ANALIZA TREH MIKROSATELITSKIH LOKUSOV PRI POSTRVI … · univerza v ljubljani biotehniŠka fakulteta oddelek za biologijo tamara jug analiza treh mikrosatelitskih lokusov pri postrvi

UNIVERZA V LJUBLJANI

BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

ODDELEK ZA BIOLOGIJO

Tamara JUG

ANALIZA TREH MIKROSATELITSKIH LOKUSOV PRI POSTRVI (Salmo trutta L.)

DIPLOMSKA NALOGA

ANALYSIS OF THREE MICROSATELLITE LOCI IN Salmo trutta L.

GRADUATION THESIS

Ljubljana, 1998

Jug, T. Analiza treh mikrosatelitskih lokusov pri postrvi (Salmo trutta L.). II Dipl. nal., Ljubljana, BF, Odd. za biologijo, 1998

Diplomska naloga je bila opravljena v genetskem laboratoriju Oddelka za zootehniko

Biotehniške fakultete v Domžalah.

Študijska komisija Oddelka za biologijo je za mentorja diplomske naloge imenovala prof.

dr. P. Dovča in za somentorja dr. A. Snoja.

Mentor: prof. dr. Peter Dovč

Somentor: dr. Aleš Snoj

Komisija za oceno in zagovor diplomske naloge:

Predsednik: prof. dr. Miklavž Grabnar

Člana: prof. dr. Jure Pohar

prof. dr. Peter Dovč

Datum zagovora: 10. 9. 1998

Jug, T. Analiza treh mikrosatelitskih lokusov pri postrvi (Salmo trutta L.). III Dipl. nal., Ljubljana, BF, Odd. za biologijo, 1998

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA

ŠD Dn

DK UDK 577.2:575.17:597(043.2)=863

KG molekularna biologija / molekularna genetika / Salmo marmoratus / soška postrv / Salmo trutta / potočna postrv / DNA polimorfizem / mikrosatelitska DNA / genetski markerji

AV JUG, Tamara

SA DOVČ, Peter ment. / SNOJ, Aleš soment.

KZ 1000 Ljubljana, SLO, Večna pot 111

ZA Univ. v Ljubljani, Biotehniška fak., Odd. za biologijo

LI 1998

IN ANALIZA TREH MIKROSATELITSKIH LOKUSOV PRI POSTRVI (Salmo trutta L.)

TD diplomska naloga

OP VII, 37 s., 11 tab., 3 graf., 8 sl., 39 ref.

IJ SL

JI sl / en

AI Preučevali smo genetske polimorfizeme na treh mikrosatelitskih lokusih pri populacijah soške postrvi (Salmo trutta marmoratus), potočne postrvi (Salmo truttaf. fario) donavskega in atlantskega tipa ter križancev med soško in potočno postrvjo. DNA smo izolirali iz krvi in mikrosatelitske lokuse pomnožili z verižno reakcijo s polimerazo. Dolžino lokusov smo ugotavljali z elektroforezo na poliakrilamidnem gelu in s kapilarno elektroforezo. Mikrosatelitski lokus 10/9 je bilzelo variabilen in je vseboval dva alela značilna le za soško postrv. Mikrosatelitska lokusa 10/2 in 5/65 sta bila precej manj variabilna. Lokus 10/2 je vseboval alel za katerega so bile populacije potočne postrvi atlantskega tipa homozigotne, drugače pa so ta alel vsebovale tudi populacije donavskega tipa. Lokus 5/65 je vseboval alel, ki je prevladoval pri populacijah donavskega tipa potočne postrvi. Kombinacija vseh treh mikrosatelitskih lokusov nam je omogočila precej natančno določitev vrste in tipa postrvi. Ugotovili smo, da se v Soči še nahajajo populacije čiste soške postrvi in da so v njej tudi avtohtone potočne postrvi. Nekatere slovenske reke in potoki so bili v zadnjem desetletju naseljeni z atlantskim tipom potočne postrvi.

Jug, T. Analiza treh mikrosatelitskih lokusov pri postrvi (Salmo trutta L.). IV Dipl. nal., Ljubljana, BF, Odd. za biologijo, 1998

KEY WORDS DOCUMENTATION

ND Dn

DC UDC 577.2:575.17:597(043.2)=863

CX molecular biology / molecular genetics / Salmo marmoratus / marble trout / Salmo trutta / brown trout / DNA polymorphism / microsatellite DNA / genetic markers

AU JUG, Tamara

AA DOVČ, Peter supervisor / SNOJ, Aleš co-adviser

PP 1000 Ljubljana, SI, Večna pot 111

PB Univ. of Ljubljana, Biotechnical Fac., Biol. dep.

TI ANALYSIS OF THREE MICROSATELLITE LOCI IN Salmo trutta L.

DT graduation thesis

NO VII, 37 s., 11 tab., 3 graph., 8 fig., 39 ref.

LA SL

AL sl / en

AB Genetic polymorphisms at three microsatellite loci in marble trout (Salmo trutta marmoratus), two distinc types of brown trout (Salmo trutta f. fario) from Atlantic and Danubian origin and their crosses with marble trout were studied. Genomic DNA was isolated from red blood cells and microsatellite loci were amplified using polymerase chain reaction (PCR). Length polymorphisms were detected on polyacrylamide gels and by capillary electrophoresis. Microsatellite locus 10/9 is highly polymorphic and revealed at the same time two alleles specific for marble trout. Considerably lower degree of variability was found at loci 10/2 and 5/65. At the locus 10/2 were brown trout populations of Atlantic origin homozygous but the same allele was also present in the populations of Danubian origin. At the locus 5/65 an allele which was predominant in the population of Danubian origin was found. Combination of the genotypes at all three loci enabled relativelly reliable determination of the geographical type. Our study confirmed the existence of the pure marble trout in the Soča river. However, we were able to find there also endemic brown trout. Some Slovenian fresh waters are populated with the Atlantic type of brown trout which was introduced to this area during the last decade.

Jug, T. Analiza treh mikrosatelitskih lokusov pri postrvi (Salmo trutta L.). V Dipl. nal., Ljubljana, BF, Odd. za biologijo, 1998

KAZALO VSEBINE

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA (KDI) ........................................IIIKEY WORDS DOCUMENTATION (KWD) ........................................................... IVKAZALO VSEBINE................................................................................................ VKAZALO TABEL................................................................................................... VIKAZALO SLIK ...................................................................................................... VIOKRAJŠAVE....................................................................................................... VII

1 UVOD.....................................................................................................................1

2 PREGLED OBJAV.................................................................................................22.1 MIKROSATELITI ....................................................................................................22.2 SPLOŠNO O SALMONIDIH ...................................................................................42.2.1 SOŠKA POSTRV ...................................................................................................52.2.2 POTOČNA POSTRV ..............................................................................................6

3 MATERIAL IN METODE DELA..............................................................................93.1 VZORCI..................................................................................................................93.2 IZOLACIJA GENOMSKE DNA .............................................................................113.3 IZBIRA MIKROSATELITOV IN OLIGONUKLEOTIDNIH ZAČETNIKOV...............123.4 VERIŽNA REAKCIJA S POLIMERAZO (PCR) .....................................................133.5 ANALIZA MIKROSATELITSKE DNA....................................................................143.5.1 ELEKTROFOREZA NA AGAROZNEM GELU......................................................143.5.2 POLIAKRILAMIDNA GELSKA ELEKTROFOREZA IN PRENOS NA MEMB. .......153.5.3 ANALIZA MIKROSATELITSKIH LOKUSOV NA ABI PRISMTM 310 ......................153.6 STATISTIČNA ANALIZA ......................................................................................163.6.1 IZRAČUN HETEROZIGOTNOSTI ........................................................................163.6.2 VREDNOST PIC ..................................................................................................163.6.3 IZRAČUN VREDNOSTI 2 ...................................................................................16

4 REZULTATI..........................................................................................................174.1 ELEKTROFOREZA NA AGAROZNEM GELU......................................................174.2 ELEKTROFOREZA NA POLIAKRILAMIDNEM GELU IN PRENOS NA MEMB. ...174.3 DOLOČANJE VELIKOSTI MIKROSATELITOV NA ABI PRISMTM 310 .................194.4 ANALIZA MIKROSATELITSKIH LOKUSOV.........................................................204.4.1 MIKROSATELITSKI LOKUS 10/9 ........................................................................204.4.2 MIKROSATELITSKI LOKUS 10/2 ........................................................................234.4.3 MIKROSATELITSKI LOKUS 5/65 ........................................................................25

5 RAZPRAVA IN SKLEPI .......................................................................................29

6 POVZETEK..........................................................................................................35

7 ZAHVALA ............................................................................................................36

8 LITERATURA.......................................................................................................37

Jug, T. Analiza treh mikrosatelitskih lokusov pri postrvi (Salmo trutta L.). VI Dipl. nal., Ljubljana, BF, Odd. za biologijo, 1998

KAZALO TABEL

Tabela 1 Taksonomska razvrstitev predstavnikov družine Salmonidae .....................4

Tabela 2 Vrsta in lokacija odvzetih vzorcev................................................................9

Tabela 3 Izbrani mikrosatelitski lokusi......................................................................12

Tabela 4 Porazdelitev alelov na mikrosatelitskem lokusu 10/9.................................20

Tabela 5 Opažene frekvence alelov na mikrosatelitskem lokusu 10/9 .....................21


Tabela 7 Porazdelitev genotipov na mikrosatelitskem lokusu 10/2 ..........................23



Tabela 10 Porazdelitev genotipov na mikrosatelitskem lokusu 5/65 ..........................26


KAZALO SLIK

Slika 1 Soška postrv ...............................................................................................5

Slika 2 Avtohtona potočna postrv donavskega tipa.................................................8

Slika 3 Potočna postrv atlantskega tipa ..................................................................8

Slika 4 Lokacije rek in potokov v Sloveniji, katerih populacije smo preučevali ......10

Slika 5 Ocenjevanje velikosti mikrosatelita 5/65 z gelsko elektroforezo ................17

Slika 6 Alelni polimorfizem na lokusu 10/9 ............................................................18

Slika 7 Alelni polimorfizem na lokusu 5/65............................................................18

Slika 8 Alelni polimorfizem na lokusu 10/2 ............................................................19

Graf 1 Alelni polimorfizem na lokusu 10/9 ............................................................21

Graf 2 Alelni polimorfizem na lokusu 10/2 ............................................................24

Graf 3 Alelni polimorfizem na lokusu 5/65............................................................27

Jug, T. Analiza treh mikrosatelitskih lokusov pri postrvi (Salmo trutta L.). VII Dipl. nal., Ljubljana, BF, Odd. za biologijo, 1998

OKRAJŠAVE

A adenin

ABI Perkin Elmer Applied Biosystems

ATP adenozin trifosfat

bp bazni par

C citozin

CTP citozin trifosfat

DIG digoksigenin

DNA dezoksiribonukleinska kislina

EDTA etilen diamin tetraacetat

G gvanin

GTP gvanin trifosfat

MS mikrosatelit

mtDNA mitohondrijska DNA

PIC polymorphism information content

PCR polymerase chain reaction

RD ribiško društvo

RFLP restriction fragment length polymorphism

T timin

TTP timin trifosfat

TBE Tris-borat-EDTA pufer

Tris tris (hidroksimetil) aminometan (= 2-amino-2-(hidroksimetil)-1,3-propandiol)

Z-DNA levosučna DNA

Jug, T. Analiza treh mikrosatelitskih lokusov pri postrvi (Salmo trutta L.). 1 Dipl. nal., Ljubljana, BF, Odd. za biologijo, 1998

1 UVOD

V Sloveniji živita dve avtohtoni vrsti postrvi, soška in potočna. Soška postrv (Salmo

marmoratus Cuvier 1817) živi v Soči in njenih pritokih in je endemit, saj živi le v severnem

delu jadranskega porečja. Potočna postrv (Salmo trutta f. fario Linnaeus 1758) je v

Sloveniji zastopana z donavsko obliko te vrste in jo najdemo v številnih rekah in potokih.

Zaradi vse večjega onesnaževanja, regulacije potokov in izlavljanja se zmanjšuje število

biotopov primernih za drstenje, in s tem upada število postrvi v naših vodah. Da bi

povečali število postrvi, so začeli ribiči vlagati v potoke neavtohtone tipe postrvi. V

donavsko porečje so začeli vlagati atlantski tip potočne postrvi. Posledic vnosa druge

vrste oziroma tipa postrvi se niso zavedali.

Največja škoda je bila narejena v Soči in njenih pritokih, kjer je prišlo do križanja med

soško in vnešeno potočno postrvjo. Zaradi prizadevanj, da bi to endemično vrsto ohranili,

poteka v zadnjem času vse več repopulacij. Vendar ni zanesljivih morfoloških znakov, ki

bi omogočali razlikovanje med soško postrvjo in njenimi križanci s potočno postrvjo.

Za potočno postrv donavskega tipa ribiči niso v hudih skrbeh, saj ta živi v vsem

donavskem porečju. Vendar pa moramo ohraniti tudi avtohtone vrste, ki niso tako

znamenite, kot je soška postrv.

Za razlikovanje posameznih vrst in tipov postrvi potrebujemo zanesljive genetske

markerje, ki bi nam omogočili natančno, hitro in poceni določanje. Pomembno je, da pri

vzorčenju rib ne žrtvujemo in jih tudi čim manj poškodujemo.

Do sedaj najbolj uveljavljen način genotipizacije temelji na analizi aloencimov.

Pomanjklivost metode je, da je treba živali žrtvovati, preučujemo pa lahko le gene, ki

kodirajo topne proteine. S preučevanjem proteinov se nam lahko tudi marsikatera

mutacija izmakne, saj vse ne povzročajo sprememb aminokislinskega zaporedja. Novejša

in zanesljivejša metoda temelji na preučevanju mitohondrijske DNA. Za takšno

preučevanje zadostuje že majhna količina krvi, ki jo lahko brez posledic živali

odvzamemo. S to metodo lahko ločujemo potočno postrv na več tipov. Njena slabost je v

tem, da podedujejo potomci mitohondrijsko DNA le od matere in tako lahko zasledujemo

le maternalno filogenijo. Najnovejša in najmanj raziskana metoda temelji na preučevanju

mikrosatelitske DNA, ki slovi po veliki variabilnosti.

Naš namen je bil odkriti mikrosatelitske lokuse, ki bi omogočali razločevanje med soško

postrvjo in potočno postrvjo donavskega in atlantskega tipa. Upali smo, da bomo lahko na

njihovi osnovi zanesljivo ločili vrsti in tipa postrvi med seboj.


2 PREGLED OBJAV

2.1 MIKROSATELITI

Mikrosateliti ali preproste tandemske ponovitve so odseki DNA, sestavljeni iz kratkih,

ponavljajočih se nukleotidnih motivov. Prisotni so v vseh evkariontskih genomih in delno

tudi v prokariontskih (37). Ponavljajoče enote so dolge od 1 do 6 nukleotidov in jih

sestavljajo skoraj vse permutacije nukleotidov, na enem lokusu pa se ponovijo od 5 do

100-krat. So več ali manj naključno raztreseni po genomu in jih najdemo vsaj na vsakih

10 000 baznih parov (38). Dinukleotidni mikrosateliti so najpogostejši, tri- ali tetra-

nukleotidni mikrosateliti so redkejši, a še vedno dovolj pogosti.

Mikrosateliti so le del vseh ponavljajočih se zaporedij DNA. Poleg njih poznamo še

satelite in minisatelite. Sateliti so sestavljeni iz enot velikih od 2 do nekaj tisoč baznih

parov, ki imajo od 103 do 107 ponovitev na lokus. Najdemo jih v heterokromatinu, največ 2

na kromosom. Odkrili so jih pri ultracentrifugiranju v bujonskem gostotnem gradientu

genomske DNA. Pri takem centrifugiranju tvori genomska DNA frakcijo, ki je odvisna od

vsebnosti gvanina in citozina v DNA. Prokariontska genomska DNA tvori eno samo

frakcijo, evkariontska DNA pa tvori zelo širok pas ali celo več pasov. Stranske

sedimentne pasove so poimenovali satelitski pasovi, njim pripadajočo DNA pa satelitska

DNA. Genomska DNA satelitskih pasov vsebuje veliko kratkih nukleotidnih ponovitev z

nizko kompleksnostjo. Njihova povprečna vsebnost gvanina in citozina se zato razlikuje

od povprečne vsebnosti v preostali DNA. Vsa ponavljajoča se zaporedja ne kažejo

posebnih sedimentnih pasov, ker imajo enako vrednost gvanina in citozina kot preostali

del genoma. Takšna zaporedja so poimenovali skriti sateliti (38).

Pri minisatelitih je število ponavljajočih enot bolj omejeno in so bolj razkropljeni po

genomu. Najpogosteje se zbirajo okrog telomernih regij. Ponavljajoče enote so dolge od

9 do 100 baznih parov in se ponovijo od 2 do nekaj stokrat na lokus. Na kromosomu se

jih nahaja tudi po več tisoč (38).

Vloga mikrosatelitov ni znana. Ko so odkrili GATA in GACA ponovitve so predvidevali, da

imajo mikrosateliti vlogo pri določitvi spola pri kačah. Ob odkritju GC ponovitev pa so

sklepali na vpliv mikrosatelitov na nastanek Z-DNA in s tem na ekspresijo genov. Nobena

od predpostavk kasneje ni bila potrjena, zato ostaja vloga mikrosatelitov nejasna (38).

Predvidevajo, da mikrosateliti nastanejo zaradi zdrsa DNA-polimeraze ob enojni DNA

vijačnici pri pomnoževanju DNA. In vitro so sintetizirali vse vrste di- in tri-nukleotidnih

ponovitev z uporabo kratkih začetnih oligonukleotidov, DNA nukleotidov in DNA


polimeraze. Hitrost sinteze je bila odvisna od hitrosti zdrsa in hitrosti ponovne

vzpostavitve kompleksa med DNA polimerazo in matrico. Fragmenti rastejo s konstantno

hitrostjo, tisti s trinukleotidno ponovitvijo rastejo počasneje od tistih z dinukleotidno

ponovitvijo. Odmik DNA polimeraznega kompleksa od enojne DNA vijačnice povzroči

nastanek zanke, ki jo popravljalni mehanizmi popravijo tako, da zanko odrežejo ali na

komplementarni verigi vgradijo manjkajoče nukleotide. Pri vgraditvi manjkajočih

nukleotidov pride do podaljšanja fragmenta (38).

Zaradi napak pri podvajanju so mikrosateliti pri različnih organizmih različno dolgi.

Mutacije so dovolj pogoste za vzdrževanje visoke stopnje polimorfizma med populacijami,

ne pa tako pogoste, da bi se dogajale v zaporednih generacijah. Dolžinski polimorfizem je

glavna in najuporabnejša lastnost mikrosatelitov, saj jo lahko uporabljamo za preučevanje

povezanosti med organizmi znotraj in med populacijami. Dolžinske polimorfizme

mikrosatelitov (SSLP = simple sequence length polymorphism) pogosto uporabljajo za

preučevanje populacij, študij vezave genov in genomsko kartiranje. (37). Različno število

ponovitev povzroča polimorfnost mikrosatelitskih lokusov.

Preučevanje populacij na osnovi mikrosatelitov je enostavno, saj so zanj potrebne zelo

majhne količine materiala, ker lahko potrebno DNA namnožimo z verižno reakcijo s

polimerazo. Zato preučevanih živali ni potrebno žrtvovati, preučujemo pa lahko tudi

ostanke živali, iztrebke in drug material, ki vsebuje delno degradirano DNA (28).

Željen mikrosatelit pomnožimo z verižno reakcijo s polimerazo (PCR) tako, da izberemo

začetne oligonukleotide, ki prilegajo robnim nukleotidnim zaporedjem mikrosatelita. DNA

polimeraza pomnoži mikrosatelit med obema začetnima oligonukleotidoma. Dobljen

produkt analiziramo z gelsko elektroforezo. Težava, ki se pogosto pojavlja, je nastanek

dodatnih fragmentov poleg glavnega fragmenta. To se najpogosteje zgodi pri

dinukleotidnih mikrosatelitih, kjer nastanejo dodatni fragmenti, ki so za po dva bazna para

krajši od glavnega fragmenta. Dodatni fragmenti povzročajo težave zlasti pri določanju

alelov, ki se razlikujejo za dva bazna para. Vzrok nastanka dodatnih fragmentov še ni

povsem znan. Predvidevajo, da pride med pomnoževanjem z verižno reakcijo s

polimerazo do odmika DNA polimeraznega kompleksa od matrice in zato do tvorbe zank

na njej. Zato je na novo nastala veriga krajša od osnovne (24).

Mikrosateliti so dober genetski marker, saj kažejo najhitrejši evolucijski razvoj. Njihova

stopnja mutacij niha med 2,5×10-5 do 10-2 mutacij na generacijo na lokus. Ker so

mikrosateliti zelo polimorfni, so uporabnejši od aloencimov (1). Pri aloencimih zaradi

degeneriranega genetskega koda določene bazne substitucije znotraj kodona ne

povzročajo spremembe amino kislin, zato nekaterih mutacij ne moremo zaznati. Pri


mikrosatelitih pa lahko zaznamo vsako spremembo v dolžini. Mikrosateliti načeloma niso

podvrženi selekcijskemu pritisku, zato se njihove spremembe ohranjajo. Take markerje

imenujemo nevtralni genetski markerji. Mikrosateliti so primernejši za ugotavljanje

povezanosti med populacijami in sorodnimi vrstami, za preučevanje bolj oddaljenih

taksonov pa je njihova uporabnost manjša. Pri določeni oddaljenosti med taksoni so

razlike v dolžini mikrosatelitov manj informativne, ker so spremembe v številu ponovitev v

takih primerih pogosto blizu zgornje meje še možnega števila ponovitev (15).

2.2 SPLOŠNO O SALMONIDIH

Družina Salmonidae zavzema le 5 rodov s 24 vrstami. Za vse predstavnike te družine je

značilna tolščenka ali tolsta plavut, ki leži med hrbtno in repno plavutjo. Med predstavniki

te družine so zastopani v naših vodah rodovi Salmo, Hucho, Onchorhynchus in

Salvelinus. Salmo in Hucho sta avtohtona rodova, Onchorhynchus in Salvelinus pa sta

bila v naše kraje prinešena.

Tabela 1: Taksonomska razvrstitev predstavnikov družine Salmonidae

družina: Salmonidae (salmonidi)

rod: Salmo

vrsta: Salmo salar (atlantski losos)

vrsta: Salmo trutta (postrv)

forma: trutta (morska postrv)

forma: fario (potočna postrv)

forma: lacustris (jezerska postrv)

forma: letnica (ohridska postrv)

vrsta: Salmo marmoratus (soška postrv)

rod: Hucho (sulci)

rod: Salmothymus (mehkouste postrvi)

rod: Onchorhynchus (pacifiški lososi)

rod: Salvelinus (zlatovčice)

rod: Coregonus (ozimice)

Za vse vrste je značilno, da imajo telo pokrito z drobnimi luskami, da imajo velik gobec in

močne zobe. Pri odraslih samcih je spodnja čeljust kavljasto zakrivljena čez zgornjo.


Ribe te družine so izredno spremenljive tako po videzu kot po načinu vedenja in

razmnoževanja. Nekatere vrste so sposobne medsebojnega križanja in tako se

spremenljivost še povečuje. Na obarvanost telesa pa zelo vpliva tudi okolje.

Družina postrvi naseljuje avtohtono vse vodotoke severne zemeljske poloble do

povratnikov (26).

2.2.1 SOŠKA POSTRV

Salmo marmoratus Cuvier 1817

Soške postrvi so precej večje in težje od drugih vrst postrvi pri nas, zrastejo do enega

metra. Obarvanost telesa je zelo značilna. Osnovna barva je olivno zelenkasta, po vrhu

glave in telesa so črnikaste večje ali manjše pege, ki na obeh straneh navzdol prehajajo v

vijugaste proge. Črne pege so tudi po hrbtni plavuti. Pege in proge jim dajejo značilen

marmoriran videz. Imajo zelo velike glave, ki zajemajo do 1/4 dolžine telesa. Oči imajo

majhne, hrbtna in podrepna plavut sta kratki (26).

Odrasle živali so ribojede, mladice pa se hranijo s talno favno. Prehranjujejo se tudi z

vodnimi žuželkami.

Živi samo v vodah jadranskega porečja, najštevilnejša je v Soči in v njenih pritokih ter v

severnoitalijanskih rekah, ki se izlivajo v Jadransko morje. Našli so jo tudi v Avstriji in

Albaniji. Naseljuje le srednje in spodnje dele rečnih strug, v manjših potokih pa se ne

zadržuje.

Soška postrv je ena najbolj ogroženih vrst pri nas. Najbolj jo ogroža potočna postrv, s

katero se uspešno križa in ima plodne potomce (26).

Nekateri avtorji jo uvrščajo v sistem kot vrsto Salmo marmoratus, drugi pa kot podvrsto

potočne postrvi Salmo trutta f. marmoratus (33). V prid samostojni vrsti govori njena

razločna fenotipska drugačnost. Vendar pa analize mitohondrijske DNA te izrazite razlike

niso potrdile. Pokazale so, da se je soška postrv odcepila od skupnega prednika

istočasno kot vse ostale skupine potočne postrvi (13)(14).

Slika 1: Soška postrv (foto: dr. Aleš Snoj)


2.2.2 POTOČNA POSTRV

Salmo trutta f. fario Linnaeus 1758

Potočne postrvi so precej manjše od soških, saj zrastejo le do 50 cm. Imajo zelenkast do

rjavkast hrbet, včasih skoraj črn. Boki so svetlejši, rumeni do zlato rumeni, trebuh je

belkast. Po hrbtu imajo črne pike, obrobljene s svetlim robom, po bokih pa so pike rdeče

in obrobljene belo ali svetlo modro. Mlade postrvi imajo 6-9 prečnih temnejših prog po

bokih.

Odrasle ribe se hranijo pretežno z vodnimi nevretenčarji in žuželkami, ki letajo nad vodo.

Delno se prehranjujejo tudi z ribami. Naseljujejo celoten rečni tok, od hitro tekočih gorskih

potokov do širokih nižinskih rek (26).

Poleg potočne postrvi (S. trutta f. fario) poznamo še morsko anadromno postrv (S. trutta f.

trutta), ki živi v morju in se drsti v sladki vodi in jezersko postrv (S. trutta f. lacustris), ki živi

v jezerih. Te tri skupine so osnovne ekološke oblike potočne postrvi in niso v tesni

povezavi s filogenetsko razporeditvijo (6). Z elektroforetskim preučevanjem aloencimov so

ugotovili, da obstajajo večje genetske razlike med postrvmi iste ekološke skupine, ki se

drstijo na različnih lokacijah, kot med postrvmi različnih ekoloških skupin, ki se drstijo na

isti lokaciji (17).

Naravno okolje potočne postrvi se razširja od severne Norveške in vzhodne Rusije do

Atlasa v severni Afriki. Potočna postrv kaže veliko fenotipsko raznolikost in pomembne

razlike v načinu življenja znotraj geografskih regij. To vnaša zmedo v taksonomijo, saj so

potočno postrv uvrstili že v več kot 50 različnih vrst. Do boljšega razumevanja genetskih

razlik je prišlo v zadnjih dveh desetletjih, ko so začeli uporabljati elektroforetsko analizo

aloencimov. Da bi opredelili filogenetsko povezavo med morfološko in geografsko

oddaljenimi populacijami potočnih postrvi, so v zadnjem desetletju začeli preučevati

mitohondrijsko DNA (mtDNA). Določili so razlike nukleotidnih zaporedij v odseku

mitohondrijske kontrolne regije, ki je zelo variabilna. Razlike med mtDNA so ugotavljali s

tehniko RFLP (RFLP = restriction fragment length polymorphism). Pri tej tehniki cepijo

mtDNA z restrikcijskimi encimi. To so endonukleaze, ki cepijo DNA na točno določenih

mestih. Po cepitvi dobimo različno dolge fragmente DNA, katerih velikost lahko ugotovimo

z elektroforezo. S primerjanjem tako dobljenih fragmentov so potočne postrvi razdelili v

filogenetske skupine s pripadajočimi lokacijami (6):

sredozemska skupina: sredozemsko porečje Francije, del Korzike

jadranska skupina: jadranski bazen, Korzika

donavska skupina: donavsko porečje, del jadranskega porečja v BiH, črnomorski in

kaspijski bazen


atlantska skupina: atlantski bazen, donavsko porečje, sredozemsko porečje

Nekateri avtorji opisujejo še peto skupino potočne postrvi, v katero uvrščajo soško postrv

(Salmo marmoratus), ki jo opisujejo le kot drugačno obliko potočne postrvi, torej za Salmo

trutta f. marmoratus.

Na osnovi molekularne ure sklepajo, da so se skupine ločile pred najmanj 450.000 -

700.000 leti. Izolacija vseh skupin se je zgodila ob približno enakem času, kar se ujema z

razcepom v ločena porečja in kasnejšim omejenim mešanjem (6)(4).

Potočna postrv predstavlja eno najbolj genetsko strukturiranih ribjih vrst. Med

filogenetskimi skupinami dobljenimi na osnovi mtDNA in morfološkimi oblikami niso našli

povezave. Tudi populacije znotraj posameznih skupin so genetsko zelo pestre. Le

potočne postrvi atlantske skupine ne kažejo velike genetske raznolikosti, kar je verjetno

rezultat geoloških sprememb v času zadnje poledenitve. Takrat je bila večina severne

Evrope prekrita z ledeniki in današnja populacija se je razvila iz redkih preživelih

posameznikov (3).

Zanimiv je podatek o nahajanju atlantske skupine potočne postrvi v donavskem porečju.

Našli so jo tudi v rekah, kjer ni bilo umetnega vnosa rib, tako da so antropogeni dejavnik

lahko izključili. Vse kaže na to, da je do mešanja prišlo ob zadnji poledenitvi (6). Atlantska

skupina potočnih postrvi pa se nahaja tudi v mnogih drugih rekah, ki niso v atlantskem

bazenu. Za ta pojav je v celoti krivo človeško vmešavanje v okolje. Zaradi uničenja

naravnih habitatov se je razmnoževanje avtohtonih populacij zelo zmanjšalo. Da bi

popravil narejeno škodo, je človek vnesel v reke v ribogojnicah vzrejene potočne postrvi.

Na žalost pa v ribogojnicah gojene potočne postrvi izvirajo iz atlantske skupine. Med

vnešeno skupino in avtohtonimi potočnimi postrvmi je prišlo do križanja in veliko

avtohtonih populacij je izgubljenih ali ogroženih (20).


Slika 2: Avtohtona potočna postrv donavskega tipa; pike po hrbtu so črne, po boku pa

rdeče (foto: dr. Aleš Snoj)

Slika 3: Potočna postrv atlantskega tipa iz ribogojnice Povodje; po vsem telesu so samo

črne pike (foto: Andreja Ramšak)


3 MATERIAL IN METODE DELA

3.1 VZORCI

Vzorce smo zbirali od leta 1994 do 1997.

Tabela 2: Vrsta in lokacija odvzetih vzorcev

VRSTA LOKACIJA ŠTEVILO DONAVSKI TIP ATLANTSKI TIPSalmo trutta fario Iška 6 × ×

Mahnečica 10 ×Cerkniščica 1 × ×Temenica 1 × ×Stiški potok 1 × ×Krka 1 × ×Sovpat 17 ×Ribnica 21 ×Kozji jarek 7 ×Humski potok 2 ×Obrh 4 × ×vsota 71

Salmo trutta fario Povodje 14 ×Mount Lassen 3 ×

Salmo trutta trutta 4 ×vsota 21

Salmo marmoratus Trebuščica 16Zadlaščica 41Predelica 22vsota 79

križanci Kanomljica 1Tolminka 11Soča pri Bovcu 10vsota 22skupna vsota 193

V raziskavo je bilo vključeno 193 rib. Od tega je bilo 88 potočnih postrvi (Salmo trutta f.

fario), 4 morske postrvi (Salmo trutta f. trutta), 79 soških postrvi (Salmo marmoratus) in

22 križancev med soško in potočno postrvjo.

Primerki soške postrvi so iz treh različnih potokov: 16 iz Trebuščice, 41 iz Zadlaščice in

22 iz Predelice. Vsi spadajo v porečje Soče. Zadlaščica se izliva v Tolminko, Predelica v

Koritnico, Trebuščica pa v Idrijco. Trebuščica spada pod idrijsko porečje in soške postrvi v

njej se morfološko ločijo od soških postrvi iz drugih dveh potokov. Po uradnih zapisih v te

tri potoke potočna postrv ni bila vnešena, naravne prepreke pa onemogočajo migracijo rib

proti toku, zato predvidevamo, da se tu nahajajo populacije čiste soške postrvi.


Slika 4: Lokacije rek in potokov v Sloveniji, katerih populacije smo preučevali

Primerki potočne postrvi so iz trinajstih različnih potokov: šest iz Iške, 10 iz Mahnečice,

ena iz Cerkniščice, ena iz Temenice, ena iz Stiškega potoka, ena iz Krke, 17 iz Sovpata,

21 iz Ribnice, sedem iz Kozjega jarka, dve iz Humskega potoka in štiri iz Obrha. Vsi ti

potoki spadajo v donavsko porečje, v nekatere pa so vnašali tudi ribe iz ribogojnic, ki so

domnevno atlantskega porekla. Zato smo v nekaterih potokih poleg donavskega

pričakovali tudi atlantski tip potočne postrvi.

Iško poribljajo s potočno postrvjo iz ribogojnice Povodje, zato predvidevamo, da se tu

nahajata oba tipa potočne postrvi. Mahnečica, Cerkniščica in Obrh predstavljajo del

kraškega rečnega sistema. Mahnečica se izliva v Cerkniščico, Cerkniščica in Obrh pa se

združita na Cerkniškem polju. V Cerkniščico redno vlagajo ribogojniško potočno postrv,

zato se tu verjetno nahajata oba tipa potočne postrvi. Mahnečica ni poribljena, od

Cerkniščice pa je ločena z visokim slapom, tako da je preprečena migracija rib proti toku;

tu se nahaja le donavski tip potočne postrvi. Temenica in Stiški potok sta pritoka Krke. V

Krko vlagajo ribogojniške potočne postrvi, ki lahko migrirajo v Temenico in Stiški potok,

zato predvidevamo, da se tu nahajata oba tipa potočne postrvi. Sovpat se izliva v

Poljanščico; to je izoliran potok v katerega niso vlagali ribogojniških postrvi, zato naj bi se

tu nahajale le potočne postrvi donavskega tipa. Tudi v Ribnici naj bi živele le potočne


postrvi donavskega tipa, saj vanjo niso vlagali drugih postrvi. Humski potok se izliva v

Sočo, vendar je od nje izoliran. Zanj je zanimivo to, da so v njem našli samo fenotipsko

čisto potočno postrv brez križancev. Kozji jarek se nahaja blizu Broda na Kolpi. V Kolpo

se izliva posredno, ker pred izlivom ponikne v tla. Izliv se verjetno zgodi nekje na dnu

Kolpine struge. Predvidevamo, da se kljub temu, da v Kolpo vlagajo ribogojniško potočno

postrv, v Kozjem jarku nahajajo le potočne postrvi donavskega tipa. Podzemni tunel

predstavlja prepreko za migracijo postrvi. Ne vemo kdaj je do vdora prišlo in ali je poteklo

že dovolj časa za fiksacijo določenih alelov, zaradi efekta majhne populacije.

Primerki potočne postrvi prihajajo tudi iz dveh ribogojnic: 14 iz ribogojnice Povodje in 3 iz

ribogojnice Mount Lassen Fish Farm iz Kalifornije. Po poreklu so vse ribogojniške postrvi

atlantskega tipa.

Primerki križancev med potočno in soško postrvjo so bili ujeti v soškem porečju: 1 iz

Kanomljice, 11 iz Tolminke in 10 iz Soče pri Bovcu. V te vode so poleg avtohtone soške

postrvi vlagali še ribogojniško potočno postrv.

V raziskavo smo vključili tudi 4 primerke morske postrvi. Ujeli so jih na hrvaški strani

Piranskega zaliva blizu Crvenega Vrha.

3.2 IZOLACIJA GENOMSKE DNA

Genomsko DNA smo izolirali iz svežega ali zmrznjenega krvnega sedimenta. Kri smo

jemali iz lateralne vene anesteziranih rib. Uporabljali smo dvo- ali trimililiterske vakuumske

zbiralce z EDTA in igle velike 0,5×17 mm ali 0,7×40 mm. Odvzeli smo različno velike

volumne krvi (50 l - 2 ml) in jo hranili na ledu. Najkasneje v dvanajstih urah smo kri

centrifugirali pri 1300 g 30 minut pri 4°C. Dobljen sediment smo takoj uporabili za izolacijo

DNA ali pa ga shranili pri -25°C.

Ribe in drugi vretenčarji razen sesalcev imajo eritrocite z jedri. Ribe vsebujejo 500.000 do

2.600.000 eritrocitov na mm3. Za potočno postrv je znano, da vsebuje 5,6 pg DNA na

jedro. Zato smo lahko iz zelo majhnega vzorca krvi izolirali precej veliko količino DNA, rib

pa pri tem ni bilo potrebno žrtvovati. Uporabili smo protokol po Medranu in sodelavcih

(1990).

Od 5 do 20 l krvnega sedimenta smo raztopili v 3 ml liznega pufra (10 mM Tris, 400 mM

NaCl, 2 mM EDTA, pH 8.2). Za razgradnjo membran in proteinov smo dodali 0,2 ml 10%

SDS in 0,5% proteinaze K. Suspenzijo smo inkubirali 2 uri pri 50°C in občasno premešali.

Razgrajene proteine smo precipitirali z dodatkom 1 ml 6M NaCl. Suspenzijo smo stresali

15 sekund in centrifugirali 15 minut pri 1300 g. Supernatant, ki je vseboval DNA, smo


odlili v novo centrifugirko in celoten postopek še dvakrat ponovili. Supernatant, ki ni več

vseboval proteinov smo prelili v novo centrifugirko in precipitirali DNA z dodatkom

dvojnega volumna na sobno temperaturo segretega 96% etanola. Oborino smo dvakrat

oprali v 70% etanolu in jo posušili. Dobljeno DNA smo raztopili v ustreznem volumnu

dvakrat destilirane vode.

3.3 IZBIRA MIKROSATELITOV IN ZAČETNIH OLIGONUKLEOTIDOV

Mikrosatelite in njim pripadajoče začetne oligonukleotide, ki so značilni za postrvi, smo

izbirali iz biblioteke enostavnih dinukleotidnih ponovitev v genomu Salmo trutta. Pri izbiri

začetnih oligonukleotidov smo bili predvsem pozorni na naslednje parametre:

dolžina naj bi se gibala med 18 in 28 nukleotidi

temperatura prileganja naj bi bila med 57 in 63°C

odstotek GC naj bi znašal med 20 in 80%, optimalno med 50 in 60%

vse baze morajo biti znane

začetni oligonukleotid ne sme tvoriti sekundarnih struktur

G, A, T in C morajo biti slučajno porazdeljeni; nukleotidi se ne smejo ponavljati v

pravilnem zaporedju

avtokomplementarnost mora biti manjša od 12 baz

Izbrali smo tri mikrosatelitske lokuse: 10/9, 10/2 in 5/65.

Tabela 3: Izbrani mikrosatelitski lokusi: ime, dolžina mikrosatelita skupaj z robnimi

nukleotidnimi zaporedji na katere prilegata oligonukleotidna začetnika, zaporedje

nukleotidov, ki predstavljajo mikrosatelit, pripadajoča oligonukleotidna začetnika

IME MS + zač. olig.

PONAVLJAJOČI SE MOTIV

ZAČETNI OLIGONUKLEOTID

10/9 202 bp (TG)13(AG)4(TG)2 -CA(TG)2CGAC(TG)12

5’ TTTGGAATGATATGGATATGG 3’5’ CTTACAGCCACCTTTATGCG 3’

10/2 122 bp (GT)14 5’ ATGTTTTTGACTGCACTATGTATT 3’5’ GGAGATAAGAGTCAACGAGGC 3’

5/65 149 bp (TG)21 5’ GTTTGAATGAGCCATCTGC 3’5’ GTGAATGTGTAAAAATACAAAAACGG 3’


3.4 VERIŽNA REAKCIJA S POLIMERAZO (PCR)

Verižno reakcijo sinteze DNA s pomočjo DNA polimeraze smo uporabili za pomnoževanje

odsekov DNA na katerih se nahajajo mikrosateliti. Uporabili smo tri pare začetnih

oligonukleotidov, s pomočjo katerih smo pomnožili tri izbrane mikrosatelite:

10/9: 5’ TTTGGAATGATATGGATATGG 3’

5’ CTTACAGCCACCTTTATGCG 3’

10/2: 5’ ATGTTTTTGACTGCACTATGTATTG 3’

5’ GGAGATAAGAGTCAACGAGGC 3’

5/65: 5’ GTTTGAATGAGCCATCTGC 3’

5’ GTGAATGTGTAAAAATACAAAAACGG 3’

Za izvedbo PCR smo potrebovali genomsko DNA znotraj katere se nahaja odsek, ki smo

ga želeli pomnožiti, posamezne deoksinukleotidtrifosfate, pare začetnih oligonukleotidov,

DNA polimerazo, ter soli in detergente točno določenih koncentracij. PCR je potekala v

treh stopnjah pri treh različnih temperaturah. V prvi stopnji je prišlo do denaturacije

dvoverižne molekule DNA, nato je sledilo prileganje začetnih oligonukleotidov s

komplementarno DNA verigo in nazadnje se je ob prisotnosti DNA polimeraze vršilo

podaljševanje oligonukleotidnih začetnikov in s tem sinteza komplementarne verige

odseka DNA, ki smo ga želeli pomnožiti. Ta tristopenjski ciklus smo ponovili 25 - 30 krat.

V verižni reakciji s polimerazo smo za vse tri mikrosatelite pripravili reakcijske mešanice s

končnim volumnom 10 l, ki so vsebovale komponente z naslednjimi koncentracijami:

začetnega oligonukleotida s koncentracijo 0,75 M

deoksinukleotidtrifosfate (dATP, dGTP, dCTP,dTTP) s koncentracijo 0,2 mM

10 mM Tris-HCl

50 mM KCl

1,5 mM MgCl2

0,5 enote Ampli Taq Gold DNA Polimeraze

10 ng genomske DNA

Uporabljali smo Ampli Taq Gold DNA Polymerazo, ki je kemično spremenjena oblika

Ampli Taq DNA Polymeraze. Taq DNA polimeraza je izolirana iz soja YT1 termofilne

bakterije Thermus aquaticus. Gold oblika pa je neaktivna inačica tega proteina, ki jo je

pred uporabo treba inkubirati na 95°C. To nam omogoča lažje delo z encimom, saj ga

lahko dodamo reakcijski mešanici pri sobni temperaturi brez bojazni, da bo začel encim

delovati. Za aktivacijo encima je potrebna 10 minutna predhodna inkubacija pri 95°C. V


tem času se aktivira 40% encima, preostali pa se aktivira v vsakem ciklusu med

denaturacijo. Med aktivacijo mora biti pH nižji od 7,0.

Potek PCR za mikrosatelita 10/9 in 10/2 je bil že znan, za mikrosatelit 5/65 pa je bilo

potrebno PCR pogoje še optimirati. Optimizacijo smo začeli s standardnimi PCR pogoji in

PCR produkt preverili na agaroznem gelu. Spreminjali smo temperaturo prileganja s 55

na 50 in 48°C. Ker je bil PCR produkt slabo viden, smo povečali koncentracijo MgCl2 za 2

do 3 krat in število ciklusov s 30 na 35. Povišali smo tudi koncentracijo začetnih

oligonukleotidov za polovico. Ugotovili smo, da je najprimernejša temperatura prileganja

48°C, pri povišani koncentraciji začetnih oligonukleotidov pa povišana koncentracija

MgCl2 bistveno ne vpliva na izboljšanje PCR produkta, zato smo ohranili osnovno najnižjo

koncentracijo MgCl2 (1,5 mM).

PCR je potekala v cikličnem termostatu PTC-100, MJ Research, Inc.

PCR za mikrosatelita 10/9 in 10/2 je potekala po naslednjem časovno-temperaturnem

profilu: 10 minutna aktivacija encima pri 95°C, nakar sledi 30 ciklov: 45 s pri 94°C in 25 s

pri 60°C. Stopnjo s temperaturo 72°C smo izpustili, ker polimerizacija DNA fragmentov

velikosti do 200 bp v celoti poteče pri prehodu od 60 k 94°C. PCR smo zaključili z

ohlajanjem na 14°C.

PCR za mikrosatelit 5/65 je potekala po naslednjem časovno-temperaturnem profilu: 10

min aktivacije pri 95°C, 35 ciklov: 45 s pri 94°C in 30 s pri 48°C.

3.5 ANALIZA MIKROSATELITSKE DNA

3.5.1 ELEKTROFOREZA NA AGAROZNEM GELU

Agarozno gelsko elektroforezo smo uporabljali za ločevanje fragmentov DNA in za

ocenjevanje velikosti PCR produktov. Velikost elektroforetskih frakcij smo ocenjevali

primerjalno z velikostnim standardom, ki pokriva področje od 100 do 2000 baznih parov

(100 bp DNA Ladder). Uporabljali smo dva različno velika kalupa za gel: 5,5×7,5 cm in

7,5×10,5 cm. Gel smo pripravili s segrevanjem agaroze (SeaKem LE agarose, FMC) v

1×TBE pufru (50 mM Tris, 50 mM borna kislina, 1 mM EDTA; pH 8,2).

Agarozni raztopini smo dodali etidijev bromid v koncentraciji 0,5 g/ml in vse skupaj prelili

v kalup in ohladili.

Vzorcem smo pred nanosom na gel dodali aplikacijski pufer, ki je vseboval 0,25%

bromfenol modrega, 0,25% ksilen cianola in 30% glicerola v vodi.


Elektroforeza je tekla v 1×TBE pri sobni temperaturi pod začetno napetostjo 90 V, potem

pa pri 120V. Tekla je približno pol ure. Elektroforetske frakcije smo pregledali pod

transluminatorjem pri valovni dolžini 302 nm.

3.5.2 POLIAKRILAMIDNA GELSKA ELEKTROFOREZA IN PRENOS NA MEMBRANO

Za analizo mikrosatelitske DNA smo uporabili gelsko elektroforezo in prenos na

membrano, ki sta potekala na aparatu »Direct-Blotting-Electrophoresis GATC 1500 DNA

Sequencer«. Po navodilih proizvajalca smo pripravili 4% poliakrilamidni gel. Namestili

smo ga vertikalno in dodali odzračen elektrodni pufer 1×TBE (50 mM Tris, 50 mM borna

kislina, 1 mM EDTA; pH 8,2).

Mikrosatelitsko DNA smo pomnožili s PCR, pri kateri smo uporabili z digoksigeninom

označen začetn oligonukleotid. PCR produktu smo dodali formamidni pufer, ki je vseboval

bromfenol modro in ksilen cianol. Vzorce smo pred nanosom na gel toplotno denaturirali

pri 85°C za 3 minute in jih takoj ohladili na ledu. Približno 2 l vzorca smo nanesli na

predhodno ogret gel. Začetni tek je trajal 10 minut pri 500 V, ločitveni pa 1 uro in 20 minut

pri 30 W (1500 V, 19 mA). Pod gel smo namestili 25 cm dolgo najlonsko membrano, ki

smo jo pognali ob izteku barvila bromfenol modro iz gela. Membrana se je premikala s

hitrostjo 19 cm na uro. Po končani elektroforezi smo membrano posušili.

Osušeno membrano smo 3 minute obsevali pod UV pri 302 nm in jo nato pobarvali.

Barvanje temelji na odkrivanju z digoksigeninom označenih nukleinskih kislin.

Digoksigenin je steroidni hapten, ki izzove imunski odgovor le, kadar je vezan na večjo

molekulo. Na digoksigenin vežemo protitelesa - anti-digoksigenin alkalno fosfatazo, ki

reagira s 5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfatom in nitromodro tetrazolno soljo. Ko encimska

reakcija poteče, dobimo modro-vijolični precipitat na mestu, kjer so vezani fragmenti DNA.

Za celoten postopek barvanja smo uporabili DIG Nucleic Acid Detection Kit (Boehringer

Mannheim), potekal pa je v valju hibridizacijske pečice pri 30°C.

3.5.3 ANALIZA MIKROSATELITSKIH LOKUSOV NA ABI PRISMTM 310

Za analizo mikrosatelita 10/2 smo uporabili aparat ABI PRISMTM 310 (Perkin Elmer). To je

naprava za avtomatsko sekvenciranje in analizo fragmentov nukleinskih kislin.

Vzorce smo pripravili s pomnoževanjem s PCR, kjer smo enega od začetnih

oligonukleotidov označili s fluorescentnim barvilom Hex. 1l PCR produkta smo dodali 12

l deioniziranega formamida in 0,5 l velikostnega standarda Tamra 350. DNA smo

denaturirali 2 minuti pri 95°C in takoj ohladili na ledu.


Denaturiran vzorec smo vstavili v napravo ABI PRISMTM 310. Elektroforetsko ločevanje

fragmentov je potekalo v 47 cm dolgi kapilari z gelom POP-4 (Performance Optimized

Polymers), ki je primeren za analizo mikrosatelitov. Ločevanje fragmentov je delovalo na

principu kapilarne elektroforeze, kjer so se fragmenti ločevali glede na velikost. Laser je

vzbudil emisijo fluorescentnega barvila, ki jo je zaznal detektor. Podatke smo

računalniško obdelali.

3.6 STATISTIČNA ANALIZA

3.6.1 IZRAČUN HETEROZIGOTNOSTI

Opažena ali neposredno izračunana heterozigotnost je delež osebkov z dvema različnima

aleloma. Izračunamo jo po formuli:

Hn

nhet

tot

kjer je nhet število heterozigotnih živali, ntot pa velikost vzorca.

Heterozigotnost smo računali samo za populacije, ki so vsebovale več kot 30 osebkov.

3.6.2 VREDNOST PIC (polymorphism information content)

Vrednost PIC izračunamo po formuli:

PIC p p pii

n

i jj i

n

i

n

1 22

1

2 2

11

1

kjer je pi frekvenca i-tega alela, n pa število osebkov v preučevani populaciji.

Za izračun vrednosti PIC smo uporabili program, ki ga je napisal ing. David Rozman.

3.6.3 IZRAČUN VREDNOSTI 2

Za dokazovanje statistično značilnih razlik med populacijami smo uporabili 2 test.

Primerjali smo opažano in pričakovano število posameznih alelov v populaciji. Na osnovi

rezultatov 2 testa smo presojali statistično značilnost razlik v frekvencah alelov med

populacijami.


4 REZULTATI

Alelni polimorfizem smo opazovali na agaroznem gelu, poliakrilamidnem gelu in s

pomočjo ABI PRISMTM 310.

4.1 ELEKTROFOREZA NA AGAROZNEM GELU

Z elektroforezo na agaroznem gelu smo preverili uspešnost PCR reakcije in približno

velikost mikrosatelitskih lokusov. Natančne dolžine posameznih fragmentov pa zaradi

premajhne ločljivosti nismo mogli določiti.

Slika 5: Ocenjevanje velikosti mikrosatelitskega lokusa 5/65 z gelsko elektroforezo.

Nanešeni vzorci so iz različnih potokov: 1 iz Ribnice, 2 iz Predelice, 3 iz Povodja, 4 iz

Temenice, 5 iz Stiškega potoka, 6 iz Krke, na mesto 7 je nanešen velikostni standard 100

bp. S pomočjo velikostnega standarda lahko določimo, da so fragmenti na gelu veliki

okrog 150 bp.

4.2 ELEKTROFOREZA NA POLIAKRILAMIDNEM GELU IN NANOS NA

MEMBRANO

Z napravo Direct-Blotting-Electrophoresis GATC 1500 DNA Sequencer smo lahko

natančno določili velikost mikrosatelitskih lokusov.


Slika 6: Alelni polimorfizem na lokusu 10/9. Vzorci so iz različnih potokov: 1-4 Obrh, 5-8

Soča pri Bovcu, 9-13 Sovpat, 14-18 Predelica, 19-20 Ribnica. Velikosti alelov v bp so

podane na robovih.

Slika 7: Alelni polimorfizem na lokusu 5/65. Vzorci so iz različnih potokov: 1-4 Obrh, 5-6

Predelica, 7 Povodje, 8-14 Trebuščica, 15 Mahnečica, 16 Sovpat, 17 Ribnica, 18 Kozji

jarek, 19 Povodje, 20 Tolminka. Velikosti alelov v bp so podane na robovih.


4.3 DOLOČANJE VELIKOSTI MIKROSATELITOV NA ABI PRISMTM 310

Z napravo ABI PRISMTM 310 smo avtomatsko določili velikost mikrosatelitskih lokusov.

Podatke smo računalniško obdelali.

A) Vzorec iz Kozjega jarka.

B) Vzorec iz Predelice.

Slika 8: Alelni polimorfizem na lokusu 10/2.


4.4 ANALIZA MIKROSATELITSKIH LOKUSOV

Alelni polimorfizem smo opazili pri vseh treh preučevanih mikrosatelitskih lokusih.

4.4.1 MIKROSATELITSKI LOKUS 10/9

Tabela 4: Porazdelitev alelov na mikrosatelitskem lokusu 10/9 glede na različne

populacije postrvi: T = Trebuščica, Z = Zadlaščica, P = Predelica, M = Mahnečica, Tem = Temenica, SP =

Stiški potok, Sov = Sovpat, Rib = Ribnica, KJ = Kozji jarek, HP = Humski potok, I = Iščica, Cer = Cerkniščica,

K =Krka, Ob = Obrh, Pov = ribogojnica Povodje, ML = ribogojnica Mount Lassen Fish Farm iz Kalifornije, Stt =

Salmo trutta f. trutta, morska postrv, Kan = Kanomljica, Tol = Tolminka, Soča = Soča pri Bovcu.

10/9 soška postrv potočna postrv morska križanci sk.donavski tip donavski in atlantski tip atlantski tip atlan. tip

aleli T Z P M Sov Rib KJ HP Tem SP I Cer K Ob Pov ML Stt Kan Tol Soča200 1 1202 6 15 28 3 7 59204 25 6 16 16 1 1 8 6 79206 11 1 3 1 16208 10 1 11210 2 2212 1 61 1 1 64214 2 5 1 3 1 12216 20 2 1 6 11 6 1 1 1 49218 5 5220 1 1 1 6 1 1 1 12222 1 1 1 3224 4 3 1 1 9226 1 1 2 4228 1 1230 4 1 1 1 1 8232 4 3 7234 9 3 1 13236 1 1 1 3238 1 1 1 1 4244 1 1 2250 2 2254 1 4 5260 1 1sk. 32 82 44 20 32 30 14 4 2 2 12 2 2 8 28 6 8 2 22 20 372H 0,25 0,46 0,55 0,53 0,60 0,53

H: heterozigotnost; izračunana je le za skupine z več kot 30 vzorci.


Tabela 5: Opažene frekvence alelov na mikrosatelitskem lokusu 10/9 glede na različne

populacije postrvi:T = Trebuščica, Z = Zadlaščica, P = Predelica, M = Mahnečica, Tem = Temenica, SP =




10/9 soška postrv potočna postrv morska križanci sk.donavski tip donavski in atlantski tip atlantski tip atl. tip

aleli T Z P M Sov Rib KJ HP Tem SP I Cer K Ob Pov ML Stt Kan Tol Soča200 0,13 0,003202 0,19 0,18 0,64 0,14 0,35 0,159204 0,78 0,07 0,36 0,5 0,25 0,5 0,36 0,3 0,212206 0,34 0,25 0,25 0,5 0,043208 0,33 0,05 0,030210 0,14 0,005212 0,03 0,74 0,5 0,05 0,172214 0,14 0,18 0,125 0,14 0,05 0,032216 1 0,5 0,5 0,5 0,39 1 0,125 0,05 0,05 0,132218 0,625 0,013220 0,5 0,08 0,13 0,21 0,5 0,05 0,05 0,032222 0,03 0,5 0,05 0,008224 0,5 0,11 0,05 0,05 0,024226 0,5 0,13 0,07 0,011228 0,13 0,003230 0,13 0,5 0,04 0,125 0,05 0,022232 0,13 0,21 0,019234 0,3 0,21 0,5 0,035236 0,03 0,03 0,08 0,008238 0,03 0,03 0,08 0,05 0,011244 0,05 0,05 0,005250 0,06 0,005254 0,03 0,29 0,013260 0,05 0,003PIC 0,3 0,4 0,4 0 0,6 0,7 0,8 0,6 0,4 0,4 0,6 0,4 0,4 0,7 0,7 0 0,524 0,4 0,8 0,7 0,86

PIC: polymorphic information content

Alelni polimorfizem na lokusu 10/9

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

velikost alelov

del

ež v

po

pu

laci

ji

soška postrv

donavski tip

atlantski tip

Graf 1: Alelni polimorfizem na lokusu 10/9.


Na mikrosatelitskem lokusu 10/9 smo našli 24 alelov in 65 različnih genotipov: 13

homozigotov in 52 heterozigotov. Zaradi prevelikega števila genotipov in zato velike

nepreglednosti smo v obdelavo podatkov vključili le frekvence alelov.

Lokus izraža visok polimorfizem, saj znaša njegova PIC vrednost 0,86, celokupna

heterozigotnost pa 0,53. Največja variabilnost na lokusu 10/9 je pri vzorcih iz Tolminke

(11 alelov, PIC = 0,80), sledijo jim vzorci iz Kozjega jarka (5 alelov, PIC = 0,75), Soče pri

Bovcu (9 alelov, PIC = 0,74), Ribnice (7 alelov, PIC = 0,72) in ribogojnice Povodje (6

alelov, PIC = 0,71). Pri populacijah iz Mahnečice in ribogojnice Mount Lassen so vsi aleli

enaki.

Alela 202 in 212 sta značilna za soško postrv in ju ne najdemo pri potočni in morski

postrvi. Nahajata pa se pri križancih med soško in potočno postrvjo. Tudi alel 204 se

nahaja v populaciji soške postrvi, vendar smo ga odkrili tudi pri populacijah iz Sovpata,

Humskega potoka in Cerkniščice. Seveda se je nahajal tudi pri križancih med soško in

potočno postrvjo. Populacije iz Trebuščice, Zadlaščice in Predelice se zaznavno

razlikujejo v pojavljanju teh treh alelov. V populaciji iz Trebuščice je najpogostejši alel

204, iz Zadlaščice 212 in iz Predelice 202.

Alel 218 je značilen za morsko postrv Salmo trutta f. trutta. Poleg tega alela smo pri

morski postrvi našli še alela 214, 216 in 230, ki se nahajajo tudi pri potočni postrvi.

Populacija iz Mahnečice in populacija iz ribogojnice Mount Lassen iz Kalifornije sta

popolnoma homozigotni, saj obe vsebujeta le alel 216. Ta podatek je zanimiv, ker

spadata populaciji v različna tipa potočne postrvi: populacija iz Mahnečice je donavskega

tipa, ribogojniške pa atlantskega tipa.

Alela 200 in 228 smo odkrili le pri populaciji iz Obrha.

Aleli 206, 208, 210, 220, 222, 224, 226, 232, 234, 236, 238, 250 in 254 se nahajajo pri

različnih populacijah potočnih postrvi.

Alela 244 in 260 smo odkrili le pri populacijah križancev, pri populacijah soške in potočne

postrvi pa ne.









aleli T Z P M Sov Rib KJ HP Tem SP I Cer K Ob Pov ML Stt Kan Tol Soča118 1 6 3 1 1 1 1 6 25 6 8 6 6 71122 8 34 30 8 9 1 2 2 3 97124 1 1126 16 26 43 12 1 1 1 3 1 2 13 14 133sk. 16 26 44 20 34 30 14 4 2 2 12 2 2 8 28 6 8 2 22 20 302H 0,05 0,00 0,00 0,21


Tabela 7: Porazdelitev genotipov na mikrosatelitskem lokusu 10/2 glede na različne






aleli T Z P M Sov

Rib KJ HP Tem SP I Cer K Ob Pov ML Stt Kan Tol Soča

118 0,02 0,43 0,75 0,5 0,5 0,5 0,5 0,75 0,89 1 1 0,27 0,3 0,235122 0,4 1 1 0,57 0,75 0,5 0,25 0,07 0,14 0,321124 0,5 0,003126 1 1 0,98 0,6 0,25 0,5 0,5 0,25 0,04 1 0,59 0,7 0,440PIC 0 0 0 0,4 0 0 0,4 0,3 0,4 0,4 0,3 0,4 0,4 0,3 0,2 0 0 0 0,5 0,3 0,575







10/2 soška postrv potočna postrv morska križancidonavski tip donavski in atlantski tip atlantski tip atlan. tip

genotipi T Z P M Sov Rib KJ HP Tem SP I Cer K Ob Pov ML Stt Kan Tol Soča118/118 2 1 2 11 3 4118/122 2 1 2 2 1118/124 1118/126 1 1 1 1 1 5 6122/122 2 17 15 3 4122/126 4 1 2126/126 8 13 21 4 1 1 3 4



0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

118 122 124 126

velikost alelov

del

ež v

po

pu

laci

ji

soška postrv

donavski tip

atlantski tip

Graf 2: Alelni polimorfizem na lokusu 10/2

Na mikrosatelitskem lokusu 10/2 smo našli 5 alelov in 7 genotipov: 3 homozigote in 4

heterozigote. Lokus 10/2 izraža veliko manjši polimorfizem kot lokus 10/9. PIC za ta lokus

znaša 0,57, celokupna heterozigotnost pa 0,21. Največjo variabilnost smo zaznali pri

vzorcu iz Tolminke (3 aleli, PIC = 0,49). Populacije iz Trebuščice, Zadlaščice, Sovpata,

Ribnice, ribogojnice Mount Lassen, Kanomljice in morja so na tem lokusu monomorfne.

V populaciji soške postrvi prevladuje alel 126, vendar ni značilen samo za soško postrv,

saj smo ga našli tudi pri populacijah potočne postrvi. V populaciji soške postrvi smo našli

tudi en alel 118.

Alel 118 se nahaja v populaciji potočne postrvi iz ribogojnice Mount Lassen iz Kalifornije

in pri morski postrvi v homozigotni obliki. Tudi v populaciji potočne postrvi iz ribogojnice

Povodje se ta alel nahaja v največjem številu. Ker so vse tri populacije atlantskega

porekla, bi lahko bil ta alel značilen za atlantski tip potočne postrvi. Vendar pa smo alel

118 našli tudi pri populacijah iz Kozjega jarka in Humskega potoka, kjer naj bi atlantski tip

potočne postrvi ne bil prisoten.

Alela 122 in 126 smo našli pri populacijah donavskega tipa potočne postrvi, pri

populacijah atlantskega tipa pa ne, razen dveh alelov pri populaciji iz ribogojnice Povodje.

Zato bi ta alel lahko bil značilen le za potočno postrv donavskega tipa.

Pri populaciji iz Krke smo našli še alel 124.

Pri križancih med soško in potočno postrvjo smo odkrili vse tri alele, značilne za obe

populaciji: 118, 122 in 126.

Pregled genotipov jasneje nakazuje razliko med donavskim in atlantskim tipom potočne

postrvi. Genotip 122/122 smo našli le v populacijah donavskega tipa v Mahnečici,

Sovpatu, Ribnici, Kozjem jarku in Iščici. V populacijah atlantskega tipa iz ribogojnic in


morja tega genotipa nismo zasledili. Genotip 118/118 je značilen za populacije

atlantskega tipa, vendar smo ga našli tudi v dveh populacijah donavskega tipa v Kozjem

jarku in Humskem potoku.

Genotip 126/126, ki je značilen za soško postrv, pa smo našli tudi v populacijah potočne

postrvi iz Mahnečice in Iške, tako da ni značilen izključno za soško postrv.

Heterozigotni genotipi so redko razsejani med populacijami potočne postrvi.

V hibridnih conah soške in potočne postrvi prevladujeta genotipa 126/126, ki je značilen

za soško postrv, in 118/126, kjer je prvi alel značilen za atlantski tip potočne postrvi, drugi

pa za soško postrv.








aleli T Z P M Sov Rib KJ HP Tem SP I Cer K Ob Pov ML Stt Kan Tol Soča149 20 34 33 13 2 1 3 4 1 3 2 116151 29 32 44 1 9 1 15 15 146153 1 1 2 1 1 1 1 5 1 14155 1 1159 1 1161 1 1163 1 2 2 1 6165 1 1 2167 1 2 3169 1 2 3171 1 2 14 3 3 1 1 25173 3 1 2 6175 2 1 3sk. 32 32 44 20 34 34 14 4 2 2 12 2 2 8 27 6 8 2 22 20 327H 0,19 0,00 0,00 0,00 0,06 0,28



Tabela 10: Porazdelitev genotipov na mikrosatelitskem lokusu 5/65 glede na različne






aleli T Z P M Sov Rib KJ HP Tem SP I Cer K Ob Pov ML Stt Kan Tol Soča149 1 1 0,971 0,929 0,167 0,5 0,375 0,148 0,125 0,136 0,1 0,355151 0,906 1 1 0,25 0,75 0,5 0,682 0,75 0,446153 0,029 0,071 0,5 0,5 0,5 0,083 0,5 0,185 0,045 0,043155 0,045 0,003159 0,25 0,003161 0,5 0,003163 0,5 0,333 0,25 0,045 0,018165 0,125 0,037 0,006167 0,037 0,1 0,009169 0,5 0,25 0,009171 0,5 0,25 0,519 0,5 0,375 0,045 0,05 0,076173 0,094 0,5 0,074 0,018175 0,25 0,167 0,009PIC 0,16 0 0 0 0 0,06 0,12 0,55 0,38 0,38 0,36 0,38 0,38 0,67 0,63 0,54 0,667 0,38 0,48 0,39 0,610







5/65 soška postrv potočna postrv morska križancidonavski tip donavski in atlantski tip atlantski tip atlan. tip

genotipi T Z P M Sov Rib KJ HP Tem SP I Cer K Ob Pov ML Stt Kan Tol Soča149/149 10 17 16 6 1 1149/151 2 3 2149/153 1 1 1149/163 1149/165 1149/171 2151/151 13 16 22 3 5 5151/153 1 1 1151/161 1151/167 2151/171 1 1151/173 3153/159 1153/163 1153/171 1 5155/163 1163/171 2 1165/167 1169/171 2169/173 1171/171 3171/173 1171/175 2 1173/175 1



0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0,80

0,90

1,00

149

151

153

155

159

161

163

165

167

169

171

173

175

velikost alelov

del

ež v

po

pu

laci

jisoška postrv

donavski tip

atlantski tip

Graf 3: Alelni polimorfizem na lokusu 5/65.

Na mikrosatelitskem lokusu 5/65 smo našli 13 različnih alelov in 24 genotipov: 3

homozigote in 21 heterozigotov. PIC na tem lokusu znaša 0,61, skupna heterozigotnost

pa 0,28. Največjo polimorfnost smo zaznali pri populacijah iz Obrha (4 aleli, PIC = 0,67),

iz morja (4 aleli, PIC = 0,67) in ribogojnice Povodje (6 alelov, PIC = 0,63).

Za soško postrv je značilen alel 151, ki smo ga v populacijah iz Zadlaščice in Predelice

našli v homozigotni obliki, v populaciji iz Trebuščice pa se je poleg tega nahajal še alel

173. Heterozigotno obliko 151/173 smo našli samo pri soški postrvi iz Trebuščice. Alel

151 smo v manjši meri odkrili tudi pri populaciji potočne postrvi iz Iške in Humskega

potoka.

Alel 149 smo odkrili predvsem v populacijah potočne postrvi donavskega tipa, v populaciji

atlantskega tipa pa smo odkrili 4 take alele v populaciji iz ribogojnice Povodje in enega pri

morski postrvi. Populaciji iz Mahnečice in Sovpata vsebujeta samo alel 149.

Alel 171 je najpogostejši v populacijah potočnih postrvi atlantskega tipa, vendar ni edini.

Aleli 153, 159, 163, 165, 167, 169, 173 in 175 so razmeroma redki v populacijah potočne

postrvi obeh tipov.

Alela 155 in 161 smo našli le pri križancih med soško in potočno postrvjo iz Kanomljice in

Tolminke.

Genotipa 151/151 in 151/173 sta značilna za soško postrv, vendar smo genotip 151/151

zasledili tudi pri potočni postrvi iz Iške in to kar pri polovici pregledanih postrvi. Genotip

151/173 smo našli samo pri soški postrvi iz Trebuščice.


Genotip 149/149 je značilen za donavski tip potočne postrvi, saj smo ga našli pri vseh

postrveh iz Mahnečice in Sovpata in pri veliki večini iz Ribnice in Kozjega jarka. Pri

populacijah atlantskega tipa ga nismo zasledili, našli smo ga le pri enem osebku iz

ribogojnice Povodje.

Pri populacijah križancev med soško in potočno postrvjo sta najpogostejša genotipa

151/151 in 149/151. Prvi je značilen za populacijo soške postrvi, drugi pa vsebuje alel iz

genotipa soških postrvi in alel iz genotipa značilnega za potočne postrvi.


5 RAZPRAVA IN SKLEPI

Naše predpostavke o tem, v katero skupino spadajo postrvi določene populacije, temeljijo

na morfoloških razlikah med populacijami in na raziskavah njihove mitohondrijske DNA.

Morfološke razlike so precej nezanesljive, saj poznamo veliko primerov iz preteklosti, ko

so zaradi podobnosti ali različnosti med populacijami le-te popolnoma napačno uvrstili.

Mitohondrijska DNA je precej zanesljiv genetski marker. Na njegovi osnovi lahko ločimo

soško postrv (genotip D), od atlantskega tipa (genotip C) in donavskega tipa (genotipa A

in B) potočne postrvi. Slabost mitohondrijske DNA je v tem, da se deduje samo po

maternalni strani in nam tako prikrije marsikatero križanje. Z uporabo mikrosatelitske DNA

kot genetskega markerja smo želeli vsaj nekoliko razjasniti dosedanje ugotovitve.

Na Zavodu za ribištvo v Ljubljani smo povprašali o vnosu atlantskega tipa potočne postrvi

v slovenske vode. Ikre tega tipa postrvi so leta 1988 kupili v Italiji. Že konec istega leta in

oktobra naslednjega leta so mladice prodali Ribiškemu društvu Tolmin, ki jih je leta 1990

prvič naselilo v Sočo in njene pritoke. To seveda ni bil prvi vnos potočne postrvi v Sočo,

saj vlagajo vanjo potočne postrvi donavskega tipa že od začetka tega stoletja.

V naši raziskavi smo primerke soških postrvi dobili iz Trebuščice, Zadlaščice in Predelice.

Na mikrosatelitskem lokusu 10/9 smo odkrili dva, samo za soško postrv značilna alela

(202 in 212). Tretji alel (204) značilen za soško postrv pa smo zasledili tudi pri populacijah

v drugih potokih. Vse soške postrvi vsebujejo tudi alel 151 na lokusu 5/65, vendar smo ta

alel zasledili tudi drugod. Za soške postrvi iz Trebuščice je znano, da se razlikujejo od

drugih soških postrvi po rdečih pikah na pobočnici, rdeči pegi na tolščenki in rdečem robu

na hrbtni in repni plavuti. Z analizami mitohondrijske DNA križanja niso potrdili. Analiza

mikrosatelitov je pokazala, da imajo postrvi iz Trebuščice enak genotip kot ostale soške

postrvi. Le na lokusu 5/65 smo odkrili kombinacijo alelov (151/173), ki je nismo odkrili pri

nobeni drugi pregledani populaciji. Pri lokusu 10/9 so pri vseh treh populacijah vidne

razlike v frekvenci alelov. Z izračunavanjem 2 smo dokazali, da lahko na lokusu 10/9

pokažemo značilne razlike med populacijami iz različnih potokov (2=114,3; P<0,001).

Zanimivo je, da smo alel 204, ki se najpogosteje nahaja pri populaciji iz Trebuščice

zasledili tudi pri potočni postrvi. Kar polovica pregledanih potočnih postrvi iz Sovpata

vsebuje ta alel. Ta podatek napeljuje na možnost, da je bilo v preteklosti Idrijsko porečje

povezano s Savskim. Razdalja med povirjem Poljanščice in Idrijce je krajša od dveh

kilometrov. Geologi ocenjujejo, da se to ozemlje premakne vsako leto za 1-4 mm. V

potresih so ti premiki še večji. Ker je višinska razlika med Idrijco in grebenom ob njej le


400 m, predvidevajo, da so se ti premiki zgodili v bližnji geološki preteklosti. Možno je, da

sta bili Poljanščica in Idrijca povezani, in tako je lahko prišlo do združitve obeh populacij.

Na ta način bi lahko soške postrvi dobile rdeč pigment. Genotipska razlika med njimi in

ostalimi soškimi postrvmi je tako majhna, da je na nivoju mitohondrijske DNA ne moremo

zaznati, zato se zdi smiselno, da jo uvrstimo med soške postrvi.

Za Humski potok, ki je pritok Soče, predvidevamo, da v njem ne živijo soške postrvi. Našli

smo le alele potočne postrvi, ki so pripadali atlantskemu in donavskemu tipu, njihove

frekvence pa zaradi premajhnega vzorca nismo mogli ugotoviti. Ker ni znano, da bi v ta

potok vlagali potočno postrv, migracija pa zaradi preprek ni mogoča, obstaja možnost, da

se v Soči in njenih pritokih nahaja avtohtona potočna postrv. Pri pregledu križancev smo

naleteli tudi na alele, značilne za donavski tip potočne postrvi. Za reko Pad so ugotovili,

da se v njej nahajata soška in potočna postrv kot avtohtoni in da med njima ne prihaja do

križanja, ker se drstita v različnih habitatih (13). Morda je bila pred vnosom atlantskega

tipa tudi v Soči situacija podobna. Možna je hipoteza, da so z vnosom novega tipa postrvi

v reko porušili naravno ravnovesje med vrstama in je tako prišlo do masovnega križanja.

Iz ribiško gojitvenih načrtov smo izvedeli, da so v Cerkniščico vlagali potočno postrv

atlantskega tipa v letih 1992, 1993, 1994 in 1995 (29). V njen pritok Mrzlek pa že leta

1991. Direktno v Obrh atlantskega tipa postrvi niso vlagali, obstaja pa možnost, da je

migriral iz Cerkniščice. V Lipsenjščici, ki je pritok Obrha, so leta 1985 gojili soške postrvi.

Vložili so 5 000 mladic z namenom, da bi preučevali možnosti umetne vzreje (25).

Naslednje leto so jih sicer izlovili, vendar obstaja verjetnost, da so med tem že migrirale v

Obrh. Tudi v Uncu se zaradi vnosa nahaja soška postrv.

V Cerkniščici smo našli donavski in atlantski tip potočne postrvi, kar dokazuje vlaganje

ribogojniške postrvi. V Mahnečici, ki se izliva v Cerkniščico pa smo našli populacijo s

povsem drugačnim genotipom. Na mikrosatelitskih lokusih 10/9 in 5/65 so bili vsi

pregledani osebki homozigotni. Ta potok je izoliran od ostalih in v njem prihaja do velikih

nihanj v vodostaju, zato so postrvi v njem pogosto izpostavljene efektu ozkega grla. Pri

primerku iz Cerkniščice smo na lokusu 10/9 res odkrili alel značilen za soško postrv,

vendar en sam primerek ne zadostuje za kakršnekoli zaključke.

Kot primer potočne postrvi atlantskega tipa smo preučevali postrvi iz slovenske

ribogojnice Povodje in iz kalifornijske ribogojnice Mount Lassen. Razlike med postrvmi iz

obeh ribogojnic so zelo očitne. Iz ribogojnice Mount Lassen smo imeli majhno število

vzorcev, vsi pa so bili homozigotni na dveh mikrosatelitskih lokusih (10/9 in 10/2). Iz tega

lahko sklepamo, da je frekvenca odkritih alelov v celotni populaciji zelo velika. V nasprotju

z njimi pa vsebujejo primerki iz Povodja zelo različne alele. V ribogojnici Povodje so pri


razplodu uporabljali večinoma samice atlantskega tipa in avtohtone samce donavskega

tipa. Zato je analiza mitohondrijske DNA pokazala atlantski tip postrvi kljub temu, da so

vsi osebki mešani. Z analizo mikrosatelitov smo v populaciji iz Povodja odkrili alele,

značilne za oba tipa potočne postrvi, vendar je bila frekvenca alelov, značilnih za atlantski

tip, višja.

Potočne postrvi atlantskega tipa rastejo veliko hitreje kot postrvi donavskega tipa, njihovo

vzrejanje pa je enostavnejše. Ribiške družine jih rade vnašajo v potoke, saj s tem

spodbujajo športni ribolov v svojih vodah.

V Kolpo so potočne postrvi iz ribogojnice Povodje prvič vložili leta 1996. V Kozji jarek jih

niso vlagali, vsaj podatki za zadnjih 25 let ne omenjajo nikakršnih posegov v ta potok.

Rezultati naše raziskave kažejo, da populacija v Kozjem jarku vsebuje alele značilne za

donavski in atlantski tip potočne postrvi. Ker se Kozji jarek ne izliva direktno v Kolpo

ampak prej ponikne, smo predvidevali, da potočne postrvi atlantskega tipa ne morejo

migrirati iz Kolpe v potok. Izgleda, da to predvidevanje ni pravilno. Možno je, da postrvi

prehajajo preko ponikalnice in se drstijo v Kozjem jarku. Če pa je prehod onemogočen,

obstaja možnost, da populacija v Kozjem jarku vsebuje arhaične alele, ki ne

karakterizirajo le atlantskega tipa, ampak tudi donavski tip potočne postrvi.

V Iško so prvič vložili potočno postrv atlantskega tipa iz ribogojnice Povodje leta 1996

(30), zato populacija iz Iške vsebuje atlantski in donavski tip potočne postrvi. Pri njej je

zanimivo to, da na mikrosatelitskem lokusu 5/65 vsebuje alel, značilen za soško postrv.

Tega pojava ne znamo razložiti. Mogoče gre za skupni alel, ki se je pri soški postrvi

ohranil, pri potočni pa izgubil. Populacija iz Iške bi lahko v tem primeru predstavljala

nekakšen relikt predniške populacije. Seveda ne smemo izključiti tudi možnosti, da je

soško postrv v Iško zanesel človek.

Temenica, Stiški potok in Krka vsebujejo populacije donavskega in atlantskega tipa.

Znano je, da so v Krko vlagali ribogojniško potočno postrv in izgleda, da je ta migrirala v

Temenico in Stiški potok.

Pri opisovanju populacij z mešanim tipom potočne postrvi moramo omeniti tudi raziskave

v katerih so ugotovili, da se v donavskem porečju nahaja tudi avtohtoni atlantski tip

potočne postrvi, kar situacijo še dodatno zaplete (6). To naj bi bila posledica zadnje

poledenitve, ko se je atlantski tip potočne postrvi umikal pred ledeniki proti jugu. Iz naše

raziskave ni razvidno, da bi se avtohtoni atlantski tip nahajal tudi v potokih, ki smo jih

preiskali, saj smo atlantski tip našli le tam kjer so vlagali ribogojniško potočno postrv.


Populaciji iz Sovpata in Ribnice sta sestavljeni samo iz potočnih postrvi donavskega tipa.

Na mikrosatelitskih lokusih 10/2 in 5/65 sta homozigotni, kar dokazuje homogenost

populacije.

Predvidevamo, da morska postrv (Salmo trutta f. trutta), ki so jo ulovili v Piranskem zalivu,

ni avtohtona. Verjetno je ušla iz italijanskih ribogojnic ob rekah, ki se izlivajo v Jadransko

morje. V Jadranskem morju so te postrvi zelo redke, zato njihovega načina življenja ne

poznamo. Ni znano, ali ob drstenju tudi morske postrvi iz Jadrana migrirajo v reke.

Pregled njihovega genotipa je pokazal, da imajo na lokusu 10/2 samo alel, značilen za

atlantski tip potočne postrvi, na preostalih dveh lokusih pa imajo različne alele.

Pri postrveh iz hibridnih con na križanje lepo nakazujejo genotipi. Na lokusu 10/2 je za

atlantski tip potočne postrvi značilen genotip 118/118 za soško postrv pa 126/126.

Populacije v hibridnih conah imajo genotipa 126/126 in 118/126, genotip 118/118 pa ni

prisoten. Za donavski tip potočne postrvi je značilen genotip 122/122. V hibridni coni se

nahajajo tudi populacije z genotipom 122/126. Iz tega bi lahko sklepali, da se je v hibridni

coni križala soška postrv z obema tipoma potočne postrvi, atlantskim in donavskim.

Visoka frekvenca alela 126 je verjetno posledica križanja med avtohtono soško postrvjo in

njenimi križanci s potočno postrvjo.

Lokus 10/9 je najbolj variabilen, saj znaša njegova vrednost PIC 0,86, skupna

heterozigotnost pa 0,53. Sledi mu lokus 5/65 z vrednostjo PIC 0,61 in skupno

heterozigotnostjo 0,28. Najmanj variabilen je lokus 10/2, ki ima vrednost PIC 0,57 in

skupno heterozigotnost 0,21.

Zaradi prevelike variabilnosti lokus 10/9 ni najprimernejši za ločevanje med posameznimi

populacijami, uporaben je le za opredelitev populacij soške postrvi, pri katerih je

variabilnost veliko manjša. Na osnovi lokusov 10/2 in 5/65 je ločevanje jasnejše, ker sta

manj variabilna. Tako lažje določimo alel, ki naj bi bil značilen za določeno populacijo.

Na osnovi treh preučenih mikrosatelitskih lokusov ne moremo podati zanesljivega načina

za ločevanje med donavskim in atlantskim tipom potočne postrvi. Ugotovili smo, da se

čisti atlantski tip potočne postrvi v Sloveniji verjetno ne nahaja, saj ga ne zasledimo niti v

ribogojnici. Za predstavitev donavskega tipa je še najprimernejši mikrosatelitski lokus

5/65, na katerem vse čiste potočne postrvi donavskega tipa vsebujejo alel 149. Za

atlantski tip potočne postrvi je značilen alel 118 na lokusu 10/2. Ta lokus sicer ne določa


samo atlantskega tipa, lahko pa z dokazovanjem drugih alelov ovržemo možnost, da

imamo opravka s čistim atlantskim tipom potočne postrvi.

Ločitev med soško in potočno postrvjo na osnovi mikrosatelitskih lokusov je preprostejša

in zanesljivejša. Z gotovostjo lahko povemo, katere alele mora določena postrv vsebovati,

da jo lahko uvrstimo med soške postrvi. Če postrv ustreza naslednjim pogojem, spada

med soške postrvi:

na lokusu 10/9: alel 202, 204 ali 212

na lokusu 10/2: alel 126

na lokusu 5/65: alel 151

Najpomembnejša lastnost mikrosatelitov je, da ne nosijo zapisa za določeno fenotipsko

lastnost. Prav zaradi te prednosti smo jih izbrali, saj nanje selekcija ne deluje. Ta lastnost

pa prinaša tudi določene nevšečnosti. Sprememba v dolžini mikrosatelita se lahko dogodi

tudi kot posledica drugih mehanizmov, recimo z različnimi genskimi rekombinacijami, ki

povzročijo, da postane alel značilen za eno populacijo identičen alelu neke druge

populacije. V tem primeru sama dolžina mikrosatelita ne daje zanesljive informacije o

izvoru populacije. Teh pomanjkljivosti se moramo pri interpretaciji rezultatov ves čas

zavedati.

Zavedati se moramo tudi dejstva, da so bili preučeni vzorci veliko premajhni za realno

ocenitev stanja v izbranih potokih. Že v naši raziskavi smo opazili, kako se je slika o

stanju določenega potoka ali reke spreminjala z večanjem števila primerkov.

Predvidevamo lahko, da bi se ta trend nadaljeval še naprej. Potoke z le enim vzorčnim

primerkom smo omenili le za orientacijo, saj se zavedamo, da en sam podatek ni realni

odsev dejanskega stanja.

Omenili smo že možnost, da se atlantski tip potočne postrvi nahaja tudi v donavskem

porečju. Tudi če ta hipoteza ne velja, obstaja velika verjetnost, da imata donavski in

atlantski tip potočne postrvi skupne alele. Oba tipa sta se verjetno razvila iz iste predniške

populacije. Po ločitvi sta se različno razvijala, saj so nanju delovali različni selekcijski

pritiski. Selekcija na mikrosatelite načeloma ni delovala, so pa bili tudi ti odvisni od

začetnih frekvenc v populaciji in učinka majhne populacije (ozko grlo). Oba pojava sta

lahko vplivala na izločitev nekaterih alelov iz populacije in tako pripeljala do današnjih

razlik med donavskim in atlantskim tipom potočne postrvi, ki pa lahko še vedno vsebujeta

tudi enake alele.

Pri preučevanju populacij moramo upoštevati geološke spremembe v preteklosti. Na

področju Slovenije sta v času nastanka posameznih vrst močno delovali neotektonika in


erozija, ki sta močno spreminjali površino ozemlja in s tem habitate. Zaradi naravnih

preprek je prišlo do razhajanja populacij in s tem do nastanka novih vrst.

Na koncu moramo omeniti še človeški faktor, saj izgleda, da je pri razporeditvi populacij

postrvi odigral odločilno vlogo. Ljudje se niso zavedali, da s premeščanjem postrvi v tuje

okolje rušijo ravnovesje v naravi in uničujejo svojo naravno dediščino.


6 POVZETEK

V Sloveniji živita dve avtohtoni vrsti postrvi: soška postrv (Salmo marmoratus) in donavski

tip potočne postrvi (Salmo trutta f. fario). Soška postrv živi v Soči in njenih pritokih,

potočna pa v vseh vodotokih donavskega porečja. V začetku tega stoletja so potočno

postrv naselili tudi v Sočo in njene pritoke, konec osemdesetih in v začetku devetdesetih

pa so v veliko voda naselili še potočno postrv atlantskega tipa. Vse tri skupine postrvi se

med seboj lahko križajo. Tako je v slovenskih potokih in rekah nastala velika zmeda.

Grozi nam, da bomo izgubili čisto soško postrv, ki je slovenski endemit, in čisti donavski

tip potočne postrvi.

Čiste oblike postrvi se med seboj razlikujejo, ne obstaja pa zanesljiv morfološki marker za

ločevanje njihovih križancev. Zato smo želeli odkriti genetski marker na podlagi katerega

bi lahko hitro, zanesljivo in poceni ločili različne skupine postrvi in njihove križance, kajti le

z natančnim razlikovanjem bomo lahko spet vzredili čisto vrsto soške postrvi in potočne

postrvi donavskega tipa.

Razlikovanja na osnovi aloencimov in mitohondrijske DNA so že bila delno narejena,

vendar niso bila povsem zanesljiva. S preučevanjem mikrosatelitov smo želeli dopolniti že

uveljavljene genetske markerje.

Izbrali smo tri mikrosatelitske lokuse, ki smo jih preverili na 193 ribah iz 20 različnih

populacij. V raziskavo smo vključili potočno postrv (Salmo trutta f. fario), soško postrv

(Salmo marmoratus), križance med soško in potočno postrvjo in morsko postrv (Salmo

trutta f. trutta). Izkazalo se je, da je mikrosatelitski lokus 10/9 najbolj variabilen in zato ni

primeren za ločevanje med atlantskim in donavskim tipom potočne postrvi. Za soško

postrv pa sta na tem lokusu značilna dva alela. Mikrosatelitska lokusa 10/2 in 5/65 sta

manj variabilna. Lokus 10/2 je primeren za ločevanje atlantskega tipa od donavskega, ker

je atlantski tip postrvi homozigoten za enega od alelov. Lokus 5/65 vsebuje alel značilen

za soško postrv in nakazuje razlike med atlantskim in donavskim tipom.

Na podlagi treh preučevanih mikrosatelitov ne moremo izpeljati zanesljivega pravila za

ločevanje soške postrvi od obeh tipov potočne postrvi. Malo alelov je značilnih samo za

eno skupino postrvi, lahko pa s kombinacijo večih alelov in z metodo izločanja precej

natančno določimo v katero skupino spada preučevana postrv. Za povečanje zanesljivosti

lahko poleg mikrosatelitskih lokusov pregledamo še mitohondrijsko DNA.

Na podlagi pravilne določitve vrste postrvi bodo lahko spet vzgojili čiste populacije soške

postrvi in preprečili, da bi se atlantski tip potočne postrvi še naprej vlagal v slovenske

vode.


7 ZAHVALA

Zahvaljujem se mentorju prof. dr. Petru Dovču, da mi je omogočil izdelavo diplomske

naloge v genetskem laboratoriju Oddelka za zootehniko Biotehniške fakultete v

Domžalah, mi strokovno svetoval in pomagal pri pripravi zagovora.

Zahvaljujem se somentorju dr. Alešu Snoju za vsakodnevno pomoč in svetovanje in vsem

sodelavcem v genetskem laboratoriju.

Zahvaljujem se članoma komisije prof. dr. Miklavžu Grabnarju in prof. dr. Juretu Poharju.

Hvala Davidu, ki mi je omogočil, da sem diplomirala le iz biologije in ne tudi iz

računalništva.

Hvala mami, ki je naredila vse, kar naredijo prave mame.


8 LITERATURA

1. Angers, B./ Bernatchez, L. Complex evolution of a salmonid microsatellite locus and

its consequences in inferring allelic divergence from size information. Mol. Biol. Evol.,

14 (1997), s. 230-238.

2. Apostolidis, A./ Karakousis, Y./ Triantaphyllidis, C. Genetic differentiation and

phylogenetic relationships among Greek Salmo trutta L. (brown trout) populations as

revealed by RFLP analysis of PCR amplified mitochondrial DNA segments. Heredity,

77 (1996), 608-618.

3. Apostolidis, A./ Karakousis, Y./ Triantaphyllidis, C. Genetic divergence and

phylogenetic relationships among Salmo trutta L. (brown trout) populations from

Greece and other European countries. Heredity, 76 (1996), s. 551-560.

4. Apostolidis, A.P./ Triantaphyllidis, C./ Kouvatsi, A./ Economidis P.S. Mitochondrial

DNA sequence variation and phylogeography among Salmo trutta L. (Greek brown

trout) populations. Mol. Ecol., 6 (1997), s. 531-542.

5. Avise, J.C. Molecular markers, natural history and evolution. Interpretive tools. New

York, Chapman &Hall, 1994, s. 78-82.

6. Bernatchez, L./ Guyomard, R./ Bonhomme, F. DNA sequence variation of the

mitochondrial control region among geographically and morphologically remote

European brown trout Salmo trutta populations. Mol. Ecol., 1 (1992), s. 161-173.

7. Bernatchez, L./ Osinov, A. Genetic diversity of trout (genus Salmo) from its most

eastern native range based on mitochondrial DNA and nuclear gene variation. Mol.

Ecol., 4 (1995), 285-297.

8. Boleda, M.D./ Briones, P./ Farres, J./ Tyfield, L./ Pi, R. Experimental design: A useful

tool for PCR optimization. BioTechniques, 21 (1996), s. 134-140.

9. Callen, F.D./ Thompson, A.D./ Shen, Y./ Philips, H.A./ Richards, R.I./ Mulley, J.C./

Sutherland, R. Incidence and origin of »null« allels in the (AC)n microsatellite

markers. Am. J. Human Genet., 52 (1993), s. 922-927.

10. Cobb, B.D./Clarkson, J.M. A simple procedure for optimising the polymerase chain

reaction (PCR) using modified Taguchi methods. Nucleic Acids Research, 22 (1994),

s. 3801-3805.

11. Crooijmans, R.P.M.A./ Bierbooms, V.A.F./ Komen, J./ Van der Poel, J.J./ Groenen,

M.A.M. Microsatellite markers in common carp (Cyprinus carpio L.). Animal Genetics,

28 (1997), s. 129-134.


12. Estoup, A./ Rousset, F./ Michalakis, Y./ Cornuet, J.M./Adriamanga, M./ Guyomard, R.

Comparative analysis of microsatellite and allozyme markers: a case study

investigating microgeographic differentiation in brown trout (Salmo trutta). Molecular

Ecology, 7 (1998), s. 339-353.

13. Giuffra, E./ Bernatchez, L./ Guyomard, R. Mitochondrial control region and protein

coding genes sequence variation among phenotypic forms of brown trout Salmo

trutta from northern Italy. Mol. Ecol., 3 (1994), s. 161-171.

14. Giuffra, E./ Guyomard, R./ Forneris, G. Phylogenetic relationships and introgression

patterens between incipient parapatric species of Italian brown trout (Salmo trutta L.

complex). Mol. Ecol., 5 (1996), s. 207-220.

15. Goldstein, B.G./ Linares, A.R./ Cavalli-Sforza, L.L./ Feldman, M.W. An evaluation of

genetic distances for use with microsatellite loci. Genetics, 139 (1995), s. 463-471.

16. Harrison, R.G. Animal mitochondrial DNA as a genetic marker in population and

evolutionary biology. Trends Ecol. Evol., 4 (1989), s. 6-11.

17. Hindar, K./ Jonson, B./ Ryman, N./ Stahl, G. Genetic relationship among landlocked,

resident, and anadromous Brown trout, Salmo trutta L. Heredity, 66 (1991), s. 83-91.

18. Hoelzel, A.R. Molecular genetics analysis of populations. A practical approach. New

York, Oxford University Press, 1992.

19. Lagercrantz, U./ Ellegren, H./ Andersson, L. The abundance of various polymorphic

microsatellite motifs differs between plants and vertebrates. Nucleic Acids Res., 21

(1993), s. 1111-1115.

20. Largiader, C.R./ Scholl, A. Genetic introgression between native and introduced

brown trout Salmo trutta L. populations in the Rhone River Basin. Mol. Ecol., 5

(1996), 417-426.

21. McPherson, M.J./ Quirke, P./ Taylor, G.R. PCR. A practical Approach. New York,

Oxford University Press, 1991.

22. Medrano, F.J./ Aasen, E./ Sharrow, L. DNA extraction from nucleated red blood cells.

Biotechniques, 8 (1990), s. 43.

23. Messier, W./ Li, S.H./ Stewart, C.B. The birth of micrasatellites. Nature, 381 (1996),

s. 483.

24. Murray, V./ Monchawin, C./ England, P.R. The determination of the sequences

present in the shadow bands of a dinucleotide repeat PCR. Nucleic Acids Res., 10

(1993), s. 2395-2398.

25. Ocvirk, J. Soška postrv (Salmo marmoratus Curvier 1817) biologija, ekologija in

možnosti umetne vzreje. Ljubljana, Zavod za ribištvo Ljubljana,1986.


26. Povž, M./ Skat, B. Naše sladkovodne ribe. Ljubljana, Mladinska knjiga, 1990, s. 84-

89.

27. Preiss, T./ Hentze, M.W. Dual function of the messenger RNA cap structure in

poly(A)- tail-promoted translation in yeast. Nature, 392 (1998), s. 516-519.

28. Queller, D.C./ Strassmann, J.E./ Hughes, C.R. Microsatellites and kinship. Trends

Ecol. Evol., 8 (1993), s. 258-288.

29. Ribiško-gojitveni načrt 1990-1995, RD Cerknica. Zavod za ribištvo Ljubljana.

30. Ribiško-gojitveni načrt 1996, RD Barje. Zavod za ribištvo ljubljana.

31. Ryman, N./ Utter, F. Population genetics & fishery management. Washington,

University of Washington, 1988, s. 161-192.

32. Scholtterer, C./ Tautz, D. Slippage synthesis of simple sequence DNA. Nucleic Acids

Res., 20 (1992), s. 211-215.

33. Skaala, O./ Solberg, G. Biochemical genetic variability and taxonomy of a

marmorated salmonid in river Otra, Norway. Nordic J. Freshw. Res., 73 (1997), s. 3-

12.

34. Slatkin, M. A measure of population subdivision based on microsatellite allele

frequencies. Genetics, 139 (1995), s. 457-462.

35. Snoj, A./ Pohar, J./ Dovč, P. The first microsatellite DNA marker for marble trout,

BFRO 001. J. Anim. Sci., 75 (1997), s. 1983.

36. Sušnik, S./ Snoj, A./ Pohar, J./ Dovč, P. The microsatellite marker (BFRO 002)

characteristic for different geographically remote brown trout, Salmo trutta L.,

populations. Animal Genetics, 28 (1997), s. 370-383.

37. Tautz, D. Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorfic

DNA markers. Nucleic Acids Res., 17 (1989), s. 6463-6471.

38. Tautz, D. Notes on the definition and nomenclature of tandemly repetitive DNA

sequences. DNA fingerprinting: State of the science. Basel, Birkhauser Verlag, 1993,

s. 21-28.

39. Tautz, D./ Trick, M./ Dover, G.A. Cryptic simplicity in DNA is a major source of

genetic variation. Nature, 322 (1986), s. 652-656.

Documents

ANALIZA TREH MIKROSATELITSKIH LOKUSOV PRI POSTRVI … · univerza v ljubljani biotehniŠka fakulteta oddelek za biologijo tamara jug analiza treh mikrosatelitskih lokusov pri postrvi