Anh Huong Cua AP Suat Cao Den He Enzyme Trong Sua

8/18/2019 Anh Huong Cua AP Suat Cao Den He Enzyme Trong Sua

1/23

1

1. Giới thiệu enzyme trong sữa: Năm 1881, lần đầu tiên Arnold phát hiện sự có mặt của enzyme trong sữa bò.

Enzyme đầu tiên được tìm thấy trong sữa là lactoperoxydase. Đến nay hàng trămnghiên cứu công bố hơn 60 enzyme khác nhau đã tìm thấy trong sữa . Chúng do tuyếnvú tiết ra hoặc do các VSV trong sữa tổng hợp nên. Enzyme là những chất xúc tác

phản ứng, có bản chất là protein. Sự có mặt của các enzyme trong sữa là nguyên nhângây biến đổi thành phần hoá học của sữa trong quá trình bảo quản, từ đó làm giảmchất lượng hoặc làm hư hỏng sữa. Tuy nhiên, một số enzyme có trong sữa nhưlactoperoxydase, lysozyme có vai trò kháng khuẩn. Chúng tham gia vào việc ổn địnhchất lượng sữa tươi trong quá trinh bảo quản trước khi chế biến.

Người ta sử dụng phương pháp định tính thông qua việc phát hiện sự có mặtmột vài enzyme trong sữa và xem đó là một chỉ tiêu để đánh giá chất lượng sữa. Dướiđây , xin giới thiệu khái quát về một số enzyme quan trọng trong sữa bò.

1.1.Lactoperoxydase:

Enzyme này luôn có trong sữa động vật, nó do tuyến vú tiết ra. Tuy nhiên, vi

khuẩn leucocyte cũng có thể tổng hợp được lactoperoxydase. Enzyme xúc tác phản ứngchuyển hoá oxy từ hydrogen peroxide (H2O2) đến các chất oxy hoá khác. Đây là mộtmetallo enzyme, nó có chứa sắt (Fe) trong phân tử. Phân tử lượng enzyme là 82.000Da.Enzyme có pH tối thích là 6.8. Theo Luquet (1985), hàm lượng trung bìnhlactoperoxydase trong sữa là 30mg/l. Trong sữa non, hàm lượng enzyme thường caohơn. Khi đun nóng sữa đến 80oC trong vài giây, lactoperoxydase sẽ bị vô hoạt.

1.2.Lipase:

Người ta tìm thấy một hệ enzyme lipase trong sữa bò. Chúng xúc tác thuỷ phânliên kết ester trong triglyceride và giải phóng ra các acid béo tự do. Trong sữa, một số

lipase hấp phụ lên màng bao xung quanh các hạt cầu béo, một số khác được tìm thấytrong plasma, chúng liên kết với các micelle của casein.Enzyme lipase quan trọng nhất trong sữa được kí hiệu là mLPL (milk Lipo

Protein Lipase), là một glycoprotein gồm hai tiểu phần. Phân tử lượng của tiểu phần là50.000Da. Enzyme có giá trị pH tối ưu là 8,9. Hàm lượng mLPL trong sữa chỉ khoảng1÷2mg/l , nó chỉ xúc tác thuỷ phân liên kết ester trong cơ chất glycerid ở dạng nhũtương tại bề mặt tiếp xúc pha giữa chất béo và nước. Các enzyme lipase khác xúc tácthuỷ phân các ester hoà tan và không nhũ hoá.

Sự thuỷ phân triglyceride làm tích luỹ các acid béo tự do trong sữa. Quá trình phân giải tiếp các acid béo này làm cho sữa có mùi ôi khét và mùi kim loại.

1.3.Phosphatase:Các phosphatase tìm thấy trong sữa chủ yếu thuộc về nhóm

phosphomonoesterase. Chúng xúc tác phản ứng thuỷ phân liên kết ester giữa acid phosphoric và glycerin. Một số nghiên cứu đã tìm thấy sự có mặt của ATPase và pyrophosphatase trong màng protein bao xung quanh các hạt cầu béo. Có 2 dạng phosphomonoesterase trong sữa: phophatase kiềm và phosphotase acid.


2/23

2

1.3.1.Phosphatase kiềm: Enzyme có pH tối thích là 9,6. Enzyme này đượchoạt hoá bởi Mg2+, Mn2+ và bị vô hoạt bởi Zn2+, Be2+, I2. Có khoảng 30÷40% lượngenzyme được phân bố trong các hạt cầu béo, phần còn lại ở dưới dạng li poprotein.

Một trong những tính chất đặc trưng của phosphatase kiềm là khả năng táihoạt hoá của nó. Sau quá trình thanh trùng, nếu ta kiểm tra mẫu sữa thì không phát

hiện thấy hoạt tính phosphatase kiềm. Tuy nhiên, sau thời gian bảo quản, trong sữa sẽxuất hiện trở lại hoạt tính của enzyme này. Người ta gọi đây là hiện tượng tái hoạt hoácủa phosphatase kiềm và đến nay vẫn chưa tìm được lời giải thích rõ ràng về hiệntượng này. Để tránh hiện tượng tái hoạt hoá cùa phosphatase kiềm, ta cần làm lạnhnhanh sữa sau quá trình thanh trùng và bảo quản sữa ở nhiệt độ thấp (2oC). Mộtnghiên cứu cho rằng, sự có mặt của ion Ca2+ và Mg2+ thúc đẩy quá trình tái hoạt hoáenzyme, và ngược lại, các ion cobalt, đồng và niken lại kiềm hãm hiện tượng này .

1.3.2.Phosphatase acid: enzyme này có pH tối thích là 4,7 và là enzyme bềnnhiệt nhất trong sữa đến 96oC và giữ ở nhiệt độ này trong thời gian tối thiểu là 5 phút. Phos phatase acid bị vô hoạt bởi NaF.

Trong suốt chu kì tiết sữa ở bò, hoạt tính phosphatase acid trong sữa khá ổnđịnh. Ngược lại, hoạt tính phosphatase kiềm tăng dần vào khoảng cuối chu kì tiết sữa.

Để kiểm tra sữa có hoạt tính phosphatase hay không , người ta bổ sung estercủa acid phosphoric và hoá chất đặc hiệu vào sữa. Nếu có enzyme, ester sẽ bị thuỷ phân, giải phóng ra rượi tự do. Sản phẩm này làm chuyển màu hoá chất đặc hiệu trên.

1.4.Lysozyme:

Đến nay, người ta đã trích ly và tinh sạch được lysozyme từ sữa. Đó là mộtglucosaminidase (hay muramidase) có phân tử lượng khoảng 14.000÷18.000Da và làmột enzyme bền nhiệt .

Lysozyme xúc tác phản ứng thuỷ phân liên kết β giữa acid muramic vàglucosamine của mucopolysaccharide trong màng tế bào vi khuẩn, từ đó gây phânhuỷ tế bào. Lysozyme trong sữa bò hoạt động ở pH tối thích là 7,9. Hàm lượnglysozyme trong sữa bò trung bình là 130µg/l, khoảng 3000 lần thấp hơn trong sữangười (400mg/l) .

1.5.Protease:

Nhiều nghiên cứu đã tìm thấy trong sữa có hoạt tính enzyme protease. TheoHumber và Alais (1979) thì có 2 loại enzyme: protease acid và protease kiềm đượctiết ra từ tuyến vú . Chúng thường liên kết với casein và cũng bị kết tủa ở pH = 4,6.Một số nghiên cứu khác tìm thấy 2 loại enzyme trên có mặt trong màng bao xung

quanh các hạt cầu béo trong sữa.Các enzyme protease xúc tác phản ứng thuỷ phân protein, tạo các sản phẩm

như proteose pepton, peptid và các acid amin tự do. Có lẽ các κ-casein là ít bị tấn côngnhất. Sản phẩm thuỷ phân là γ-casein và các phân đoạn proteose-pe pton có phân tửlượng khác nhau. Các protease acid trong sữa có pH tối thích là 4,0 ,còn proteasekiềm hoạt động mạnh nhất ở pH = 7,5÷8,0. Chúng bị vô hoạt hoàn toàn ở 80oC sau 10 phút.


3/23

3

1.6.Catalase:

Enzyme được tìm thấy trong protein màng bao xung quanh các hạt cầu béo.Trong sản xuất phomai, khi các casein bị đông tụ, một số phân tử catalase cũng bị kếttủa theo. Enzyme này xúc tác phản ứng phân huỷ hydrogen peroxide thành nước và oxytự do. Sữa từ những con vật khoẻ mạnh có lượng catalase rất thấp. Sữa nhiễm vi sinh

vật thường có hoạt tính catalase rất cao.Catalase là một metallo enzyme (có chứa Fetrong phân tử).Phân tử lượng của enzyme là 240.000Da. Enzyme có pH tối thích là 6,8÷ 7,0. Vào cuối chu kì tiết sữa của con vật, hoạt tính enzyme trong sữa thường rất cao.Catalase bị vô hoạt ở 75oC sau thời gian 1 phút hoặc vô hoạt ở 65÷68oC sau 30 phút.

2. Khảo sát ảnh hưởng của áp suất cao đến enzyme trong sữa: 2.1.Lactoperoxydase:

2.1.1.Sự thay đổi hoạt tính enzyme: Hoạt tính enzyme sau khi qua xử lý áp suất tại 73 oC ở các áp suất khác nhau

trong sữa tươi và trong whey loãng được trình bày trong hình 1. Từ đồ thị có thể nhânthấy là tại 73oC, sự vô hoạt lactoperoxidase tại áp suất khí quyển xảy ra rất nhanh, nếu

sử dụng áp suất từ 150-700 MPa tại nhiệt độ này có thể ức chế hoàn toàn sự vô hoạtlactoperoxidase của nhiệt độ trong sữa. Như trên hình 1a, một tác động tương phảngiữa áp suất cao và nhiệt độ đã được thể hiện. Tương tự, sự tác động tương phản nàycũng xuất hiện trong nước whey. Tuy nhiên,trong nước whey, áp suất bằng hoặc caohơn 700 MPa có thể làm vô hoạt lactoperoxidase nhưng tốc độ vô hoạt nhỏ hơn so vớitrường hợp tại áp suất khí quyển, nhiệt độ 73oC. Thậm chí, tại áp suất 150 MPa, hoạttính của lactoperoxidase trong whey tăng nhưng không đáng kể. Điều này chứng tỏ sựổn định áp suất của lactoperoxidase trong sữa cao hơn trong nước whey.


4/23

4

Hình 1: Hoạt tính enzyme sau khi xử lý nhiệt độ 73oC tại các áp suất khác nhau (a) sữa tươi: 0.1(O), 150( ), 400( ), 700( ) và 750(x) MPa

(b) whey loãng: 0.1(O), 150( ), 400( ), 700( ) và 750(x) MPa


5/23

5

Hình 1 chỉ mô tả áp suất cao tại một nhiệt độ nhất định (73oC). Để hiểu rõ hơn,ta sẽ khảo sát thêm về sự ảnh hưởng ở các nhiệt độ khác nhau. Sự thay đổi hoạt tínhenzyme qua xử lý áp suất cao (700MPa) tại các nhiệt độ khác nhau được trình bàytrong hình 2. Ở áp suất 700 MPa, sự vô hoạt lactoperoxidase là không đáng kể, thậmchí ngay cả khi nhiệt độ là 65oC trong 140 phút (hình a). Trong nước whey, sự vô

hoạt lactoperoxidase tại 65o

C, 700 MPa và trong 140 phút cũng nhỏ. Nhìn chung,hoạt tính enzyme tại 700MPa ở các nhiệt độ khác nhau dao động không nhiều vàkhông tuân theo quy luật nhất định nào cả. Sự ổn định áp suất của lactoperoxidasetrong sữa cao hơn trong nước whey.


6/23

6

Hình 2: Hoạt tính enzyme sau khi xử lý áp suất 700MPa tại các nhiệt độ khác nhau (a) sữa tươi: 15(O), 25( ), 35( ), 45( ) và 65(x) oC

(b) whey loãng: 10(O), 40( ), 65( ) oC


7/23


8/23

8

Hình 3: Ảnh hưởng của áp suất cao lên enzyme lipase

2.2.2.Giải thích: Sự gia tăng hoạt tính của lipase ở áp suất cao vẫn chưa được hiểu rõ một cách

cặn kẽ. Hiện tượng này có thể là do: -Sự thay đổi cấu tạo trong một giới hạn nào đó. -Sự giải phóng của các enzyme hoạt động từ phức enzyme-micelle-Sự giải phóng của các vị trí hoạt động trong enzyme qua sự thủy phân protein

có giới hạn. Ngược lại, khi áp suất quá cao, sự thay đổi cấu trúc enzyme xảy ra mãnh liệt

khiến hoạt tính enzyme giảm dần.

2.3.Phosphatase:

2.3.1.Sự thay đổi hoạt tính enzyme: Enzyme được khảo sát ở đây là phosphatase kiềm. Hoạt tính enzyme này tại

các áp suất khác nhau (từ 500-800MPa) được biểu diễn trên hình 4 với các bậc phảnứng khác nhau n= 0-2 và ở nhiệt độ 5oC. Hình trên cho thấy hoạt tính enzyme tươngđối Ct/Co đã giảm khi tăng thời gian và áp suất. Tại các áp suất cao hơn, hoạt tínhgiảm nhiều hơn và nhanh hơn, để giảm hoạt tính triệt để hơn ví dụ như giảm 99% thìáp suất phải từ 650 MPa trở lên.


9/23

9

Hình 4: Ảnh hưởng của áp suất cao lên enzyme phosphatase kiềm ở 5oC

2.3.2.Giải thích: Hiện tại, cơ chế vô hoạt enzyme này vẫn chưa được hiểu rõ một cách cặn kẽ.

Theo Kouassi và cộng sự (2007), nguyên nhân có thể là do sự thay đổi cấu trúc phântử của enzyme mà cụ thể ở đây là cấu trúc bậc 2. Khi áp suất tăng cao, cấu trúc xoắn

giảm trong khi cấu trúc gấp nếp tăng, điều này cho thấy có thể có mối quan hệgiữa cấu trúc xoắn đến hoạt tính enzyme. Hay nói cách khác, cấu trúc bậc 2 có thểđóng vai trò quyết định đến hoạt tính enzyme.


10/23

10

2.4.Lysozyme:

2.4.1.Sự thay đổi hoạt tính enzyme: Ở đây, ta sẽ quan sát ở 2 môi trường khác nhau để đánh giá ảnh hưởng của áp

suất cao lên lysozyme. Trong canh trường Brain Heart Infusion:

Sự ức chế L. monocytogenes trong canh trường (Brain Heart Infusion) sử dụngđồng hóa áp suất cao, nhiệt độ và lysozyme được trình bày trong bảng sau:

Bảng 1: Ảnh hưởng của đồng hóa áp suất cao (100MPa) và nhiệt độ lên hoạt tính ứcchế vi sinh vật ( L. monocytogenes) của lysozyme

Cell load (log cfu mL-1)

Immediately

after

inoculation

Time of incubation

24h(37oC) 48h(37oC) 48h(6oC) 96h(6oC)

Samples without Ly

Untreated (UT) cells 7.3 0.2 8.1 0.2 7.8 0.3 7.1 0.2 8.6 0.2

HPH BHI 7.3 0.1 8.1 0.2 6.0 0.3 7.5 0.4 8.7 0.1

Samples with Ly

UT cells + UT Ly 6.7 0.2


11/23

11

Hình 5: Tế bào L. monocytogenes trong canh trường trước và sau khi bổ sunglysozyme qua xử lý áp suất cao

Sự khác nhau của các điều kiện xử lý nhiệt độ tại 70 oC trong 30s, 70oC trong 5 phút và 100oC trong 5 phút cũng có thể làm gia tăng hoạt tính ức chế vi sinh vật củalysozyme. Trong thực tế, ngay sau khi nuôi cấy thì độ giảm lần lượt là 1,7; 1,5; và 1

log(cfu/ml) tương ứng với các nhiệt độ là 70o

C trong 30s, 70

o

C trong 5 phút và 100

o

Ctrong 5 phút. Cuối cùng so sánh với các mẫu không có enzyme thì mẫu có enzyme cókhả năng vô hoạt cao hơn một chút khi có độ giảm là 0,6 log(cfu/ml). Trong suốt thờigian nuôi cấy tại 6oC, sự khác nhau về khả năng ức chế vi sinh vật trong các điều kiệnthí nghiệm được xét là không đáng kể. Thực tế, tất cả các mẫu có lysozyme sau khinuôi cấy ở 6oC trong 96h thì lượng tế bào còn lại dao động trong khoảng 2 -2,8log(cfu/ml). Tuy nhiên, lượng tế bào thấp nhất được ghi nhận ở mẫu có lysozyme quađồng hóa áp suất cao. Khi nuôi cấy ở 37oC trong 24h và 48h, không phát hiện được sự


12/23

12

khác nhau giữa các mẫu có lysozyme vì tất cả đều có lượng vi sinh vật còn lại nằmdưới ngưỡng phát hiện.

Trong sữa: Hình 6 mô tả sự vô hoạt tế bào trong sữa bò hoặc sữa cừu tương ứng với các

phương pháp xử lý lysozyme khác nhau tại đồng hóa áp suất 100MPa hoặc 70oC

trong 30s

Hình 6: Sự ức chế tế bào L. monocytogenes trong sữa bò hoặc sữa cừu tương ứng vớicác phương pháp xử lý lysozyme khác nhau với (a) sữa bò và (b) sữa cừu


13/23

13

Sau 6h, mẫu sữa bò có lysozyme qua đồng hóa áp suất cao có độ giảm tế bàolà 0,5 log(cfu/ml) khi so sánh với mẫu có lysozyme không qua xử lý. Mặt khác, độchênh lệch về độ giảm tế bào giữa mẫu có enzyme qua đồng hóa áp suất cao và mẫucó enzyme qua xử lý nhiệt độ thì thấp hơn. Trong sữa cừu, mẫu có enzyme qua đồnghóa áp suất cao có thể làm giảm đáng kể lượng tế bào vi sinh vật. Điển hình là sau 6h

nuôi cấy tại 37o

C, mẫu có enzyme qua đồng hóa áp suất cao có lượng tế bào còn lại là5 log(cfu/ml). Ngoài ra, mẫu qua đồng hóa không bổ sung enzyme cũng cho thấy sựgiảm tế bào vi sinh vật. Tuy nhiên, số tế bào trong sữa cừu có lysozyme qua xử lý ápsuất cao có dấu hiệu tăng lên khi thời gian từ hơn 6h đến 10h, trong khi đối với sữa bòthì vẫn chưa có hiện tương này ứng với khoảng thời gian trên.

2.4.2.Giải thích: Các số liệu ở trên cho thấy đồng hóa áp suất cao là một phương pháp hữu hiệu

trong việc làm gia tăng hoạt tính ức chế vi sinh vật L. monocytogenes của lysozyme. Để giải thích cho điều này, Vannini et al. (2004) cho rằng sự gia tăng hoạt tính ức chếvi sinh vật của lysozyme có thể là do sự thay đổi cấu trúc phân tử của chúng. Thực tế,

hoạt tính của lysozyme dựa trên cấu hình không gian ba chiều của chúng, một sự thayđổi nhỏ các vị trí hoạt động có thể làm gia tăng hoặc làm giảm hoạt tính của chún g.Mặt khác, Guerzoni et al. (1999) cho rằng sử dụng đồng hóa áp suất cao có thể làm bộc lộ các nhóm kị nước của protein, các vùng này gắn trên membrane của vi sinhvật, hậu quả là làm xác trộn chức năng của chúng nên làm gia tăng hoạt tính ức chế visinh vật của lysozyme. Nhưng theo thời gian, vi sinh vật có khả năng kháng lạienzyme này nên số lượng tế bào tăng lên. Thời điểm gia tăng phụ thuộc vào môitrường sống của chúng.

2.5.Protease:

2.5.1.Sự thay đổi hoạt tính enzyme: Hoạt tính plasmin, dẫn xuất của plasminogen và chất hoạt hóa plasminogentrong sữa :

Ảnh hưởng của áp suất cao lên hoạt tính plasmin, dẫn xuất của plasminogen vàchất hoạt hóa plasminogen được trình bày trong bảng 3:


14/23

14

Bảng 2: Ảnh hưởng của áp suất cao tại các nhiệt độ khác nhau lên plasmincộng dẫn xuất của plasminogen (PL) và chất hoạt hóa plasminogen (PA)

Pressur

e

(MPa)

Temper

ature

(o

C)

Activity (units ml-1)

PL PA

Milkserum

Casein Milkserum

Casein

0 Raw

milk

1.66a, ,c 0.49 11.03e 1.90 2.06a, 0.52 12.48 2.20

200 20

40

55

2.15 b,c 0.63

2.22 b,c 0.69

2.14 b,c 0.64

9.96d,e 1.37

10.03d,e 1.51

9.99d,e 1.43

2.67 b 0.74

2.65 b 0.68

2.71 b 0.83

11.31e,f 1.98

11.42e,f 2.22

11.36e,f 2.04

450 20

40

55

2.59c 0.96

1.69a,b,c 0.35

1.13a 0.25

8.35c,d 1.29

5.86 b 1.19

3.85a 0.08

3.16 b 1.12

2.05a,b 0.28

1.29a 1.19

9.58d,e,f 1.93

6.68 b,c 1.80

4.43a,b 1.44

650 20

40

55

2.52c 0.88

1.52a,b 0.35

0.98a 0.18

8.38c,d 1.18

6.63 b,c 1.13

3.61a 0.75

2.93 b 1.01

2.11a,b 0.56

1.33a 0.39

8.80c,d,e 1.16

6.81 b,c,d 1.70

3.87a 1.51

Các số liệu trong bảng cho thấy hoạt tính của plasmin, dẫn xuất của plasminogen và chất hoạt hóa plasminogen giảm không đáng kể trong casein và tăngtrong huyết thanh sữa khi xử lý ở 200 MPa. Nhưng ở 450 va 650 MPa, hoạt tính của plasmin, dẫn xuất của plasminogen và chất hoạt hóa plasminogen trong casein giảm

đáng kể, còn ở huyết thanh sữa thì tăng ở 20o

C nhưng lại giảm ở 40 và 55o

C. Điều cầnlưu ý ở đây là khi áp suất 450 và 650 MPa ở nhiệt độ 55oC thì hoạt tính của plasmin,dẫn xuất của plasminogen và chất hoạt hóa plasminogen còn lại trong huyết thanh sữalà rất thấp.

Hoạt tính của cathepsin D và các protease khác:Hoạt tính của protease trong acid whey của sữa cừu và sữa bò chưa qua xử l ý

được trình bày trên hình 7 từ các số liệu của sắc ký hấp phụ pha đảo. Các số liệu củacác mẫu đã qua xử lý được trình bày trong hình 8. Các cuộc thí nghiệm với chất ứcchế protease và cathepsin D và B của sữa bò được thực hiện để giải thích các dữ liệucủa sắc ký hấp phụ pha đảo.


15/23

15

Hình 7: Biểu đồ biểu diễn hoạt tính protease trong acid whey của sữa cừu và sữa bòchưa qua xử lý, sau khi nuôi trong cơ chất Pro-Thr-Glu-Phe-[p-nitro-Phe]-Arg-Leu,

pH 3,2 ; trong 12h, nhiệt độ 37oCWP: whey protein, S: cơ chất sót, P: cathepsin D


16/23

16

Hình 8: hoạt tính protease trong acid whey của sữa cừu xử lý tại 450 hoặc 650 MPa ở55oC, sau khi nuôi trong cơ chất Pro-Thr-Glu-Phe-[p-nitro-Phe]-Arg-Leu, pH 3,2 ;

trong 12h, nhiệt độ 37oCWP: whey protein, S: cơ chất sót, P: cathepsin D


17/23

17

Đỉnh P là của cathepsin D. Đỉnh 1 có thể là của các protease chưa được xácđịnh trong whey. Đỉnh 2 có thể là cathepsin B. Đỉnh 3 là các cysteine protease khác,không phải catehpsin B.

Ngoài ra, Sự thay đổi hoạt tính của cathepsin D và các protease khác cũngđược trình bày trong bảng 4. Ở đây, các số liệu được trình bày theo vùng sắc kí đo

được giống như trong hình 7 và 8. Để dễ hình dung, ta sẽ quan tâm đến bảng dưới.

Bảng 3: Ảnh hưởng của áp suất cao tại các nhiệt độ khác nhau lên hoạt tínhcủa protease trong acid whey của sữa cừu

Pressure

(MPa)

Temperature

(oC)

Cathepsin

D-like

product

(P)

Peak 1 Peak 2 Peak 3

0 Raw milk 0.26 ,e 0.02 2.30 ,c 0.13 0.21a, 0.11 0.49 0.06

200 20

40

55

0.30e 0.05

0.29e,f 0.02

0.27d,e 0.01

2.34c 0.30

2.44c 0.17

2.32c 0.25

0.13a,b 0.07

0.13a,b 0.07

0.13a,b 0.06

0.21c 0.07

0.20c 0.08

0.17 b,c 0.06

450 20

40

55

0.23c,d 0.04

0.19 b,c 0.03

0.15a,b 0.03

2.23 b,c 0.21

2.22 b,c 0.19

2.14 b,c 0.17

0.28 b 0.13

0.23a,b 0.08

0.28 b 0.07

0.13a,b,c 0.06

0.08a,b 0.02

0.08a,b 0.03

650 20

40

55

0.19 b,c 0.04

0.12 b 0.02

0.11

a

0.03

1.94 b 0.20

2.09 b,c 0.17

1.58

a

0.28

0.27a,b 0.12

0.22a,b 0.14

0.19

a

0.06

0.07a,b 0.04

0.08a,b 0.05

0.06

a

0.01

Hoạt tính của cathepsin D (đỉnh P) không thay đổi nhiều khi xử lý ở 200 MPatại 3 nhiệt độ khác nhau và tại 450 MPa ở 20oC. Ngược lại, tại 450 MPa ở 40 hoặc55oC, hoạt tính của chúng giảm còn 73% và 58% so với lúc chưa xử lý. Tại 650 MPa,độ giảm là đáng kể, tương ứng là 73, 46 và 42% tại 20, 40 và 55 oC.

Đỉnh 1 có khả năng chịu đựng rất tốt nó chỉ giảm đáng kể khi xử lý tại 650MPa ở 55oC. Theo các điều kiện xử lý này, chúng giảm còn 69,2%.

Đỉnh 2 thay đổi nhiều, hoạt tính của chúng giảm tại 200 MPa ở cả 3 nhiệt độkhỏa sát. Còn ở áp suất 450 và 650 MPa, hoạt tính của chúng lại tăng.Ngoài ra, nhiều

ảnh hưởng đã được dấu kín bởi độ lệch tiêu chuẩn tương đối cao của các giá trị ởvùng 2.

Đỉnh 3 giảm đáng kể và ở nhiệt độ cao thì giảm nhiều hơn. Đặc biệt hơn, việcxử lý ở 650 MPa làm giảm 80-84% so với hoạt tính ban đầu. Sự sụt giảm tương ứng ở200MPa là 57-65%.


18/23

18

2.5.2. Giải thích: Một số vấn đề cần làm rõ trong phần này:

- Thứ nhất, sự gia tăng hoạt tính của plasmin cộng dẫn xuất của plasminogen vàchất hoạt hóa plasminogen khi xử lý ở 200 MPa ở cả 3 nhiệt độ khảo sát hay tại 450và 650 MPa ở 20oC. Theo Garı´a-Risco et al. (2003), nguyên nhân là do có sự dịch

chuyển các enzyme từ casein đến huyết thanh sữa, việc dịch chuyển này diễn ra thuậnlợi khi sự liên kết của chúng với casein bị phá vỡ .

- Thứ hai, sự giảm hoạt tính của plasmin cộng dẫn xuất của plasminogen và chấthoạt hóa plasminogen khi xử lý tại 450 và 650 MPa ở nhiệt độ 40 và 55oC. Nguyênnhân là do hiệu ứng đồng vận giữa nhiệt độ và áp suất là lớn, cơ chế có thể xảy ra ởđây là sự thay đổi cấu trúc của các enzyme xảy ra lớn. Ngoài ra, các nhà khoa học còncho rằng có mối tương quan mật thiết giữa plasmin cộng dẫn xuất của plasminogen vàchất hoạt hóa plasminogen với phần trăm whey protein còn lại trong sữa nhất là với

-lactoglobulin, cho thấy rằng sự gia tăng độ biến tính whey protein làm giảm hoạttính enzyme. Theo các nghiên cứu của Garcı´a-Risco et al. (2003), Huppertz, Smiddy,

et al. (2006), và Scollard et al. (2000b) cho rằng sự có mặt của -lactoglobulin làmenzyme trong sữa bị mất ổn định dưới áp suất cao, nguyên nhân là do sự tương tácgiữa thiol-sulfide với các liên kết disulfide trong phân tử plasmin, tương tự như sự vôhoạt bằng nhiệt.

Một vấn đề khác cần nói ở đây chính là hoạt tính của các protease khác trongacid whey. Nhìn chung, hoạt tính của các protease này giảm khi tăng nhiệt độ và ápsuất ngoại trừ cathepsin B (enzyme này giảm đáng kể ở 200MPa nhưng lại tăng tại450 và 650 MPa). Hiện nay, vấn đề này vẫn chưa được nghiên cứu kỹ và giải thích rõràng. Nhưng theo Moatsou và cộng sự (2008) thì có mối tương quan giữa các vùngđỉnh và lượng -lactoglobulin dư, gợi ý rằng sự giảm hoạt tính enzyme có thể liênquan đến sự biến tính whey protein.

2.6.Một số enzyme khác: Các enzyme khảo sát trong phần này là -glutamyltransferase và

phosphohexoseisomerase

2.6.1.Sự thay đổi hoạt tính enzyme: -glutamyltransferase:

Ảnh hưởng của áp suất cao lên hoạt tính enzyme -glutamyltransferase ở 20oCđược trình bày trong hình 9. Từ đồ thị dưới, ta thấy khi áp suất càng cao thì thời gianvô hoạt enzyme càng thấp. Tại 500 MPa, thời gian vô hoạt hoàn toàn vào khoảng 130 phút. Trong khi đó tại 700MPa, thời gian vô hoạt hoàn toàn là 18 phút. Nhìn chung,

để vô hoạt enzyme một cách triệt để, áp suất áp dụng phải từ 500MPa trở lên.


19/23

19

Hình 9: Sự vô hoạt -glutamyltransferase bằng áp suất tại 20oC

Phosphohexoseisomerase:

Ảnh hưởng của áp suất cao lên hoạt tính enzyme phosphohexoseisomerase ở20oC được trình bày trong hình 10. Đồ thị cho thấy enzyme này có khả năng chịu áp

suất thấp hơn so với -glutamyltransferase. Áp suất càng cao thì thời gian vô hoạtenzyme càng thấp. Tại 500MPa, thời gian vô hoạt gần như hoàn toàn hoạt tính enzymelà 33 phút. Trong khi tại 420 và 460 MPa, thời gia vô hoạt cao hơn.


20/23

20

Hình 10: Sự vô hoạt phosphohexoseisomerase bằng áp suất tại 20oC

2.6.2. Giải thích: Do các enzyme này không có tầm ảnh hưởng quan trọng đến sữa nên không có

nhiều các cuộc nghiên cứu về chúng. Sự vô hoạt enzyme bởi áp suất cao có thể là do sự

tác động làm thay đổi cấu trúc phân tử của chúng (cấu trúc bậc 2 hoặc bậc 4).

3. Ứng dụng phương pháp xử lý áp suất cao để hoạt hóa/vô hoạt hệ enzyme trongsữa:

Sữa chứa hơn 60 loại enzyme khác nhau, hầu hết đều được phân lập và phân tíchđặc điểm tương đối tốt. Trong đó, nhiều loại enzyme có tiềm năng ứng dụng rất caotrong thực phẩm, đặc biệt là trong các sản phẩm từ sữa. Tuy nhiên, tiềm năng củachúng vẫn chưa được hiểu rõ một cách đầy đủ và cặn kẽ. Nguyên nhân là do hầu hếtcác enzyme này đều bị vô hoạt hoặc hoạt tính còn lại rất thấp sau quá trình thanh trùng bằng nhiệt. Vì thế, việc sử dụng áp suất cao trong thực phẩm nói chung và trong sữa nói

riêng ngày càng được quan tâm nhiều hơn. Việc ứng dụng áp suất cao để xử lý enzymetrong sữa vẫn đang được nghiên cứu. Ở đây xin giới thiệu về một vài ứng dụng củachúng:

3.1. Trong sản xuất sữa thanh trùng:Ở đây, sữa sẽ được xử lý bằng áp suất cao thay vì dùng nhiệt độ. Theo các kết

quả đã trình bày ở trên, ta thấy khi thanh trùng sữa ở áp suất cao sẽ có các ảnh hưởng có lợi và có hại trong sản xuất sữa thanh trùng.


21/23

21

Các ảnh hưởng có lợi: -Hoạt tính enzyme lacto peroxidase không thay đổi nhiều. Lactoperoxidase là

enzyme có vai trò kháng khuẩn, tự nó không có khả năng ức chế vi khuẩn, chỉ đơnthuần là xúc tác tạo ra các chất ức chế vi sinh vật. Do đó, việc sử dụng áp suất caokhông làm thay đổi vai trò ức chế vi sinh vật của nó trong khi nếu thanh trùng bằng

nhiệt độ thì enzyme này sẽ bị vô hoạt gần như hoàn toàn. -Hoạt tính enzyme lysozyme tăng cao hơn so với khi xử lý bằng nhiệt độ. Điềunày là có lợi vì lysozyme có khả năng ức chế vi sinh vật nên là gia tăng hiệu quả thanhtrùng bằng áp suất cao. Tuy nhiên, enzyme này chỉ được khảo sát ở áp suất 100 MPanên cần phải được nghiên cứu ở các áp suất cao khác để hiểu rõ hơn về sự thay đổi hoạttính.

Các ảnh hưởng có hại: -Hoạt tính enzyme lipase tăng khi xử lý ở áp suất 400 MPa. Enzyme này có

khả năng thủy phân lipid tạo ra các acid béo tự do, các chất này dễ bị oxy hóa làm chosữa bị ôi, hư hỏng. Tuy nhiên, hoạt tính enzyme này sẽ giảm khi xử lý ở áp suất caohơn 400 MPa.

-Hoạt tính enzyme protease tăng. Điều này không có lợi trong quá trình bảoquản vì sự thủy phân protein bởi enzyme này ảnh hưởng đến sự mất ổn định vật lý hoặclàm gia tăng vị đắng. Ví dụ như sự thủy phân casein trong sữa có thể liên quan đến sựthay đổi vật lý trong sữa như sự đặc lại bất thuận nghịch trong quá trình bảo quản. Vấnđề này có thể được giải quyết khi ta kết áp suất cao với một nhiệt độ thích hợp.

Ngoài ra, một vấn đề cũng cần phải quan tâm ở đây chính là cách đánh giá hiệuquả thanh trùng bằng áp suất cao. Để một enzyme được coi như là chất chỉ thị hiệu quảcủa quá trình xử lý sữa bằng áp suất., yêu cầu chủ yếu chính là sự tương đương về điềukiện vô hoạt giữa enzyme và các vi sinh vật mà ta quan tâm đến. Một số ý kiến chọn phosphatase kiềm làm chất chỉ thị do enzyme này chịu được áp suất tốt hơn các vi sinh

vật có trong sữa. Do đó, sự vô hoạt enzyme ( như hoạt tính < 0,1%) có thể nói lên sữađã qua xử lý bằng áp suất không có các vi sinh vật gây bệnh này. Tuy nhiên, việc sửdụng enzyme này làm chất chỉ thị cũng có một vài điểm hạn chế:

-Việc sử dụng áp suất cao có thể dẫn đến sự lãng phí do khi dùng các áp suất caođủ ức chế hoặc tiêu diệt vi sinh vật (dữ liệu về sự vô hoạt các vi sinh vật gây bệnh trongsữa đã được nói rõ trong 1 vài bài nghiên cứu) thì thời gian vô hoạt enzyme này là dài.

-Một vài vi sinh vật trong sữa ( như một số vi khuẩn lactic và Penicilliumroqueforti) có phos phatase kiềm nên sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả chỉ thị.

-Sự tái hoạt hóa phosphatase kiềm có thể xảy ra. Do đó, một chất chỉ thị nhạy cảm với áp suất hơn được đặt ra. Trong đó,

enzyme -glutamyltransferase là thích hợp hơn cả.

3.2. Trong sản xuất phomai: Việc sử dụng áp suất cao trong quá trình làm phomai có nhiều ưu điểm. Ngoài

những ảnh hưởng có lợi trong thanh trùng sữa được trình bày ở trên còn có những ưuđiểm sau:

-Hoạt tính enzyme protease tăng. Điều này là có lợi vì hoạt tính protease cóthể ảnh hưởng đến chất lượng phomai bằng 2 con đường. Thứ nhất, sự thủy phân


22/23

22

casein trước khi sản xuất có tác động đến đặc điểm đông tụ sữa của rennet. Thời gianđông tụ bởi rennet có thể được làm giảm bởi tác động của plasmin. Thứ 2, p lasmintrong khối đông là chất quan trọng góp phần thủy phân casein trong suốt quá trìnhchín của phomai.

-Hoạt tính enzyme lipase tăng khi xử lý ở áp suất 400 MPa. Lipase có vai trò

trong sự thủy phân lipid trong suốt quá trình chín của phomai. Sự có mặt của lipasetrong phomai là một trong những nhân tố tạo nên sự khác nhau về mùi vị giữa cácloại phomai. Do đó, các loại phomai sẽ có mùi vị đặc trưng riêng cho chúng.

4. Kết luận: Sử dụng áp suất cao là một phương pháp có tiềm năng ứng dụng rất cao tr ong

công nghiệp thực phẩm nói chung và trong sữa nói riêng. Tuy nhiên, vấn đề này cần phải được nghiên cứu nhiều hơn và ở phạm vi rộng hơn về ảnh hưởng của áp suất đếncác giá trị dinh dưỡng ,enzyme, vi sinh vật trong sữa. Ngoài ra, việc kết hợp áp suấtcao với nhiệt độ hoặc các chất kháng khuẩn cũng cần phải được nghiên cứu vì điềunày sẽ giúp tránh được các nhược điểm khi sử dụng áp suất cao, việc xử lý bằng ápsuất sẽ có hiệu quả cao và cải thiện chất lượng sữa hơn.


23/23

Tài liệu tham khảo

1. Lê Văn Việt Mẫn. Công nghệ sản xuất các sản phẩm từ sữa và thức uống (tập1). NXB ĐH quốc gia TPHCM, 2004.

2.

Gerrit Smith. Dairy processing: improving quality. Woodhead publishinglimited, 2003.

3. Y.H.Hui . Handbook of Food Science, Technology, and Engineering . CRC

Taylor & Francis, 2006.

4. C.J.Doona, F.E.Feeherry. High pressure processing of foods. Blackwell

publishing, 2007.

5. G.Moatsou, G.Katsaros, C.Bakopanos, I.Kandarakis, P.Taoukis, I.Politis (2008).

Effect of high-pressure treatment at various temperatures on activity of

indigenous proteolytic enzymes and denaturation of whey proteins in ovine milk .

International dairy journal, 18, 1119-1125.

6. G.Moatsou, G.Katsaros, C.Bakopanos, I.Kandarakis, P.Taoukis, I.Politis,

D.Katharios (2008). Effect of high-pressure treatment at various temperatureson activity of indigenous proteolytic enzymes and denaturation of whey proteins

in bovine milk . Journal of dairy research, 75, 262-269.

7. B.Rademacher, J.Hinrichs (2006). Effect of high pressure treatment on

indigenous enzymes in bovine milk: Reaction kinetics, inactivation and potential

application. International dairy journal, 16, 655-661.

8. L.Iucci, F.Patrignani, M.Vallicelli, M.E.Guerzoni, R.Lanciotti (2007). Effect of

high pressure homogenization on the activity of lysozyme and lactoferrin against

Listeria monocytogenes. Food control, 18, 558-565.

9. P.K.Pandey, H.S.Ramaswamy (2004 ). Effect of high-pressure treatment of milk

on lipase and -glutamyl transferase activity. Journal of food biochemistry, 28,449-462.

10. L.R.Ludykhuyze, W.L.Claeys, M.E.Hendrickx (2001). Effect of temperature

and/or pressure on lactoperoxidase activity in bovine milk and acid whey .

Journal of dairy research, 68, 625-637.

11. G.K.Kouassi, R.C.Anantheswaran, S.J.Knabel, J.D.Floros (2007). Effect of high-

pressure processing on activity and structure of alkaline phosphatase and

lactate dehydrogenase in buffer and milk . Journal of agricultural and food

chemistry, 55, 9520-9529.

12. M.G.Hayes, A.L.Kelly (2003 ). High pressure homogenisation of milk (b) effect

on indigenous enzymatic activity. Journal of dairy research, 70, 307-313.

Documents

Anh Huong Cua AP Suat Cao Den He Enzyme Trong Sua