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AFMによる細胞の局所弾性計測および液中原子分解能計測
埼玉大学大学院理工学研究科
戦略的研究部門ライフ・ナノバイオ領域
助教 小林成貴
2018年7月12日JST新技術説明会
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AFMによる細胞力学(硬さ)計測
Ramos et al., Beilstein J. Nanotechnol. 5 (2014) 447.
探針を試料に押し込ませると、
細胞は変形し、カンチレバーはたわむ(探針に力がかかる)
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AFMによる細胞力学(硬さ)計測
フォースカーブ(力 vs. カンチレバーの変形量)
ヘルツの接触理論
Etip, Esample: ヤング率(縦弾性係数)νtip, νsample: ポアソン比α: 半頂角
ヘルツ接触式フォースカーブに対して
ヘルツ接触式でフィッティング
試料のヤング率(硬さ)
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がんの転移能と細胞の硬さの関係
Watanabe, Suganuma et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol., 138 (2012) 859.Watanabe, Suganuma et al., Int. J. Cancer, 134 (2014) 2373.
がんの転移性とがん細胞の硬さの関係
転移性の高いがん細胞ほど柔らかい
緑茶カテキンによる転移抑制
がんの転移性は細胞の硬さと大きく関係している
緑茶カテキンの添加がん細胞の硬化
がんの転移の抑制
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従来法
・ひとつの細胞(フォースカーブ)に対してひとつのヤング率を取得
・ヘルツ理論では試料の硬さを均一と仮定
細胞の種類・状態が違っていても、ヤング率が同じ値を示すと、それらを区別することができない
従来のAFM細胞力学(硬さ)計測の欠点
試料変形方向に対する局所的な硬さの解析が重要
細胞 → 不均一な硬さを持つ物体細胞硬化処理 → 局所的な硬化
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新規硬さ解析方法のアイデア
フォースカーブをある区間ごとに分割し、各区間のヤング率を求めることで、変形方向に対する細胞の硬さの局所的な変化を評価できる。
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新規硬さ解析方法の概要①
・接触点から最も押し込んだ位置までを解析区間
・解析区間を接触点から任意の値( Δd )で等間隔に分割
(※最後の区間は必ずしもΔdとはならない)
・各区間(δi)をヘルツ式でフィッティングし、ヤング率(Ei)を取得
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強度マップ
新規硬さ解析方法の概要②
・複数の細胞上でフォースカーブを取得し、同様の解析を行う
・区間(δi)で得られたヤング率の(相対)度数分布を作成する
・各区間の(相対)度数を強度マップで表示させる
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細胞:ヒト非細胞肺がん(H1299) 細胞処理:
①未処理②AXLの発現を抑制したもの③緑茶カテキン(EGCG)を添加したもの④mβcdを添加したもの⑤クルクミンを添加したもの※②~⑤の処理はH1299細胞を硬化することが既に確認されている。
フォースカーブ測定:・探針に0.5 nNの力がかかるまで細胞を押し付ける・1つの細胞につき、核付近の異なる16箇所で測定・この測定を各種細胞につき、20個の細胞に対して測定(各種細胞につき320本のフォースカーブ測定を取得)
解析:・変形区間を接触点からΔd=50 nmごとに分割・各区間のフォースカーブを接触点を通過するヘルツ接触式でフィッティング・強度マップは相対度数(分母:全フォースカーブ数)で表示
実施例:測定条件
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従来法:1.35 kPa
実施例:未処理のH1299細胞
500 nm ~ 1 μmの変形領域に、硬さ1.2 ~ 1.6 kPaの細胞が多く分布している。
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従来法:2.91 kPa
実施例:緑茶カテキンを添加したH1299細胞
600 nm ~ 800 nmの変形領域に、硬さ2.8 ~ 3.2 kPaの細胞が多く分布している。
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実施例:siAXL処理したH1299細胞
300 nm ~ 600 nmの間に、硬さ4.0 kPa前後の細胞が多く分布している。
従来法では、EGCG添加した細胞とsiAXL処理した細胞の硬さは同じであるが、硬さ分布だと大きな違いがみられる。
従来法:2.91 kPa
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従来法:3.76 kPa
実施例:mβcd処理したH1299細胞
500 nm ~ 700 nmの間に、硬さ4.0 kPa前後の細胞が多く分布している。
細胞の硬さのばらつきが少なく、同じ力でもせいぜい1.3 μmの変形しか起こらない。
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従来法:1.84 kPa
実施例:クルクミンを添加したH1299細胞
500 nm ~ 800 nmの変形領域に、硬さ2.4 kPaの細胞が多く分布している。
未処理に比べて硬く、mβcdを添加した細胞と同様、硬さのばらつきが少ない。
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液中周波数変調原子間力顕微鏡(FM-AFM)
AFMの原理 FM-AFMの原理
・高い力検出感度
・精密な探針-試料間距離制御
⇒液中での原子分解能イメージング
マイカの液中原子像
1 nm
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10 nm
FM-AFMによるバイオイメージング
脂質二重膜(モデル細胞膜) コラーゲン三重らせん
コラーゲンの構造モデル
5 nm
化学品メーカーとの共同研究
2 nm
リン脂質分子の個々の頭部を分解して観察
リン脂質の頭部
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FM-AFMによる3次元力分布計測
探針
従来のAFM
Fukuma et al. PRL 104 (2010) 016101.
3次元走査型力顕微鏡
探針を3次元に走査し、各位置における探針-試料間相互作用力を記録することで、相互作用力の3次元空間分布を可視化できる。
FM-AFMと組み合わせることで、サブナノスケールでの力分布計測が可能となる。
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サブナノスケール水和構造計測
炭酸カルシウム結晶-水界面
局在した水分子の層を明瞭に直接可視化できる。
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まとめ:新技術の特徴・従来技術との比較
新規細胞力学計測
従来:細胞全体の平均的な硬さを測定
新規:細胞の変形方向に対する局所的な硬さを測定
→従来法では区別できない細胞の種類・内部状態を区別できる。
原子分解能計測
・従来の液中ナノ計測技術と比べて非常に高い空間分解能をもち、単
一原子・分子レベルでの表面構造観察が可能
・固液界面に形成される水和構造のサブナノスケール直接観察も可能
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想定される用途
新規細胞力学計測
・正常細胞との比較によるがん細胞の状態の詳細解析や悪性度診断
・がんの転移を抑制する薬剤・細胞処理法の効果検証
・細胞に限らず、不均一な弾性体の構造解析
原子分解能計測
・脂質膜やタンパク質など各種バイオ試料の高分解能イメージング
・タンパク質表面の水和構造計測と構造・機能との相関
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新規細胞力学計測
・細胞の状態や細胞のどの部分を詳細に調べたいか、など状況に応じ
た測定方法・解析プログラムの検討
・検証事例数の増大(データベース化)
・細胞以外の不均一弾性体への応用
原子分解能計測
・バイオ試料を対象とした水和構造計測法の確立
実用化に向けた課題
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新規細胞力学計測に関しては、検証事例をさらに増やし、本技術を
改善していきたいと思っています。「硬さ」という物理指標を観点
としたアプローチによる細胞の研究に興味のある企業との共同研究
を希望します。
原子分解能計測に関しては、基礎研究・応用研究に限らず、原子・
分子レベルでの生体分子構造・生体機能の解析に興味のある企業と
の共同研究を希望します。
企業の方々への期待
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発明の名称
細胞の弾性特性を解析する方法,解析システム,細胞の弾性特性を可視化する方法およびプログラム
出願番号
特願2017-179265
出願人
埼玉大学
発明者
小林成貴,吉川洋史,菅沼雅美,中林誠一郎
本技術に関する知的財産権
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産学連携の経歴
2010年-2014年
博士研究員として各種企業様との共同研究に参加
2017年-現在
化学品メーカー(1社)と共同研究実施中