Upload
others
View
17
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
1
AKTIVITAS ENZIM LAKTAT DEHIDROGENASE PADA JARINGAN OTAK TIKUS YANG DIINDUKSI HIPOKSIA SISTEMIK
Rineke Twistixa Arandita*, Ani Retno Prijanti**, Muhammad Sadikin**
*Pendidikan Dokter, Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia **Departemen Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia
Hipoksia merupakan keadaan dimana kadar oksigen berada dibawah kadar 20-21%. Otak merupakan salah satu organ yang rentan mengalami kematian sel akibat hipoksia disebabkan oleh kebutuhan energi yang lebih banyak untuk melakukan fungsinya. Aktivitas Enzim Laktat Dehidrogenase (LDH) memiliki peran dalam keadaan hipoksia untuk menghasilkan energi melalui reaksi glikolisis anaerob. Penelitian ini bertujuan untuk mengamati dan mempelajari adaptasi jaringan otak dengan melihat aktivitas enzim LDH di jaringan otak tikus normoksia dibandingkan dengan hipoksia. Penelitian ini merupakan studi eksperimental yang dilaksanakan sejak Maret 2011. Dilakukan pengkondisian hipoksia dalam hypoxic chamber (oksigen 10% dan nitrogen 90%) selama 1 hari, 3 hari, 7 hari, dan 14 hari kepada 20 tikus galur Sprague Dawley, sedangkan 5 ekor tikus akan berperan sebagai kontrol. Pasca perlakuan, otak tikus diambil melalui proses bedah dengan melakukan eutanasia dengan eter terlebih dahulu, otak ditimbang hingga batas 100 mg, dan diubah menjadi supernatan yang akan diperiksa absorbansinya dengan menggunakan elektrofotometer untuk menentukan aktivitas enzim LDH. Hasil menunujukkan peningkatan aktivitas pada 1 dan 3 hari hipoksia, dan menurun pada 7 dan 14 hari hipoksia. Analisis dengan uji nonparametrik Kruskal-Wallis didapatkan nilai p > 0.05 sehingga tidak ada perbedaan bermakna antara aktivitas LDH pada kelompok kontrol dengan kelompok yang diberi perlakuan hipoksia.
Kata kunci : Aktivitas Laktat Dehidrogenase (LDH), Glikolisis Anaerob, Hipoksia, Jaringan Otak, Tikus. Hypoxia is a term to a condition which oxygen level below 20-21%. The brain is an organ which is susceptible to cell death due to hypoxia caused by the need of more energy to perform its function. Lactate Dehydrogenase (LDH)’s activity has role in hypoxic condition to produce energy through anaerob glycolisis. This research aimed to observe and study about the adaptation of brain through LDH’s activity in the tissue of normoxic rat brain compared to the hypoxic rat. This is an experimental study which held from March 2011. 20 rats were placed in the hypoxic chamber (10% Oxygen, 90% Nitrogen) for 1, 3, 7, and 14 days; while 5 normoxic rats will be served as control. The brain were taken by a surgery with a process of eutanaschia before it. The brain weighed up to the limit of 100 mg, then converted to supernatant. Absorbance of the supernatant examined by electrophotometer as the activity of the enzymes. There were increased activity in the 1, and 3-day hipoxia, and decreased in 7, and 14-day hipoxia. analyzed by Kruskal-Wallis nonparametric test obtained p > 0.05 which means there is no significant difference between LDH’s activity in the normoxic and hypoxic tissue. Keywords: Anaerob Glycolysis, Brain Tissue, Hypoxia, Lactate Dehydrogenase (LDH)’s activity, Rats.
Aktivitas enzim..., Rineke Twistixa Arandita, FK-UI, 2013
2
1. Pendahuluan Seluruh sel hidup menjalani proses transformasi energi yang mengalami tiga
fase, yaitu pembentukan energi dari oksidasi bahan bakar, perubahan energi yang
terjadi menjadi ikatan pospat berenergi tinggi ATP, dan penggunaan energi pada
ikatan pospat ATP untuk menjalankan proses yang memerlukan energi.1,2,3,4,5,6 Fase
pertama dari transformasi energi terjadi melalui reaksi yang bernama fosforilasi
oksidatif yang terjadi secara aerobik di dalam mitokondria dan termasuk dalam
rangkaian proses respirasi yang sangat membutuhkan oksigen sebagai senyawa
yang akan memasuki siklus tricarboxyclic acid cycle (TCA) sebagai akseptor elektron
terakhir untuk pembentukan ATP yang merupakan energi untuk sel.1,2,3,4,5,6
Pemenuhan ATP sebagai energi untuk sel tubuh sangat penting untuk
keberlangsungan fungsi sel yang akan berakhir pada pemenuhan kebutuhan tubuh
seutuhnya. 5,6,7,8 Sedangkan, pada keadaan defisiensi oksigen (hipoksia) tubuh akan
memproduksi ATP dengan melakukan glikolisis anaerob; ATP yang dihasilkan akan
mencapai 18 kali lebih rendah dibandingkan dengan ATP dalam keadaan aerob,
pada proses ini piruvat merupakan substrat utama yang akan mengalami reduksi
menjadi laktat yang diperantarai oleh enzim laktat dehydrogenase.1,2,4,5,7,8 Reaksi ini
dapat berlangsung secara bolak-balik dan merupakan reaksi yang berhubungan erat
dengan kondisi hipoksia, sehingga pengukuran aktivitas dari enzim ini dapat
dijadikan salah satu tolok ukur dalam melihat respon jaringan terhadap kondisi
hipoksia pada mamalia.1,2,3,4
Otak merupakan salah satu organ yang membtutuhkan oksigen dalam jumlah
banyak untuk dapat melakukan fungsinya. Dalam keadaan hipoksia, akan terjadi
pembentukan radikal bebas yang dapat menyebabkan stres oksidatif. 4,10
Melihat kebutuhan otak akan oksigen yang banyak untuk dapat menajalankan
fungsinya, peneliti ingin mempelajari adaptasi organ otak terhadap keadaan hipoksia
dengan membandingkan aktivitas enzim laktat dehidrogenase yang terdapat dalam
tikus normoksia dan hipoksia dengan variasi waktu yang berbeda.
2. Tinjauan Pustaka 2.1 Hipoksia
Hipoksia merupakan keadaan ketika kadar oksigen berada dalam kisaran
dibawah kadar normal (20-21%).11 Keadaan hipoksia ini akan memberikan efek lebih
Aktivitas enzim..., Rineke Twistixa Arandita, FK-UI, 2013
3
lanjut berupa cedera jaringan sebagai akibat berkurangnya aktivitas respirasi aerob;
yang jika dibiarkan berlanjut dapat menimbulkan efek paling berat berupa kematian
sel. Setiap sel dalam tubuh makhluk hidup memiliki kemampuan untuk melakukan
adaptasi dalam keadaan ini sampai batas hipoksia tertentu dengan melakukan
produksi energi melalui glikolisis anaerob.12
Dalam keadaan kurangnya kadar oksigen, sel akan melakukan mekanisme
adaptasi untuk mempertahankan energi sehingga ia dapat tetap bertahan hidup
berupa penurunan aktivitas fosforilasi oksidatif yang bersifat aerob dan peningkatan
aktivitas glikolisis yang dapat tetap berlangsung pada keadaan anaerob; akan terjadi
peningkatan protein HIF yang akan memicu produksi VEGF yang akan menstimulasi
angiogenesis dan eritropoietin yang akan meningkatkan produksi eritrosit.13 Adaptasi
lain yang dilakukan oleh sel untuk tetap mendapatkan energi adalah mencoba untuk
mengembalikan oksigenasi dengan bergantung pada oxygen-sensing prolyl
hydroxylases (PHDs) yang merupakan enzim yang mengkatalisis hidroksilasi prolin
subunit Hypoxic-induced factor-1α (HIF-1α).14 ,15
2.1.1 Hipoksia pada Jaringan Otak
Pada otak, dibutuhkan metabolisme glukosa untuk mendapatkan energi yang
akan digunakan untuk melakukan fungsinya. Kekurangan oksigen atau glukosa pada
otak akan menyebabkan gangguan fungsi dan jika berkelanjutan atau sangat parah
akan menyebabkan kerusakan otak secara permanen. Terganggunya asupan
oksigen pada otak merupakan penyebab utama timbulnya kerusakan otak secara
cepat; hal ini menjelaskan ketika sirkulasi menuju otak terhenti, hanya akan
memakan waktu 10 detik untuk kehilangan kesadaran, dan segera setelah hilangnya
kesadaran, otak akan mulai mengalami kerusakan.14
Penurunan tekanan oksigen secara mendadak hingga berada dibawah 20
mmHg akan mengakibatkan kehilangan kesadaran dalam 10 hingga 20 detik dan
kematian dalam 4 hingga 5 menit. Pada kasus hipoksia yang lebih ringan, akan
terjadi variasi gangguan mental yang sama dengan yang terjadi pada intoksikasi
alkohol, yaitu tidak dapat menilai sesuatu dengan baik, drowsiness, menurunnya
sensibilitas terhadap nyeri, disorientasi, anoreksia, mual-muntah, atau pun
takikardi.5,16,17
Aktivitas enzim..., Rineke Twistixa Arandita, FK-UI, 2013
4
Kerusakan jaringan terjadi akibat ketidakseimbangan antara ketersediaan
energi dengan tingkat kebutuhan energi, akan menyebabkan penghentian aliran
listrik secara bertahap pada otak sebagai suatu mekanisme proteksi. Penghentian
aliran listrik secara bertahap ini terjadi karena 3 hal, yaitu :18 hiperpolarisasi dari
neuron akibat peningkatan permeabilitas membran terhadap ion kalium, arus yang
mengalir pada membran yang menyebabkan penekanan potensial aksi dari ion
natrium dan kalsium, transmisi eksitatori sinaps akan dihambat secara selektif; 3 hal
ini dipicu oleh meningkatnya kalsium bebas di sitoplama akibat hipoksia,
menurunnya ATP, dan akumulasi adenosin di ekstraseluler.5,17
2.2 Glikolisis Glikolisis merupakan jalur metabolisme glukosa utama yang terjadi di sitosol
setiap sel di tubuh. Proses glikolisis dapat bekerja baik dalam lingkungan cukup
oksigen secara aerob, maupun lingkungan yang tengah mengalami kekurangan
oksigen secara anaerob; hal ini ditentukan dengan jumlah oksigen yang tersedia dan
rantai transport elektron.4
Secara singkat glikolisis jika terjadi dalam keadaan aerob akan berjalan seperti
skema dibawah ini :
Glukosa + 2NAD+ + 2 Pi + 2ADP à 2Piruvat + 2NADH + 4H+ + 2ATP + 2H2O Sedangkan, pada glikolisis anaerob, secara singkat, akan berjalan berdasarkan
skema dibawah ini :
Glukosa + 2 ADP + 2 Pi à 2 Laktat + 2 ATP + 2 H2O Dalam keadaan anaerob, NADH tidak mengalami oksidasi oleh oksigen
sehingga akan mereduksi piruvat menjadi laktat dengan katalis oleh LDH.19
2.3 Enzim LDH Enzim LDH merupakan sebuah protein globular yang memiliki sekitar 31%
struktur alpha-heliks dan 28% struktur beta yang terlipat ganda.20 Bagian alpha dan
beta akan berikatan dengan membentuk sebuah formasi memutar (loop) yang tidak
beraturan dan distabilisasi dengan adanya ikatan hidrogen spesifik yang terdapat
dalam molekul LDH. Loop ini, umumya, memiliki sifat yang lebih fleksibel
dibandingkan dengan struktur alpha maupun beta yang berdiri sendiri; stuktur ini pula
yang memungkinkan LDH untuk dapat bergerak sebagai satu kesatuan molekul
Aktivitas enzim..., Rineke Twistixa Arandita, FK-UI, 2013
5
diantara molekul-molekul protein lain.20 Sedangkan bentuk aktif dari enzim LDH
merupakan suatu tetramer yang berarti terdiri dari 4 subunit yang bertugas
mengkatalisis transfer ion hidrida dari NADH ke piruvat atau dari laktat ke NAD+.19
4 subunit dari enzim LDH disusun oleh dua isoform yang dilambangkan dengan
huruf H dan M. Kedua isoform ini membentuk kombinasi tetramer yang terjadi
berdasarkan proses duplikasi gen, perbedaan sekuen asam amino, perbedaan
struktur tiga dimensi dan perbedaan ikatan kovalen. Perbedaan kombinasi ini pun
akan mempengaruhi sifat dari jaringan yang mengandung kombinasi isozim tertentu.
Isozim dari laktat dehydrogenase akan dipaparkan dalam tabel 2.1 dibawah ini
Tabel 2.1 Isozim LDH dan Subunit Penyusunnya.4
2.4 Tikus Sprague Dawley (Rattus novergicus) sebagai Model Hewan Coba Hipoksia
Tikus ini merupakan hewan percobaan yang umum digunakan untuk keperluan
penelitian terkait kesehatan manusia dan genetik, seperti pada penelitian tentang
fisiologi, genetik, imunologi, patologi, dan epidemiologi.21,22 Spesies ini pun banyak
dikembangbiakan untuk digunakan dalam penelitian terkait perilaku karena
kemampuannya beradaptasinya yang cepat dan mudah dirawat dalam lingkungan
laboratorium.24 Tikus ini merupakan model peneitian yang dikembangkan oleh R.
Dawley pada tahun 1925 dalam perusahaan Sprague-Dawley.22
Taksonomi dari tikus ini adalah sebagai berikut :23,24
Kingdom : Animalia
Phylum : Chordata
Subphylum : Vertebrata Class : Mammalia
Ordo : Rodentia
Isozim LDH Subunit Penyusun
I1 HHHH
I2 HHHM
I3 HHMM
I4 HMMM
I5 MMMM
Aktivitas enzim..., Rineke Twistixa Arandita, FK-UI, 2013
6
Familia : Muridae
Genus : Rattus
Spesies : Rattus norvegicus
Subspesies : Rattus norvegicus albus
3. Metode Penelitian Penelitian ini merupakan sebuah uji eksperimental di Laboratorium Biokimia dan
Biomolekuler FKUI sejak Maret 2011 hingga Juni 2013.
Sampel penelitian ini adalah organ otak tikus putih galur Sprague dawley yang
terbagi dalam 5 kelompok, yaitu kelompok kontrol berupa otak tikus normoksia,
kelompok otak tikus yang mengalami hipoksia selama 1 hari, 3 hari, 7 hari, dan 14
hari. Setiap kelompok dibekukan dalam deep freezer -80oC untuk menjaga dari
kerusakan. Kriteria inklusi yang digunakan dalam penentuan sampel adalah tikus
putih galur Sprague dawley, berusia 3 bulan, dan memili berat badan berkisar 200-
250 g; dengan kriteria ekslusi berupa tikus galur Sprague dawley dengan kelainan
organ atau dalam kondisi tidak sehat, sedangkan kriteria drop-out berupa tikus
Sprague dawley yang mati selama masa perlakuan. Besar sampel ditentukan
dengan rumus Federer dan didapatkan minimal 5 ekor tikus untuk setiap perlakuan.
25 tikus percobaan dibagi kedalam 5 kelompok dan ditempatkan dalam hypoxic
chamber sesuai dengan kelompok waktunya. Pada akhir masa hipoksia dilakukan
pembedahan pada 5 kelompok tikus yang diawali dengan euthanasia dengan eter.
Organ otak ditimbang hingga batas 100 mg, dan diubah menjadi homogenat dengan
bantuan buffer dan homogenizer. Homogenat disentrifus dalam alat sentrifugasi
dengan kecepatan 5000 rpm, dalam waktu 10 menit untuk mendapatkan supernatan.
Sebelum dilakukan pengukuran terhadap kadar aktivitas enzim LDH, dilakukan
pengukuran kadar protein dalam jaringan dengan menggunakan spektrofotometer
dengan panjang gelombang 280 nm untuk kemudian di-plot kedalam kurva standar
yang telah dibuat dengan kadar absorbansi BSA.
Pengukuran kadar aktivitas LDH dilakukan dengan menggunakan Kit LDH
QuantiChrom™. Hasil pengukuran kemudian dianalisis dengan program statistik
SPSS 20.0 for Mac. Analisis diawali dengan uji normalitas data dengan
menggunakan uji Saphiro-Wilk karena hanya terdapat 25 data, kemudian dilanjutkan
dengan uji hipotesis dengan uji Kruskal-Wallis karena didapatkan distribusi data yang
Aktivitas enzim..., Rineke Twistixa Arandita, FK-UI, 2013
7
tidak normal. Pada uji ini akan dilihat tingkat kebermaknaan dari perbedaan yang
terjadi pada aktivitas enzim LDH pada kelompok normoksia dan hipoksia; jika
didapatkan p < 0.05, hal ini menunjukkan perbedaan yang bermakna antara kedua
kelompok, sehingga uji akan dilanjutkan dengan analisis Post Hoc untuk dapat
mengetahui kelompok mana sajakah yang memiliki perbedaan yang bermakna
tersebut.
Pada penelitian ini, didapatkan p > 0.05 pada uji hipotesis Kruskal-Wallis, hal ini
menunjukkan tidak terdapat perbedaan yang bermakna pada aktivitas enzim LDH
antara dua kelompok data sehingga analisis tidak dilanjutkan dengan analisis Post
Hoc.
4. Hasil dan Pembahasan 4.1 Hasil Penelitian 4.1.1 Pengukuran Kadar Protein Jaringan Otak
Kadar protein diukur dengan memasukan kadar absorbansi supernatan
jaringan otak kedalam rumus yang telah didapatkan dari kurva standar berdasarkan
nilai absorbansi stock BSA.
Dari data absorbansi BSA yang didapatkan, diperoleh persamaan garis dari
kurva standar yaitu y=0.000475903x + 0.019758343 dengan bentuk linier. Hal ini
menunjukkan bahwa konsentrasi BSA berbanding lurus dengan absorbansi yang
dihasilkan melalui spektrofotometer, sehingga persamaan kurva standar ini dapat
digunakan untuk menghitung kadar protein berdasarkan dengan absorbansi dari
supernatan.
Aktivitas enzim..., Rineke Twistixa Arandita, FK-UI, 2013
8
Gambar 4.1. Kurva Standar Berdasarkan Data Konsentrasi dan Nilai
Absorbansi BSA
Untuk mendapatkan kadar protein per jaringan otak normoksia dan hipoksia
dilakukan pengukuran absorbansi dari supernatan yang telah diencerkan sebanyak
50x dan dimasukan kedalam perhitungan berdasarkan yang telah didapatkan dalam
kurva standar dikalikan dengan faktor pengencer dan dibagi dengan berat jaringan.
Gambar 4.2 Grafik Perbandingan Kadar Protein antara kelompok Kontrol dengan
Kelompok Perlakuan.
Aktivitas enzim..., Rineke Twistixa Arandita, FK-UI, 2013
9
Dari data diatas, didapatkan bahwa kadar protein pada jaringan otak tikus
normoksia sebagai kontrol dibandingkan dengan kadar protein jaringan otak tikus
hipoksia 1 hari, 3 hari, 7 hari, dan 14 hari mengalami kecenderungan naik dengan
kadar protein tertinggi terdapat pada saat jaringan otak mengalami hipoksia selama 3
hari.
Untuk melihat kebermaknaan perubahan kadar protein dalam jaringan otak
tikus normoksia dibandingkan dengan jaringan otak tikus yang mengalami perlakuan
hipoksia, dilakukan uji statistik dengan menggunakan program SPSS 20.0.
Uji statistik diawali dengan melakukan uji normalitas Saphiro-Wilk untuk kadar
protein jaringan tiap kelompok didapatkan p>0.05 yang menunjukkan data
terdistribusi normal, maka untuk melanjutkan kepada uji hipotesis kebermaknaan
perubahan kadar protein pada setiap kelompok, dilakukan uji varians untuk melihat
apakah variasi data sama atau tidak. Pada uji varians, didapatkan p > 0.05 (p=
0.403) yang menunjukkan variasi data sama, sehingga untuk uji hipotesis dilakukan
uji One-Way Annova untuk melihat kebermaknaan perubahan kadar protein setiap
kelompok perlakuan terhadap kontrol.
Hasil uji Hipotesis One-Way Annova menunjukkan kebermaknaan yang rendah
terhadap perubahan kadar protein pada setiap kelompok yang diwakili dengan nilai p
yang didapatkan setelah analisis berada dalam kisaran > 0.05, yaitu p = 0.542 (tabel
4.2).
4.1.2 Pengukuran Aktivitas Spesifik Enzim LDH
Pengukuran kadar enzim LDH dilakukan dengan menggunakan kit LDH
QuantiChrom™ dan program spektrofotometri. Angka yang terbaca dalam program
merupakan nilai yang akan dimasukan kedalam rumus yang telah ditentukan oleh
cara kerja di kit LDH QuantiChrom™. Angka yang terbaca dan dimasukan kedalam
rumus adalah angka pada awal pembacaan dan angka pada menit ke-25.
Dari data, didapatkan kadar laktat dehydrogenase per milliliter supernatant
jaringan, (gambar 4.3) dan akan dibagi dengan kadar protein yang telah didapatkan
dari supernatant jaringan untuk mendapatkan aktivitas spesifik enzim laktat
dehydrogenase per milligram jaringan. Dari data hasil perhitungan aktivitas spesifik
enzim laktat dehydrogenase pada setiap milligram jaringan otak tikus, didapatkan
hubungan yang digambarkan pada gambar 4.4
Aktivitas enzim..., Rineke Twistixa Arandita, FK-UI, 2013
10
Gambar 4.3 Grafik Perbandingan Aktivitas LDH per milliliter Protein Jaringan
Otak Tikus Normoksia dibandingkan dengan Jaringan Otak Tikus Hipoksia.
Pada gambar 4.3 ditunjukkan aktivitas LDH per milliliter protein jaringan otak
tikus pada setiap kelompok, didapatkan terdapat peningkatan aktivitas pada
kelompok perlakuan hipoksia 1 hari dan 3 hari dibandingkan dengan kelompok
control, dan pada perlakuan hipoksia 7 dan 14 hari didapatkan aktivitas enzim laktat
dehydrogenase berada dibawah nilai kontrol. Aktivitas spesifik pada jaringan otak
tikus normoksia dibandingkan dengan hipoksia didapatkan dengan membagi
aktivitas LDH per milliliter protein jaringan dengan kadar protein jaringan otak
(gambar 4.4).
Gambar 4.4. Grafik Perbandingan Aktivitas Spesifik Enzim LDH pada Jaringan
Otak Tikus Normoksia dan Hipoksia 1 hari, 3 hari, 7 hari, dan 14 hari
Aktivitas enzim..., Rineke Twistixa Arandita, FK-UI, 2013
11
Dari gambar yang ditunjukkan di atas, terlihat adanya peningkatan aktivitas
enzim laktat dehydrogenase pada jaringan otak tikus yang mengalami hipoksia 1 hari
dan menurun pada jaringan otak yang mengalami hipoksia 3 hari, namun masih
berada di atas nilai aktivitas enzim laktat dehydrogenase kontrol. Penurunan nilai
aktivitas enzim laktat dehydrogenase hingga berada di bawah nilai nomal mulai
terjadi pada jaringan otak tikus yang mengalami hipoksia 7 hari dan semakin
menurun pada jaringan otak tikus yang mengalami hipoksia 14 hari.
4.1.3 Uji Statistik Terhadap Aktivitas Enzim LDH Uji Statistik dilakukan untuk menguji hipotesis yang telah dirumuskan yaitu
terdapat perbedaan aktivitas enzim LDH pada jaringan otak tikus normoksia dan
hipoksia, dan untuk melihat kebermaknaan yang terdapat pada perbedaan yang
terjadi pada aktivitas enzim LDH pada setiap perlakuan.
Uji normalitas Saphiro-Wilk menunjukkan data terdistribusi normal (p > 0.05)
kecuali pada data hipoksia 1 hari memiliki distribusi yang tidak normal (p < 0.05),
sehingga untuk menguji hipotesis secara spesifik antara setiap kelompok
menggunakan uji hipotesis non-parametrik Kruskal-Wallis untuk meihat
kebermaknaan perbedaan aktivitas enzim LDH pada setiap kelompok.
Hasil uji non parametrik Kruskal-Wallis menunjukkan peningkatan pada
kelompok yang mendapatkan perlakuan hipoksia 1 hari dan 3 hari dibandingkan
dengan kontrol, dan menurun pada kelompok yang mendapatkan perlakuan hipoksia
7 hari dan 14 hari dibandingkan dengan normal. Puncak aktivitas enzim LDH
ditunjukkan pada kelompok yang mendapatkan perlakuan hipoksia selama 1 hari,
dan aktivitas terendah pada kelompok yang mendapatkan perlakuan hipoksia 14
hari.
Hasil akhir uji statistik menunjukkan nilai p = 0.461, hal ini berarti perubahan
aktivitas enzim LDH pada kelompok normal dibandingkan dengan kelompok
perlakuan memiliki kebermaknaan yang rendah.
4.2 Pembahasan 4.2.1 Kadar Protein Jaringan Otak
Kadar protein jaringan otak dalam kondisi normoksia dan hipoksia disajikan
dalam gambar 4.2 menunjukkan kecenderungan peningkatan kadar protein pada
Aktivitas enzim..., Rineke Twistixa Arandita, FK-UI, 2013
12
kelompok-kelompok perlakuan dibandingkan dengan kelompok kontrol. Untuk
mengetahui kebermaknaan pada peningkatan kadar protein, dilakukan uji statistik
dengan menggunakan SPSS 20.0 for Mac dan didapatkan bahwa tidak terdapat
peningkatan kadar yang bermakna pada kelompok-kelompok perlakuan
dibandingkan dengan kelompok kontrol.
Pada keadaan hipoksia, dapat terjadi respon inflamasi yang akan mengaktifkan
respon HIF-1 yang berperan dalam inflamasi adaptif dan HIF-2 yang lebih berperan
dalam aktivasi gen pengkode protein eritropoietin, VEGF, dan PDKI. Aktivasi HIF
dalam keadaan hipoksia akan meningkatkan kadar protein pula. Hal ini terlihat dapat
gambar 4.2, namun didapatkan peningkatan yang terjadi secara statistik tidak
bermakna. Hal ini menunjukkan bahwa aktivasi HIF pada keadaan hipoksia di
jaringan otak tidak terjadi secara bermakna pada keadaan hipoksia dibandingkan
dengan kontrol sehingga kadar protein diantara kedua kelompok pun tidak
menunjukkan peningkatan yang bermakna seiring dengan lama hipoksia yang
terjadi.
4.2.2 Aktivitas Spesifik Enzim LDH Perbandingan aktivitas spesifik enzim LDH ditunjukkan pada gambar 4.3 pada
setiap kelompok, dan diperlihatkan kembali pada gambar 4.4 hingga 4.7 untuk
perbandingan lebih jelas antara aktivitas enzim LDH normoksia dibandingkan
dengan aktivitas enzim LDH pada setiap perlakuan hipoksia.
Dari gambar didapatkan adanya peningkatan aktivitas pada kelompok yang
mendapat perlakuan hipoksia selama 1 hari, dan 3 hari dibandingkan dengan
kelompok kontrol. Walaupun begitu, aktivitas LDH mulai mengalami penurunan pada
kelompok perlakuan hipoksia 3 hari dibandingkan dengan kelompok perlakuan
hipoksia 1 hari, namun masih berada diatas kelompok kontrol. Penurunan aktivitas
yang lebih besar tampak pada kelompok perlakuan hipoksia 7 hari, dan 14 hari
dibandingkan dengan kontrol. Kedua kelompok ini memiliki aktivitas LDH yang
berada dibawah aktivitas normal.
Untuk menguji statistik aktivitas enzim LDH pada kelompok kontrol
dibandingkan dengan kelompok perlakuan hipoksia 1 hari, 3 hari, 7 hari, dan 14 hari
digunakan uji non parametrik Kruskal-Wallis dan didapatkan nilai p > 0.05 yang
Aktivitas enzim..., Rineke Twistixa Arandita, FK-UI, 2013
13
berarti perbedaan aktivitas enzim LDH pada setiap kelompok tidak menunjukkan
perbedaan yang bermakna.
Enzim LDH merupakan enzim yang berperan dalam proses glikolisis anaerob.
Penelitian mengenai aktivitas enzim LDH pada otot dalam keadaan normoksia
dibandingkan dengan keadaan hipoksia menunjukkan peningkatan yang bermakna
pada kelompok hipoksia.3 Hal ini menunjukkan bahwa adaptasi jaringan otot
terhadap keadaan hipoksia berlangsung baik, sehingga otot dapat tetap bekerja
dengan mengaktivasi proses perubahan piruvat menjadi laktat dengan perantara
enzim LDH.1,3,18
Pada jaringan otak, dibutuhkan energi yang lebih besar untuk dapat melakukan
fungsinya. Otak merupakan organ pertama yang mengalami gangguan fungsi jika
ditempatkan dalam keadaan hipoksia, dan dapat menimbulkan kematian sel pada 4
hingga 5 menit pertama paparan hipoksia, khususnya pada bagian hipokampus,
korteks, dan striatum yang merupakan bagian yang paling rentan terhadap stres
oksidatif yang disebabkan oleh hipoksia.17 Peningkatan aktivitas LDH pada hipoksia
1 hari disebabkan oleh kemampuan adaptasi sel pada jaringan otak yang masih
melakukan konversi piruvat menjadi laktat yang meningkat sehingga aktivitas enzim
LDH pun mengalami peningkatan, namun, pada kelompok hipoksia 3 hari mulai
ditemukan penurunan aktivitas LDH walaupun masih terdapat aktivitas LDH yang
lebih banyak dibandingkan dengan kontrol. Pada hipoksia 7 hari dan 14 hari
didapatkan aktivitas LDH telah turun hingga berada dibawah aktivitas LDH kontrol,
sehingga dapat dikatakan bahwa pada 2 kelompok perlakuan ini telah terjadi
apoptosis sel dalam jaringan otak tikus sehingga proses konversi piruvat menjadi
laktat tidak lagi terjadi.
Kemungkinan lain yang dapat menjelaskan semakin menurunnya aktivitas LDH
pada kelompok perlakuan hipoksia terdapat dalam rasio ALT dibandingkan dengan
LDH. Penelitian pada jaringan hati menunjukkan kelompok individu dengan penyakit
hati akut memiliki kemungkinan bertahan hidup yang lebih tinggi dengan ratio ALT
dibandingkan dengan LDH yang tinggi, sebaliknya ratio ALT dibandingkan LDH yang
rendah akan menghasilkan nilai yang rendah. Sehingga pada penelitian ini,
dimungkinkan terdapat aktivitas LDH yang semakin rendah diakibatkan adanya
pembentukan glukosa baru melalui proses glukoneogenesis sehingga akan terjadi
peningkatan ALT sebagai katalisator pembentukan prekursor glokoneogenesis .
Aktivitas enzim..., Rineke Twistixa Arandita, FK-UI, 2013
14
Pada penelitian sebelumnya terhadap efek hipoksia pada metabolisme energi
pada neuron di daerah korteks serebri didapatkan peningkatan kadar LDH seiring
dengan meningkatnya kadar glukosa dan laktat pada kelompok yang dipaparkan
dengan keadaan hipoksia selama 2 jam.28 Perbedaan hasil yang terjadi pada
penelitian ini dengan penelitian sebelumnya dapat terjadi karena adanya perbedaan
waktu paparan hipoksia yang menyebabkan perbedaan aktivitas akibat kemampuan
adaptasi dari jaringan otak tikus itu sendiri.
5. Kesimpulan Berdasarkan hasil yang didapatkan dari penelitian, dapat disimpulkan bahwa
terdapat perbedaan aktivitas enzim LDH pada jaringan otak tikus hipoksia
dibandingkan dengan otak tikus normoksia, selain itu didapatkan pula pengaruh
pajanan waktu hipoksia dengan aktivitas LDH, perbedaan aktivitas ataupun
pengaruh pajanan hipoksia ini tidak bermakna secara statistik.
6. Saran Perlu dilakukan pengukuran kadar laktat sebagai produk dari LDH sebagai
pertimbangan dalam merumuskan aktivitas LDH yang terjadi dan pengamatan
secara mikroskopik untuk melihat apakah jaringan otak mengalami apoptosis
sebelum dilakukan pengukuran aktivitas LDH, karena hal ini akan mempengaruhi
pembacaan aktivitas LDH.
Aktivitas enzim..., Rineke Twistixa Arandita, FK-UI, 2013
15
DAFTAR PUSTAKA
1. Murray RK, Granner DK, Rodwell VW. Harper’s Illustrated Biochemistry [e-book].
Edisi 27. United States: The McGraw-Hill Companies; 2006.
2. Marks DB, Marks AD, Smith CM. Biokimia Kedokteran Dasar: Sebuah Penelitian
Klinis. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC; 2002. h. 305-319, 268, 335-350,
422-423.
3. Achyat SR. Perbandingan Konsumsi Glukosa, Aktivitas, dan Pola Elektroforesis
Enzim Laktat Dehidrogenase (LDH) pada Otot Tikus Normoksia, Hipoksia, dan
Otot Penyu Hijau (Chelonia mydas) [thesis S2]. Jakarta: Fakultas Kedokteran
Universitas Indonesia; 2010.
4. Bender DA. Glycolysis & The Oxidation of Pyruvate. Dalam: Murray RK, Bender
DA, Botham KM, Kennelly PJ, Rodwell VW, Weil PA, editor. Harper’s Illustrated
Biochemistry. Edisi 28. Chicago: The McGraw-Hill Company; 2009. h. 150-156.
5. Barret KE, Barman SM, Boitano S, Brooks HL. Ganong’s Review of Medical
Physiology [e-book]. Edisi 23. Chicago: The McGraw-Hill Company; 2010.
6. Sherwood L. Human Physiology: From Cells to Systems. Edisi 7. Canada:
Brooks/Cole Cengage Learning; 2010. h. 32-33, 39, 460, 497.
7. Ganong WF. Review of Medical Physiology [e-book]. Edisi 21. Chicago: Lange
Medical Books/McGraw-Hill; 2003.
8. Tortora GJ, Derrickson BH. Principles of Anatomy and Physiology: Volume 2.
Edisi 12. Danvers: John Wiley and Sons, Inc; 2009. h. 56-57.
9. Marieb EN, Hoehn K. Human Anatomy & Physiology [e-book]. Edisi 7. San
Fransisco: Benjamin Cummings Company; 2006.
10. Fauci S, Kasper DL, Longo DL, Braunwald E, Hauser SL, Jameson JL, et al.
Harrison’s Principles of Internal Medicine [ebook]. Edisi 17. Philadelphia:
McGraw-Hill; 2008.
11. Ivanovic Z. Hypoxia or in situ normoxia: The stem cell paradigm. J Cell Physiol;
2009; 219:271-5.
12. Murach EI, Erlykina EI. The Principles of Protective Effects Formation Using
Different Hypoxic Preconditioning Modes. Biomedical Investigations;2012. 8-
092:577.17.
Aktivitas enzim..., Rineke Twistixa Arandita, FK-UI, 2013
16
13. Eltzschig HK, Carmeliet P. Hypoxia and inflammation. N Engl J Med. 2011; 364:
656-665.
14. Semenza GL. Oxygen sensing, homeostasis, and disease. N Engl J Med. 2011;
365: 537-547.
15. Kim J, Tchernyshyov I, Semenza GL, Dang CV. HIF-1-mediated expression of
pyruvate dehydrogenase kinase: A metabolic switch required for cellular
adaptation to hypoxia. Cell metabolism. 2006; 3: 177-185.
16. Brierley JB. Experimental Hypoxic Brain Damage. J Clin Pathol. S3-11 : 181-187.
17. Maiti P, Singh SB, Sharma AK, Muthuraju S, Banerjee PK, Ilavazhagan G.
Hypobaric Hypoxia Induces Oxidative Stress in Rat Brain. Neurochemistry
International;2006. 49 : 709-716.
18. Krnjeviæ K. Early Effects of Hypoxia on Brain Function. Croatian Medical Journal.
1999; 40(3) : 375-380.
19. Marks AD, Lieberman M. Marks’ Basic Medical Biochemistry : A Clinical Approach
[ebook]. 4th edition. Philadelphia : Lippincott Williams & Wilkins;2013.
20. Bender DA, Mayes PA. Glikolisis dan oksidasi piruvat. Dalam: Murray RK,
Granner DK, Mayes PA, Rodwell VW, editor. Biokimia Harper. Edisi 26.Jakarta:
EGC, 2009. h. 158-65.
21. Kotoh K, Enjoji M, Kato M, Motoyuki K, Nakamuta M, Takayanagi R. A New
Parameter Using Serum Lactate Dehydrogenase and Alanine Aminotransferase
Level is Useful for Predicting the Prognosis of Patients at An Early Stage of Acute
Liver Injury : A Retrospective Study. Comparative Hepatology; 2008. 7:6.
22. Armitage D. Rattus norvegicus [internet].2004 [diunduh pada tanggal 4 Juni 2013]
diambil dari http://animaldiversity.ummz.umich.edu/accounts/Rattus_norvegicus/.
23. Taconic. Sprague-Dawley Rats [internet]. 2013 [diunduh 13 Januari 2013].
Diambil dari http://www.taconic.com/user-
assets/Documents/spraguedawley_booklet.pdf.
24. Bossenmeyer C, Chihab R, Muller S, Schroeder H, Daval JL.
Hypoxia/Reoxygenation Induces Apoptosis Through Biphasic Induction of Protein
Synthesis in Cultured Rat Brain Neurons. Brain Research;1997. 787: 107-116.
Aktivitas enzim..., Rineke Twistixa Arandita, FK-UI, 2013