Embed Size (px)
Citation preview
1
AMINOSAVAK, PEPTIDEK, FEHÉRJÉK
Aminosavak szerkezete, fizikai, kémiai tulajdonságai, biokémiai szerepük. Konvenció szerinti
rövidítések. Aminosavak szintézise. A peptidkötés szerkezete. Peptidszintézisek,
védőcsoportok, kapcsolási eljárások, a szilárd fázisú technika. A fehérjék primer, szekunder,
tercier, illetve kvaterner szerkezete. A Ramachandram diagram. A fehérjék csoportosítsa és
biokémiai szerepük.
Aminosavak szerkezete
Az aminosavak amino-, illetve karboxilcsoportot egyaránt tartalmazó vegyületek. Az
aminocsoport helyzete alapján megkülönböztethetünk α-, β-, γ-…-aminosavakat. A köznapi
nyelvhasználatban aminosavak alatt általában az α-aminosavakat értjük.
H3N COO
glicin
H3N COO
-aminovajsav
H3NCOO
-alanin
Az α-aminosavakban egy szénatom választja el egymástól a karboxil-, és az
aminocsoportot. A glicint kivéve ezért minden α-aminosav királis. A természetben általában
L-térállású aminosavak fordulnak elő. A természetes L-aminosavak a CIP szabály szerint
többnyire (S)-térállásúak. Ez alól kivétel az L-cisztein, ami (R). Ennek oka, hogy a cisztein
királis szénatomjához kapcsolódó CH2-SH a CIP nomenklatúra szerint magasabb rendű, mint
a COOH.
L-szerin L-cisztein
H3N
CH2SH
COOH3N
CH2OH
COOH3N COO
R
-L-aminosavak
(S) (R)
COO
R
H3N H
Sav-bázis tulajdonságok
Az aminosavakban egyszerre van jelen egy savas jellegű (karboxil-), illetve bázikus
jellegű (amino-) csoport, tehát sav-bázis tulajdonságaik tekintetében amfoterek. A molekula
karboxilcsoport része általában elég erős sav ahhoz, hogy protonálja a molekula bázikus
jellegű részét. Tehát a savas csoport pKa-ja kisebb a bázikus jellegű csoport pKa-jánál. Emiatt
az aminosavak jellemzően ikerionos (A–)(BH+) formában fordulnak elő. A karboxilcsoport
deprotonált, azaz negatív töltésű az aminocsoport pedig protonált, azaz pozitív töltésű. Ez azt
jelenti, hogy bár a molekula össztöltése semleges, a benne található két molekularészlet
pozitív, illetve negatív töltéssel rendelkezik. Ennek következtében az aminosavak ionrácsban
kristályosodnak, illetve magas az olvadáspontjuk.
Az aminosavak oldatban is ionos formában vannak jelen, azonban a molekulák
protonáltsága pH függő. Savas környezetben mindkét funkciós csoport protonált formában
van jelen. Így az aminosav össztöltése pozitív lesz, tehát az aminosav kationos (HA)(BH+)
formában lesz jelen. Bázikus környezetben mindkét csoport deprotonálódik. Az aminosav így
negatív, anionos (A–)(B) formában lesz jelen. A két véglet között van egy olyan pH érték,
amelyen az aminosavmolekulák össztöltése semleges. Ez az ikerionos (A–)(BH+) formára
jellemző pH az aminosav izoelektromos pontja (pI). Ez nem feltétlenül pH 7-nél van, hiszen
függ az aminosavak oldalláncától is.
2
Az aminosavak titrálási görbéjét tekintve a fent leírtak jól látszanak. Alacsony pH-n az
aminosav 100%-ban (HA)(BH+) formában van jelen. Az a pH, amelyen 50% a kationos, és
50% az ikerionos forma aránya, megegyezik a (HA) csoport pKa-értékével. Az izoelektromos
pontnak megfelelő pH-n az aminosav össztöltése semleges, ikerionos formában van jelen. Az
a pH, amelyen 50%-ban van jelen az ikerionos és az anionos forma, megegyezik a (BH+)
csoport pKa értékével.
Az alanin titrálási görbéje.
Forrás: https://chem.libretexts.org
Az aminosav protonáltságának leírása akkor bonyolultabb, ha az aminosav az
oldalláncán is protikus csoportot tartalmaz. Példaként az amfoter oldalláncú hisztidint
mutatjuk be.
HNNH
HNN
NNH
NN
H+
OH-
Stabil aromás kation Stabil aromás anion
Biológiai funkciók
Biológiai szempontból az α-aminosavaknak van a legnagyobb jelentősége, hiszen
eukariótákban ezek alkotják a sejtműködés szempontjából kulcsfontosságú
makromolekulákat, a fehérjéket. Az eukarióta szervezetekben a glicinen kívül 19 fehérjeépítő
L-α-aminosav fordul elő, melyeket oldalláncuk alapján csoportosíthatunk. Nemzetközi
megállapodás alapján ezen aminosavakat nevükből képzett hárombetűs rövidítéssel
jelölhetjük, bonyolultabb esetben egybetűs rövidítés is használható. Mindezt az alábbi ábra
foglalja össze. A számunkra szükséges aminosavak egy részét szervezetünk képes előállítani,
de vannak olyan aminosavak, melyeket táplálékkal kell bevinnünk.
Az aminosavak fehérjeépítő szerepük mellett egyéb fontos funkciókat is elláthatnak. A
glutaminsav, illetve a GABA (γ-aminovajsav) például egymással ellentétes hatású ingerület
átvivő anyagok, a β-alanin pedig a koenzim-A alkotórésze.
3
Név Kód Oldallánc (Q)
COOH3N
Q
Alifás oldalláncú aminosavak
Glicin Gly (G) 6,06
Alanin Ala (A) 6,11
Valin Val (V) 6,00
Leucin Leu (L) 6,01
Izoleucin Ile (I) 6,05
Prolin Pro (P) 6,30
-CH3 Me
H3C
CH3
H3C
CH3
H3C
CH3
NH2
iPr
iBu
sBu
COO
(aminosav képlete)
Név Kód Oldallánc (Q)
Poláris aprotikus oldalláncú aminosavak
Szerin Ser (S) 5,68
Cisztein Cys (C) 5,05
Treonin Thr (T) 5,60
Tirozin Tyr (Y) 5,64
Aszparagin Asn(N) 5,41
Glutamin Gln (Q) 5,65
Metionin Met (M) 5,74
-CH2OH
H3C
OH
-CH2SH
HO
-CH2CH2CONH2
Aromás apoláris oldalláncú aminosavak
Fenilalanin Phe (F) 5,49
Triptofán Trp (W) 5,89
-CH2Ph Bn
HN
Savas oldalláncú aminosavak
Aszparaginsav Asp (D) 2,85
Glutaminsav Glu (E) 3,15 -CH2CH2COOH
Bázikus oldalláncú aminosavak
Lizin Lys (K) 9,60
Arginin Arg (R) 10,76
-[CH2]4-NH2
-[CH2]3-NH
NH2HN
Amfoter oldalláncú aminosavak
Hisztidin His (H) 7,60
N
HN
Bázikus NSavas N
-H
-CH2CONH2
-CH2CH2SCH3
-CH2COOH
pI pI
Előállítás
Az aminosavak kémiai szintézise azért fontos kérdés, mert a fehérjékből történő
kinyerésük nem robosztus, viszont számos esetben nagy mennyiségű, tiszta aminosavra lehet
szükség (gyógyszeripar, élelmiszeripar, peptidszintézisek…). Az alábbiakban a fontosabb
módszereket vesszük át.
1. Aminocsoport beépítése a karbonsav α-helyzetébe
A karbonsavból kiindulva formálisan az α-szénatomon lévő H-atomot cseréljük le
aminocsoportra. Ez közvetlenül nem lehetséges, először halogénatomot kell beépítenünk. Az
α-szénatomra történő bróm beépítése például úgy lehetséges, hogy a karbonsavat reagáltatjuk
tionil-kloriddal (SOCl2 savkloridot előállítva), majd brómmal (α-brómozott savklorid
keletkezik), végül hidrolízissel kapjuk meg az α-brómozott savat (lásd: α-helyettesített savak
előállítása).
4
A halogénezett savat például ammóniafeleslegben (a), alakíthatjuk tovább. Nagyon
fontos, hogy ez esetben az ikerionos szerkezet keletkezése miatt lesz szelektív a reakció, a
primer aminocsoport így nem tud tovább alkileződni. A Gabriel-szintézis alkalmazásakor
észterből kell kiindulnunk (a ftálimid-sót protonálná a sav), illetve a ftálimidet vissza kell
nyernünk a reakció után, hogy növeljük a reakció atomhatékonyságát. E módszerrel
elsősorban olyan aminosavakat tudunk előállítani, amelyekhez a kiindulási karbonsav (pl.
ecetsav, propionsav, izovaleriánsav) rendelkezésre áll. ε-Kaprolaktámból kindulva az ε-
aminocsoportot benzoil-kloriddal védve, ugyancsak a Gabriel-szintézist alkalmazva
kaphatjuk a lizint.
a) Ammóniafelesleggel
COOH
R
Hlg
NH3 felesleg
COO
R
H3N
b) Gabriel-szintézissel (ftálimiddel)
N KBr COOEt
RO
O
N
O
O
R
COOEt H+/H2OH3N COOH
R
COOH
COOH
DMFMelegítés
1. NH32. KOH
NH
O
1. H+/H2O
2. PhCOCl/ KOH
BzHN[CH2]4 COOH
1. SOCl22. Cl23. EtOH
BzHN[CH2]4 COOEt
Cl
N K
O
O
BzHN[CH2]4 COOEt
NFt
H+/H2O
H3N[CH2]4 COO
NH3
Gly, Ala, Val
Gly, Ala, Val
Lys
2. Szénlánchosszabbítás és aminocsoport beépítés az aktivált ecetsav α-szénatomján
Az előbbi módszernek az a hátránya, hogy a megfelelő karbonsav kiindulási anyagnak
rendelkezésre kell állnia, amely bonyolultabb oldalláncú aminosavaknál nem triviális.
Karbonsavak α-szénatomjára nem tudunk közvetlenül szénatomot kapcsolni, erre alkalmas
módszerek a korábban is tanult acetecetészter-, illetve malonészter-szintézisek.
5
a) Acetecetészter szintézis
O
COOEt
1. NaOEt2. RBr
O
COOEt
R
iBuONO
cc.H2SO4
O
COOEt
R
NOPhN2
+Cl-
R COOH
NOH
R COO
NH3
H2/Pd/C
O
COOEt
R
NaOH
NN
Ph
1. cc.NaOH
2. H+
R COOH
N
H2/Pd/CPh
COOH COOHR COOHR
NH2
Val, Leu, Ile, Phe
NH
Az acetecetészter-szintézis során elsőként az oldallánc beépítése történik meg, majd
ezt követi az aminocsoport kialakítása. Ehhez pozitív töltésű nitrogéntartalmú reagenst kell
alkalmazni, ami egyrészt lehet az izobutil-nitritből (iBuONO) savas közegben képződő
NO(+), vagy másrészt a benzoldiazónium-klorid. A köztitermék nitrozo-, illetve diazenil-
származék az erősen savas, illetve lúgos közegben spontán retro-Claisen reakcióval
fragmentálódik. A keletkezett karbonsav-α-oximot, illetve -α-fenilhidrazont katalitikus
redukcióval alakítjuk a kívánt végtermékké.
A malonészter-szintézis során fordított sorrendet alkalmazunk, először történik a
védett aminocsoport kialakítása, és ezt követi az oldallánc kiépítése. A savas közegű
nitrozálással kialakított oxim katalitikus redukciója során ecetsav-anhidridet alkalmazunk,
hogy a keletkező aminocsoportot in situ acetilezéssel védjük. Ezt követően az oldalláncot
bázikus közegben alkilezéssel (RBr), aldehiddel (RCHO), vagy telítetlen savszármazékkal (pl.
akrilnitril) történő reakcióval alakítjuk ki. A végterméket vagy savas hidrolízissel kapjuk,
vagy további reakciólépések is szükségesek. Pl.: A nitrilcsoportot katalitikusan redukáljuk, a
keletkező amino-észter spontán laktámgyűrűvé záródik. A savas hidrolízissel kapott ornitint
ciánamiddal lehet a végtermék argininné alakítani.
A malonészter-szintézist kombinálhatjuk a Gabriel-szintézissel is. Ez esetben a
brómmalonésztert reagáltatjuk ftálimid-kálium-sóval. Ezt követően az oldalláncot bázikus
közegben alkilezéssel (RBr), aldehiddel (RCHO), vagy telítetlen savszármazékkal (pl.
akrilészter) történő reakcióval alakítjuk ki. A végtermékeket savas hidrolízissel kapjuk.
6
1. NH2 beépítés nitrozálással
COOEtEtOOCNaNO2
HCl
COOEtEtOOC
NO
COOEtEtOOC
NOH Ac2OH2/Pt/C
COOEtEtOOC
NHAc
NaOEt
CCH2OOEtEtOOC
NHAc
Na
RCHO
CCOOEtEtOOC
NHAc
HOH+/H2OCOOHH3N
OH
Ser (R=H), Thr (R=Me)
CH2CHCNC
COOEtEtOOC
NHAc
CN
Ni/H2
NH
AcHNCOOEt
OH2N
H3N
COOH
HN
H3N
COO
HN NH2
NH2CNBázis
Arg
b) Malonészter szintézisCOOH COOHH2N COOHR
NH2
R
R
1. RBr
2. H+/H2O
R COO
NH3
Val, Leu, Ile, Phe
H+/H2O
2. NH2 beépítés ftálimiddel
COOEtEtOOCBr2
CCl4
COOEtEtOOC
Br
N
O
O
K
N
O
O
COOEt
COOEt
NaOEt
N
O
O
C
COOEt
COOEtNa
1. RBr
2. H+/H2O
R COO
NH3
COOEt
N
O
O
C
COOEt
COOEt
COOEt
COOEt
H3N COOH
Glu
COOHH3N
OH
Ser (R=H), Thr (R=Me)
R
1. RCHO
2. H+/H2O
Val, Leu, Ile, Phe
H+/H2O
ornitin
7
3. Addíciós reakciók
Telítetlen karbonsavra közvetlenül addícionáltatható az ammónia (lásd: aszparaginsav
előállítása). Számos esetben azonban az aminosav-szintézis köztitermékének kialakítását
végzik addícióval.
COOH
HOOC
COOH NH3
HOOC
COO
NH3
Asp
HOBrCOOHHO
Br 2. Ftálimid-K
3. H+/H2O
COOHO
NH3Thr
CHOMeSH Strecker-Zelinszkij
COO
NH3
Met
NH4Cl/ KCN
1. EtOH/H+
MeS
CHO
MeS
4. Strecker-Zelinszkij szintézis: amino- és karboxilcsoport one-pot kiépítése
A Strecker—Zelinszkij-, vagy rövidebben csak Strecker-szintézis során
oxovegyületeket reagáltatunk NH4Cl-dal és KCN-dal. A reagens valójában az in situ
keletkező instabil NH4CN. Az enyhén savas pH (erősen savas pH-n HCN távozna a
reakcióelegyből) és az egyensúly eltolása érdekében ammónium-klorid felesleget kell
alkalmazni. A köztitermék aminosav-nitril további sav hozzáadására könnyen hidrolizál,
kialakítva ezzel az α-aminosav terméket.
O
NH4Cl, KCNin situ:
NH2NH2
CN
H+/H2O
NH3
COOHPhe, Tyr
aminosav-nitril
NH4CN NH3 + HCN
X X X
XX=H, OH
8
5. Azlakton szintézis: oldallánc beépítése a glicin α-szénatomjára
A szintézis során a glicinre, mint a legegyszerűbb aminosavra aldehidek segítségével
építjük be a megfelelő oldalláncot. Ehhez a glicin aminocsoportját védeni, az α-helyzetű CH2-
csoportot aktiválni kell. A védést és aktiválást az aminocsoport benzoilezésével, és az N-
benzoilglicin (hippursav) ecetsav-anhidriddel, mint vízelvonószerrel történő gyűrűzárásával
oldjuk meg. Azolakton gyűrűre kondenzáltathatóak aromás gyűrűt tartalmazó aldehidek.
COOHH2NPhCOClNaOH
COOHBzHNAc2O
NaOAc
NO
O
RCHO
NaOAc
Ac2O
NO
O
R1. Na/ Hg/ KOH
2. H+/ H2O
vagy
1. H2/Pt/C
2. H+/ H2O
NH3+
COO-R
Phe/ Thr/ Trp/ His
6. Rezolválás
A fenti módszerek egyike sem alkalmas enantiomertiszta termékek előállítására.
Ehhez a korábban előállított racém vegyületet rezolválni kell. Egy igen gyakori módszer a
rezolválásra a diasztereomer sópár-képzés. Ez aminosavak esetén azért problémás, mert
egyszerre tartalmaznak savas, illetve bázikus csoportot. Sóképzés előtt ezért védeni kell
valamelyik csoportot, ha például az alanin esetén az aminocsoportot acilezéssel védjük, királis
bázissal (sztrichnin, brucin) megoldható a rezolválás.
COOHH2NPhCOClNaOH
COOHBzHN
D,L-Ala
sztrichnin
brucin
sztrichnin-HCOOBzHN
COOBzHN brucin-H
H+/ H2O/ OH-COO-+H3N
H+/ H2O/ OH-
COO-+H3N
L-AlaD-Ala
csapadék
csapadék
(Bz-L-Ala-só oldatban marad)
(Bz-D-Ala-só oldatban marad)
A rezolválás során a rosszabbul oldódó sót kiszűrjük az oldatból, és az átkristályosított
anyagból savas hidrolízissel kapjuk az enantiomer-tiszta terméket.
9
Peptidek, fehérjék
Bevezetés
A peptidek 2-50 aminosavegységből felépülő polimerek. Fehérjéknek az 50-nél több
építőegységből felépülő polipeptideket (proteinek) és a nemcsak polipetid-típusú
alkotórészeket tartalmazó komplex molekula-társulásokat nevezzük. Az aminosavak a
karboxil- és az aminocsoportjaik révén peptidkötéssel kapcsolódnak össze. A peptidkötés a
CO és az NH csoport között lévő kovalens (savamid) kötés. Nagyon fontos, hogy a C(O)NH
szerkezeti rész egy síkban van. Ennek oka az, hogy a nitrogén nemkötő elektronpárja,
valamint az oxigén π-elektronjai delokalizálódnak.
Az N-terminális a peptid szabad aminocsoportja, a C-terminális a szabad
karboxilcsoportja. A peptideket alkotó aminosavakat az N-terminálistól kezdve soroljuk fel.
Az alkotó aminosavaknak a hárombetűs kódját használjuk, hosszabb peptidek esetén pedig az
egybetűs kódokat.
H3N
R1
O
HN
N-terminálisCOO
R2
C-terminális
peptidkötés C N
delokalizált elektronrendszer
O
H
Peptidszintézisek
A peptidek szintézise az alkotó aminosavak kapcsolásával történik. Az aminosavak
azonban bifunkciós vegyületek. Két aminosav kapcsolásával tehát több termék is keletkezhet.
Ezért a leendő dipeptid N-terminális, valamint a C-terminális csoportját le kell védenünk, a
kapcsolódó karboxil-csoportot pedig aktiválni kell. A védőcsoporttal szemben alapvető
elvárás, hogy a mind a kiépítési, mind az eltávolítási reakció minél egyszerűbb legyen, illetve
jó termeléssel menjen végbe.
Q-Leu Ala-Q Q-Leu-Ala-Q
DipeptidN-terminálison védett as.
C-terminálison védett as.
Lys
Q
Oldalláncon is védett as.
...Q-Leu-Ala
Q
NH2-védése
A következő táblázat összefoglalja az aminocsoport védésére alkalmas reakciókat,
illetve a védőcsoportok eltávolítását.
10
Kiépítés Eltávolítás
O Cl
O
K2CO3
Benziloxikarbonil-csoport(jele: Z)
Pd/C/H2Z
HN
Termék
tBuOCON3/ Et3N
vagy
(tBuOCO)2O/ KOHBoc
HN H+
O
O
O
FtN MeNHNH2
SO2Cl
PiridinTozil-csoport
(jele: Tos, vagy Ts) Tos
HN
terc-Butoxikarbonil-csoport(jele:Boc)
Ftaloil-csoport(jele:Ft)
Na/NH3
Név
O
OCl
FMOC
HN
Me2NHFluorenilmetoxikarbonil csoport
(jele: FMOC)
Et3N
COOH-védése
Az alábbi táblázat ábra összefoglalja a karboxilcsoport védésére alkalmas reakciókat,
illetve a védőcsoportok eltávolítását.
Kiépítés Eltávolítás
OH
TosOH
Benzil-csoport(jele: Bn)
Pd/C/H2
Termék
NaIMetil-csoport(jele: Me)
Név
MeOH SOCl2
COOBn
COOMe
11
Uretán-típusú védőcsoportok kiépítése és eltávolítása:
COOH3N
R Ph O Cl
O
K2CO3Ph O N
H
O
COOH
R
H2/Pd/C
PhCH3
H2N
RCO2
COOH3N
R O O
O
KOHO N
H
O
COOH
R
TFA
H2N
RCO2
2
COOH3N
R
O Cl
O
Et3N
COOH
R
H2N
R
CO2
H
O NH
OH
Me2NH
kapcsolási reakciók
Ph O NH
O R
peptid
O
peptid
O
kapcsolási reakciók
O NH
O R
peptid
O O
peptid
kapcsolási reakciók
O
peptid
R
O NH
OH
O
peptid
Ftaloil-védőcsoport kiépítése és eltávolítása
COOH3N
RN COOH
R
H2N
R
kapcsolási reakciók
N
R
peptid
O
peptid
O
O
O
O
O
O
O
O
MeNHNH2
NH
N
O
O
Me
12
Tozil-védőcsoport kiépítése és eltávolítása
COOH3N
R
Py
COOH
R
H2N
R
SNH
O
Na/NH3
kapcsolási reakciók
O
peptid
R
SNH
O
O
peptid
Me
SO2Cl
Me
O
Me
OSO2H
Me
Észter-típusú védőcsoportok kiépítése és eltávolítása:
COOH3N
R
PhCH2OHCOOBn
R
H3N
H2/Pd/C
kapcsolási reakciók
R
NH
O
OBn
Me
SO3H
COOH3N
R
MeOH COOMe
R
NH
R
H3N
NaI
kapcsolási reakciók
O
O
R
PeptidNH
O
OMe
SOCl2
Cl
Peptid
Na+ MeI
Me
SO3
Peptid
R
NH
O
OHPeptid + PhMe
Fontos megjegyezni, hogy az észterek aminocsoportjának mindig protonált formában
kell lennie (pl.: tozilát-, klorid-só), az önkapcsolás elkerülése miatt.
Aktiválás
A karboxilcsoportot valamilyen erősebb acilezőszerré (pl.: savklorid, savazid, vegyes
anhidrid) alakítjuk.
13
QHN
R
COOH
PCl5
QHN
R
COCl Savklorid
MeOH/
SOCl2 QHN
R
COOMeH2N-NH2
QHN
R
CONHNH2
NaNO2/ HCl
QHN
R
CON3Savazid
Cl
O
OMe
QHN
R
O
O
O
OMeSavanhidrid
Kapcsolás
1. Hagyományos módon
Ez esetben a megfelelően védett és aktivált aminosavakat egyesével reagáltatjuk, a
köztitermék peptideket pedig kipreparáljuk,
Lineáris szintézis során az alkotó aminosavakat sorban kapcsoljuk hozzá az egy
aminosavval rövidebb peptidre. Itt a hátrány, hogyha például egy lépésre 90%-os termelést
feltételezünk, akkor az n aminosavból álló peptidre a végső termelés csupán 0,9n lesz.
Konvergens szintézisnél külön-külön szintetizáljuk a peptidek nagyobb darabjait, majd
ezeket kapcsoljuk össze. Ekkor a termelés magasabb lesz.
QHN
R1
O
A
H3N
R2
O
ORCl
Et3NQHN
R1
O
NH
R2
O
OR
y = 90%
A AB
C CD
E EF
G GH
B
D
F
H
ABCD
EFGH
ABCDEFGH
y=0,93
Konvergens szintézis Lineáris szintézis
AB
ABC
ABCD
ABCDE
ABCDE
GH
F
ABCDEFABCDEFGABCDEFGH
y=0,97
2. Leuchs-anhidriddel
A Leuchs-anhidrid képzése során ugyanazzal a reagenssel a karboxilcsoportot
aktiváljuk az aminocsoportot pedig védjük. Nagy előnye a hagyományos módszerhez képest,
hogy a kapcsolás során a védő-aktiváló csoport szén-dioxidként távozik, nem kell tisztítani a
köztes termékeket, ezért jobb termelés érhető el. Így kb. 10 aminosav kapcsolható össze
lineáris módon, amely 10 tagú fragmenseket konvergens szintézisstratégia alkalmazásával
hagyományos úton kapcsoljuk össze hosszabb peptiddé.
14
H3N COO
R2
Cl OMe
O
Leuchs-anhidrid
Et3N
HNO
R2
O
O
Et3NH3N COO
R1
HN COO
R1O
H3N
R2
HNO
R3
O
O
+ CO2
HN COO
R1O
NH
R2O
R3
H3N
+
Konvergens szintézisLineáris Leuchs-szintézis
AB
BAC
CBAD
DCBAE
EDCBA
GH
F
FEDCBAGFEDCBAHGFEDCBA
I
IHGFEDCBAJ
JIHGFEDCBA
pep1
pep2
pep3
pep4pep1
pep2-pep1
pep4-pep3
peptid
10-tagú peptidek szintézise 10-tagú peptidek kapcsolása
hasonlóképpen pep2, pep3 és pep4 fragmens
3. Szilárd fázisú szintézis
A módszer lényege, hogy a C-terminális aminosavat észter-kötéssel szilárd fázisú
polimerhez kötjük. A soron következő, aminocsoportján védett aminosavat DCC-vel
(diciklohexilkarbodiimid) együtt adagoljuk. A DCC in situ aktiválószerként működik, vegyes
anhidridet képez az aminosavval. A kapcsolási lépés után az N-védőcsoportot eltávolítjuk,
majd a következő aminocsoportján védett aminosavat kapcsoljuk a polimeren növekedő
peptidlánchoz. A végén HF-dal hasítjuk le a termék peptidet a szilárd fázisról.
N C N
DCC
NH
COOH
R2
NH
R2
O
O
HN
N
O
O
NH2
R2
in situ aktiválás
O
O
NH
R1 OHN
R2
O
O
NH
R1 O
NH2
R2
NH
COOH
R3
DCC...
TFA
H3N COO
R1
Cl
HFF Termék
BOC
BOC
BOC
HN C
HN
DCUO
BOC
Et3N
15
A módszer előnye, hogy folytonos-átfolyásos üzemű csőreaktorban automatizálható; a
reagensek feleslege, illetve a melléktermékek az szilárd fázisról könnyen lemoshatóak; illetve
a reagensoldat recirkuláltatásával a konverzió nagy reagensfelesleg alkalmazása nélkül is
növelhető. Így az egyes kapcsolások során közel 100%-os termelés érhető el. Ezzel az
eljárással 100-nál több aminosavból álló peptidlánc is szintetizálható.
4. Bioszintézis
Teljes fehérjemolekulák legújabb szintézismódszere az itt részleteiben nem ismertetett
bioszintézis. Ehhez először a fehérje aminosav-sorrendjét kódoló m-RNS-t állítják elő
szilárdfázisú szintézis alkalmazásával, majd a kész m-RNS-t megfelelő baktériumsejtbe
juttatva szintetizáltatják a fehérjét.
Oldalláncok védése
Egyes esetekben a szelektivitás megőrzése érdekében szükség lehet az oldalláncon
lévő funkciós csoportok védésére is. Az alábbi ábra a védőcsoportok kiépítését, illetve
eltávolítását mutatja be.
SH
Na
BnCl
Na
NH3
Cisztein
Arginin
HNO3
H2SO4
H2/Pt/C
Szerin / Treonin
TFA
vagyHF
CuSO4
Lizin
BnO Cl
O
NH
OOC
Q kapcsolási reakciók
pep SBn
pep SH
HN
NH
OOC
Q
S
NH
OOC
Q
Bn
3
NH
NH2
HN
NH
OOC
Q
3
NH
NH
O2N kapcsolási reakciók
HN
pep 3
NH
NH
O2N
HN
pep 3
NH
NH2
OH
NH
OOC
Q R BnCl
OH
NH
BnOOC
Q R
H OtBu
NH
BnOOC
Q RH2/Pd/C
OtBu
NH
OOC
Q R
kapcsolási reakciók
OtBu
pep
R
OH
pep
R
NH2
H3N
OOC4
OH2N
ONH2
Cu
O
O
H2N
4
4
H2N
NaHCO3
OH2N
ONH2
Cu
O
O
HN
4
4
HN
Z
Z
H2S
HN
H3N
OOC4
Z
kapcsolási reakciók
HN
pep 4
Z
H2/Pd/C
NH2
pep 4
16
CuSO4
Aszparaginsav / Glutaminsav
BnI
COOH
H3N
OOCn
OH2N
ONH2
Cu
O
O
HOOC
n
n
HOOC
NaHCO3
OH2N
ONH2
Cu
O
O
BnOOC
n
n
BnOOC
H2S
COOBn
H3N
OOCn
kapcsolási reakciók
COOBn
pep n
H2/Pd/C
COOH
pep n
n=1,2
A fehérjék szerkezete
A fehérjék primer (elsődleges) szerkezete az aminosav-sorrendjük. A DNS a primer
szerkezetet kódolja, és az aminosav-sorrend megszabja a fehérje további szerkezeti
tulajdonságait is. A primer szerkezet meghatározása hagyományosan a peptid teljes
hidrolízisével történhet. A leggyakrabban alkalmazott módszer az itt részletesen nem
ismertetett Edman-lebontás. Ennek során az N-terminális aminosav felől egyesével lehasítjuk
és azonosítjuk az aminosavakat (maximum 50 aminosav-egységig alkalmazható). Az ennél
több aminosavból felépülő fehérjéket először rövidebb peptidekre kell bontani, ehhez az
egyes peptidkötéseket szelektíven kell elhasítani kémiai, vagy enzimatikus módszerekkel. Az
egyes aminosavak azonosítására hatékonyan használható fel a HPLC-MS analitika. Újabban
bioinformatikai módszerekkel, a kódoló génszakaszok bázissorrendjéből határozzák meg a
fehérjék aminosav-szekvenciáit.
A fehérjék szekunder (másodlagos) szerkezetén a fehérjemolekula peptidgerincének,
a peptidkötések között létrejövő hidrogénkötések által stabilizált, lokális konformációját
értjük. A legfontosabb szekunder szerkezeti elemek a periodikus szerkezetű hélix, és redő,
illetve az aperiodikus kanyar és hurok.
Az α-hélix egy 18 egységenként ismétlődő jobb- (αR) vagy ritkábban balmenetes (αL)
spirál alakú szerkezeti rész. A szerkezetet a spirálban egymás felett helyet foglaló
peptidkötések közt kialakuló intramolekuláris H-hidak stabilizálják. Ugyancsak helikális, de
eltérő menetemelkedésű szerkezet a π-hélix.
17
A β-redő két, vagy több egymással párhuzamosan futó (azonos, vagy különböző
peptidmolekulához tartozó) peptidlánc részvételével létrejövő redőzött lemezszerű szerkezet,
amelyet ugyancsak a peptidkötések között létrejövő intra- vagy intermolekuláris H-hidak
stabilizálnak. β-paralell szerkezet esetén a peptidláncok azonos, míg a β-antiparalell szerkezet
esetén ellentétes irányúak.
A másodlagos szerkezetet a sík szerkezetű (a karbonil szénatom és az amid
nitrogénatom is sp2-es hibridállapotú) peptidkötések egymáshoz képesti elfordulásával
jellemezhetjük. Hat-hat atom van egy síkban, mely síkok az sp3-as hibridállapotú α-szénatom
(Cα) kötései körül elfordulhatnak. A rotáció mindkét irányban megengedett, ellenben a
rotációt az oldalláncok korlátozzák. Emiatt minél hosszabb a peptidlánc, annál inkább
rögzítettebb a jellemző konformáció. A Cα atom körüli rotációkat a ψ (karbonil C-atom felé)
és ϕ (amid N-atom felé) torziós szögekkel jellemezhetjük. A fehérjékben jellemzően
előforduló torziós szögek ábrázolására alkalmas a Ramachandram-diagram. Az alábbi ábrán
jól látszik, hogy számos konformáció nem előnyös, így a diagramon üres tartományok is
találhatóak.
Az előzőekben ismertetett periodikus szerkezetek jellemző torziós szögtartományai:
αR-hélix: ϕ < 0°, –60° < ψ < 0°
αL-hélix: ϕ > 0°, 60° > ψ > 0°
π-hélix: ϕ < 0°, ψ ~ –60°
β-redő: ϕ < 0°, ψ > 60°
A tercier (harmadlagos) szerkezet a fehérjemolekula oldalláncok helyzetét is
tartalmazó tényleges térbeli elrendeződése, melyet az oldalláncok közötti diszulfid- és H-
hidak, van der Waals kölcsönhatások és Coulomb erők tartanak össze. Megkülönböztetünk
globuláris, illetve fibrilláris fehérjéket. A globuláris tercier struktúrájú fehérje (pl: enzimek)
minden irányban kb. azonos kiterjedésűek. A fibrilláris fehérjék (pl: α-keratin) a tér egyik
irányában nagyobb kiterjedésűek, mint a másik kettő irányban.
18
A kvaterner (negyedleges) szerkezeten több protein és esetleg nem peptidtípusú
alkotórész (prosztetikus csoport, koenzim) részvételével kialakuló diszulfid- és H-hidak, van
der Waals kölcsönhatások és Coulomb erők által összetartott komplex szerkezeteket értjük. A
hemoglobin pl. négy proteinből és négy hem prosztetikus csoportból létrejövő fehérje.
A fehérjék biológiai funkciói, csoportosítása
A fehérjék a 20 féle fehérjealkotó α-L-aminosavból felépülő makromolekulák. A
fehérjék csoportosítása többek közt történhet funkciójuk szerint, vízoldhatóságuk szerint (pl:
az albumin vízoldható), stb. Összetétel szerint megkülönböztetünk proteineket (csak
aminosavból épül fel), valamint proteideket (aminosavakon kívül egyéb szerkezeti elemeket is
tartalmaz). Számos létfontosságú sejtfunkció köthető fehérjékhez, ezek közül néhányat alább
sorolunk fel.
Biokatalizátorok: az enzimek szerepe a sejtekben lejátszódó folyamatok
aktiválási energiájának csökkentése. Szűk pH és hőmérséklettartományban
működnek. Szubsztrát-, kemo-, regio- és sztereoszelektivitás jellemző rájuk.
Vázanyagok: pl. a miozin az izmokban fordul elő; a kollagén a bőr és a
csontok mátrixa; az α-keratin a haj és a gyapjú jellemző fehérjéje.
Az immunrendszer működésében vesznek részt: az immunoglobulinok
antigének (idegen fehérjék) megjelenésekor termelődnek. Jellegzetes Y alakjuk
van. A rövidebb szál felel a felismerésért, a hosszabb szál a makrofágokhoz
(nagy falósejt) kapcsolódik, amelyek az idegentestek (vírusok, baktériumok,
rákos sejtek, stb.) lebontását végzik.
Információ átvitelben vesznek részt: pl: a rodopszin a látás során.
A szabályozásban vesznek részt: pl. az agyalapi mirigyben termelt hormonok.
Tápanyagforrások: pl. a növényi magvak és a tojások fehérjéi.
Anyagtranszportban vesznek részt: pl. a hemoglobin az O2/CO2 transzport
fehérjéje. A hemoglobinban helyet foglaló négy porfinvázas prosztetikus
csoport egy-egy O2/CO2 molekula szállítására képes.
A porfinvázas hem szerkezete
