ANALISIS IN SILICO DAN PENGHAMBATAN LEVEL EKSPRESI mRNA

SEL PANC1 SENYAWA 5,5’-DIBROMOMETILSESAMIN

IN SILICO ANALYSIS AND INHIBITION OF PANC1 CELLS mRNA

EXPRESSION LEVEL OF 5,5'-DIBROMOMETHYLSESAMIN

COMPOUND

ANDRI ANUGRAH PRATAMA

P2501215003

PROGRAM STUDI FARMASI PASCASARJANA

UNIVERSITAS HASANUDDIN

MAKASSAR

2017

ii

ANALISIS IN SILICO DAN PENGHAMBATAN LEVEL EKSPRESI mRNA

SEL PANC1 SENYAWA 5,5’-DIBROMOMETILSESAMIN

Tesis

Sebagai salah satu syarat untuk mencapai gelar magister

Program Studi

Farmasi Herbal Medicine

Disusun dan diajukan oleh

ANDRI ANUGRAH PRATAMA

Kepada

PROGRAM PASCASARJANA

UNIVERSITAS HASANUDDIN

MAKASSAR

2017

iii

iv

PERNYATAAN KEASLIAN TESIS

Yang bertandatangan di bawah ini :

NAMA : ANDRI ANUGRAH PRATAMA

NOMOR MAHASISWA : P2501215003

PROGRAM STUDI : FARMASI HERBAL MEDICINE

JUDUL TESIS : ANALISIS IN SILICO DAN PENGHAMBATAN

LEVEL EKSPRESI mRNA SEL PANC1

SENYAWA 5,5’-DIBROMOMETILSESAMIN

Menyatakan dengan sebenarnya bahwa tesis yang saya tulis ini benar-

benar merupakan hasil karya sendiri, bukan merupakan hasil karya

sendiri, bukan merupakan pengambilan tulisan atau pemikiran orang lain.

Apabila dikemudan hari terbukti atau dapat dibuktikan bahwa sebagian

atau keseluruhan tesis ini hasil karya orang lain, saya bersedia menerima

sanksi atas perbuatan tersebut.

Makassar, Agustus 2017

Yang menyatakan

Andri Anugrah Pratama

v

PRAKATA

Alhamdulillah, segala puji penulis panjatkan kehadirat Allah SWT

atas segala karunia dan ridha-Nya, sehingga tesis ini dapat diselsaikan

dengan baik.

Oleh karena itu, pada kesempatan ini penulis mengucapkan

banyak terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Ibu Yusnita Rifai,

S.Si., M.Pharm., Ph.D., Apt sebagai Ketua Komisi Penasehat dimana

dalam kesibukan aktivitasnya beliau selalu menyempatkan membimbing

dan memberi arahan mulai dari awal hingga selesainya tesis ini. Terima

kasih juga penulis sampaikan kepada Prof. Dr. Hj. Asnah Marzuki, M.Si.,

Apt sebagai komisi penasehat.

Tidak lupa juga penulis ucapkan terima kasih banyak kepada kedua

orang tua penulis atas bantuan berupa dukungan moril dan materi dalam

menyelesaikan tesis ini.

Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada :

1. Bapak Prof. Dr. Gemini Alam, M.Si., Apt. sebagai Dekan Fakultas

Farmasi Universitas Hasanuddin.

2. Ibu Dr. Latifah Rahman, DESS., Apt. sebagai Ketua Program Studi

Magister Farmasi Universitas Hasanuddin.

vi

3. Bapak Prof. Dr. H. Tadjuddin Naid, M.Sc., Apt., Bapak Subehan,

M.Pharm.Sc., Ph.D., Apt. dan Muhammad Aswad, M.Pharm.Sc.,

Ph.D., Apt sebagai komisi penguji yang telah memberikan masukan

dan saran dalam penyusunan tesis ini.

4. Teman-teman angkatan 2015 (Genome) yang telah berjuang bersama

dalam menempuh pendidikan pascasarjana.

5. Kepada semua pihak yang telah membantu dalam menyelesaikan tesis

ini yang tidak dapat disebutkan satu persatu.

Penulis menyadari bahwa tesis ini masih banyak kekurangan dan jauh

dari kesempurnaan, sehingga saran dan kritik yang membangun sangat

diharapkan penulis untuk perbaikan dan pengembangan kedepannya

Akhir kata, semoga tesis ini dapat membantu dalam pengembangan ilmu

pengetahuan dalam bidang farmasi.

Makassar, Agustus 2017

Andri Anugrah Pratama

vii

ABSTRAK

Andri Anugrah Pratama. Analisis in silico dan penghambatan level

ekspresi mRNA sel PANC1 senyawa 5,5’-dibromometilsesamin (dibimbing

oleh Yusnita Rifai dan Asnah Marzuki).

Penelitian ini bertujuan untuk melakukan docking dan pemodelan

molekul senyawa 5,5’-dibromometilsesamin yang memiliki afinitas

terhadap reseptor SMO (4O9R) serta melakukan analisa Real Time PCR

untuk mengetahui mekanisme penghambatan mRNA senyawa 5,5’-

dibromometilsesamin terhadap reseptor aktif berdasarkan hasil docking.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa docking molekul 5,5’-

dibromometilsesamin memberikan afinitas pada 4O9R dengan Docking

score -7.8500 dan terikat dengan residu asam amino yang sama pada

cyclopamine yaitu Glu518 yang berarti 5,5’-dibromometilsesamin mampu

menempati posisi yang sama dengan cyclopamine. Hasil pengukuran

qRT-PCR menunjukkan penurunan level ekspresi mRNA PANC1 pada

kelompok perlakuan cyclopamine 1 µM, 5,5’-dibromometilsesamin 0,5 µM

dan 5,5’-dibromometilsesamin 1 µM yang berbeda signifikan dengan

kelompok kontrol negatif (p < 0.05). Hal ini menunjukkan bahwa

mekanisme kerja 5,5’-dibromometilsesamin mungkin menyerupai

mekanisme kerja cyclopamine namun perlu penelitian lebih lanjut.

Kata kunci : 5,5’-dibromometilsesamin, docking, Real Time PCR, PANC1.

viii

ABSTRACT

Andri Anugrah Pratama. In silico analysis and inhibition of PANC1 cells

mRNA expression level of 5.5'-dibromemethylsesamine compound

(supervised by Yusnita Rifai and Asnah Marzuki).

This study aimed to perform docking and molecules modeling of

5.5'-dibromemethylsesamine compound suspected of having affinity to

SMO receptor (4O9R) and performing Real Time PCR analysis to

determine the mechanism of mRNA inhibition of 5.5'-

dibromemethylsesamine compound against active receptors based on the

docking result. The results showed that docking molecule of 5.5'-

dibromomethylsesamine had showed the best affinity to 4O9R with

Docking score -7.8500 and bound the same amino acid residues in

cyclopamine that is Glu518, which means 5.5'-dibromomethylacsamine

capable of occupying the same position with cyclopamine.. The results of

qRT-PCR analysis showed decreased levels of PANC1 mRNA

expressions in the treatment group of cyclopamine 1 μM, 5.5'-

dibromemethylsesamine 0.5 μM and 5.5'-dibromemethylsesamine 1 μM,

which were significantly different from the negative control group (p <0.05).

This suggests that the mechanism of action of 5.5'-dibromomethylsamine

may resemble the mechanism of action of cyclopamine but needs further

investigation.

Keywords : 5.5'-dibromomethylsesamine, docking, Real Time PCR,

PANC1.

ix

DAFTAR ISI

PRAKATA v

ABSTRAK vii

ABSTRACT viii

DAFTAR ISI ix

DAFTAR TABEL xi

DAFTAR GAMBAR xii

DAFTAR LAMPIRAN xiii

DAFTAR SINGKATAN xiv

BAB I PENDAHULUAN 1

A. Latar Belakang 1

B. Rumusan Masalah 4

C. Tujuan Penelitian 5

D. Manfaat Penelitian 5

BAB II TINJAUAN PUSTAKA 6

A. 5,5’-dibromometilsesamin 6

B. Jalur Sinyal Hedgehog (Hh) 9

C. Reseptor Smoothened 13

x

D. Docking Molekuler 15

E. Polymerase Chain Reaction 17

F. Kerangka Teori 20

G. Kerangka Konseptual 21

H. Hipotesis 21

BAB III METODE KERJA 22

A. Rancangan Penelitian 22

B. Waktu dan Lokasi Penelitian 22

C. Alat dan Bahan 22

D. Prosedur Kerja 23

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 29

A. Hasil Pengamatan 29

B. Pembahasan 30

BAB V PENUTUP 39

A. Kesimpulan 39

B. Saran 40

DAFTAR PUSTAKA 41

LAMPIRAN 44

xi

DAFTAR TABEL

Nomor Halaman

1. Hasil docking molekul cyclopamine dan 5,5’-dibromosesamin pada

reseptor 4O9R 29

2. Hasil pengukuran level ekspresi mRNA PANC1 30

xii

DAFTAR GAMBAR

Nomor Halaman

1. 5,5’-dibromosesamin 7

2. Sesamin 8

3. Cyclopamine 8

4. Jalur pensignalan Hedgehod pada vertebrata 10

5. Validasi docking ligan asli (native ligand) terhadap 4O9R 32

6. Interaksi cyclopamine dengan reseptor 4O9R 33

7. Interaksi 5,5’-dibromometilsesamin dengan reseptor 4O9R 34

8. Grafik hasil pengukuran level ekspresi mRNA PANC1 37

xiii

DAFTAR LAMPIRAN

Nomor Halaman

1. Skema kerja docking molekul 44

2. Skema kerja kultur sel dan sintesis cDNA 45

3. Skema kerja ekstraksi RNA 46

4. Skema kerja analisis real time PCR 47

5. Perhitungan level ekspresi PANC1 48

6. Analisis statistik hasil pengukuran level ekspresi mRNA PANC1 54

xiv

DAFTAR SINGKATAN

cDNA : Complementary Deoxyribonucleic Acid

GLI : Glioma

Glu : Glutamat

Hh : Hedgehog

MOE : Molecular Operating Environment

PTCH : Patch

PCR : Polymerase Chain Reaction

RNA : Ribonucleic Acid

SMO : Smoothened

1

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Metode in vitro dan in vivo termasuk metode yang lazim digunakan

dalam proses penemuan obat. Dengan kemajuan teknologi saat ini, komputer

kemudian menawarkan suatu metode in silico, yaitu suatu metode yang

menggunakan kemampuan komputer dalam proses merancang obat, sebagai

komplemen dari in vitro dan in vivo. Kemampuan komputasi yang meningkat

secara eksponensial ini merupakan peluang mengembangkan simulasi dan

kalkulasi dalam merancang obat baru (Pranowo, 2011).

Penemuan obat baru melibatkan proses sintesis dari beberapa struktur

kimia yang sulit, perlu ketelitian dan sistematis. Pada saat ini sangat

dimungkinkan untuk menyelesaikan permasalahan dalam bidang teknik dan

desain baru dalam proses kimia dengan menggunakan metode komputasi

(Reddy et al, 2007 dan Pranowo, 2011). Kimia komputasi merupakan disiplin

ilmu yang menerapkan metode matematika dalam menghitung sifat molekuler

atau untuk mensimulasi kelakuan dari molekul (Waterbeemd et al, 1997).

Pendekatan in silico ini terus berkembang hingga memperoleh popularitas

besar dan telah menjadi bagian dari penelitian industri dan akademik yang

mengarahkan pada desain obat dan penemuan (Reddy et al, 2007).

2

Desain obat merupakan proses iterasi yang dimulai dengan penentuan

senyawa yang menunjukkan sifat biologi penting dan diakhiri dengan langkah

optimasi, baik dari profil aktivitas maupun sintesis senyawa kimia. Kombinasi

antara strategi mensintesis dan uji aktivitasnya menjadi sangat rumit dan

memerlukan waktu yang lama untuk sampai pada pemanfaatan obat. Dengan

kemajuan di bidang kimia komputasi, peneliti dapat menggunakan komputer

untuk mengoptimasi aktivitas, geometri dan reaktivitas, sebelum senyawa

disintesis secara eksperimental. Hal ini dapat menghindarkan langkah

sintesis suatu senyawa yang membutuhkan waktu dan biaya mahal, tetapi

senyawa baru tersebut tidak memiliki aktivitas seperti yang diharapkan.

Teknik komputasi dapat digunakan sebagai pelengkap dan petunjuk serta

menggantikan perhitungan eksperimen sehingga mampu mengurangi jumlah

waktu dan biaya yang diperlukan dalam penelitian untuk membawa ide dari

skala laboratorium ke aplikasi praktis. (Pranowo, 2011).

Pemodelan molekuler merupakan teknik penyelidikan struktur dan sifat

molekul menggunakan kimia komputasi dan teknik visualisasi grafis dalam

menampilkan gambaran tiga dimensi dalam sistem kimia (Pranowo, 2009).

Perangkat lunak seperti HyperChem dapat memberikan fasilitas yang

memadai untuk menampilkan bentuk molekul, vibrasi ikatan antar atom

dalam spektra infra merah dan dinamika perubahan struktur molekul akibat

pengaruh sistem reaksi. Salah satu aplikasi kimia komputasi yang cukup

memadai untuk digunakan dalam penemuan obat adalah Molecular

3

Operating Environment (MOE) yang dikembangkan Chemical Computing

Group. Pada aplikasi Molecular Operating Environment (MOE) dapat

dilakukan Docking molekuler, yaitu simulasi secara komputasi untuk

memprediksi ikatan antara obat/ligan dan reseptor/protein.

5,5’-Dibromometilsesamin merupakan senyawa sintetik baru yang

merupakan turunan dari senyawa sesamin, dengan cara brominasi yakni

pemberian gugus metil Br pada sesamin (Husain, 2014). Sesamin merupakan

lignin, yaitu kandungan utama pada wijen (Sesamum indicum L.). Sesamin

memiliki beberapa aktivitas biologis seperti pengurangan serum dan kadar

kolesterol hatiserta serum trigliserida dengan meningkatkan oksidasi asam

lemak hati; terlibat dalam penekanan hipertensi; pencegahan stroke;

meningkatkan kadar γ-tokoferol; menurunkan produksi endotoxin-induced

interleukin (IL)-1β, prostaglandin E2 (PGE2), dan tromboksan B2;

meningkatkan produksi IL-6; menghambat 7,12-dimetilbenzantrasena yang

diinduksi karsinogenesis payudara dan menghambat pertumbuhan berbagai

neoplastik sel. Dengan demikian, sesamin dipercaya dapat mencegah kanker

dan penyakit kronis lainnya (Lim et al, 2012).

Signal Hedgehog (Hh) merupakan jalur yang berperan mengatur

beberapa proses yang terlibat dalam pertumbuhan dan perkembangan serta

etiologi kanker (Xu, 2009). Jalur Signal Hedgehog (Hh) merupakan mediator

kunci dalam proses perkembangan embrio dan pemeliharaan jaringan

dewasa (Rifai et al, 2010). Jalur Hh merupakan jaringan yang sangat

4

terkoordinasi dan terintegrasi yang pada dasarnya terdiri dari protein Hh

(Sonic Hh, Indian Hh dan Desert Hh), reseptor transmembran Patched

(Patched1 dan Patched2), protein transmembran Smoothened (Smo), dan

faktor transkripsi gen Glioma (GLI1, GLI2 dan GLI3) (Kameda et al, 2009).

Cacat atau penyimpangan pada pensinyalan Hh mengarah pada terjadinya

kanker. Dalam sel kanker, pengikatan ligan protein Hh pada reseptor

Patched1 akan meniadakan efek penghambatan pada proto-onkogen

Smoothened yang selanjutnya akan mengaktifkan faktor transkripsi GLI (Rifai

et al, 2010). Oleh karena itu, SMO dan GLI dapat dijadikan sebagai target

terapi dalam penemuan obat antikanker.

Berdasarkan uraian diatas, maka hal ini yang mendasari perlunya

dilakukan analisis in silico dan molekuler senyawa 5,5’-dibromometilsesamin

terhadap beberapa reseptor.

B. Rumusan Masalah

Berdasarkan uraian diatas, maka dapat dirumuskan masalah sebagai

berikut :

1. Apakah senyawa 5,5’-dibromometilsesamin memiliki afinitas terhadap

reseptor SMO berdasarkan hasil docking molekul ?

5

2. Bagaimana mekanisme penghambatan secara molekuler senyawa 5,5’-

dibromometilsesamin terhadap reseptor yang dihasilkan dari hasil docking

?

C. Tujuan Penelitian

1. Melakukan docking dan pemodelan molekul senyawa 5,5’-

dibromometilsesamin yang diduga memiliki afinitas terhadap reseptor

SMO.

2. Melakukan analisa Real Time PCR untuk mengetahui mekanisme

penghambatan mRNA senyawa 5,5’-dibromometilsesamin terhadap

reseptor aktif yang dihasilkan dari proses docking.

D. Manfaat Penelitian

Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat diperoleh informasi mengenai

mekanisme in silico dan molekuler senyawa 5,5’-dibromometilsesamin

terhadap reseptor aktif dan sebagai pengembangan dalam penemuan obat

baru.

6

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. 5,5’-dibromometilsesamin

5,5’-dibromometilsesamin merupakan senyawa sintetik baru yang

merupakan turunan dari sesamin, dengan cara brominasi yakni adisi gugus

metil Br pada sesamin. Sesamin merupakan lignin, yaitu kandungan utama

pada wijen (Sesamum indicum L.). 5,5’-dibromometilsesamin berbentuk

kristal kasar berwarna jingga kecokelatan dengan bau khas. 5,5’-

dibromometilsesamin larut dalam methanol dan mudah larut dalam air.

(Husain, 2014). Sesamin memiliki beberapa aktivitas biologis seperti

pengurangan serum dan kadar kolesterol hati serta serum trigliserida dengan

meningkatkan oksidasi asam lemak hati; terlibat dalam penekanan hipertensi;

pencegahan stroke; meningkatkan kadar γ-tokoferol; menurunkan produksi

endotoxin-induced interleukin (IL)-1β, prostaglandin E2 (PGE2), dan

tromboksan B2; meningkatkan produksi IL-6; menghambat 7,12-

dimetilbenzantrasena yang diinduksi karsinogenesis payudara dan

menghambat pertumbuhan berbagai neoplastik sel. Dengan demikian,

sesamin dipercaya dapat mencegah kanker dan penyakit kronis lainnya (Lim

et al, 2012).

7

Gambar 1. 5,5’-dibromometisesamin

Penelitian yang telah dilakukan sebelumnya oleh Ester Carolina (2013)

menunjukan bahwa hasil docking molekul senyawa sesamin memiliki ikatan

pose ligan protein dan memiliki hasil scoring yang mendekati kontrol positif

yaitu Cyclopamine. Hasil scoring Sesamin yaitu -75,8 dan Cyclopamine -

73,27. Cyclopamine merupakan senyawa alkaloid yang bersifat antikanker.

Studi menunjukkan Cyclopamine sebagai penghambat jalur Hedgehog (Hh)

dapat menekan proliferasi sel pankreas adekarsinoma dan mengurangi

ekspresi gen yang terlibat signal Hh (PTCH 1 dan GLI1) (Husain, 2014).

8

Gambar 2. Sesamin

Gambar 3. Cyclopamine

9

B. Jalur Signal Hedgehog (Hh)

Jalur signal Hedgehog (Hh) berperan dalam berbagai proses seperti

diferensiasi sel dan perkembangan embrio vertebrata. Hedgehog

merupakan nama dari ligan polipeptida yang diberikan yang ditemukan pada

lalat buah dari genus Drosophila. Molekul signal intraseluler ini disebut

Hedgehog karena mutasi yang menyebabkan aktivitas yang tidak terkontrol

dari lalat buah sehingga memiliki penampilan dentikel yang memiliki “duri”

dan “rambut” yang mirip landak (Hedgehog) jika dibandingkan dengan

penampilan normalnya. Jalur ini pertama kali diperkenalkan oleh Christiane

Nüsslein-Volhard dan Eric Wieschaus pada tahun 1908 yang mengisolasi

mutasi pada gen yang mengontrol perkembangan bagian anterior dan

posterior dari Drosophila (Abidi, 2014).

Jalur Hh pada vertebrata terdiri dari reseptor PATCH (PTCH) yang

merupakan protein reseptor 12 transmembran dan protein Smoothened

(SMO) yaitu protein 7 transmembran yang berkaitan pada reseptor

terhubung-protein G. Terdapat tiga famili dari gen Hh pada mamalia, yaitu

Sonic Hedgehog (SHh), Indian Hedgehog (IHh) dan Desert Hedgehog (DHh)

(Arai et al, 2008 & Hosoya et al, 2008). SHh memiliki peran penting selama

perkembangan embrio, mengarahkan pembentukan pola dan menginduksi

proliferasi sel di berbagai jaringan, termasuk sistem saraf pusat (SSP),

anggota badan, somit, kerangka dan kulit (Matise, 1999). Terdapat 2 reseptor

10

PATCH yaitu PTCH 1 dan PTCH 2. Pensignalan hilir dari SMO pada mamalia

dikenal sebagai glioma terkait onkogen-GLI 1, GLI 2 dan GLI 3. GLI 1 dan

GLI 2 merupakan aktivator transkripsi, sedangkan GLI 3 merupakan

repressor transkripsi.

Tanpa adanya ligan Hh, PTCH berada pada membran sel di dasar silia

dan menekan SMO memasuki silia sehingga mencegah inisiasi dari

pensignalan hilir. PTCH bertindak sebagai pompa sterol dan menyingkirkan

oksiterol sehingga menahan jalur inisiasi SMO. GLI 1 bersama dengan SUFU

yang merupakan penekan negatif, mencegah terjadinya transkripsi target gen

GLI dengan demikian menjaga jalur tidak aktif (Gambar 4a).

(a) (b)

Gambar. 4. Jalur pensignalan Hedgehod pada vertebrata (a) tanpa ligan Hh,

(b) dengan ligan Hh

11

Jalur pensignalan Hh dimulai dengan pengikatan ligan Hh pada

reseptor PTCH 1. Hal ini menyebabkan translokasi PTCH 1 dan internalisasi

yang menyebabkan pompa sterol dimatikan memungkinkan oksiterol

menumpuk di sekitar SMO sehingga menghilangkan efek penghambatan

pada SMO. SMO yang diaktifkan kemudian bergerak menuju membran sel

dari silia. Hal ini memicu aktivasi faktor transkripsi GLI dengan cara

membelah dari protein Suppresor of Fused (SUFU) sehingga menghilangkan

efek penghambatannya. GLI yang diaktifkan memasuki nukleus dan

berikatan dengan promotor GLI yang merangsang transkripsi dari gen target

mamalia (Gambar 4b). Gen target ini terlibat dalam proliferasi sel,

perkembangan organ dan perbaikan jaringan. Signal yang terganggu dan

menyimpang dari jalur Hh dapat menyebabkan sejumlah kanker.

Jalur Hh menjadi inaktif pada beberapa jaringan dewasa, tetapi

membantu dalam mengatur sel induk / sel punca dewasa dan terlibat dalam

proses pemeliharaan dan perbaikan jaringan. Reaktivitas yang tidak tepat

dan signal yang menyimpang dalam jaringan dewasa dihubungkan dengan

beberapa kanker pada manusia, seperti karsinoma sel basal (KSB),

meduloblastoma, kanker prostat, kanker paru, karsinoma pankreas dan

leukemia. Oleh karena itu, jalur ini mungkin merupakan terapi yang potensial

untuk pengobatan antikanker baru. Sejumlah perusahaan farmasi aktif

12

mengembangkan obat-obatan yang secara khusus menargetkan signal Hh

untuk melawan penyakit kanker (Abidi, 2014).

Menurut Xu (2009), aktivasi jalur Hh terlibat dalam pengembangan dan

invasi tumor, termasuk karsinoma pankreas. Aktivasi jalur Hh yang tidak

terkontrol terlibat dalam perkembangan dan pemeliharaan adenokarsinoma

pankreas. Penghalangan signal Hh akan menghambat pertumbuhan sel

kanker pankreas. Selain itu, juga diketahui bahwa ekspresi SHH

meningkatkan inisiasi dan pertumbuhan tumor, dan mengurangi kematian sel

tumor. SHH terlibat dalam tumorgenesis pankreas dalam beberapa cara,

dimana pada akhirnya terjadi overekspresi pada Hh menyebabkan

pertumbuhan yang tidak teratur pada sel induk jaringan dan menghasilkan

lesi pre-malignant yang ditandai dengan pertumbuhan sel induk yang tidak

normal dan hiperproliferasi. Hal ini menandakan bahwa signal SHH berperan

penting dalam inisiasi, pertumbuhan dan kelangsungan hidup tumor

pankreas. Kita dapat berhipotesis bahwa agen yang memodulasi aktivitas

jalur ini dapat digunakan sebagai pengobatan kanker pankreas. Blokade atau

penghalangan jalur Hh dapat menjadi strategi terapi yang efektif untuk

mencegah kanker pankreas (Xu, 2009).

SMO dan GLI dapat dijadikan target protein untuk penemuan obat

antikanker. Cyclopamine merupakan inhibitor SMO yang pertama kali diuji

pada manusia. Penghambatan pensignalan Hh dengan cyclopamine

13

meningkatkan kelangsungan hidup pada model tikus rekayasa genetika yang

mengalami kanker pankreas dan membatalkan metastasis sistemik yang

timbul dari xenograft. Cyclopamine dapat menurunkan laju pertumbuhan sel-

sel medulloblastoma tikus baik dalam kultur dan dalam model allograft.

Kadang-kadang kanker dapat terjadi karena mutasi pada jalur signal hilir

seperti amplifikasi GLI. Sehingga dapat juga dijadikan sebagai target

potensial untuk penemuan obat. GANT-61 merupakan antagonis aktivitas

transkripsi GLI 1 pada xenograft kanker prostat manusia. Arsenik trioksida

juga menunjukkan penghambatan pensignalan Hh dengan mengganggu

fungsi dan transkripsi GLI dengan menghalangi penumpukan GLI 2 pada silia

mengakibatkan pengurangan tingkat kestabilan GLI 2 sehingga menghambat

pertumbuhan medulloblastoma pada model tikus. Dengan demikan, target

pensignalan Hh/GLI dapat dijadikan sebagai strategi terapi dalam penemuan

obat antikanker yang efektif (Rubin, 2006; Ara et al, 2008; Heretsch, 2010;

Wang et al, 2014 & Abidi 2014).

C. Reseptor Smoothened

Smoothened (SMO) merupakan reseptor terhubung-protein G dan

dikenal sebagai reseptor 7 transmembran yang berperan dalam

pengembangan embrio vertebrata dan pertumbuhan tumor. Untuk dapat

memahami mekanisme fungsionalnya dan mendesain obat baru dengan

selektivitas dan potensi tinggi, maka sangat diperlukan struktur tiga dimensi

14

protein membran beresolusi tinggi. Dibutuhkan pengembangan metode lebih

lanjut dan pendekatan yang inovatif untuk pengetahuan tentang struktur

protein membran.

Metode alternatif kristalisasi yang dikenal sebagai fase kubik lipidik

(Lipidic Cubic Phase, LCP) merupakan metode untuk menentukan struktur

tiga dimensi dan mekanisme fungsional protein membran. Untuk pertama

kalinya, struktur kompleks SMO dengan antagonis LY2940680 berhasil

ditentukan oleh mikrokristalografi tradisional pada sumber sinkrotron. Struktur

kompleks SMO dengan cyclopamine tidak berhasil ditentukan dengan

menggunakan data sinkrotron karena difraksi yang buruk dari kristal yang

relatif besar.

Pembentukan reseptor smoothened manusia disusun dengan

potongan dari amino-terminal cysteine-rich domain (residues 1–189) dan

carboxy terminus pada Q555, dan thermostabilized Escherichia coli

apocytochrome B562 (BRIL)34 yang tergabung ke dalam intracellular loop 3

(replacing residues from P434 to K440) dihasilkan, diekspresikan dan

dimurnikan. Mikrokristal dengan densitas tinggi dalam LCP dihasilkan dari

pembentukan ΔDCRD-SMO-BRIL-ΔDC secara kompleks dengan

cyclopamine berdasarkan protokol kristalisasi.

15

Molecular replacement dengan program Phaser digunakan untuk

penentuan struktur kompleks SMO cyclopamine. Alternate refinement

dilakukan pada Phenix.refine. Geometri struktur yang sangat bagus yang

diperoleh, sesuai dengan MolProbity server dengan residu 95,6% pada

residu yang favored dan 4,4% pada konformasi Ramachandran yang

disediakan (Weierstall, 2013). Dari penelitian yang dilakukan Wierestall dkk

(2013) diperoleh struktur kompleks tiga dimensi smoothened cyclopamine

yang dapat diunduh dengan kode pdb id 4O9R.

D. Docking Molekuler

Perkembangan teknologi saat ini khususnya dalam eksperimen

komputer yang dilengkapi dengan aplikasi kimia komputasi memiliki peranan

penting dalam penemuan obat baru. Metode komputasi yang dilakukan

dalam penemuan obat yaitu :

1. Desain obat berbasis ligan (ligan-based drug design, LBDD), yaitu

rancangan obat berdasarkan ligan yang sudah diketahui.

2. Desain obat berbasis struktur (Structure-based drug design, SBDD), yaitu

rancangan obat berdasarkan struktur target yang didasarkan pada

struktur target reseptor yang bertanggungjawab atas toksisitas dan

aktivitas suatu senyawa di dalam tubuh.

Metode LBDD memanfaatkan senyawa aktif sebagai landasan dalam

mendesain senyawa baru. Metode LBDD yang umum digunakan yaitu

16

penemuan farmakofor (pharmacophore discovery), QSAR (quantitative

structure-activity relationship) dan docking molekul (molecular docking)

(Pranowo, 2011).

Docking molekul merupakan suatu metode komputasi yang digunakan

untuk memasangkan suatu molekul kecil (ligan) pada bagian sisi aktif dari

enzim (reseptor) dan menggambarkan interaksi dari yang terjadi. Docking

sering digunakan untuk memprediksi orientasi pengikatan molekul kecil calon

obat dengan target proteinnya, memprediksi afinitas dan aktivitas dari

molekul kecil serta melihat geometri tiga dimensi dari senyawa yang terikat

pada sisi aktif protein. Oleh karena itu, docking berperan penting dalam

desain obat rasional (Young, 2009; Mukesh, 2011 & Ferreira et al, 2015).

Pembentukan kompleks protein-ligan non kovalen merupakan subjek dari

docking. Secara termodinamika, kekuatan interaksi antara protein dan ligan

digambarkan dengan afinitas pengikatan atau energi bebas pengikatan

(Gibbs). (Abraham, 2003).

Adapun beberapa jenis docking molekul berdasarkan sifat ligan dan

reseptornya, yaitu :

1. docking dimana reseptor dan ligan keduanya diperlakukan kaku, yaitu

rigid body docking.

2. docking dimana reseptor diperlakukan kaku dan ligan dapat digerakkan

ke segala arah, yaitu flexible ligand docking.

17

3. docking dimana fleksibilitas reseptor dan ligan dipertimbangkan, yaitu

flexible docking.

Pada umumnya prosedur docking yang paling umum dipergunakan

yaitu model flexible ligand docking. Fungsi scoring dapat dikategorikan dalam

tiga kategori, yaitu :

1. berdasarkan fungsi statistik untuk memasukkan aturan yang dianjurkan

dan tidak dianjurkan, interaksi pasangan atom dari eksperimen

penentuan kompleks protein-ligan, yaitu knowledge-based,

2. menjumlahkan interaksi entalpi dan entropi dengan bobot relatif

berdasarkan pengaturan kompleks protein-ligan, yaitu empirical-based,

3. memprediksikan energi bebas pengikatan dari kompleks protein-ligan

dengan penambahan kontribusi individual dari berbagai tipe interaksi,

yaitu force field-based (Kitchen et al, 2004 & Mohan et al, 2005).

D. Polymerase Chain Reaction (PCR)

Reaksi berantai polymerase atau Polymerase Chain Reaction (PCR)

merupakan suatu metode enzimatis yang digunakan untuk melipatgandakan

sekuen nukleotida tertentu secara in vitro. Prosedur untuk melakukan

Polymerase Chain Reaction (PCR) pertama kali diperkenalkan oleh Kary

Mullis pada tahun 1983, yang kemudian memenangkan Hadiah Nobel pada

tahun 1993. Metode ini tidak hanya digunakan untuk memperbanyak atau

mengamplifikasi DNA, tetapi juga dikembangkan dan dimodifikasi sehingga

18

dapat digunakan untuk mengamplifiasi secara kuantitatif molekul-molekul

mRNA yang dikenal sebagai Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR) (Dorak,

2006 & Djide, 2012).

Beberapa hal yang mendasari melakukan PCR yaitu DNA cetakan,

oligonukleotida primer, deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP), enzim DNA

polymerase dan buffer tertentu. DNA cetakan merupakan fragmen DNA yang

akan diamplifikasi/diperbanyak. DNA cetakan diisolasi dari sel yang kemudian

digunakan dalam membuat salinan nukleotida. Oligonukleotida primer

merupakan suatu sekuen nukleotida pendek oligonukleotida pendek (15-25

basa nukleotida) yang digunakan untuk mengawali sintesis DNA.

Deoksiribonukleotida trifosfat terdiri dari dATP,dGTP, dCTP dan dTTP. Enzim

DNA polymerase merupakan enzim yang digunakan untuk mengkatalis reaksi

sintesa rantai DNA (Djide, 2012).

Tahap melakukan PCR terdiri dari tiga, yaitu denaturasi (denaturation),

penempelan primer (anneling) dan pemanjangan (extension). Langkah awal

dalam melakukan PCR dimulai dari melakukan denaturasi DNA cetakan

(template) pada suhu tinggi yaitu 90-97 ºC selama 1-2 menit, sehingga akan

diperoleh rantai DNA tunggal (single stranded). Selanjutnya suhu diturunkan

pada temperatur 50-60 ºC selama 1-2 menit, sehingga primer akan

menempel (annealing) pada cetakan yang terpisah dan menjadi rantai

tunggal. Primer akan membentuk suatu jembatan hidrogen dengan cetakan

di daerah sekuen yang komplementer dengan sekuen primer. Setelah

19

dilakukan annealing terhadap oligonukleotida primer dengan DNA cetakan,

kemudian suhu dinaikkan menjadi 72 ºC selama 2-5 menit. Pada suhu

tersebut enzim DNA polymerase melakukan proses polimerisasi terhadap

rantai DNA baru. Setelah itu DNA baru akan membentuk ikatan hidrogen

dengan DNA cetakan. DNA rantai ganda yang terbentuk ini, kemudian akan

terdenaturasi lagi karena kenaikan suhu. DNA baru tersebut berfungsi lagi

sebagai cetakan untuk reaksi polimerisasi berikutnya pada siklus selanjutnya.

Reaksi ini biasanya diulangi 25-30 siklus, sehingga pada akhir siklus

diperoleh DNA hasil polimerisasi dengan jumlah yang lebih banyak (Joshi,

2011 & Djide 2012).

20

E. Kerangka Teori

Penemuan Obat baru Metode In silico

Docking molekul 5,5’-

dibromometilsesamin pada beberapa

reseptor

Penelitian :

sesamin memiliki ikatan pose ligan

protein dan memiliki hasil scoring yang

mendekati kontrol positif yaitu

Cyclopamine. Hasil scoring Sesamin yaitu

-75,8 dan Cyclopamine -73,27.

Cyclopamine merupakan senyawa

alkaloid yang bersifat antikanker. Studi

menunjukkan Cyclopamine sebagai

penghambat jalur Hedgehog (Hh) dapat

menekan proliferasi sel pankreas

adekarsinoma dan mengurangi ekspresi

gen yang terlibat signal Hh.

5,5’-dibromometilsesamin

menunjukkan afinitas pada beberapa

reseptor

Dilakukan analisa Real Time PCR

untuk mengetahui mekanisme

penghambatan secara molekuler

21

F. Kerangka Konseptual

Keterangan :

Variabel bebas :

Variabel antara :

Variabel tergantung :

Hubungan variabel bebas :

Hubungan Variabel tergantung :

G. Hipotesis

1. Senyawa 5,5’-dibromometilsesamin memiliki afinitas terhadap reseptor

SMO.

2. Senyawa 5,5’-dibromometilsesamin menghambat mRNA secara

molekuler terhadap reseptor yang dihasilkan dari hasil docking.

5,5’-dibromosesamin

Docking molekuler

pada beberapa

reseptor

Aktivitas inhibisi

mRNA pada sel

PANC1