll, K. 1983. Beta-1,3 glucan enhancement of protease activity in crayfish haemocyte lysate. Comp. Biochem. Physiol. 74, 221-224.

Söderhäll. K. and Ajaxon, R. 1982. Effect of quinone and melanin on mycehal growth of Aphanomyces spp. and extracellular protease of Aphanomyces astaci, a parasite of crayfish. J. Invertbr. Pathol. 39, 105-109.

Söderhäll, K., Aspan, A. and Duvic, B. 1990. The proPO-system and association proteins; role in cellular communication in arthropods. Res. Immunol. 141, 896-907.

Söderhäll, K. and Cerenius, L. 1992. Crustacean Immunity. Annu. Rev. of Fish Dis. 2, 3-23.

Söderhäll, K. and Cerenius, L. 1998. Role of the prophenoloxidase activating system in invertebrate immunity. Curr. Opin. Immunol. 10, 23-28.

Söderhäll, K., Cerenius, L. and Johansson, M.W. 1996. The prophenoloxidase

activating system in invertebrates. In: New Directions in Invertebrate Immunology, Söderhäll, K., Iwanaga, S. and Vasta, G.R.., Eds. Fair Haven, SOS Publications, 229–253.

Song, Y.L., Yu, C.I., Lien, T.W., Huang, C.C. and Lin, M.N. 2003. Haemolymph parameters of Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) infected with Taura syndrome Virus. Fish Shellfish Immunol. 14, 317-331.

Sritunyalucksana, K., Wongsuebsantati, K., Johansson, M.W. and Söderhäll, K. 2001. Peroxinectin, a cell adhesive protein associated with the ProPO system from the black tiger shrimp, Penaeus monodon. Dev. Comp. Immunol. 25, 353-356.

Sritunyalucksana, K., Lee, S.Y. and Söderhäll, K. 2002. A β-1,3-glucan binding protein from black tiger shrimp, Penaeus monodon. Dev. Comp. Immunol. 26, 237-245.

Steel, R.G.D. and Torrie, J.H. 1980. Principle of Procedure of Statistics. McGraw-Hill, New york.

Structure of Gram-negative bacteria [online] Available: http://http://www.bact.wisc.edu (retrived 3/5/2008).

112

Sun, H.S. and Li, G.Y. 1999. Phenoloxidase and myeloperoxidase activity in the haemocytes and serum of Chlamys farreri. J. Fish Sci. 6, 9-13.

Sung, H.H., Yang, Y.L. and Song, Y.L. 1996. Microbicidal reaction enhancement in tiger shrimp (Penaeus monodon) via immunostimulants. J. Biol. Crus. 16, 279-285.

Sugumaran, M. 1996. Roles of the insect cuticle in host defense reactions. In Söderhöll, K., Iwanaga, S., Vasta, G.R. and Federici, B.A. (eds.), Parasites and Pathogens of Insects, 317-342.

Sugumaran, M. and Kanost, M.R. 1993. Regulation of insect hemolymph phenoloxidases. In: New Directions in Invertebrate Immunology, Beckage, N., Thompson, S.N. and Federici, B.A., Eds. Fair Haven, SOS Publications, 355-374.

Takahashi, Y., Itami, T., Maeda, M., Suzuki, N., Kasornchandra, J., Supamattaya, K., Khungpradit, R., Boonyaratpalin, S., Kondo, M., Kawai, K., Kusuda, R., Hirono, I. and Aoki, T. 1996. Polymerase chain reaction (PCR) amplification of bacilli form virus (RU-PJ) DNA in Penaeus japonicus bate and systemic ectodermal and mesodermal baculovirus (WSSV) DNA in Penaeus monodon Fabricius. J. Fish Dis. 19, 399-403.

The gram-negative cell wall [online] Available: http://www.bv229.k12.ks.u (retrived 9/5/2008).

Thornqvist, P.O., Johansson, M.W. and Söderhäll, K. 1994. Opsonic activity of cell adhesion proteins and beta-1,3-glucan binding proteins from two crustaceans. Dev. Comp. Immunol. 18, 3-12.

Utarabhand, P., Rittidach, W. and Paijit, N. 2007. Bacterial agglutination by sialic acid-specific lectin in the hemolymph of the banana shrimp, Penaeus (Ferneropenaeus) merquiensis. Science Asia 33, 41-46

Vazquez, L., Masso, F., Rosas, P., Montano, L.F. and Zenteno, E. 1993. Purification and characterization of a lectin from Macrobrachuim rosenbergii (Crustacea, Decapoda) hemolymph. Comp. Biochem. Physiol. 105, 617-623.

113

Wang, R., Lee, S.Y., Cerenius, L. and Söderhäll, K., 2001. Properties of the prophenol- oxidase activating enzyme of the freshwater crayfish, Pacifastacus leniusculus. Eur. J. Biochem. 268, 895-902.

Wang, H., Songa, L., Li, C., Zhaoa, J., Zhang, H., Ni, D. and Xu, W. 2007. Cloning and characterization of a novel C-type lectin from zhikong scallop Chlamys farreri. Molec. Immunol. 44, 722-731.

Wessels, G.M., Truschel, M.R., Chamber, S.A. and Mcclay, D.R. 1987. A cortical granule specific enzyme, β-1,3-glucanase, in sea urchin eggs. Gamete Res. 18, 339-348.

Witteveldt, J., Vlak, J.M., Mariëlle C.W. and van Hulten, M.C.W. 2004. Protection of Penaeus monodon against white spot syndrome virus using a WSSV subunit vaccine. Fish Shellfish Immunol. 16, 571-579.

Wolin, M.J. 1973. The cholerae Vibrio and related form. In: Textbook of microbiology, 20th Ed. Burrows, W., Ed. WB. Saunders, Philadelphia, 520-536.

Wongteerasupaya, C., Wongwisansri, S., Boonsaeng, V., Panyim, S., Pratanpipat, P., Nash, G.L., Withyachumnamkul, B. and Flegel T.W. 1995. DNA fragment of Penaeus monodon Baculovirus PmNOBII gives positive in situ hybridization with white-spot viral infections in six penaeid shrimp species. Aquaculture 143, 23-32.

Wuyts, N., Waele, D.D. and Swennen, R. 2006. Extraction and partial characterization of polyphenol oxidase from banana (Musa acuminata Grande naine) roots. Plant Physiol. Biochem. 44, 308-314.

Xue, C.-B., Luo, W.-C., Chen, Q.-X., Wang, Q.I.N. and Ke, L.-N., 2006. Enzymatic properties of phenoloxidase from Pieris rapae (Lepidoptera) larvae. Insect Sci. 13, 251-256.

Yang, C.P., Fujita, S., Ashrafuzzaman, M., Nakamura, N. and Hayashi, N. 2000. Purification and characterization of polyphenol oxidase from banana (Musa sapientum L.) pulp. J. Agric. Food Chem. 48, 2732-2735.

114

Young, D.H. and Pegg, G.F. 1981. Purification and characterization of 1,3-β-D-glucan hydrolases from healthy and Verticillum albo-atrum infected tomato plants. Physiol. Plant Pathol. 19, 391-417.

Yu, X.-Q. and Kanost, M.R. 2004. Immulectin-2, a pattern recognition receptor that stimulates hemocyte encapsulation and melanization in the tobacco hornworm, Manduca sexta. Dev. Comp. Immunol. 28, 891-900.

Zelck, U.E. 1999. Glycosidase activities in plasma of naive and schistosome-infected Biomphalaria glabrata (Gastropoda). Parasitology 119, 563-568.

ZHANG, G., Qiang, L.Z., JIANG, H. and Sassan, A. 2004. Negative regulation of prophenoloxidase (proPO) activation by a clip-domain serine proteinase homolog (SPH) from endoparasitoid venom. Insect Biochem. Molec. Boil. 34, 477-483.

Zhao, J., Qi, X.Y., You, Y.M., Wang, J.X. and Zhou, P.G. 1997. Study on some charac-teristics of phenoloxidase from Japanese prawn, Penaeus japonicus. J. Shanghai Fish Univ. 6, 157-165.

http://naffi.trf.or.th (retrived 6/5/2008).

http://www.courseware.rmutl.ac.th (retrived 5/5/2008).

http://www.talaythai.com (retrived 16-20/5/2008).

115

ภาคผนวก

116

การเตรียมอาหารสําหรับเลี้ยงเชื้อ

1. อาหารนับเชื้อ PCA (Plate count agar) ที่มี 1.5% NaCl ประกอบดวย ละลายสวนผสมอาหารเลี้ยงเชื้อ PCA 23.5 กรัม และ NaCl 15 กรัม ในน้ํากลั่น ใหมีปริมาตรครบ 1 ลิตร นําไปน่ึงฆาเชื้อ (autoclave) เปนเวลา 15 นาที ที่ความดัน 15 psi อุณหภูมิ 121°ซ จากนั้นนําไปวางในอางน้ํารอน (water bath) ที่อุณหภูมิ 50°ซ เพ่ือลดอุณหภูมิใหเหมาะสมแลวนําเทใสเพลทแกวที่น่ึงฆาเชื้อและอบใหแหงหรือเทใสเพลทพลาสติก ตากจนอาหารแข็งและแหงเก็บรักษาอาหารเลี้ยงเชื้อในถุงพลาสติกสะอาด ที่ 4°ซ ไวสําหรับใชตอไป ซ่ึงเตรียมไวใชไดเปนเวลา 2 สัปดาห 2. อาหารคัดเลือกเชื้อ TCBS (Thiosulphate citrate bile salt sucrose) Agar

ประกอบดวย ละลายอาหารเลี้ยงเชื้อ TCBS agar 89.0 กรัม ในนํ้ากลั่นใหมีปริมาตรครบ 1 ลิตร เขยาใหเปนเนื้อเดียวในขวดดูแรน (duran) ที่ผานการนึ่งฆาเชื้อแลว ตมใหเดือด ตั้งทิ้งไวจนอุณหภูมิ 50°ซ เพ่ือลดอุณหภูมิใหเหมาะสม แลวนําไปเทใสเพลทแกวที่น่ึงฆาเชื้อและอบใหแหงหรือเทใสเพลทพลาสติก ตากจนอาหารแข็งและแหงเก็บรักษาอาหารเลี้ยงเชื้อในถุงพลาสติกสะอาด ที่ 4°ซ ไวสําหรับใชตอไป ซ่ึงเตรียมเก็บไวใชไดเปนเวลา 2 สัปดาห หมายเหตุ : การเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อ TCBS ไมตองน่ึงฆาเชื้อดวยหมอความดัน หรือตมอาหารเลี้ยงเชื้อดวยไมโครเวฟ เพราะจะทําใหคุณสมบัติของอาหารเลี้ยงเชื้อลดลง 3. อาหารแข็ง TSA (Tryptic soy agar) ประกอบดวย

TSB Soybean-Casein Digest Medium 12 กรัม Agar 6 กรัม

NaCl 6 กรัม นํ้ากลั่นปริมาตร 400 มิลลิลิตร

ละลายสวนผสมในน้ํากลั่นในขวดดูแรนขนาด 500 มิลลิลิตร เขยาและนําไปใหความรอนโดยไมโครเวฟ เบาๆ จนสวนผสมละลายไมจับกันเปนกอน นําไปนึ่งฆาเชื้อเปนเวลา 15 นาที ที่ความดัน 15 psi อุณหภูมิ 121°ซ ตั้งทิ้งไวจนอุณหภูมิ 50°ซ เพ่ือลดอุณหภูมิใหเหมาะสม จากนั้นเทใสเพลทแกวที่น่ึงฆาเชื้อและอบใหแหงหรือเพลทพลาสติก ตากจนอาหารแข็งและแหงเก็บรักษาอาหารเลี้ยงเช้ือในถุงพลาสติกสะอาด ที่ 4°ซ ไวสําหรับใชตอไป ซ่ึงเตรียมเก็บไวใชไดเปนเวลา 2 สัปดาห

117

ประวัติผูเขียน

ชื่อ สกุล นางสาววิไลพร ธรรมรัตน รหัสประจําตวันักศึกษา 4822069 วุฒิการศึกษา

วุฒิ ชื่อสถาบัน ปที่สําเร็จการศึกษา วิทยาศาสตรบัณฑิต มหาวิทยาลัยทักษิณ 2547

(เคมี) ทุนการศึกษา (ที่ไดรับในระหวางการศึกษา) ทุนการศึกษาระดับบัณฑิตศึกษา จากโครงการสรางความเขมแข็งสูความเปนเลิศทางวิชาการ สาขาวิชาชีวเคมี มหาวิทยาลัยสงขลานครินทร ประจําป 2548 การตีพิมพเผยแพรผลงาน วิไลพร ธรรมรัตน อรัญญา คงแกว และ ประภาพร อุทารพันธุ. 2550. แอคทิวิทีของเอนไซมเบตา-1,3-กลูคาเนส เอ็น-อะซิติลกลูโคซามินิเดสและฟนอลออกซิเดสที่ตอบสนองตอเชื้อกอโรคและไมกอโรคของกุงแชบวย. การประชุมทางวิชาการกุงทะเลแหงชาติ ครั้งที่ 6. อาคารไบโอเทค อุทยานวิทยาศาสตรประเทศไทย จังหวัดปทุมธานี, 29-30 เดือน มีนาคม 2550. หนา