PRCTICA.9:
AGAR KIA (KLIGLER IRON AGAR)
Nom: Laura Cirera Prez2n de laboratori de diagnstic clnicCrdit
5: Microbiologia1.OBJECTIU: Sembrar un medi en bec de flauta per
picadura i en superfcie. Realitzar una prova bioqumica per a
identificar microorganismes. Identificar el gnere (i espcie, si
podem) dels microorganismes utilitzats en la prctica. 2.FONAMENT
TERIC:2.1.Els Enterobacteris :
Sn de lordre dels Enterobacteriales i de la famlia dels
Enterobacteriaceae) sn bacteris Gram negatius que contenen ms de 30
gneres i ms de 100 espcies i que poden tenir morfologia de bacils o
cocs. Els membres d'aquest grup formen part especialment de la
microbiota de l'intest (anomenats coliforms), tot i que tamb
d'altres rgans de l'sser hum i d'altres espcies animals. Algunes
espcies poden viure en el terra, en laigua o en les plantes.
Sucumbeixen amb relativa facilitat a desinfectants comuns, incls el
clor. Sovint es troben espcies d'enterobacteris en la bio-indstria:
per comprovar la sanitat de la fermentaci de formatges i productes
lctics, alcohols i en tractaments mdics, com la producci de toxines
en l's de cosmtics i fabricaci d'agents antivirals de la indstria
farmacutica, etc.
2.2.Composici en g/l del medi agar KIA: Extracte de carn 3.0
Extracte de llevat 3.0 Peptona 20.0 Lactosa 10.0 Glucosa 1.0 Clorur
sdic 5.0 Citrat frric amnic 0.5 Tiosulfat sdic 0.5: font de sofre,
els bacteris el redueixen produint cid sulfhdric (precipitat negre)
Vermell de fenol 0.03: indicador, si vira a rosat, indica basicitat
del medi, si s groc indica acidificaci (derivada de cid de la
fermentaci)2.3.Proves que valorarem:Utilitzaci dels hidrats de
carboni (canvi de pH): No fermentaci de glucosa ni de lactosa K/K:
bec i fons alcal (vermell). El medi salcalinitza degut a la formaci
damines a partir de protenes. Aquest podria ser una Pseudomona
aeruginosa (bacil no Enterobacteriaceae gram-). Fermentaci de
glucosa i no de la lactosa K/A: bec alcal (vermell) i fons cid
(groc). Aquests poden ser Shigella, Proteus, Salmonella, etc...
Fermentaci de glucosa i lactosa A/A: bec i fons cid (groc). El medi
sacidifica degut a la formaci dcids orgnics. Aquests poden ser
E.coli, Klebsiella, Enterobacter, etc...Producci de gas: Aparici de
bombolles de CO2 i H2 com productes finals del metabolisme de la
glucosa a la part inferior del medi. Es denota amb un cercle al
voltant del smbol que indica lacidesa o basicitat (K/A, K/K,
A/A).Producci de sulfur dhidrogen: Es detecta per la formaci de
sulfur ferrs (FeS) que s de color negre. Com que es requereix un
medi cid perqu un microorganisme produeixi H2S, un fons negre sha
de llegir com a cid, tot i que el color groc estigui enfosquit pel
precipitat negre. Sindica amb una S al costat del smbol que indica
lacidesa o basicitat a la part inferior del tub. 2.4.identificaci
dels microorganismes:Escherichia coli: s una enterobactria que es
troba generalment en els intestins animals, per se'l pot trobar a
altres llocs, ja que s un organisme ubico. Aquesta i altres
bacteris sn necessries per al funcionament correcte del procs
digestiu, a ms de produir les vitamines B i K. s un bacil que
reacciona negativament a la tinci de Gram (gramnegativo), s
anaerobi facultatiu, mbil per flagels pertrics (que envolten el seu
cos), no forma espores, s capa de fermentar la glucosa i la lactosa
i la seva prova de IMVIC s ++ -.s un bacteri utilitzat freqentment
en experiments de gentica i biologia molecular.Shigella
dysenteriae: s un bacteri amb forma de bacil del gnere Shigella,
habitant normal del tracte gastrointestinal hum i que pot causar
shigellosis (disenteria bacteriana). s un bacteri Gram-negativa, no
formadora d'espores i no-mtil. Es propaga contaminant l'aigua i els
aliments, causant les ms severes disenteries causa de la seva
potent i mortal toxina Shiga, encara que altres espcies tamb poden
ser agents de disenteria. Encara que sn aneerobios facultatius, per
creixen millor en condicions aerbies. Les colnies convexes,
circulars i transparents amb vores ntides arriben a un dimetre
d'aproximadament 2 mm en 24 hores. Fermenta la glucosa per no la
lactosa. Forma cid a partir de carbohidrats, per poques vegades
produeixen gas. Produeix una exotoxina termolbil que afecta
l'intest i el sistema nervis central. La exotoxina s una protena
antignica mortal per als animals d'experimentaci. Actua com
enterotoxina i produeix diarrea. En humans tamb inhibeix l'absorci
de sucre i aminocids en l'intest prim. Actua com neurotoxina i
aquesta substncia pot contribuir a la gravetat extrema i naturalesa
mortal de les infeccions per S. dysenteriae.
Pseudomona aeruginosa: Pseudomonas aeruginosa s un bacteri
Gram-negativa, aerbica, amb motilitat unipolar. s un patogen
oportunista en humans i tamb en plantes. Secreta una varietat de
pigments com piocianina (blau verds), fluorescena (groc verds
fluorescent) i piorrubina (vermell bru). s sovint identificada, de
manera preliminar, per la seva aparena perlada i olor de ram in
vitro. La identificaci clnica definitiva de P. aeruginosa
freqentment inclou, tant identificar la producci de piocianina i
fluorescena com determinar la seva habilitat de crixer a 42 C. P.
aeruginosa s capa de crixer en combustibles com queros o gasoil, ja
que s un microorganisme capa de nodrir a partir d'hidrocarburs,
causant estralls de corrosi microbiana, i creant una gelatina fosca
que de vegades s'identifica inadequadament amb una alga.
3. MATERIAL:MaterialFotoMaterialFoto
INCUBADORAMEDI KIA
NANSA DE KOLLE GRADETA
BEC-BUNSEN
4.PROCEDIMENT:PROCEDIMENT 1: Reconstituci i sembra dels
microorganismes.Primer de tot preparem el lloc de treball engegant
el bec-bunsen per proporcionar un ambient estril. Seguidament
agafem el medi de tioglicolat, reconstitum els microorganismes i ho
deixem incubar com a mnim 24 hores. Passat aquest perode de temps
procedirem a la sembra en Agar TSA. Un cop sembrats els medis de
cultiu, els incubarem a 37C durant 24 hores, i a partir de les
colnies pures crescudes en els medis realitzarem les proves
bioqumiques.
PROCEDIMENT 2: inoculaci dels medisPrimer de tot preparem el
lloc de treball engegant el bec-bunsen per proporcionar un ambient
estril. Prepararem tot el material necessari per a la realitzaci de
la prctica i seguidament identifiquem cada tub de Agar KIA (3) amb
el nmero de la mostra a sembrar, la data de sembra i una
identificaci del grup de treball. En el nostre cas hem posat: per
la mostra 1 (M1, 9-03-15, LL) , la mostra 2 (M2, 9-03-15, LL) i la
mostra 3 (M3, 9-03-15, LL).En cada tub realitzarem dues sembres per
picadura. Cal treballar a prop del bec Bunsen per intentar que la
sembra es realitzi amb esterilitat i sense contaminacions. Comencem
flamejant la nansa recta fins que quedi roja i la deixem refredar
per no produir la mort dels microorganismes. Recollim diverses
colnies de microorganismes amb la nansa de kolle estril (una vegada
estigui freda) del medi TSA sembrat. Seguidament obrim el medi KIA,
flamegem el coll del tub i procedim a sembrar en picadura. La
picada ha se ser el ms vertical possible, al centre del medi,
introduint parts de la nansa en el medi sense tocar les parets amb
el mnec. Esterilitzem la nansa, flamegem el tap i el coll del tub
KIA i tapem. A continuaci agafem la nansa de kolle estndard i
procedirem a sembrar en superfcie tots els tubs de medi KIA amb
lincul adequat. Comencem flamejant la nansa estndard fins que quedi
roja i la deixem refredar per no produir la mort dels
microorganismes. Recollim diverses colnies de microorganismes amb
la nansa de kolle estril (una vegada estigui freda) del medi TSA
sembrat. Seguidament obrim el medi KIA, flamegem el coll del tub i
procedim a sembrar la superfcie del medi sobre el bec de flauta.
Aqu ens interessa tenir creixement, no allament.Mantindrem una
atmosfera aerbica en linterior del medi (tub no enroscat del tot) i
els incubarem durant 24-48 hores. Tamb incubarem un tub de medi KIA
sense incul que ens servir de control. 5. RESULTATS:Mostra 1:
Producci de gas (es pot observar en el fons del tub al veure com ha
elevat el medi). Doble color (bec alcal (vermell) i fons cid
(groc). Per tant estem davant un microorganisme que fermenta la
glucosa i no fermenta la lactosa (K/A). No esveu ennegriment del
medi.Podria ser Escherichia coli, tot i que E.coli s A/A (tan el
bec com el fons de color groc, ja que fermenta la glucosa i la
lactosa i tamb produeix gas) per en aquest cas podria ser que la
sembra no shagus realitzat correctament i no shagus produt
creixement a la punta, ja que el bec de flauta no s vermell
dalcalinitat sin que s rosat com el medi inicial.
Mostra 2: Doble color (bec alcal (vermell) i fons cid (groc),
per tant estem davant un microorganisme que fermenta la glucosa per
no la lactosa (K/A). No es veu producci de gas Ennegriment del
medi, per tant producci de sulfur dhidrogen.Podria ser Shigella
dysenteriae, ja que s un microorganisme (K/A)
Mostra 3: Trobem tant el bec com el medi de color vermell (K/K).
Per tant tenim un medi alcal i per tant un microorganisme que ni
fermenta la glucosa ni la lactoca. No es veu producci de gas. No es
veu ennegriment del mediPodria ser Pseudomona aeruginosa, ja que s
un microorganisme (K/K).
6.EXERCICI:Elabora un breu resum de les caracterstiques
estudiades al llarg de les diferents prctiques realitzades per al
microorganisme Escherichia coli.LEscherichia coli la podem
identificar mitjanant: 1. Primer de tot cal realitzar la tinci de
gram per veure si es tracta de un bacil gram negatiu.2. Agar
Salmonella - Shigella: S'utilitza per allar bacteris lactosa
negativa com Salmonella i Shigella. Espcies de la famlia
Enterobacteriaceae lactosa - positives, com Escherichia coli,
presenten colnies rosades en aquest tipus de mitj.3. Agar
MacConkey: Igual que l'anterior separa els bacteris fermentadors de
la lactosa. Escherichia coli produeix colnies rosades.4. Prova
d'ureasa: Els microorganismes que hidrolitzen la urea a travs de
l'enzim ureasa, alliberen amonac qual cosa produeix un canvi de
color vermell en el medi. L'agar urea de Christensen permet la
detecci de menors quantitats d'amonac per a aquells microorganismes
que produeixen menors quantitats de ureasa s'avaluen amb aquest
mtode. 1% de positivitat per a aquesta prova en E. coli.5. Producci
de Indol: El indol s un dels productes de la degradaci de
l'aminocid triptfan. Per a la seva detecci del bacteri s conreada
en brou triptona i posteriorment s'utilitza el reactiu d'Ehrlich,
el qual s ms sensible que el reactiu de Kovacs quan s'estudien
bacils no fermentadors o anaerobis la producci de indol s mnima.
98% de positivitat per a aquesta prova en E. coli.6. Prova de
fermentaci de carbohidrats: Es recomana l's del brou de base porpra
de bromocresol contenint un determinat substrat a una concentraci
de l'1% per a la determinaci de la fermentaci de carbohidrats i
alcohols per espcies de la famlia Enterobacteriaceae. D-Sorbitol
94% de positivitat. Lactosa 95% de positivitat. Sacarosa 50% de
positivitat. Maltosa 96% de positivitat.7. Prova KIA: fermenta tant
la glucosa com la lactosa (K/K)
7.BIBLIOGRAFIA:https://www.google.es/imghp?hl=es&tab=wi&ei=uY-BVOTbCovLaPSSgcgF&ved=0CAQQqi4oAghttps://biotaetscientia.wordpress.com/2011/06/15/pruebas-microbiologicas-para-e-coli/www.wikipedia.com
