Andler_diaz_29,36

INGENERARE 27 - 2013 / 29

INGENIERA PARA PRODUCIR PLSTICOS DESDE BACTERIAS

TECHNOLOGICAL AND MARKET ASPECTS OF MICROBIAL BIOPLASTICS PRODUCTION

Rodrigo Andler y Alvaro Daz-Barrera*

(VFXHO GH,Q HQLHUt %LRTXtPLF 3RQWLFL 8QLYHUVLG

G&

W OLF GH9 OS U tVR$YHQLG %U VLO

9 OS U tVR& LOH

OY

URGL

]#XFYFO

RESUMEN: Este trabajo entrega un panorama acerca de los aspec-tos tecnolgicos y de mercado de la produccin de bioplsticos mi-crobianos. Un tipo de bioplstico producido por bacterias es el po-lihidroxibutirato (PHB), el cual es un biopolister biodegradable con diferentes propiedades de gran potencial biotecnolgico. En pases desarrollados existen impuestos al uso de materiales no degradables

derivados del petrleo y sumado a que las reservas de petrleo son

QLW V FWX OPHQWHH[LVWHO QHFHVLG GGHJHQHU UQXHYRVP WHUL OHV plsticos biodegradables como los bioplsticos. La demanda global por este tipo de material ha crecido en los ltimos aos, sin embargo,

su produccin a mayor escala requiere desarrollar un proceso ms

HFLHQWH HV GHFLU XQ P \RU FRQFHQWU FL Q \ SURGXFWLYLG G O P V bajo costo posible. Para esto, la ingeniera bioqumica tiene un rol im-

portante. La implementacin de estrategias de produccin microbiana

P V HFRQ PLF V \ HO GHV UUROOR GH QXHY V FHS V PRGLF G V P V HFLHQWHHQO SURGXFFL QGH3+%VRQQHFHV ULRVS U SURGXFLUSO V-

ticos microbianos.

Palabras clave: PHB, bioproceso, bioplsticos.

ABSTRACT: This paper gives a current overview about technolo-gical and market aspects of microbial bioplastics production. One type of bioplastic produced by bacteria is the polyhydroxybutyrate (PHB), which is a biodegradable biopolyester with different properties with high biotechnological potential. In developed countries taxes are charged for the use of non-degradable petroleum derivatives, in addi-tion to that the petroleum reserves are limited, and then there is current

need to generate new biodegradable plastics such as the bioplastics.

7KHJOR OGHP QGIRUWKLVW\SHRIP WHUL OK VVLJQLF QWO\JURZQLQ

the past few years; however, its production at higher scale requires the

GHYHORSPHQWRI PRUHHIFLHQWSURFHVVLH KLJKHUFRQFHQWU WLRQ and productivity at the lowest possible cost. For this, the biochemical engineering has an important role. The implementation of less

expensive microbial production and the development of new

PRGLHGVWU LQVPRUHHIFLHQW3+%SURGXFHUV UHQHFHVV U\LQ order to produce plastics from bacteria.

Key Words: PHB, bioprocess, bioplastics.

30 / INGENERARE 27 - 2013

1. INTRODUCCIN

Los bioplsticos son un tipo de material que en las ltimas d-cadas se han utilizado como reemplazo de plsticos derivados del petrleo. La asociacin Europea de Bioplsticos considera que los bioplsticos pueden ser clasificados como: 1) plsticos sintetizados a partir de fuentes renovables y 2) polmeros bio-degradables que cumplen con todos los criterios de las normas cientficas reconocidas de biodegradabilidad y compostaje de plsticos segn el estndar Europeo EN 13432 [1].

La demanda total de bioplsticos estimada en el 2011 fue de 475.900 toneladas mtricas, llegando a un total de 574.100 toneladas mtricas en el 2012, observndose as un potencial de mercado en este campo. Con un 34,1% de demanda por bioplsticos en el 2011, Europa es la regin de mayor demanda seguida de la regin Asia-Pacfico con un 24,7% en el mismo ao. En trminos de crecimiento, las regiones de Asia-Pacfico junto con Amrica del Sur emergen como regiones de mayor perspectiva para el mercado de los bioplsticos [1].

En este contexto la capacidad instalada de produccin de bioplsticos ha aumentado en los ltimos aos. Europa en el ao 2011 posea un 28% de capacidad de produccin global para bioplsticos, mientras que Norteamrica y Sudamrica seguan con un 24% y 22% respectivamente. En la tabla 1 se resume la capacidad de produccin de bioplsticos instalada en el mundo. Se puede observar que el bio-polietileno es el bioplstico de mayor produccin con ms de 250 mil toneladas mtricas en el 2011.

Tabla 1. Capacidad de produccin global de bioplsticos por tipo de producto en el ao 2011[1].

Tipo de bioplstico

Capacidad de produccin

global (%)

Bio-polietileno

25

Mezclas de almidn

15

Polilactato (PLA)

13

Otros (polmeros generados de

13

celulosa y bio-poliamida)

Polihidroxialcanoatos (PHA)

11

Cloruro de bio-polivinilo

9

Polisteres biodegradables

7

Bio-polietileno tereftalato

7

Entre los bioplsticos producidos por microorganismos, destacan dos polmeros biodegradables: polilactato (PLA) y polihidroxial-canoato (PHA). Ambos bioplsticos pueden ser manufacturados usando un 100% de recursos renovables. Los polmeros de PHA son ms caros que los de PLA, ya que pueden ser usados en un mayor espectro de aplicaciones, incluyendo en biomedicina

[2]. Destaca en esta comparacin, la posibilidad que ofrece la produccin microbiana de PHA en trminos de generar mate-riales con mltiples propiedades y aplicaciones (a diferencia del PLA) as como, la opcin de mayor explotacin de propiedad intelectual que ofrece la produccin de PHA respecto de PLA [3]. Por estas razones, la produccin de PHA es un campo promisorio que se puede seguir desarrollando e innovando.

En los ltimos aos el incentivo de producir plsticos no convencionales, es decir, que no provengan de la industria petroqumica, se ha incrementado notoriamente debido al alza en el precio del petrleo, en especial a partir del ao 2003. Es as como a mediados del 2008 el precio por barril de petrleo super los USD 140 y a partir de entonces se han mantenido precios por sobre los USD 100. Debido al desarrollo de nuevas tcnicas de biologa molecular y que en pases desarrollados las normativas legales han generado un impuesto al uso de materiales no degradables derivados del petrleo, en los ltimos aos ha tomado ms fuerza la necesidad de generar plsticos biodegradables de origen microbiano. Hoy existen diferentes compaas productoras de PHA con capacidades instaladas que van desde 50 a 50.000 ton/ao (Tabla 2).

Tabla 2. Compaas productores de PHA [2]

Compaa

Tipo

Escala de

de PHA

produccin

(ton/ao)

Biomer, Alemania

PHB

---

BASF, Alemania

PHB, PHBV

Piloto

Metabolix, Estados Unidos

PHAs

---

Tepha, Estados Unidos

PHAs

50.000

Meredian, Estados Unidos

PHAs

10.000

Kaneka, Japn

PHAs

---

Biocycle, Brasil

PHB, PHBV

50

Bio-On, Italia

---

10.000

Zhejiang Tian An, China

PHBV

2.000

Yikeman, China

---

3.000

Jiang Su Nan Tian, China

PHB

Piloto

Shenzhen OBioer, China

PHAs

---

Tianjin Green Bio-Science,

PHB4B

10.000

China

Shandong Lukang, China

PHAs

Piloto

Copolmeros de PHB: PHBV, poli(3-hidroxibutirato-co-4-hidroxi-valerato); PHB4B, poli(3-hidroxibutirato-co-4-hidroxibutirato) ; informacin no disponible.

2. ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE LOS PHA

Los PHA son polisteres de hidroxialcanoatos que pueden ser sintetizados por microorganismos y constituyen un grupo de materiales biodegradables de gran potencial biotecnolgico. Se conocen ms de 150 estructuras de PHA que tienen diferentes caractersticas de termoflexibilidad y propiedades mecnicas. En la Figura 1 se muestra la estructura qumica bsica de los PHA microbianos.

Figura 1. Estructura qumica del PHA.

El valor de n depende del grupo R y el microorganismo en el cual se produce, variando entre 100 y 30000 [4]. En la Tabla 2 se indican las sustituciones ms comunes del grupo radical y el nombre que recibe el polmero.

Tabla 3. Sustituciones del grupo radical

Grupo R

Nombre del polmero

Abreviacin

CH3

poli(3-hidroxibutirato)

PHB

CH2CH3

poli(3-hidroxivalerato)

PHV

CH2CH2CH3

poli(3-hidroxihexanoato)

PHHx


aguas de mar), acelerndose la degradacin por exposicin a luz UV [6].

3. APLICACIONES DEL PHB

Las aplicaciones que posee el PHB son muchas en diversos mbitos. En artculos de uso cotidiano como bolsas, artculos de empaque, contenedores, revestimientos, artculos desechables de higiene personal, entre otros [7]. En el rea mdica como vestimenta, artculos ortopdicos, prtesis, todo esto gracias a la compatibilidad con nuestro organismo [8]. Adems se est incursionando en utilizar el PHB como portadores de biofrmacos y como un tipo de biocombustible [9].

4. BIOSNTESIS DE PHB

El PHB es un polmero de reserva energtica que se acumula al interior de las clulas. La principal ruta bioqumica de produccin es a partir de acetil-CoA, el cual es convertido a PHB mediante la intervencin de tres enzimas biosintticas (Figura 2).

Fuente de carbono

(Glucosa, glicerol, etanol, otros)

Acetil-CoA

Acetil-CoA

3-cetotiolasa (phA)

Acetoacetil-CoA

El poli(3-hidroxibutirato) o PHB es uno de los PHA ms estudia-dos y es sintetizado por diferentes bacterias. Posee caracters-

NADPH

NADP+

Acetoacetil-CoA reductasa (phaB)

ticas muy similares al polipropileno (PP), uno de los plsticos convencionales (de la industria petroqumica) de mayor uso. En la tabla 3 se muestran una comparacin de ambos polmeros.

Tabla 4. Comparacin propiedades fsicas entre PHB y polipropileno (PP) [5]

Parmetro

PHB

PP

Temperatura de fusin (C)

177

176

Temperatura de transicin vtrea (C)

2

-10

Cristalinidad (%)

60

50-70

Fuerza de tensin (MPa)

43

38

Extensin hasta quiebre (%)

5

400

Con respecto a la biodegradabilidad de los PHA, muchos mi-croorganismos en la naturaleza los degradan ya que contienen PHB hidrolasas y PHA depolimerasas [5]. Tpicamente, una estructura de PHB tiene una velocidad de degradacin de unos pocos meses (en condiciones anaerobias) o pocos aos (en

(R)-3-hidroxibutiril-CoA

PolimerizacinPHB sintasa (phaC)

PHB

Figura 2. Ruta metablica de produccin de PHB a partir de la reduccin de Acetil-CoA [5].

En el primer paso, la enzima 3-cetotiolasa condensa dos mo-lculas de acetil-CoA para formar acetoacetil-CoA. Luego, una segunda enzima, acetoacetil-CoA reductasa permite la reduccin de acetoacetil-CoA a 3-hidroxibutiril-CoA, utilizando NADPH. Finalmente la enzima PHB sintasa polimeriza 3-hidroxibutiril-CoA a PHB, liberando la coenzima-A.

La acumulacin de PHB es una manera natural para las bacterias de almacenar carbono y energa. Este polister es insoluble en agua y es por esto que los polmeros son acumulados en grnulos intracelulares. Para la bacteria es ventajoso almacenar


nutrientes en exceso, especialmente para que su estado fisio-lgico no se vea afectado [6].

Durante el crecimiento bacteriano, la enzima 3-cetotiolasa es inhibida por la coenzima-A libre y el flujo de acetil-CoA se fa-vorece hacia el ciclo de Krebs. Cuando hay limitacin de algn nutriente, diferente al carbono, el acetil-CoA es canalizado hacia la biosntesis de PHB [9].

5. BIOPROCESO DE PRODUCCIN DE PHB

El PHB debido a sus caractersticas ha sido de mucho inters con miras de producirlo a escala industrial y lograr el reemplazo del plstico convencional. Sin embargo su costo de produccin sigue siendo mayor a los plsticos derivados del petrleo. Segn lo reportado, su valor de produccin puede ser hasta 16 veces mayor que la produccin de polipropileno [10].

El bioproceso de produccin microbiana de PHB consiste en una primera etapa de fermentacin para el crecimiento de la biomasa y acumulacin intracelular del biopolmero, seguido de una etapa de cosecha de la biomasa y extraccin/recuperacin del polmero.

Se estima que para producir PHB alrededor de un 40% del costo total de produccin se debe a las materias primas [11]. Por esta razn, existen diferentes investigaciones orientadas a usar fuentes de carbono baratas para reducir el costo de su produccin [12; 13; 14].

Sin embargo, hasta ahora el desafo sigue siendo desarrollar un bioproceso con alta eficiencia de conversin en PHB al ms bajo costo posible. En este sentido, en nuestro pas existen di-ferentes procesos industriales de los cuales se pueden obtener subproductos que podran ser usados como fuente de carbono y nutrientes para la produccin microbiana de PHB. Un ejemplo de esta opcin fue recientemente evaluada en nuestro grupo de investigacin. En un estudio de evaluacin tcnica y econmica para producir PHB microbiano se evalu la factibilidad de usar suero de leche de la industria de leche y quesos como fuente de carbono para producir PHB [15]. Demostrndose que si es una opcin factible en nuestro pas.

Otra forma propuesta para abaratar costos de produccin es reducir los costos de aireacin de la fermentacin. En esta lnea, se sabe que la sntesis de PHB es afectada por la disponibili-dad de oxgeno. Se ha demostrado que bajas velocidades de agitacin y condiciones de limitacin de oxgeno favorecen la produccin de PHB [11; 16]. Esta condicin abre la posibilidad de desarrollar un proceso de cultivo con menos necesidades de aireacin y as menos costos asociados.

Despus del proceso de fermentacin, las clulas que contienen el PHB deben ser separadas para luego extraer el producto. Los

mtodos para recuperar el PHB involucran el uso de solventes orgnicos como acetona, cloroformo o dicloroetano [17; 18]. Sin embrago, la extraccin con solventes puede requerir el uso de grandes cantidades de solventes, lo cual hace menos econmico el proceso y resulta contradictorio en el esquema de desarrollo de un proceso sustentable y amigable con el medio ambiente.

Como una alternativa, han surgido mtodos de extraccin con preparados enzimticos, tratamiento con amonio o digestin con surfactantes [19]. Actualmente se han aplicado otros mtodos para recuperar PHB, entre los que destacan disrupcin usando fluidos supercrticos o bacterias modificadas en las cuales se induce una liberacin espontnea de PHB [20]. Se sabe que los procesos de extraccin y recuperacin del PHB pueden ser costosos y es necesario entonces evaluar el procedimiento de mayor rendimiento en concordancia con el costo involucrado, sobre todo pensando en desarrollar un proceso a mayor escala.

6. MICROORGANISMOS MODIFICADOS GENTICAMENTE PARA PRODUCIR PHB

Existen bacterias nativas que pueden acumular grandes cantida-des de PHB [3].Sin embargo, pocas bacterias tienen un potencial de produccin que pueda ser llevado a escala industrial [21]. Debido a esto existen diferentes investigaciones para modificar genticamente algunas bacterias [4] con el fin de maximizar la productividad, parmetros cinticos y la capacidad de utilizar fuentes de carbono renovables.

Esto se ha logrado mediante la insercin de genes provenientes desde cepas productoras en cepas no productoras de PHB o mediante el bloqueo (interrupcin) de genes de las cepas productoras enfocado en el incremento del rendimiento y de la productividad. Sin embargo, no todas las cepas recombinantes han presentado potencial de aplicacin industrial basado en los resultados observados a escala de laboratorio y piloto [21].

6.1 Produccin de PHB por E. coli recombinante

Se ha demostrado que cepas recombinantes de E. coli que contienen los genes para la biosntesis de PHB poseen varias ventajas sobre las bacterias productoras naturales de PHB [14]. Dentro de estas ventajas se incluye la capacidad de utilizar un amplio rango de fuentes de carbono, la ausencia de un sistema de depolimerasas que degraden el polmero sintetizado y una acumulacin de grandes cantidades de PHB con altos niveles de productividad. El conocimiento de su gentica y de sus vas metablicas, as como de la tecnologa para su cultivo, hacen que E. coli tenga un papel importante en el desarrollo de un proceso de produccin de PHB [14].

E. coli es considerada como un husped ideal para la produccin de PHB. Una evidencia de esto es que se han alcanzado por-

centajes cercanos al 90% (p/p) de PHB por masa de clula seca [22]. En la Tabla 5 se muestran algunos valores de porcentaje de acumulacin de PHB en diferentes cepas recombinantes de E. coli utilizando diferentes fuentes de carbono.

Tabla 5: Acumulacin de PHB en cepas recombinantes de E. coli.

&HS PRGLF G

Origen de los

PHB (%

Referencia

genes

p/p)

E. coli

Alcaligenes latus

73

[23]

XL1-Blue

E. coli

Ralstonia eutropha

80

[24]

HMS174

E. coli GCSC4401

Alcaligenes latus

87

[25]

E. coli

Ralstonia eutropha

49.1

[26]

SY-1

E. coli

Ralstonia eutropha

59.5

[26]

SY-2

E. coli

Ralstonia eutropha

50.8

[26]

SY-3

E. coli

Ralstonia eutropha

41.3

[27]

4=

E. coli W

Cupriavidus

40.1

[28]

necator

E. coli W

Cupriavidus

36.2

[28]

necator

E. coli

Cupriavidus

45.8

[28]

W6cscR

necator

7. PRODUCCIN DE PHB BACTERIANO: UNA APROXIMACIN EXPERIMENTAL

En nuestra escuela estamos trabajando en el diseo de con-diciones de proceso para producir PHB con una E. coli mo-dificada. Se utiliz una cepa de E. coli recombinante (E. coli

KO11 PPAL-), la cual contiene los genes de PHB provenientes de la bacteria $]RWR FWHUYLQHO QGLL. Asimismo la cepa E. coli

KO11 PPAL- posee bloqueos en algunas rutas metablicas que favoreceran la acumulacin intracelular de PHB. En la figura 3 se muestran las rutas metablicas involucradas en la sntesis de PHB y los bloqueos en algunas vas metablicas de la cepa E. coli KO11 PPAL-.


Figura 3. Rutas metablicas en E. coli KO11 PPAL-

En cultivos de esta cepa (E. coli KO11 PPAL-) se evalu el cre-cimiento celular y la produccin de PHB usando como fuente de carbono glucosa o lactosa.

Materiales y mtodos

Las cepas de E. coli crecieron en un medio de la siguien-te composicin (en g/L): glucosa 10; lactosa 10; NH4Cl 1; Na2HPO46,8;KH2PO4 3;NaCl 0,5; MgSO47H2O 0,24; CaCl22H2O 0,011. Se adicion adems ampicilina 0,3 mM y como inductor IPTG 0,01 mM.

Los cultivos se realizaron en matraces Erlenmeyer de 250 ml con 50 ml de medio de cultivo. Se cultiv en una incubadora rotatoria a 37C y 250 rpm.

La biomasa fue cuantificada mediante peso seco y la fuente de carbono se midi utilizando la tcnica colorimtrica DNS, que identifica azcares reductores.

El PHB fue recuperado mediante extraccin con cloroformo e hipoclorito de sodio. Para su cuantificacin, el PHB extrado fue hidrolizado con H2SO4y el producto de la hidrlisis (cido crotni-co) fue cuantificado por HPLC con un sistema de deteccin UV.

Resultados

En las Figuras 4 y 5se muestran las cinticas de crecimiento y acumulacin intracelular de PHB (%p/p) en cultivos de E. coli KO11 PPAL- con glucosa (Fig. 4) y lactosa (Fig. 5).


3,5

50

3,0

40

Biomasa (g/L)

2,5

2,0

30

PHB (%p/p)

1,5

20

1,0

10

0,5

0,0

0

0

10

20

30

40

50

Tiempo (h)

Figura 4: Cintica de crecimiento y produccin de PHB en E. coli

KO11 PPAL- utilizando glucosa ( LRP V 3+%

3,5

50

3,0

40

Biomasa (g/L)

2,5

2,0

30

PHB (%p/p)

1,5

20

1,0

10

0,5

0,0

0

0

10

20

30

40

50

60

Tiempo (h)

Figura 5: Cintica de crecimiento y produccin de PHB en E. coli KO11 PPAL- utilizando lactosa ( LRP V 3+%

Como se observa en la Figuras 4 y 5 usando lactosa se alcanza un 45% (p/p) de acumulacin de PHB mientras que con glucosa slo un 30% (p/p).

En la Tabla 6 se presentan los principales parmetros de fermen-tacin que fueron obtenidos en los cultivos de E. coli KO11 PPAL-.

Tabla 6: Parmetros de fermentacin en cultivos de E. coli KO11 PPAL-productores de PHB.

Fuente de

(h-1)

Y

Y

PHB/X

Q

PHB

(g/

carbono

X/S

(g/g)

(g/g)

Lh)

Glucosa

0,10

0,37

0,30

0,027

Lactosa

0,07

0,36

0,79

0,027

Si bien se alcanz una mayor concentracin de biomasa con glu-cosa (3,0 g/L) respecto de usar lactosa (2,0 g/L), el rendimiento

de PHB en biomasa (YPHB/X) fue 2,6 veces mayor con lactosa, por lo que lactosa resulta ser una mejor fuente de carbono para

la acumulacin de PHB en clulas de E. coli recombinante.

8. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS

Aunque durante la ltima dcada se han instalado nuevas com-paas productoras de bioplsticos microbianos, an quedan desafos para poder desarrollar un bioproceso ms eficiente. Para esto, el aporte de la ingeniera bioqumica ser disminuir los costos de produccin, generar nuevas cepas productoras y encontrar aplicaciones con un mayor valor agregado. En diferen-tes pases (incluyendo el nuestro) existen normativas tendientes a reemplazar el uso de materiales plsticos no biodegradables y ya que a nivel global hay una mayor demanda por plsticos biodegradables ms amigables con el medio ambiente, se vis-lumbra que la produccin de PHB microbiano es una importante oportunidad para la generacin bioplsticos biodegradables.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a proyecto Fondecyt de Iniciacin 11110311 y Proyecto de investigacin asociativa DI-PUCV 037.323/2013.

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