8/3/2019 Angela Seidl and Hans-Jurgen Hinz- The free energy of DNA supercoiling is enthalpy-determined

1/5

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USAV o l . 8 1 , p p . 1 3 1 2 - 1 3 1 6 , M a r c h 1 9 8 4B i o c h e m i s t r y

T h e f r e e e n e r g y o f DNA s u p e r c o i l i n g i s e n t h a l p y - d e t e r m i n e d( C o l E l amp p l a s m i d / t h e r m o d y n a m i c s o f s u p e r c o i l i n g / m i c r o c a l o r i m e t r y / t o r s i o n a l a n d f l e x u r a l r i g i d i t y / t o p o i s o m e r a s e I )

ANGELA S E I D L AND HANS -JU RGEN HINZI n s t i t u t f u r B i o p h y s i k u n d P h y s i k a l i s c h e B i o c h e m i e d er U n i v e r s i t a t R e g e n s b u r g , D - 8 4 0 0 R e g e n s b u r g , F e d e r a l R e p u b l i c o f G e r m a n yC o m m u n i c a t e d b y J u l i a n M. S t u r t e v a n t , N o v e m b e r 7 , 1 9 8 3ABSTRACT T h e t h e r m o d y n a m i c s o f s u p e r h e l i x f o r m a -t i o n w a s d e t e r m i n e d b y c o m b i n i n g s u p e r h e l i x d e n s i t y d a t aw i t h e n t h a l p y v a l u e s o b t a i n e d f r o m m i c r o c a l o r i m e t r i c m e a -s u r e m e n t s o f t h e r e l a x a t i o n o f s u p e r c o i l e d C o l E l amp p l a s m i dDN A i n t h e p r e s e n c e o f t o p o i s o m e r a s e I f r o m E s c h e r i c h i a c o l i( w p r o t e i n ) . T h e t h e r m o d y n a m i c q u a n t i t i e s f o r s u p e r h e l i x f o r -m a t i o n a t 3 7 T C i n 1 0 mM T r i s / 2 mM M 9 C l 2 / 1 mM EDTA pH8 , a r e : AG = 9 2 1 k J ( m o l o f p l a s m i d ) f ; AH 2 2 6 0 k J ( m o l o fp l a s m i d ) f ' ; AS = 4 . 3 k J - ( m o l o f p l a s m i d - K ) l . T h e s e d a t ac l e a r l y d e m o n s t r a t e t h a t t h e u n f a v o r a b l e G i b b s f r e e e n e r g y a s -s o c i a t e d w i t h s u p e r c o i l i n g o f DN A r e s u l t s e x c l u s i v e l y f r o m t h ep o s i t i v e e n t h a l p y i n v o l v e d i n f o r m a t i o n o f s u p e r h e l i c a l t u r n s .A p o s i t i v e o v e r a l l e n t r o p y c h a n g e a c c o m p a n i e s s u p e r h e l i x f o r -m a t i o n , w h i c h o v e r c o m p e ns a t e s t h e e x p e c t e d d e c r e a s e o f c o n -f i g u r a t i o n a l e n t r o p y . B y n e g l e c t i n g c o n t r i b u t i o n s f r o m b e n d -i n g , a n e s t i m a t e o f t h e t o r s i o n a l r i g i d i t y C = 1 . 7 9 x 1 0 - ' 9e r g - c m ( 1 e r g = 0 . 1 p J ) o f t h e s u p e r c o i l e d C o l E 1 amp p l a s m i dDN A w a s m a d e o n t h e b a s i s o f t h e e n t h a l p y v a l u e . T h i s v a l u e i si n e x c e l l e n t a g r e e m e n t w i t h v a l u e s o f C d e r i v e d f r o m s u b n a n o -s e c o n d t i m e - r e s o l v e d f l u o r e s c e n c e d e p o l a r i z a t i o n m e a s u r e -m e n t s f o r p B R 3 2 2 DN A [ M i l l a r , D . P . , R o b b i n s , R . J . &Z e w a i , A . H . ( 1 9 8 2 ) J . C h e m . P h y s . 7 6 , 2 0 8 0 - 2 0 9 4 1 . T h e m a g -n i t u d e o f C i s l a r g e r t h a n f o r l i n e a r D N A s , i n d i c a t i n g t h a t s u -p e r c o i l e d DN A i s m o r e r i g i d t h a n l i n e a r DNA.A s a r e s u l t o f t o p o l o g i c a l c o n s t r a i n t s , c i r c u l a r d u p l e x DNAe x h i b i t s u n i q u e s t r u c t u r a l a n d e n e r g e t i c p r o p e r t i e s t h a t l e a dt o e n h a n c e d r e a c t i v i t y i n a l a r g e n u m b e r o f b i o l o g i c a l p r o -c e s s e s ( 1 ) . I t h a s b e e n w e l l e s t a b l i s h e d t h a t many f u n c t i o n so f DNA i n r e p l i c a t i o n ( 2 , 3 ) , t r a n s c r i p t i o n ( 4 - 1 2 ) , r e c o m b i n a -t i o n ( 1 3 ) , a n d r e p a i r ( 1 4 , 1 5 ) d e p e n d c r i t i c a l l y o n t h e d e g r e eo f i t s s u p e r h e l i c i t y . S u p e r c o i l i n g f a v o r s b i n d i n g o f s i n g l e -s t r a n d r e a g e n t s a n d t h e o c c u r r e n c e o f c r u c i f o r m s t r u c t u r e si n p a l i n d r o m i c DNA s e q u e n c e s ( 1 6 - 1 9 ) . S e v e r a l o f t h e s e e x -c e p t i o n a l f e a t u r e s o f s u p e r h e l i c a l DNA c a n b e u n de r s t o o d i fo n e r e c a l l s t h a t a n y r e a c t i o n r e s u l t i n g i n a r e d u c t i o n o f s u -p e r h e l i x d e n s i t y c a n u s e t h e d e c r e a s e i n G i b b s f r e e e n e r g ya s s o c i a t e d w i t h t h a t p r o c e s s . T h e s e a s p e c t s w e r e r e a l i z e dv e r y e a r l y ( 2 0 - 2 7 ) a n d h a v e i n i t i a t e d b o t h e x p e r i m e n t a l a n dt h e o r e t i c a l w o r k t o d e t e r m i n e t h e G i b b s f r e e e n e r g y o f s u -p e r c o i l i n g b y v a r i o u s m e t h o d s i n v o l v i n g i n t e r a c t i o n o f d y e s( 2 8 , 2 9 ) , a l k a l i n e b u o y a n t t i t r a t i o n ( 3 0 ) , a n d b a n d c o u n t i n g i ng e l e l e c t r o p h o r e s i s ( 3 1 - 3 4 ) . A l t h o u g h a l l o f t h e s e m e t h o d sp e r m i t t e d a c c u r a t e d et er m i na t i o n o f t h e s u p e r h e l i x d e n s i t ya n d , t h u s , c a l c u l a t i o n o f t h e G i b b s f r e e e n e r g y , n o p r o p e re s t i m a t e s o f t h e e n t h a l p i c c o n t r i b u t i o n t o t h e G i b b s f r e e e n -e r g y o f s u p e r c o i l i n g c o u l d b e m a d e o n t h e b a s i s o f t ho s es t u d i e s . K n o w l e d g e o f t h e e n t h a l p y o f s u p e r h e l i x f o r m a t i o ni s d e s i r a b l e f o r o b t a i n i n g i n s i g h t i n t o t h e e l a s t i c p r o p e r t i e s o fDNA, f o r c h e c k i n g p r e d i c t i o n s o f t h e o r e t i c a l s t u d i e s , a n d f o rp r e c i s e p a r t i t i o n i n g o f t h e G i b b s f r e e e n e r g y i n t o e n t h a l p i ca n d e n t r o p i c c o n t r i b u t i o n s .

MATE RI ALS A N D METHODSP r e p a r a t i o n o f C o l E 1 amp R S F 2 1 2 4 P l a s m i d DNA. T h ep l a s m i d w a s i s o l a t e d f r o m t h e b a c t e r i a l s t r a i n E s c h e r i c h i ac o l i M609 ( a g i f t o f R . M a t t e s , B o e h r i n g e r , T u t z i n g ) b y t h em e t h o d o f B u r k a r d t e t a l . ( 3 5 ) e x c e p t f o r t h e c e l l l y s i s , w h e r et h e p r o c e d u r e o f V o o r d o u w e t a l . w a s f o l l o w e d ( 3 6 ) . C o v a -l e n t l y c l o s e d c i r c u l a r DNA w a s s e p a r a t e d f r o m l i n e a r a n do p e n c i r c u l a r DNA i n t h e p r e s e n c e o f e t h i d i u m b r o m i d e ( 0 . 5, u g / m l ) b y u s i n g a c e s i u m c h l o r i d e g r a d i e n t ( H i t a c h i v e r t i c a lr o t o r R PV 6 5 T ; 4 8 h r a t 4 2 , 0 0 0 rpm a n d 1 5 C ) .P r e p a r a t i o n o f t h e T o p o i s o m e r a s e I ( w p r o t e i n ) . w p r o t e i n

w a s i s o l a t e d f r o m f r o z e n E . c o l i c e l l s b y t h e p r o c e d u r e b yWang ( 3 7 ) w i t h m o d i f i c a t i o n s i n t r o d u c e d b y H . P . V o s b e r g( M a x P l a n c k I n s t i t u t , H e i d e l b e r g ; p e r s o n a l c o m m u n i c a -t i o n ) . T h e m o d i f i c a t i o n s c o m p r i s e d p u r i f i c a t i o n s t e p s u s i n gp h o s p h o c e l l u l o s e c h r o m a t o g r a p h y , h y d r o x y l a p a t i t e c h r o m a -t o g r a p h y , a n d DNA c e l l u l o s e c h r o m a t o g r a p h y . T h e DNAc e l l u l o s e w a s p r e p a r e d a s d e s c r i b e d b y L i t m a n ( 3 8 ) . P r o t e i nc o n c e n t r a t i o n w a s d e t e r m i n e d b y t h e m e t h o d o f B r a d f o r d( 3 9 ) .w P r o t e i n A s s a y . T h e a c t i v i t y o f t h e t o p o i s o m e r a s e I w a sc o n t r o l l e d b y u s i n g a s t a n d a r d a s s a y m i x t u r e o f 0 . 0 1 M T r i s( p H 8 . 0 ) / 0 . 0 0 2 M M g C l 2 / 0 . 0 0 1 M EDTA c o n t a i n i n g 1 5 , u g o fDNA i n 1 m l ; 0 . 1 - t o 5 - , u l s a m p l e s o f t h e f r a c t i o n c o n t a i n i n g

w p r o t e i n w e r e a d d e d t o 2 0 A l o f t h e a s s a y m i x t u r e , a n d t h es o l u t i o n w a s i n c u b a t e d a t 3 7 C f o r 3 0 m i n . T h e r e a c t i o n w a ss t o p p e d b y a d d i n g S , u l o f a 1% N - l a u r o y l s a r c o s i n e s o l u t i o n .T h e r e s u l t i n g s o l u t i o n s w e r e a n a l y z e d b y h o r i z o n t a l e t h i d -i u m b r o m i d e / a g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s t o d e t e c t t h ea m o u n t o f w p r o t e i n n e c e s s a r y t o r e l a x f u l l y t h e 0 . 3 , u g o fDNA i n t h e a s s a y m i x t u r e .A g a r o s e G e l E l e c t r o p h o r e s i s . E l e c t r o p h o r e s i s w a s u s e d f o rq u a l i t a t i v e a n d q u a n t i t a t i v e c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e p l a s m i dDNA c o n f i g u r a t i o n ; 1 9 x 1 9 x 0 . 5 cm h o r i z o n t a l s l a b g e l sw e r e u s ed , c o n t ai n i ng 0 . 7 % a g a r o s e a n d 0 . 4 , A g e t h i d i u m b r o -m i d e p e r m l . T h e e l e c t r o p h o r e s i s b u f f e r c o n si s te d o f 0 . 0 8 9 MT r i s , 0 . 0 8 9 M b o r i c a c i d , 0 . 0 0 2 5 M EDTA, a n d 0 . 4 , u g o fe t h i d i u m b r o m i d e p e r m l ( p H 8 . 0 ) . A c o n s t a n t c u r r e n t o f 4 5mA w a s a p p l i e d f o r 1 4 h r .D e t e r m i n a t i o n o f t h e P e r c e n t a g e o f C l o s e d C i r c u l a r DNA.T h e t o t a l DNA c o n c e n t r a t i o n w a s d e t e r m i n e d b y UV a b -s o r p t i o n m e a s u r e m e n t s a t 2 6 0 n m o f t h e s a m p l e s o l u t i o n su s i n g a n e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t a t 2 6 0 n m o f 2 0 0 c m 2 _ m g - 1 .T h e p e r c e n t a g e o f c l o s e d c i r c u l a r DNA w a s o b t a i n e d f r o ms c a n s a t 2 5 0 n m o f t h e n e g a t i v e s o f p o l a r o i d p h o t o s t a k e n o ft h e a g a r o s e g e l s u n d e r UV i l l u m i n a t i o n . T h e s a m p l e s o l u -t i o n s u s e d f o r c a l o r i m e t r y c o n t a i n e d b e t w e e n 75% a n d 95%c l o s e d c i r c u l a r DNA.D e t e r m i n a t i o n o f S u p e r h e l i x D e n s i t y . S u p e r h e l i x d e n s i t yw a s d e t e r m i n e d b y c e s i u m c h l o r i d e d e n s i t y g r a d i e n t c e n t r i f -u g a t i o n ( 4 0 ) a n d b y f l u o r e s c e n c e t i t r a t i o n ( 4 1 ) .C a l o r i m e t r y . An L KB b a t c h m i c r o c a l o r i m e t e r w a s u s e df o r t h e e x p e r i m e n t s . M e a s u r e m e n t s w e r e p e r f o r m e d a t 3 7 C .W i t h o u r c o n d i t i o n s o f t h e r m o s t a t t i n g t h e i n s tr u m en t , h ea tp u l s e s o f 5 0 , u J c a n b e w e l l r e s o l v e d . T h e s a m p l e c e l l s w e r ec h a r g e d w i t h a p p r o x i m a t e l y 4 m l o f t h e p l a s m i d DNA s o l u -

1 3 1 2

T h e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a g e c h a r g ep a y m e n t . T h i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r e b y m a r k e d " a d v e r t i s e m e n t "i n a c c o r d a n c e w i t h 1 8 U . S . C . 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t e t h i s f a c t .

8/3/2019 Angela Seidl and Hans-Jurgen Hinz- The free energy of DNA supercoiling is enthalpy-determined

2/5

P r o c . N a t L . Acad S c i USA 8 1 ( 1 9 8 4 ) 1 3 1 3

M e a s u r e m e n tC a l i b r a t i o n ; 5 mA, 2 0 sec

I

M i x i n g

C o n t r o l

M i x i n g

1 0T i m e , mi n

F I G . 1 . T yp i c a l b a t c h c a l o r i m e t r i c m e a s u r e m e n t s f o r r e l a x a t i o n o f C o l E l amp p l a s t n i d DNA b y u s i n gwr o t e i n as c a t a l y s t . Th e f i g u r e s h o w st r a c i n g s o f measur emen t 1 i n T a b l e 1 . T h e m e a s u r e m e n t s were r o u t i n e l y f o l l o w e d b y a s e r i e s o f m i x i n g a n d c a l i b r a t i o n p e a k s ; one o f e a c h i ss h o w n ( U p p e r ) . T h e r e f e r e n c e measurements h a v e b e e n p e r f o r m e d w i t h a l l f o u r compartments f i l l e d w i t h b u f f e r . S e p a r a t e d i l u t i o n e x p e r i m e n t so f t h e DNA or t h e p r o t e i n gave e s s e n t i a l l y t h e same r e s u l t s . T h e average o f two or t h r e e s u c h c o n t r o l s h a s b e e n u s e d f o r c o r r e c t i o n o f t h er e l a x a t i o n e x p e r i m e n t s .

2 0

t i o n . T h e r e a c t i o n was s t a r t e d b y m i x i n g t h e DNA s o l u t i o nw i t h 2 m l o f t h e wp r o t e i n s o l u t i o n . P l a s m i d DNA a n d t h ep r o t e i n w e r e d i a l y z e d t o e q u i l i b r i u m a g a i n s t t h e r e a c t i o nb u f f e r ( 0 . 0 1 M T r i s / 0 . 0 0 2 M M g C l 2 / 0 . 0 0 1 M EDTA, pH 8 . 0 ) .T h e DNA c o n c e n t r a t i o n s w e r e a p p r o x i m a t e l y 0 . 5 m g / m l ;t h e e x a c t c o n c e n t r a t i o n s were d e t e r m i n e d as d e s c r i b e da b o v e . F o r c a l c u l a t i o n o f m o l a r AH v a l u e s , a m o l e c u l a rw e i g h t o f 7 . 2 x 1 0 6 was u s e d f o r C o l E l amp DNA. H e a t s o fd i l u t i o n o f p r o t e i n a n d DNA were n e g l i g i b l e c o m p a r e d t o t h ed i f f e r e n t i a l s i g n a l a t 3 7 C o f t h e b u f f e r - f i l l e d s a m p l e a n d r e f -e re nc e c e l l s o f t h e c a l o r i me t er . T h e s e d i f f e r e n t i a l s i g n a l sw e r e u s e d f o r c o r r e c t i o n o f t h e o b s e r v e d h e a t s o f r e a c t i o n .As a c o n t r o l e x p e r i m e n t , wp r o t e i n a n d op e n c i r c u l a r DNAs o l u t i o n s w e r e m i x e d w i t h n o d et ec t a b l e h ea t e f f e c t . T h ep r o t e i n c o n c e n t r a t i o n s u s e d v a r i e d b e t w e e n 1 a n d 1 0 , g / m l .T h u s , t h e h i g h e s t m o l a r p r o t e i n / D N A r a t i o u s e d was 1 : 1 .H o w e v e r , u s u a l l y DNA was i n e x c e s s . T y p i c a l b a t c h c a l o r i -m e t r i c measurements ar e s h o w n i n F i g . 1 .

R E S U L T SE n t h a l p y o f S u p e r c o i l i n g . T h e e n t h a l p y v a l u e s o b t a i n e d f o rr e l a x a t i o n o f C o l E l amp DNA i n t h e p re s e nce o f t o p o i s o -

m e r a s e I f r o m E . c o l i ar e s u m m a r i z e d i n T a b l e 1 . T h e AHv a l u e s h a v e b e en c o r r e c t e d f o r t h e percentage o f open c i r c u -l a r a n d l i n e a r DNA p r e s e n t a n d r e f e r t o t h e r e a c t i o nC o l E l a m p ( c l o s e d c i r c u l a r , s u p e r h e l i c a l )

3 7 0 C wo p r o t e i nC o l E l a m p ( c l o s e d c i r c u l a r , r e l a x e d ) .

The average Yalue of six determinations is =22604 0 9 k J / m o l o f p l a s i n i d . A n a l y s i s o f t h e r e a c t i o n m i x t u r e s b yg e l e l e c t r o p h o r e s i s a f t e r t h e c a l o r i m e t r i c measur emen tss h o w e d t h a t b e s i d e s t h e c l o s e d r e l a x e d f o r m o f t h e c i r c u l a rDNA, a l s o c i r c u l a r DNA m o l e c u l e s w i t h n i c k s o c c u r r e d . I ti s n o t c l e a r w h e t h e r t h e s e s i n g l e - s t r a n d b r e a k s ar e a r e s u l t o ft h e r e l a x a t i o n r e a c t i o n or w h e t h e r t h e y ar e i n t r o d u c ed o n l yl a t e r d u r i n g t h e p r o l o n g e d s t a n d i n g ( 2 h r ) o f t h e r e a c t ed s o l u -t i o n a t 3 7 ' C i n t h e c a l o r i m et er . T h i s t i m e can h a r d l y b e r e -d u c ed d u e t o m i x i n g c o n t r o l s a n d c a l i b r a t i o n p e a k s . Howev-e r , i n t r o d u c t i o n o f o n e or a f e w n i c k s pe r p l a s m i d s h o u l dh a v e a n e g l i g i b l e e f f e c t o n t h e m a g n i t u d e o f t h e AH f o r s u -p e r h e l i x r e l a x a t i o n i n v i e w o f t h e s m a l l e n t h a l p i e s o f h y d r o -

T a b l e 1 . A H a s s o c i a t e d w i t h r e l a x a t i o n o f c o v a l e n t l y c l o s e d c i r c u l a r ( c c c ) DNAE x p . DNA, mg c c c DNA, % AQ m e a s u r e m e n t , j u J AQ c o r r e c t i o n , u J A H , k J - ( m o l o f p l a s m i d ) - '

1 1 . 0 7 6 9 5 - 1 4 9 0 - 1 1 7 6 - 2 2 1 22 2 . 2 6 3 8 5 - 1 7 3 2 - 1 2 1 3 - 1 9 4 33 2 . i 1 9 8 3 - 2 0 2 5 - 1 5 6 1 - 1 9 0 04 3 . 1 7 3 7 5 - 1 5 7 7 - 6 3 6 - 2 8 4 75 2 . 8 7 0 8 5 - 8 0 3 - 1 3 4 - 1 9 7 56 2 . 3 6 6 9 5 - 9 2 1 - 8 4 - 2 6 8 1

Mean S E M - 2 2 6 0 4 0 9C a l o r i m e t r i c a l l y d e t e r m i n e d e n t h a l p y , A H , a s s o c i a t e d w i t h r e l a x a t i o n o f c o v a l e n t l y c l o s e d c i r c u l a r s u p e r h e l i c a l C o l E lamp p l a s m i d DN A i n t h e p r e s e n c e o f t o p o i s o m e r a s e a t 3 7 0 C i n 0 . 0 1 M T r i s / 0 . 0 0 2 M M g C l 2 / 0 . 0 0 1 M E D T A , pH = 8 . 0 . Mo fC o l E l a m p , 7 . 2 x 1 0 6 ; A Q , h e a t c h a n g e .

L

B i o c h e m i s t r y : S e i d l a n d H i n z

8/3/2019 Angela Seidl and Hans-Jurgen Hinz- The free energy of DNA supercoiling is enthalpy-determined

3/5

1 3 1 4 B i o c h e m i s t r y : S e i d l a n d H i n zl y s i s o f a c y c l i c p h o s p h a t e e s t e r s ( 4 2 ) . S u m m a r i z i n g t h e en-t h a l p y d e t e r m i n a t i o n s , one c an s ay t h a t r e l a x a t i o n o f s u p e r -h e l i c a l t u r n s o f C o l E l amp DNA i s a s t r o n g l y e x o t h e r m i cr e a c t i o n . T h e r e f o r e , i n t r o d u c t i o n o f s u p e r h e l i c i t y i s e n d o -t h e r m i c .G i b b s F r e e E n e r g y o f S u p e r c o i l i n g . S e v e r a l q u a n t i t a t i v et r e a t m e n t s o f t h e G i b b s f r e e e n e r g y o f s u p e r h e l i x f o r m a t i o nh a v e b e e n g i v e n ( 2 3 , 2 5 , 3 3 , 3 4 ) , w h i c h a l l r e s u l t e d i n approx-i m a t e l y q u a d r a t i c d e p e n d e n c e o f t h e G i b b s f r e e e n e r g y o nt h e t i t r a t a b l e s u p e r h e l i x d e n s i t y o a g i v e n i n E q . 1 ( 2 ) :

A G O 1 0 RTNo2, [1]i n w h i c h N r e f e r s t o t h e n u m b e r o f b a s e p a i r s , R i s t h e g asc o n s t a n t , a n d T i s t h e a b s o l u t e t e m p e r a t u r e . T h e f a c t o r 1 0s t e m s f r o m t h e r e s u l t s i n r e f . 3 3 . W e a s s u m e d t h a t t h e v a l u eo f 1 0 0 0 f o r t h e e x p r e s s i o n N-K/RT i n Depew a n d W a n g ' st r e a t m e n t d e t e r m i n e d f o r PM2 DNA i s a l s o v a l i d f o r C o l E iamp p l a s m i d DNA, w h i c h h a s a 10% l a r g e r n u m b e r o f b a s ep a i r s ( 1 1 , 0 0 0 ) .W e o b t a i n e d v a l u e s f o r t h e s u p e r h e l i x d e n s i t y a p p l y i n gtwo i n d e p e n d e n t m e t h o d s . W e u s e d c o n v e n t i o n a l C s C l d e n -s i t y g r a d i e n t c e n t r i f u g a t i o n w i t h PM2 a n d f d DNA as s t a n -d a r d s a n d u s e d t h e f l u o r e s c e n c e a s s a y as d e s c r i b e d b y L e ea n d M o r g a n ( 4 1 ) i n t h e presen ce o f a t o p o i s o m e r a s e . A s d i s -t i n g u i s h e d f r o m r e f . 4 1 , we u s e d f o r r e l a x a t i o n t h e wr o t e i n ,w h i c h ca n o n l y r e l a x n e g a t i v e l y s u p e r c o i l e d DNA b u t n o tp o s i t i v e l y s u p e r c o i l e d m o l e c u l e s . T h i s d i f f e r e n c e d o e s n o t ,h o w e v e r , a f f e c t t h e a ccu ra c y o f t h e p r o c e d u r e .T h e a v e r a g e v a l u e o b t a i n e d f o r t h e s u p e r h e l i x d e n s i t y o fC o l E l ampDNA a t 3 7 T C i s a r = - 0 . 0 5 7 . 0 0 4 . T h i s v a l u ec o r r e s p o n d s t o a G i b b s f r e e e n e r g y o f A G , ( 3 7 0 C ) = 9 2 1 +1 3 0 k J - ( m o l o f p l a s m i d ) - l . U s i n g t h e f u n d a m e n t a l t h e r m o d y -n a m i c r e l a t i o n s h i p A G = A H -T A S , o n e o b t a i n s f o r t h e en-t r o p y c h a n g e o n s u p e r h e l i x f o r m a t i o n ( 4 . 3 1 . 8 ) k F ( m o l o fp l a s m i d K ) - 1 . T h e error l i m i t s g i v e n f o r AS r e f e r t o t h e com-b i n a t i o n s o f t h e l o w e r - l i m i t AH v a l u e w i t h t h e u p p e r - l i m i tA G v a l u e a n d v i c e ver sa.

C a l c u l a t i o n o f DN A R i g i d i t y . A l t h o u g h m u c h i s k n o w na b o u t l o n g - r a n g e s e g m e n t a l m o t i o n s i n DNA, t h e r e i s r e l a -t i v e l y l i t t l e i n f o r m a t i o n a b o u t l o c a l m o t i o n s i n t h e DNA h e -l i x . P a r a m e t e r s t h a t d e s c r i b e t h e s t a b i l i t y o f DNA a g a i n s tt o r s i o n a n d b e n d i n g a r e t h e t o r s i o n a l a n d f l e x u r a l r i g i d i t y .T h e s e p a r a m e t e r s ar e i m p o r t a n t f o r u n d e r s t a n d i n g t h e s t r u c -t u r a l f e a t u r e s o f d u p l e x DNA s u c h as s u p e r c o i l i n g a n d p a c k -aging i n c h r o m o s o m e s a n d b a c t e r i o p h a g e h e a d s , w h i c h canb e q u a l i t a t i v e l y a c c o u n t e d f o r b y m o d e l s b a s e d on t h e e l a s t i cp r o p e r t i e s o f DNA ( 4 3 - 4 7 ) . V a r i o u s e s t i m a t e s o f t h e t o r s i o n -a l r i g i d i t y , C , h a v e b e e n p u b l i s h e d ; t h e l a r g e s t c o l l e c t i o n o fd a t a i s f o u n d i n r e f . 4 8 . V a l u e s o f t h e t o r s i o n a l r i g i d i t y h a v eb e e n o b t a i n e d f r o m t i m e - d e p e n d e n t f l u o r e s c e n c e d e p o l a r i z a -t i o n measurements on e t h i d i u m i n t e r c a l a t i o n i n l i n e a r a n dc i r c u l a r DNAs ( 4 8 - 5 0 ) f r o m EPR s p e c t r o s c o p y o f i n t e r c a l a t -e d s p i n p r o b e s ( 5 1 , 5 2 ) a n d f r o m t h e f r e e e n e r g y o f s u p e r c o i l -i n g ( 3 3 , 3 4 , 5 3 ) . T h e r e i s a c o n s i d e r a b l e s p r e a d in t h e d a t a ,e v e n i f o n e c o m p a r e s o n l y t h e f e w v a l u e s p u b l i s h e d f o r t h et o r s i o n a l r i g i d i t i e s o f c i r c u l a r DNA. Th e C v a l u e s , which canb e c a l c u l a t e d f r o m t h e A G d a t a o f Depew a n d W a n g ( 3 3 ) an dP u l l e y b l a n k e t a l . ( 3 4 ) f o r s e v e r a l c i r c u l a r DNA s, range fromC = 0 . 6 4 x 1 0 - 1 9 t o C = 1 . 0 8 6 x 1 0 - 1 9 erg-cm ( 1 erg = 0 . 1, J ) , w h e r e a s t h e C v a l u e o f pBR322 d e r i v e d from t h e f l u o -r e scen ce d e p o l a r i z a t i o n m e a s u r e m e n t s by M i l l a r et a l . ( 4 8 ) i s1 . 9 5 x 1 0 - 1 e r g - c m .I t d o e s n o t a p p e a r v e r y l i k e l y t h a t t h e s e l a r g e d i f f e r e n c e si n t h e t o r s i o n a l r i g i d i t i e s o r i g i n a t e f r o m e x p e r i m e n t a l e r r o r s ;r a t h e r , a s y s t e m a t i c erlor a p p e a r s t o b e r e s p o n s i b l e f o r t h ef a c t t h a t c o n s i s t e n t l y s m a l l e r v a l u e s ar e d e t e r m i n e d f o r Cw h e n G i b b s e n e r g y v a l u e s a r e u s e d i n t h e c a l c u l a t i o n s . I t h a sb e e n o b s e r ve d b y M i l l a r e t a l . ( 4 8 ) t h a t t h e t o r s i o n a l r i g i d i t i e so f p o l y n u c l e o t i d e s c o r r e l a t e w i t h o u t e x c e p t i o n w i t h t h e c a l -

c u l a t e d s t a c k i n g e n e r g i e s a n d n o t w i t h t h e t m ( m e l t i n g t e m -p e r a t u r e s o f d o u b l e - s t r a n d e d DNA) v a l u e s o f t h e s y s t e m s .A l t h o u g h r e l a t i v e t m v a l u e s d o n o t c o r r e s p o n d r i g o r o u s l y t or e l a t i v e s t a b i l i t i e s , w h i c h a r e d e t e r m i n e d b y A G , t h e y u s u a l -l y c o n s t i t u t e a f a i r a p p r o x i m a t i o n .W e a s s u m e o n t h e b a s i s o f t h i s ' b b s e r v a t i o n t h a t n o t t h eG i b b s e n e r g y o f s u p e r c o i l i n g b u t r a t h e r t h e e n t h a l p y o f t h er e a c t i o n m a y b e t h e a p p r o p r i a t e q u a n t i t y f o r t h e c a l c u l a t i o no f t o r s i o n a l r i g i d i t i e s - a t l e a s t t o c o m p a r e t h e n u m e r i c a l v a l -u e s d e r i v e d f r o m f l u o r e s c e n c e d e p o l a r i z a t i o n m e a s u r e m e n t so f i n t e r c a l a t e d d y e s . F u r t h e r m o r e , i f o n e a s s u m e s t h a t t h een t ha l p y o f s u p e r c o i l i n g r e s u l t s e x c l u s i v e l y f r o m t o r s i o n a n dn o t f r o m b e n d i n g a s w a s d o n e i n t h e m a j o r i t y o f s t u d i e s c i t e da b o v e , o ne c a n r e l a t e t h e o b s e r v e d e n t h a l p y t o t o r s i o n a l r i -g i d i t y b y t h e e x p r e s s i o n f o r t h e t o r s i o n a l e l a s t i c e n e r g y U( 4 9 )

U , C 4 2 / 1 ,i n w h i c h U i s t h e e n e r g y o f a t w i s t 4 i i n a l e n g t h 1 . A s s u m i n g 1= 3 . 4 x 1 0 - 8 cm f o r t h e d i s t a n c e o f t w o b a s e p a i r s i n t h e B -DNA s t r u c t u r e , w e o b t a i n f o r t h e t w i s t i n t h i s l e n g t h 4 = 2i r r i N , w i t h r d e n o t i n g t h e n u m b e r o f s u p e r h e l i c a l t u r n s a n dN b e i n g t h e n u m b e r o f b a s e p a i r s i n t h e p l a s m i d . T i s c a l c u l a t -e d f r o m t h e s u p e r h e l i c a l d e n s i t y b y m u l t i p l y i n g w i t h 1 / 1 0 t ho f t h e n u m b e r o f b a s e p a i r s . U s i n g t h e e n t h a l p y v a l u e o f 2 2 6 0k J ( m o l o f p l a s m i d ) - 1 , o n e o b t a i n s f o r t h e t o r s i o n a l r i g i d i t y o fC o l E l amp p l a s m i d DNA C = ( 1 . 7 9 + 0 . 3 ) x 1 0 - 1 9 e r g - c m ,t h e e r r o r l i m i t s r e f e r r i n g t o c a l c u l a t i o n s w i t h AH = 2 6 6 9 a n dA H = 1 8 5 1 k J ( m o l o f p l a s m i d ) - ' , r e s p e c t i v e l y .

DISCUSSIONT h e p r e s e n t s t u d y o n t h e t h e r m o d y n a m i c s o f s u p e r h e l i x f o r -m a t i o n p r o v i d e s d i r e c t l y m e a s u r e d e n t h a l p y v a l u e s , w h i c hp e r m i t a n u n a m b i g u o u s a s s i g n m e n t o f t h e e n t h a l p i c a n d e n -t r o p i c c o n t r i b u t i o n s t o t h e u n f a v o r a b l e G i b b s f r e e e n e r g y o fs u p e r c o i l i n g . T h e l a r g e p o s i t i v e e n t h a l p y c o n c o m i t a n t w i t hi n t r o d u c i n g s u p e r h e l i c a l t u r n s i s c l e a r l y t h e m a j o r f a c t o r d e -t e r m i n i n g t h e u n f a v o r a b l e AG o f s u p e r c o i l i n g . A s s u m i n g t h a tC o l E l amp p l a s m i d i s n o t e x c e p t i o n a l i n i t s t h e r m o d y n a m i cp r o p e r t i e s , t h e p r e s e n t r e s u l t s u g g e s t s t h a t , i n g e n e r a l , s u -p e r c o i l i n g o f DNA i s e n t h a l p y - d e t e r m i n e d . T h i s c o n c l u s i o ni s s u p p o r t e d b y m e a s u r e m e n t s o n PM2 DNA p e r f o r m e d i no u r l a b o r a t o r y , w h e r e p r e l i m i n a r y d a t a i n d i c a t e t h a t a l s o f o rPM2 DNA t h e p o s i t i v e e n t h a l p y i n v o l v e d i n s u p e r h e l i x f o r -m a t i o n i s t h e d o m i n a n t c o m p o n e n t o f t h e s u p e r h e l i x f r e e e n -e r g y . T h e s e r e s u l t s r e s o l v e t h e a m b i g u i t y i n t h e i n t e r p r e t a -t i o n o f p r e v i o u s m e a s u r e m e n t s ( 3 3 , 3 4 ) o n t h e t h e r m o d y n a m -i c s o f s u p e r c o i l i n g .I n a r e c e n t p u b l i c a t i o n o n t h e u n w i n d i n g o f d o u b l e - s t r a n d -e d l i n e a r DNA b y d e h y d r a t i o n a n d s u b s e q u en t c l o s i n g b yl i g a s e , e s t i m a t e s o f t h e e n t h a l p y o f u n w i n d i n g o n e l i n k o f t h eDNA h e l i x w e r e g i v e n ( 5 4 ) . A A H v a l u e o f 5 1 1 . 7 k J - ( m o lo f 1 0 b a s e p a i r s ) - ' w a s r e p o r t e d , a n d i t w a s c o n s i d e r e d t o b ei n d e p e n d e n t o f b o t h DN A s i z e a n d t h e l i n k i n g n u m b e r . T h e s eA H v a l u e s s h o u l d b e r o u g h l y c o m p a r a b l e t o t h e e n t h a l p y a s -s o c i a t e d w i t h i n t r o d u c i n g o n e s u p e r h e l i c a l t u r n . T h e s u p e r -h e l i x d e n s i t y o f 0 . 0 5 7 d e t e r m i n e d i n t h i s s t u d y f o r C o l E lamp DNA i s e q u i v a l e n t t o 6 3 s u p e r h e l i c a l t u r n s . U s i n g t h i sv a l u e , we o b t a i n 3 4 . 9 k J ( m o l o f s u p e r h e l i c a l t u r n s ) ' , w h i c hi s a p p r o x i m a t e l y 70% o f t h e A H r e p o r t e d b y L e e e t a l . ( 5 4 ) .I n v i e w o f t h e v a s t l y d i f f e r e n t m e t h o d s u s e d , t h e a g r e e m e n ta p p e a r s t o b e r e l a t i v e l y g o o d .E l a s t i c P r o p e r t i e s o f DNA. T h e t o r s i o n a l r i g i d i t y o f C o l E lamp DNA h a s b e e n c a l c u l a t e d o n t h e a s s u m p t i o n t h a t o n l yt o r s i o n c o n t r i b u t e d t o t h e e n t h a l p y o f s u p e r c o i l i n g , t h e b e n d -i n g c o n t r i b u t i o n b e i n g n e g l i g i b l e . T h i s a s s u m p t i o n c e r t a i n l yc o n s t i t u t e s o n l y a n a p p r o x i m a t i o n . I t i s d u e t o a g e n e r a l u n -

P r o c . N a t L Acad S c i . USA 8 1 ( 1 9 8 4 )

8/3/2019 Angela Seidl and Hans-Jurgen Hinz- The free energy of DNA supercoiling is enthalpy-determined

4/5

P r o c . N a t L Acad S c i . USA 8 1 ( 1 9 8 4 ) 1 3 1 5c e r t a i n t y o f how t o p a r t i t i o n u n a m b i g u o u s l y t h e o v e r a l l e x -p e r i m e n t a l d a t a i n t o c o n t r i b u t i o n s f r o m b e n d i n g a n d t o r s i o n .T h e r e f o r e , i n t h e m a j o r i t y o f s t u d i e s ( 3 3 , 3 4 , 5 0 , 5 1 , 5 2 ) , o n l yt h e l i m i t i n g c a s e o f v a n i s h i n g b e n d i n g c o n t r i b u t i o n s h a s b e e nc o n s i d e r e d . Thomas e t a l . ( 5 0 ) d e r i v e d a v a l u e o f C = 1 . 2 9 x1 0 - 1 9 e r g - c m f r o m t i m e - d e p e n d e n t f l u o r e s c e n c e d e p o l a r i z a -t i o n m e a s u r e m e n t s o n e t h i d i u m i n t e r c a l a t e d i n v i r a l 4 2 9DNA. H u r l e y e t a l . ( 5 1 ) d e t e r m i n e d C = 1 . 2 x 1 0 - 1 9 e r g - c mb y EPR s t u d i e s o n s p i n p r o b e s i n t e r c a l a t e d i n c h i c k e n e r y t h -r o c y t e DNA. B a r k l e y a n d Zimm ( 4 9 ) o b t a i n e d a v a l u e o f C =4 . 1 2 5 x 1 0 1 9 e r g - c m f r o m f i t t i n g t h e f l u o r e s c e n c e d e p o l a r -i z a t i o n d at a o f W a h l e t a l . ( 5 5 ) t o t h e i r t h e o r e t i c a l m o d e l . T h ep r e v i o u s l y m e n t i o n e d t o r s i o n a l r i g i d i t i e s f o r s u p e r h e l i c a lDNA c a l c u l a t e d f r o m t h e AG d a t a o f P u l l e y b l a n k e t a l . ( 3 4 )a n d Depew a n d Wang ( 3 3 ) r a n g e f r o m 0 . 6 4 . 1 0 - 1 9 e r g - c m t o1 . 0 8 6 . 1 0 - 1 9 e r g - c m . J u s t a s a l l C v a l u e s m e n t i o n e d s o f a r , t h e yh a v e b ee n c a l c u l a t e d o n t h e a s s u m p t i o n t h a t o n l y t o r s i o nc o n t r i b u t e d t o t h e G i b b s e n e r g y o f s u p e r h e l i x f o r m a t i o n . T h ee l a s t i c m o d e l o f DNA d e v e l o p e d b y B a r k l e y a n d Z imm ( 4 9 )p e r m i t s o n e t o a n a l y z e f l u o r e s c e n c e d ep o l a r i z a ti o n d a t a i nt e r m s o f b e n d i n g a n d t w i s t i n g c o n t r i b u t i o n s , p r o v i d e d t h et i m e r e s o l u t i o n o f t h e m e a s u r e m e n t s i s h i g h e n o u g h . M i l l a re t a l . ( 4 8 ) w e r e a b l e t o r e p o r t d a t a o n t h e t o r s i o n a l r i g i d i t y o fc a l f t h y m u s DNA ( C = 1 . 4 3 x 1 0 - 1 9 e r g - c m ) a n d c i r c u l a rp B R 3 2 2 DNA ( C = 1 . 9 5 x 1 0 - 1 9 e r g - c m ) , w h e r e t he y t o o kt h e f l e x u r a l r i g i d i t y i n t o a c c o u n t . T h e i r v a l u e f o r c a l f t h y m u sDNA i s h i g h e r [ w i t h t h e e x c e p t i o n o f t h e v a l u e b y B a r k l e ya n d Zimm ( 4 9 ) ] t h a n a l l o t h e r t o r s i o n a l r i g i d i t i e s f o r l i n e a rDNAs, a n d t h e v a l u e f o r s u p e r h e l i c a l p B R 3 2 2 DNA i s d e c i d -e d l y h i g h e r t h a n t h a t f o r l i n e a r DNA. M i l l a r e t a l . ( 4 8 ) e m -p h a s i z e t h a t , f o r a c o r r e c t a n a l y s i s o f t h e f l u o r e s c e n c e d e c a ym e a s u r e m e n t s , i n c l u s i o n o f t h e b e n d i n g d y n a m i c s i s v e r y i m -p o r t a n t . T h e r e f o r e , i t i s s u r p r i s i n g t h a t t h e t o r s i o n a l r i g i d i t yo b t a i n e d f o r c i r c u l a r C o l E 1 amp DNA ( C = 1 . 7 9 x 1 0 - 1 9e r g - c m ) i n t h e p r e s e n t s t u d y f r o m t h e e n t h a l p y o f s u p e r c o i l -i n g i s i n g o o d a g r e e m e n t w i t h t h e i r v a l u e o b t a i n e d f o rp B R 3 2 2 b e c a u s e b e n d i n g c o n t r i b u t i o n s t o A H h a v e b e e n n e -g l e c t e d i n o u r c a l c u l a t i o n . W e d o n o t b e l i e v e t h a t t h e a g r e e -m e n t i s o n l y f o r t u i t o u s . I t may w e l l b e t h a t t h e f a s t l o c a lb e n d i n g m o t i o n s o f DNA i n t h e p i c o s e c o n d a n d n a n o s e c o n dr a n g e s , r e s p o n s i b l e f o r t h e f l u o r e s c e n c e a n i s o t r o p y d e c a y o ft h e i n t e r c a l a t e d d y e , d o n o t c o n t r i b u t e s i g n i f i c a n t l y t o t h er e a c t i o n e n t h a l p y a s s o c i a t e d w i t h t h e t r a n s f o r m a t i o n o f u n -d e r w o u n d , s u p e r c o i l e d c i r c u l a r DNA i n t o r e l a x e d c i r c u l a rDNA. T h i s a s s u m p t i o n i s r e a s o n a b l e i n v i e w o f t h e l a r g e s i z eo f t h e p l a s m i d a n d t h e m o d e r a t e s u p e r h e l i x d e n s i t y .R e c e n t l y V o l o g o d s k i i e t a l . ( 5 3 ) p e r f o r m e d M o n t e C a r l oc a l c u l a t i o n s o f t h e b e n d i n g c o n t r i b u t i o n s t o t h e l i n k i n g n u m -b e r d i s t r i b u t i o n o f s u p e r c o i l e d DNAs, w h i c h r e s u l t e d i n av a l u e o f C = ( 1 . 6 5 + 0 . 3 3 ) x 1 0 - 1 9 e r g - c m . H o w e v e r , t h e s ec a l c u l a t i o n s a l s o may b e u s e f u l f o r s o l v i n g t h e p r o b l e m o f t h er e l a t i v e c o n t r i b u t i o n s o f b e n d i n g a n d t o r s i o n . T h e c a l c u l a -t i o n s d e m o n s t r a t e d t h a t t h e w i d t h o f t h e w r i t h i n g - n u m b e rd i s t r i b u t i o n e q u a l s a p p r o x i m a t e l y h a l f t h e w i d t h o f t h e l i n k -i n g - n u m b e r d i s t r i b u t i o n a s d e t e r m i n e d i n r e f s . 3 3 a n d 3 4 ; i n

o t h e r w o r d s , h a l f o f t h e t o t a l n u m b e r o f t i t r a t a b l e s u p e r h e l i -c a l t u r n s i s r e a l i z e d a s w r i t h i n g o f t h e h e l i x a x i s , a n d t h eo t h e r h a l f , a s a x i a l t w i s t i n g . A p p l i c a t i o n o f t h i s r e s u l t t o e n -e r g y d a t a i s n o t s t r a i g h t f o r w a r d . T h e n u m b e r o f s u p e r h e l i c a lt u r n s i s n o t n e c e s s a r i l y e q u a l t o t h e v a lu e o f t h e w r i t h i n gn u m b e r ( 5 6 ) , a n d i t i s n o t o b v i o u s w h e t h e r t h e r e s u l t s o f V o -l o g o d s k i i e t a l . ( 5 3 ) , w h i c h a r e v a l i d f o r t h e G i b b s e n e r g i e s ,c a n b e a s s u m e d t o a p p l y t o t h e r e a c t i o n e n t h a l p i e s . H o w e v -e r , when m a k i n g t h e s e a s s u m p t i o n s , o n l y h a l f o f t h e o v e r a l lA H - i . e . , a b o u t 1 1 0 0 k J - ( m o l o f p l a s m i d ) - l - w o u l d b e a t -t r i b u t e d t o t o r s i o n a l e n e r g y ; t h e r e s i d u a l e n t h a l p y w o u l d b ea s s i g n e d t o b e n d i n g . By i d e n t i f y i n g t h e w r i t h i n g number w i t ht h e n u m b e r o f t e r t i a r y t ur ns a s a f i r s t a p p r o x i m a t i o n , o n l yh a l f o f t h e t i t r a t a b l e s u p e r h e l i c a l d e n s i t y i s r e a l i z e d a s t w i s t ,a c c o r d i n g t o r e f . 5 3 . B e c a u s e t h e t o r s i o n a l e n e r g y d e p e n d s

o n t h e s q u a r e o f t h e t w i s t , t h e r e d u c t i o n b y a f a c t o r o f 2 o fb o t h t h e e n t h a l p y a n d t h e t w i s t d o e s n o t c a n c e l e a c h o t h e r .T h e c a l c u l a t i o n l e a d s t o a s i g n i f i c a n t l y l a r g e r v a l u e f o r t h et o r s i o n a l r i g i d i t y C o f 3 . 5 8 x 1 0 - 1 9 e r g - c m .I n v i e w o f t h e d i f f e r e n c e s b e t w e e n r i g i d i t y v a l u e s o b t a i n e db y d i f f e r e n t e x p e r i m e n t a l a p p r o a c h e s a nd o n t h e b a s i s o f d i f -f e r e n t t h e o r e t i c a l m o d e l s , much e x p e r i m e n t a l a n d t h e o r e t i -c a l w o r k a p p e a r s t o b e n e c e s s a r y f o r r e s o l u t i o n o f t h e p r o b -l e m s .

T h i s w o r k h a s b e n e f i t e d t r e m e n d o u s l y f r o m c o l l a b o r a t i o n w i t h an u m b e r o f h e l p f u l c o l l e a g u e s . W e g r a t e f u l l y a c k n o w l e d g e s t i m u l a t -i n g d i s c u s s i o n s w i t h P r o f . R . S c h m i t t , I n s t i t u t f u r G e n e t i k . W e a r em u c h o b l i g e d t o D r . R . M a t t e s , B o e h r i n g e r , f o r p r o v i s i o n o f t h e b a c -t e r i a l s t r a i n a n d m u c h h e l p f u l a d v i c e c o n c e r n i n g t h e p r e p a r a t i o n o ft h e p l a s m i d s . W e a r e g r e a t l y i n d e b t e d t o P r o f . H . - P . V o s b e r g , M a xP l a n c k I n s t i t u t , H e i d e l b e r g , f o r e n c o u r a g e m e n t , m a n y s u g g e s t i o n s ,a n d a d v i c e i n t h e p r e p a r a t i o n o f w p r o t e i n . W e a p p r e c i a t e t h e f i n a n -c i a l s u p p o r t o f t h e D e u t s c h e F o r s c h u n g s g e m e i n s c h a f t .1 . B a u e r , W . R . ( 1 9 7 8 ) A n n u . R e v . B i o p h y s . B i o e n g . 7 , 2 8 7 - 3 1 3 .2 . G e l l e r t , M . , M i z u u c h i , K . , O ' D e a , M . H . & N a s h, H . A .( 1 9 7 6 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 3 , 3 8 7 2 - 3 8 7 6 .3 . G e l l e r t , M . ( 1 9 8 1 ) A n n u . R e v . B i o c h e m . 5 0 , 8 7 9 - 9 1 0 .4 . R i c h a r d s o n , J . P . ( 1 9 7 4 ) B i o c h e m i s t r y 1 3 , 3 1 6 4 - 3 1 6 9 .5 . R i c h a r d s o n , J . P . ( 1 9 7 5 ) J . M o l . B i o l . 9 1 , 4 7 7 - 4 8 7 .6 . S e e b u r g , P . H . , N u s s l e i n , C . & S c h a l l e r , H . ( 1 9 7 7 ) E u r . J . B i o -c h e m . 7 4 , 1 0 7 - 1 1 3 .7 . B o t c h a n , P . , W a n g , J . C . & E c h o l s , H . ( 1 9 7 3 ) P r o c . N a d l .A c a d . S c i . USA 7 0 , 3 0 7 7 - 3 0 8 1 .8 . B o t c h a n , P . ( 1 9 7 6 ) J . M o l . B i o l . 1 0 5 , 1 6 1 - 1 7 6 .9 . L e v i n e , A . D . & R u p p , W . D . ( 1 9 7 8 ) i n M i c r o b i o l o g y , e d .S c h l e s s i n g e r , D . ( A m e r i c a n S o c i e t y o f M i c r o b i o l o g y , W a s h i n g -t o n , D C ) , p . 1 6 3 .1 0 . W e l l s , R . D . , G o o d m a n , T . C . , H i l l e n , W . , H o r n , G . T . ,K l e i n , R . D . , L a r s o n , J . E . , M u l l e r , U . R . , N e u e n d o r f , S . K . ,P a n a y o t a t o s , N . & S t i r d i v a n t , S . M . ( 1 9 8 0 ) P r o g . N u c l e i c A c i dR e s . M o l . B i o l . 2 4 , 1 6 7 - 2 6 7 .1 1 . Y a n g , H . - L . , H e l l e r , K . , G e l l e r t , M . & Z u b ay , G . ( 1 9 7 9 ) P r o c .N a t l . A c a d . S c i . USA 7 6 , 3 3 0 4 - 3 3 0 8 .1 2 . A k r i g g , A . & C o o k , P . R . ( 1 9 8 0 ) N u c l e i c A c i d s R e s . 8 , 8 4 5 -8 5 4 .

1 3 . M i z u u c h i , K . , G e l l e r t , M . & N a s h, H . A . ( 1 9 7 8 ) J . M o l . B i o l .1 2 1 , 3 7 5 - 3 9 2 .1 4 . H e l l a n d , D . , N e s , I . F . & K l e p p e , K . ( 1 9 8 2 ) FEBS L e t t . 1 4 2 ,1 2 1 - 1 2 4 .1 5 . H a y s , J . & B o e h m e r , S . ( 1 9 7 8 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 5 ,4 1 2 5 - 4 1 2 9 .1 6 . P a n a y o t a t o s , N . & W e l l s , R . D . ( 1 9 8 1 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 2 8 9 ,4 6 6 - 4 7 0 .1 7 . M i z u u c h i , K . , M i z u u c h i , M . & G e l l e r t , M . ( 1 9 8 2 ) J . M o l . B i o l .1 5 6 , 2 2 9 - 2 4 3 .1 8 . V o l o g o d s k i i , A . V . & F r a n k - K a m e n e t s k i i , M . D . ( 1 9 8 2 ) FEBSL e t t . 1 4 3 , 2 5 7 - 1 6 0 .1 9 . B e n h a m , C . J . ( 1 9 8 2 ) B i o p o l y m e r s 2 1 , 6 7 9 - 6 9 6 .2 0 . V i n o g r a d , J . , L e b o w i t z , J . & W a t s o n , R . ( 1 9 6 8 ) J . M o l . B i o l .3 3 , 1 7 3 - 1 9 7 .2 1 . D a v i d s o n , N . ( 1 9 7 2 ) J . M o l . B i o l . 6 6 , 3 0 7 - 3 0 9 .2 2 . B a u e r , W. & V i n o g r a d , J . ( 1 9 6 8 ) J . M o l . B i o l . 3 3 , 1 7 3 - 1 9 7 .2 3 . B a u e r , W. & V i n o g r a d , J . ( 1 9 7 0 a ) J . M o l . B i o l . 4 7 , 4 1 9 - 4 3 5 .2 4 . B a u e r , W . & V i n o g r a d , J . ( 1 9 7 0 b ) J . M o l . B i o l . 5 4 , 2 8 1 - 2 9 8 .2 5 . H s i e h , T . & W a n g , J . C . ( 1 9 7 5 ) B i o c h e m i s t r y 1 4 , 5 2 7 - 5 3 3 .2 6 . W a n g , J . C . ( 1 9 7 4 a ) J . M o l . B i o l . 8 7 , 7 9 7 - 8 1 6 .2 7 . W a n g , J . C . ( 1 9 6 9 ) J . M o l . B i o l . 4 3 , 2 6 3 - 2 7 2 .2 8 . B a u e r , W. & V i n o g r a d , G . ( 1 9 6 8 ) J . M o l . B i o l . 3 3 , 1 4 1 - 1 7 2 .2 9 . C r a w f o r d , L . V . & W a r i n g , M . J . ( 1 9 6 7 ) J . M o l . B i o l . 2 5 , 2 3 -3 0 .3 0 . W a n g , J . C . ( 1 9 7 4 ) J . M o l . B i o l . 8 9 , 7 8 3 - 8 0 1 .3 1 . K e l l e r , W. ( 1 9 7 5 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 2 , 4 8 7 6 - 4 8 8 0 .3 2 . S h u r e , M . & V i n o g r a d , J . ( 1 9 7 6 ) C e l l 8 , 2 1 5 - 2 2 6 .3 3 . D e p e w , R . E . & W a n g , J . C . ( 1 9 7 5 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i .USA 7 2 , 4 2 7 5 - 4 2 7 9 .3 4 . P u l l e y b l a n k , D . E . , S h u r e , M . , T a ng , D . , V i n o g r a d , J . & V o s -b e r g , H . - P . ( 1 9 7 5 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 2 , 4 2 8 0 - 4 2 8 4 .3 5 . B u r k a r d t , H . J . , M a t t e s , R . , S c h m i d , K . & S c h m i t t , R . ( 1 9 7 8 )M o l . G e n . G e n e t . 1 6 6 , 7 5 - 8 4 .

B i o c h e m i s t r y : S e i d l a n d H i n z

8/3/2019 Angela Seidl and Hans-Jurgen Hinz- The free energy of DNA supercoiling is enthalpy-determined

5/5

1 3 1 6 B i o c h e m i s t r y : S e i d l a n d Hinz3 6 . V o o r d o u w , G . , K a m , Z . , B o r o c h o v , N . & E i s e n b e r g , H . ( 1 9 7 8 )B i o p h y s . C h e m . 8 , 1 7 1 - 1 8 9 .3 7 . W a n g , J . C . ( 1 9 7 1 ) J . M o l . B i o l . 5 5 , 5 2 3 - 5 3 3 .3 8 . L i t m a n , R . M . ( 1 9 6 8 ) J . B i o l . C h e m . 2 4 3 , 6 2 2 2 - 6 2 3 3 .3 9 . B r a d f o r d , M . M. ( 1 9 7 6 ) A n a l . B i o c h e m . 7 2 , 2 4 8 - 2 5 4 .4 0 . W a n g , J . C . ( 1 9 7 2 ) i n DNA S y n t h e s i s i n V i t r o , e d s . W e l l s ,R . D . & I n m a n , R . B . ( U n i v . P a r k P r e s s , B a l t i m o r e , M D ) , p p .1 6 3 - 1 7 4 .4 1 . L e e , J . S . & M o r g a n , A . R . ( 1 9 7 8 ) N u c l e i c A c i d s R e s . 5 , 2 4 2 5 -

2 4 3 9 .4 2 . G e r l t , J . A . , W e s t h e i m e r , F . H . & S t u r t e v a n t , J . M . ( 1 9 7 5 ) J .B i o l . C h e m . 2 5 0 , 5 0 5 9 - 5 0 6 7 .4 3 . B e n h a m , C . J . ( 1 9 8 2 ) B i o p o l y m e r s 2 1 , 6 7 9 - 6 9 6 .4 4 . C a l l a d i n e , C . R . ( 1 9 8 0 ) B i o p o l y m e r s 1 9 , 1 7 0 5 - 1 7 1 3 .4 5 . L e B r e t , M . ( 1 9 7 9 ) B i o p o l y m e r s 1 8 , 1 7 0 9 - 1 7 2 5 .4 6 . C a m e r i n i - O t e r o , R . D . & F e l s e n f e l d , G . ( 1 9 7 8 ) P r o c . N a t l .A c a d . S c i . USA 7 5 , 1 7 0 8 - 1 7 1 2 .4 7 . L e B r e t , M . ( 1 9 8 0 ) B i o p o l y m e r s 1 9 , 6 1 9 - 6 3 7 .

P r o c . N a t L A c a d . S c i . U S A 8 1 ( 1 9 8 4 )4 8 . M i l l a r , D . P . , R o b b i n s , R . J . & Z e w a i , A . H . ( 1 9 8 2 ) J . C h e m .P h y s . 7 6 , 2 0 8 0 - 2 0 9 4 .4 9 . B a r k l e y , M . D . & Z i m m , B . H . ( 1 9 7 9 ) J . C h e m . P h y s . 7 0 ,2 9 9 1 - 3 0 0 7 .5 0 . T h o m a s , J . C . , A l l i s o n , S . A . , A p p e l h o f , C . J . & S c h u r r , J . M .( 1 9 8 0 ) B i o p h y s . C h e m . 1 2 , 1 7 7 - 1 8 8 .5 1 . H u r l e y , I . , R o b i n s o n , B . H . , S c h o l e s , C . P . & L e r m a n , L . S .( 1 9 8 0 ) i n N u c l e i c A c i d G eo m e t r y a n d D y n a m i c s , e d . S a r m a , H .( P e r g a m o n , New Y o r k ) , p p . 2 5 3 - 2 7 1 .5 2 . R o b i n s o n , B . H . , L e r m a n , L . S . , B e t h , A . H . , F r i s c h , H . L . ,

D a l t o n , L . R . & A u e r , C . ( 1 9 8 0 ) J . M o l . B i o l . 1 3 9 , 1 9 - 4 4 .5 3 . V o l o g o d s k i i , A . V . , A n s h e l e v i c h , V . V . , L u k a s h i n , A . V . &F r a n k - K a m e n e t s k i i , M . D . ( 1 9 7 9 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 2 8 0 , 2 9 4 -2 9 8 .5 4 . L e e , C . - H . , M i z u s a w a , H . & K a k e f u d a , T . ( 1 9 8 1 ) P r o c . N a t l .A c a d . S c i . USA 7 8 , 2 8 3 8 - 2 8 4 2 .5 5 . W a h l , P h . , P a o l e t t i , J . & L e P e c q , J . - B . ( 1 9 7 0 ) P r o c . N a t l .A c a d . S c i . USA 6 5 , 4 1 7 - 4 2 1 .5 6 . W a n g , J . C . , P e c k , L . J . & B e c h e r e r , K . ( 1 9 8 2 ) C o l d S p r i n gH a r b o r S y m p . Q u a n t . B i o l . 4 7 , 8 5 - 9 1 .