Antibacterial Activity of Hen Egg White Lysozyme Against

8/10/2019 Antibacterial Activity of Hen Egg White Lysozyme Against

1/8

V o l . 5 5 ,

N o .

3

P P L I E D AND ENVIRONMENTAL

MICROBIOLOGY,

M a r .

1 9 8 9 ,

p .

6 3 1 - 6 3 8

0 0 9 9 - 2 2 4 0 / 8 9 / 0 3 0 6 3 1 - 0 8 0 2 . 0 0 / 0

C o p y r i g h t

C ) 1 9 8 9 , A m e r i c a n S o c i e t y

f o r M i c r o b i o l o g y

A n t i b a c t e r i a l

A c t i v i t y o f

Hen

Egg W h i t e

Lysozyme a g a i n s t

L i s t e r i a monocytogenes

S c o t t A

i n Foods

V I R G I N I A

L .

HUGHEY,

PAMELA

A . W I L G E R , AND

E R I C A.

JOHNSON

D e p a r t m e n t o f

Food

M i c r o b i o l o g y

and

T o x i c o l o g y ,

U n i v e r s i t y

o f

W i s c o n s i n , 1 9 2 5

W i l l o w

D r i v e ,

M a d i s o n ,

W i s c o n s i n

5 3 7 0 6

R e c e i v e d 2 0 S e p t e m b e r

1 9 8 8 / A c c e p t e d 1 2

December 1 9 8 8

E g g w h i t e

lysozyme

k i l l e d

or

p r e v e n t e d g r o w t h

o f

L i s t e r i a monocytogenes

S c o t t A

i n

s e v e r a l

f o o d s . Lysozyme

was

more a c t i v e

i n v e g e t a b l e s

t h a n i n a n i m a l - d e r i v e d

f o o d s t h a t we t e s t e d .

For maximum

a c t i v i t y i n

c e r t a i n

f o o d s , E D T A was

r e q u i r e d i n

a d d i t i o n t o lysozyme.

Lysozyme

w i t h EDTA

e f f e c t i v e l y k i l l e d i n o c u l a t e d

p o p u l a t i o n s

o f

1 0 4 L . monocytogenes

per g

i n

f r e s h

corn, f r e s h

green b e a n s ,

s h r e d d e d

c a b b a g e , s h r e d d e d

l e t t u c e ,

a n d c a r r o t s d u r i n g

s t o r a g e

a t 5 C . C o nt r o l

i n c u b a t i o n s w i t h o u t

lysozyme s u p p o r t e d

growth o f L .

monocytogenes

t o

1 0 6 t o 1 0 7 / g .

L y s o z y m e h a d

l e s s a c t i v i t y i n a n i m a l - d e r i v e d

f o o d s ,

i n c l u d i n g f r e s h

pork sausage

( b r a t w u r s t )

a n d

Camembert

c h e e s e .

I n b r at w ur s t, lysozyme

w i t h E D T A

p r e v e n t e d

L . monocytogenes

f r o m

g r o w i n g

f o r 2 t o 3

w e e k s b u t d i d n o t

k i l l s i g n i f i c a n t

numbers o f

c e l l s

and

d i d n o t

p r e v e n t

e v e n t u a l

g r o w t h .

The

c o n t r o l

sausages

n o t

c o n t a i n i n g

lysozyme s u p p o r t e d

r a p i d a n d h e a v y

g r o w t h ,

w h i c h i n d i c a t e d t h a t

lysozyme

was b a c t e r i o s t a t i c

f o r

2

t o

3

w e e k s

i n

f r e s h

p o r k sausage. We

a l s o p r e p a r e d

Camembert

c h e e s e

c o n t a i n i n g

1 0 4

L . monocytogenes

c e l l s

p er

g a n d

i n v e s t i g a t e d

t h e

c h a n g e s

d u r i n g r i p e n i n g

i n

c h e e s e s

s u p p l e m e n t e d

w i t h

lysozyme

a n d

ED TA.

C h e e s e s

w i t h lysozyme

b y i t s e l f

or t o g e t h e r w i t h E D T A

r e d u c e d

t h e L . monocytogenes

p o p u l a t i o n

b y

- 1 0 - f o l d over

t h e

f i r s t

3 t o

4 w e e k s o f r i p e n i n g .

I n t h e

same

p e r i o d ,

t h e

c o n t r o l

c h e e s e

w h e e l s

w i t h o u t a d d e d

lysozyme

w i t h a n d

w i t h o u t c h e l a t o r

s l o w l y s t a r t e d

t o grow and e v e n t u a l l y

r e a c h e d 1 0 6 t o

1 0 7

CFU/g

a f t e r

5 5

d a y s

o f r i p e n i n g .

I n

t h e

l y s o z y m e - c o n t a i n i n g

c h e e s e s ,

h o w e v e r ,

L . monocytogenes

a l s o grew

a f t e r

3 t o

4

w e e k s o f c u r i n g ,

w h i c h

i n d i c a t e d t h a t lysozyme

was i n i t i a l l y

b a c t e r i o s t a t i c

b u t l a t e r a l l o w e d

g r o w t h

u n d e r

t h e

e x p e r i m e n t a l

c o n d i t i o n s . A s s a y o f lysozyme

s h o w e d

t h a t lysozyme was

s t i l l a c t i v e

i n C a m e m b e r t ;

t h e r e f o r e ,

c h a n g e s

d u r i n g

r i p e n i n g i n

t h e c h e e s e or i n t h e b a c t e r i u m

p r o b a b l y overcame

t h e

i n h i b i t o r y a c t i v i t y

o f

lysozyme.

I n

c o n c l u s i o n , r e s u l t s o f

t h i s s t u d y s u g g e s t

t h a t eg g

w h i t e

lysozyme

c o u l d

b e u s e f u l

as a

p r e s e r v a t i v e

t o

p r o t e c t

a ga i n st L .

monocytogenes c o n t a m i n a t i o n

i n

s e v e r a l f o o d s , e s p e c i a l l y

t h o s e p r e p a r e d

f r o m

f r e s h v e g e t a b l e s .

T h e f o u r m a j o r

o u t b r e a k s

o f l i s t e r i o s i s t h a t

h a v e

o c c u r r e d

s i n c e

1 9 8 1

( 2 ,

4 , 1 0 , 1 9 )

h a v e p r o v e n

L i s t e r i a m o n o c y t o g e n e s

t o

b e a n

i m p o r t a n t

p a t h o g e n .

T h e i n c i d e n t s

t h a t o c c u r r e d

i n

Nova

S c o t i a

i n

1 9 8 1 ,

L o s

A n g e l e s

i n

1 9 8 5 ,

a n d

V a u d ,

S w i t z e r l a n d ,

i n

1 9 8 8

c o n f i r m e d b y

means

o f

e p i d e m i o l o g i c a l

a n d

m i c r o b i o l o g i c a l

e v i d e n c e

t h a t L . m o n o c y t o g e n e s

was

t r a n s m i t t e d b y

p a r t i c u l a r

f o o d s ( 2 8 ) .

I n t h e B o s t o n i n c i d e n t

( 4 ) , e p i d e m i o l o g i c a l

e v i d e n c e s u g g e s t e d p a s t e u r i z e d

w h o l e

m i l k a s t h e

v e h i c l e ,

b u t

m i c r o b i o l o g i c a l

c o n f i r m a t i o n

was

n o t

o b t a i n e d . T h e s e c a r e f u l l y

i n v e s t i g a t e d

o u t b r e a k s

h a v e

c l e a r l y

d e m o n s t r a t e d

t h a t

L .

m o n o c y t o g e n e s

c a n

b e t r a n s -

m i t t e d

i n

f o o d s .

I n a d d i t i o n

t o

t h e s e

p r o v e n

o u t b r e a k s ,

o t h e r

l i s t e r i o s e s

h a v e o c c u r r ed

i n w h i c h

e p i d e m i o l o g i c a l

o r m i c r o -

b i o l o g i c a l

e v i d e n c e w as

u n s a t i s f a c t o r y

t o

p r o v e

f o o d - b o r n e

t r a n s m i t t a l ( 2 8 ) .

One

o f t h e

f i r s t w e l l - d e s c r i b e d

f o o d - r e l a t e d

o u t b re ak s o f l i s t e r i o s i s

o c c u r r e d

i n 1 9 7 9 i n

a

B o s t o n

h o s p i t a l ,

w h e n 2 0 p a t i e n t s d e v e l o p e d

l i s t e r i o s i s

p r o b a b l y b y

e a t i n g

r a w

c e l e r y , t o m a t o e s ,

a n d

l e t t u c e

8 . D e s p i t e

t h e l a c k o f

c o n f i r m i n g

e v i d e n c e

i n

many

o b s e r v e d l i s t e r i o s e s ,

t h e

a v a i l -

a b l e

d a t a

i n d i c a t e

t h a t

o c c u r r e n c e

o f f o o d - b o r n e


i s

i n c r e a s i n g

i n

s e v e r a l

c o u n t r i e s

( 2 8 ) .

F o o d - b o r n e

t r a n s m i s s i o n

o f l i s t e r i o s i s

t o

humans

p r o b a b l y

o c c u r s m ai n l y t h r o u g h

e n v i r o n m e n t a l

c o n t a m i n a t i o n

b e -

c a u s e o f

t h e

uncommon

a b i l i t y

o f

L .


t o

c o l o n i z e

a n i m a l s a n d

f o o d c o n t a c t

s u r f a c e s

f r o m

e n v i r o n -

m e n t a l s o u r c e s

( 1 6 ,

2 6 ,

2 8 ) .

L .


i s

w i d e s p r e a d

i n t h e e n v i r o n m e n t a n d

h a s b e e n

i s o l a t e d

b y

e n r i c h m e n t

t e c h n i q u e s

f r o m many s o u r c e s ,

i n c l u d i n g

s e w a g e ,

v e g e t a b l e

*

C o r r e s p o n d i n g

a u t h o r .

6 3 1

m a t t e r ,

s o i l ,

s t r a w ,

s i l a g e , d u s t ,

m i l k , a n d

t h e

f e c e s o f

h e a l t h y

a n i m a l s a n d

h u m a n s

( 3 ,

7 ,

1 3 ,

2 5 ,

2 7 ) .

A l t h o u g h


was o n c e

b e l i e v e d

t o b e m a i n l y

a z o o n o s i s ,

many

e x p e r t s

no w

t h i n k

t h a t

i t

c o n t a m i n a t e s

f o o d m o s t l y

f r o m

e n v i r o n m e n t a l

s o u r c e s

( 2 8 ) .

M i c r o b i o l o g i c a l

s u r v e y s

o f f o o d s

a n d

f o o d - p r o c e s s i n g

p l a n t s

h a v e s h o w n

t h a t

t h e

p a t h o g e n

i s

t h o r o u g h l y

s p r e a d

i n

t h e f o o d

s u p p l y

a n d i n

f o o d - p r o c e s s i n g

p l a n t s

( 1 6 ,

2 6 ,

2 8 ) .

L .


h a s b e e n i s o l a t e d

f r o m raw

m i l k

( 1 , 5 , 1 6 ) ,

c h e e s e s

( 1 , 2 , 1 0 ,

1 6 , 2 4 , 2 8 ) , e g g s ( 1 7 ) ,

v e g e t a b l e s ( 1 7 , 2 8 ) ,

p r e p a r e d

s a l a d s

( 1 7 ,

2 2 ) ,

m e a t a n d

p o u l t r y

p r o d u c t s ( 6 ,

7 ,

1 6 ,

1 9 ) ,

a n d

s e a f o o d s

( 1 6 , 2 8 ) .

I n a d d i t i o n t o

i t s i n h e r e n t c o n t a m i n a t i o n

o f

many f o o d s ,

L .


s e e m s

t o h a v e a n

e x c e p t i o n a l

a b i l i t y

t o

c o l o n i z e

p a s t e u r i z e d

o r

p r o c es s e d p r o d u ct s

a n d t o

b e

t r a n s -

m i t t e d

o n - l i n e b y

p r o c e s s i n g m a c h i n e r y ,

s u c h a s

d u r i n g

s l i c i n g

o f

m e a t s

o r

v e g e t a b l e s ,

f i l l i n g

o f i c e

cream

c o n t a i n e r s ,

o r

p r e p a r a t i o n

o f

s a l a d s

( 1 4 , 1 6 , 2 8 ) .

I n a

s u r v e y

c o n d u c t e d

b y

t h e

U . S .

F o o d

a n d

D r u g

A d m i n i s t r a t i o n

b e g i n n i n g

i n

1 9 8 6 ,

2 . 5

o f

3 5 7

d a i r y p r o c e s s i n g

p l a n t s

were f o u n d t o

h a v e

p r o d u c t s

c o n t a i n i n g

L .


5 ,

1 6 ) .

P o s t p a s t e u r -

i z a t i o n


w as

t h o u g h t

t o

b e

m a i n l y

r e s p o n s i b l e

f o r

c o n t a m i n a t i o n .

L .


c a n

g r o w

a t

t e m p e r a -

t u r e s

o f

1

t o

4 5 C ( 2 0 ) ,

a n d

r e f r i g e r a t i o n

a l o n e

i s

n o t s u f f i c i e n t

t o

p r e v e n t

g r o w t h

i n

f o o d s .

I t c a n

w i t h s t a n d

25

N a C l a n d

a c i d i c

pHs

f o r s e v e r a l

m o n t h s

( 2 1 ) .

The

p r e s e n c e

o f

L .


i n

r aw

a n d c e r t a i n

p r o c e s s e d

f o o d s

may

b e

c u r r e n t l y

u n a v o i d a b l e

( 2 8 ) .

S a f e t y

o f

a

f o o d

f r o m

L .


d e p e n d s

on

m e e t i n g

t h r e e

p r o c e s s i n g

c r i t e r i a

( 1 4 ) : i

e l i m i n a t i n g

t h e


2/8

6 3 2

HUGHEY

E T A L .

o r g a n i s m

t o t h e

h i g h e s t

a c h i e v a b l e e x t e n t

b y p a s t e u r i z a t i o n

or

o t h e r

p r o c e s s i n g

m e t h o d s ,

i i a v o i d i n g

r e c o n t a m i n a t i o n ,

a n d

i i i a d d i n g

n e e d e d

a n t i m i c r o b i a l

p r o t e c t i o n

when

i n t r i n -

s i c

p r o t e c t i o n

i s

i n a d e q u a t e .

I f r e c o n t a m i n a t i o n o f

a

f o o d

d o e s

o c c u r ,

a

s e c o n d a r y


i s

h i g h l y

d e s i r e d .

O u r

l a b o r a t o r y

showed e a r l i e r

( 9 )

t h a t

eg g

w h i t e

lysozyme

k i l l e d

f o u r

p a t h o g e n i c

s t r a i n s

o f

L .

monocytogenes

i n c u l t u r e

media a n d i n

b u f f e r .

We h a v e e x t e n d e d our

t e s t s

t o

f o o d s

a n d

show

i n

t h i s

s t u d y

t h a t

l y s o z y m e

i s

e f f e c t i v e

i n

k i l l i n g

or

p r e v e n t i n g g r o w t h

o f

L .

monocytogenes

S c o t t

A

i n

s e v e r a l

f o o d s .

M A T E R I A L S

A N D

M E T H O D S

M a t e r i a l s . The sources

o f

eg g

w h i t e

lysozyme,

M i c r o c o c -

cus

l u t e u s ,

a n d

o t h e r m at e ri a l s were t h e

same

as

p r e v i o u s l y

d e s c r i b e d

9 .

O r g a n i s m s .

L .

monocytogenes

S c o t t A was

p r o v i d e d

b y E .

H .

M a r t h ,

U n i v e r s i t y

o f

W i s c o n s i n ,

M a d i s o n .

T h i s

s t r a i n

i s

b e i n g

u s e d

b y

t h e

I n t e r n a t i o n a l

D a i r y

F e d e r a t i o n

( g r o u p

E 6 4 )

f o r

d e v e l o p m e n t

o f m e t h o d s t o

d e t e c t

a n d

e n u m e r a t e

L .

monocytogenes

i n

f o o d s

( I n t e r n a t i o n a l

D a i r y

F e d e r a t i o n ,

group

E 6 4 ,

D e t e c t i o n

a n d E n u m e r a t i o n o f L . monocyto-

g e n e s ) .

P e n i c i l l i u m

c a m e m b e r t i was u s e d f o r s u rf ac e r i p en i ng

o f

c h e e s e ;

i t was

o r i g i n a l l y

s u b c u l t u r e d f r o m

t h e

K e n n e t h

R a p e r

c u l t u r e

c o l l e c t i o n i n

t h e

D e p a r t m e n t o f B ac t er io l o g y ,

U n i v e r s i t y

o f

W i s c o n s i n ,

M a d i s o n . S p o r e s

were p r o d u c e d

b y

2 -

t o

4 - w e e k

g r o w t h

a t

2 5 C

on

p o t a t o

d e x t r o s e agar.

B a c t e r i a l

m ed i a, g r o w t h ,

a n d e n u m e r a t i o n .

L . monocyto-

genes

was

r o u t i n e l y

grown

i n s t a t i c

c u l t u r e

i n

b r a i n

h e a r t

i n f u s i o n b r o t h

( D i f c o

L a b o r a t o r i e s ,

D e t r o i t , M i c h . )

a t

3 7 C .

Growth

i n

c u l t u r e m e d i a was m e a s u r e d

b y o p t i c a l

d e n s i t y

a t

5 0 0 nm

i n

a

S p e c t r o n i c

2 0

s p e c t r o p h o t o m e t e r

( B a u s c h

Lomb, I n c . ,

R o c h e s t er , N . Y . ) . O p t i c a l

d e n s i t y

v a l u e s

o f 0 . 1

a n d

1 . 0

r e p r e s e n t

v i a b l e

c e l l c o u n t s

o f

2 . 7

x

1 0 8

a n d 2 . 0

x

1 0 9 ,

r e s p e c t i v e l y ( J e a n

S c h o en i , p e r so n al

c o m m u n i c a t i o n ) .

For

g r o w t h

s t u d i e s

i n

f o o d s ,

L .

monocytogenes

S c o t t A

was f i r s t

c u l t u r e d i n b ra i n h e a r t i n f u s i o n b r o t h a t 3 7 C

a n d

i n o c u l a t e d i n t o t h e

f o o d s

a t

a

p r e d e t e r m i n e d

c o n c e n t r a t i o n

o f c e l l s .

T o

a d e q u a t e l y

m o n i t o r

l o s s o f v i a b i l i t y ,

we u s u a l l y

u s e d

1 0 4

c e l l s

p er g o f

f o o d .

A l l

f o o d i n c u b a t i o n s

were d o n e

i n

d u p l i c a t e ,

a n d

2 5 - g s a m p l e s o f f o o d s

w e r e s a m p l e d a n d

a n a l y z e d

i n d e p e n d e n t l y

f o r L .

monocytogenes.

L .

monocytogenes

was e n u m e r a t e d

b y

d i r e c t

p l a t i n g

on

l i t h i u m

c h l o r i d e - p h e n y l e t h a n o l - m o x a l a c t a m

a ga r

as d e -

s c r i b e d

p r e v i o u s l y ( 1 1 ,

1 2 )

e x c e p t t h a t g l y c i n e

was

u s e d

i n

p l a c e

o f

g l y c i n e

a n h y d r i d e . F o o d

s a m p l e s ( 2 5

g ) were

p l a c e d

i n

s t e r i l e

p l a s t i c

s t o m a c h e r b a g s

( m o d e l 4 0 0 ;

S e w a r d M e d i c a l

C o . ,

L o n d o n ,

U n i t e d

K i n g d o m ) ,

a n d

2 2 5

m l o f

L i s t e r i a

e n r i c h m e n t

b r o t h

( s e e

b e l o w

f o r

c o m p o s i t i o n )

was

a d d e d .

T h e

s a m p l e s

were

h o m o g e n i z e d

i n a s t o m a c h e r

( S t o m a c h e r

La b

B l e n d e r ,

m o d e l

4 0 0 ; Tekmar

C o . ,

C i n c i n n a t i , O h i o ) f o r

2

m i n . P o rt i o ns o f

0 . 1

m l

were

p l a t e d on

1 0 l i t h i um c h l o r i d e -

p h e n y l e t h a n o l - m o x a l a c t a m

p l a t e s .

When

c e l l s

were

present

i n

h i g h

n u m b e r s

( _ 1 0 4 / g ) , s a m p l e s

were s e r i a l l y

d i l u t e d i n

0 . 0 1

M

p h o s p h a t e

b u f f e r

( p H

7 . 2 ) , a n d

0 . 1

m i

was p l a t e d

on

d u p l i c a t e p l a t e s .

The

p l a t e s were i n c u b a t e d

a t

3 0 C

f o r

5

to

7

d a y s .

E n r i c h m e n t s

were a l s o p e r f o r m e d

t o

d e t e c t

very

low

numbers

o f L .

monocytogenes.

We m o d i f i e d

t h e e n r i c h m e n t

p r o c e d u r e

o f

M c C l a i n

a n d L e e ( 1 2 ) b y i n c u b a t i n g

c u l t u r e s

f o r

5

t o 7

d a y s

i n

t h e s t o m a c h e r b a g s

a t

3 0 C .

L i s t e r i a

e n r i c h m e n t

b r o t h

( 1 2 )

c o n s i s t e d

o f

t h e f o l l o w i n g ( p e r

l i t e r ) :

p r o t e o s e p e p t o n e

( D i f c o ) , 5 g; tryptone

( D i f c o ) ,

5

g;

La b

Lemco

p o w d e r ( O x o i d

L t d . , C o l u m b i a ,

M d . ) ,

5

g; yeast

e x t r a c t

( D i f c o ) ,

5

g ;

N a C I ,

2 0

g ; N a 2 H P O 4 ,

1 2

g ;

K H 2 P O 4 ,

1 . 3 5

g ; e s c u l i n ( S i g m a

C h e m i c a l

C o . ,

S t .

L o u i s , M o . ) ,

1

g ;

a n d n a l i d i x i c

a c i d

( s o d i u m

s a l t ;

S i g m a ) ,

2 0

m g .

A c r i f l a v i n e

h y d r o c h l o r i d e ( S i g m a ) ( 1 2 m g / l i t e r )

was f i l t e r s t e r i l i z e d

a n d

a d d e d t o

t h e m e d i u m

a f t e r

a u t o c l a v i n g .

F o r

p r i m a r y

e n r i c h -

m e n t , t h e

f o o d

h o m o g e n a t e s

i n

t h e s t o m a c h e r

b a g s

were

i n c u b a t e d

a t

3 0 C

f o r

5

t o

7

d a y s .

T h e n 0 . 1 - m l

p o r t i o n s

o f

t h e

e n r i c h m e n t s

w e r e i n o c u l a t e d i n t o

1 0

m l

o f L i s t e r i a

e n r i c h -

m e n t

b r o t h

p l u s

a c r i f l a v i n e

h y d r o c h l o r i d e

( 2 5

m g / l i t e r )

a n d

i n c u b a t e d

f o r

5

t o

7

d a y s

a s

a

s e c o n d a r y

e n r i c h m e n t .

T h e s e

s a m p l e s

w e r e s t r e a k e d

d i r e c t l y

o n

l i t h i u m

c h l o r i d e - p h e -

n y l e t h a n o l - m o x a l a c t a m

p l a t e s

a n d

a l s o

t r e a t e d

w i t h KOH

s o l u t i o n ( 1 2 )

t o

s e l e c t f o r L .

m o n o c y t o g e n e s .

T o c o n f i r m i d e n t i f i c a t i o n ,

f i v e

p r e s u m p t i v e

c o l o n i e s

p e r

s a m p l e

w e r e

e x a m i n e d

f o r v a r i o u s

p h e n o t y p i c

c h a r a c t e r i s -

t i c s , i n c l u d i n g

l a c k

o f p i g m e n t a t i o n ,

m o r p h o l o g y

o n

t r y p t o s e

a g a r ,

a n d p o s i t i v e c a t a l a s e t e s t .

T h r e e o f

t h e c o l o n i e s

w e r e

t h e n

t e s t e d

f o r

c h a r a c t e r i s t i c

e n d - o v e r - e n d

t u m b l i n g

m o t i l i t y

i n t r y p t o s e

b r o t h a t

a m b i e n t

t e m p e r a t u r e a n d f o r

u m b r e l l a

m o t i l i t y j u s t b e l o w

t h e

s u r f a c e

i n

m o t i l i t y

t e s t m e d i u m

( D i f c o )

a t

a m b i e n t

t e m p e r a t u r e a n d

a t

3 7 C . O n e c o l o n y

p e r

f o o d s am p l e w a s f u r t h e r t e s t e d

f o r

a

p o s i t i v e

m e t h y l

r e d

r e a c t i o n i n

MRVP m e d i u m ( D i f c o ) , f o r e s c u l i n

h y d r o l y s i s

i n

b i l e - e s c u l i n

a g a r

( D i f c o ) ,

a n d

f o r

r e d u c t i o n

o f l i t m u s

m i l k

( D i f c o )

a f t e r 2

d a y s

a t

3 0 C . S e r o l o g i c a l a n a l y s i s

w a s a l s o

p e r f o r m e d ,

u s i n g

L i s t e r i a 0 a n t i s e r u m t y p e 4 ( D i f c o ) . L i s t -

e r i a

0

a n t i g e n ( t y p e

4 ; D i f c o ) w a s u s e d a s a p o s i t i v e

c o n t r o l .

We a l s o t e s t e d

- 1 5

i s o l a t e s

f r o m t h e

b r a t w u r s t e x p e r i m e n t

f o r a c i d p r o d u c t i o n i n p u r p l e

b r o t h ( D i f c o )

c o n t a i n i n g

0 . 5

( w t / v o l ) g a l a c t o s e , s o r b i t o l , m a n n i t o l , d u l c i t o l ,

m a l t o s e ,

r h a m n o s e , x y l o s e , g l u c o s e ,

l a c t o s e ,

a n d

m e l e z i t o s e , a n d

we

f o u n d t h a t t h e p a t t e r n o f a c i d

f o r m a t i o n

w a s t h e

s a m e

a s

f o r

S co t t A .

F o o d s t u d i e s . S e v e ra l f o o d s w e r e

u s e d

a s

s u b s t r a t e s

f o r

L .


I n a l l f o o d s , we t e s t e d

f o u r c o n d i t i o n s :

i

c o n t r o l

( n o a d d i t i o n s ) ; i i l y s o z y m e ,

1 0 0 m g / k g ;

i i i

EDTA,

5

mM ( e x c e p t f o r C a m e m b e r t , w h i c h h a d

1

m M ) ;

a n d

( i v )

l y s o z y m e

p l u s EDTA.

I n

e a c h

e x p e r i m e n t ,

f o o d s

w e r e

p r e p a r e d a n d i n d i v i d u a l l y p l a c e d

i n s e v e r a l c o n t a i n e r s

f o r

i n c u b a t i o n .

Tw o

c o n t a i n e r s

( d u p l i c a t e

s a m p l e s )

w e r e

t e s t e d

a t

e a c h

t i m e

p o i n t

o f

s a m p l i n g . A l l f o o d s a m p l e s

w e r e

i n c u b at e d w i t h

a n d w i t h o u t e x p e ri m en t al l y i n o c u l a t e d

L .

m o n o c y t o g e n e s t o

e x a m i n e f o r

n a t u r a l

c o n t a m i n a t i o n .

F o o d s w e r e q u a l i t a t i v e l y e x a m i n e d

a t t h e

c o n c l u s i o n s

o f

t h e

e x p e r i m e n t s

f o r

l y s o z y m e

a c t i v i t y . M .

l u t e u s

d r i e d

c e l l s

( 0 . 2 5 m g / m l ; S i g ma )

w e r e

s u s p e n d e d

i n 2 . 9- ml p o rt i o ns

o f

0 . 0 6 7

M

p h o s p h a t e b u f f e r

( p H 6 . 6 ) . F o o d s a m p l e s

w e r e

d i l u t e d

1 0 - f o l d

w i t h b u f f e r a n d

a d d e d

t o t h e M.

l u t e u s

s u s p e n s i o n .

T h e d e c r e a s e i n A 5 4 0 w a s

m e a s u r e d

a f t e r 2

h .

A

m a r k e d d e c r e a s e i n

a b s o r b a n c e

c o m p a r e d

w i t h

t h a t

s e e n

i n

t h e

f o o d

s a m p l e s

w i t h o u t a d d e d

l y s o z y m e

i n d i c a t e d

t h a t

l y s o z y m e a c t i v i t y

w a s p r e s e n t . A l s o , f r e s h l y s o z y m e ( 1

t o 3

p p m [ 1 t o 3

, u g / m l ] ) w a s t e s t e d

i n

b u f f e r f o r c o m p a r i s o n

a n d

i n f o o d s w i t h o u t a d d e d l y s o zy m e

t o

a s c e r t a i n

t h a t

i n h i b i t i o n

w a s n o t o c c u r r i n g .

T h e

p H o f e a c h f o o d

s a m p l e

w a s e s t i -

m a t e d a f t e r 1 0

g

o f f o o d

w a s

h o m o g e n i z e d

i n

9 0 m l

o f

d i s t i l l e d

w a t e r .

P r e p a r a t i o n s

o f

f o o d s .

F r e s h

l e t t u c e h e a d s f r o m

a l o c a l

m a r k e t w e r e c o a r s e l y

s h r e d d e d a n d d i v i d e d i n t o

1 , 8 0 0 - g

p o r t i o n s .

L y s o z y m e

w a s

d i s s o l v e d i n

2 5

m l

o f 6 7

mM

p h o s p h a t e b u f f e r

( p H

6 . 6 ) , a n d E D T A ( t e t r a s o d i u m

s a l t ;

S i g m a )

w a s d i s s o l v e d i n

2 5 m l o f d i s t i l l e d w a t e r .

T h e

s o l u t i o n s

w e r e s p r i n k l e d o n t o t h e 1 , 8 0 0 - g p o r t i o n s

o f l e t t u c e .

T h e

f i n a l

c o n c e n t r a t i o n s

o f

l y s o z y m e

a n d E D T A

w e r e

1 0 0

m g / k g

a n d 5

mM ,

r e s p e c t i v e l y . L .


w a s

d i l u t e d

a n d p l a c e d i n 2 5

m l

o f 6 7 mM

p h o s p h a t e

b u f f e r a t

a

A P P L . E N V I R O N .

M I C R O B I O L .


3/8

LYSOZYME

AC TIVITY

A G A I N S T L .

MONOCYTOGENES IN F O O D S

6 3 3

c o n c e n t r a t i o n t o

g i v e

a p p r o x i m a t e l y 1 0 4 C F U / g o f l e t t u c e .

T h e

l e t t u c e w a s t h e n w e l l m i x e d

b y

h a n d .

P o r t i o n s

o f

1 0 0 g

w e r e

p l a c e d

i n

8 - o z

( c a . 2 2 7 - g )

p o l y s t y r e n e c o n t ai n e rs ( M il e s

S c i e n t i f i c ,

D i v . M i l e s L a b o r a t o r i e s , I n c . ,

N a p e r v i l l e ,

I l l . ,

a n d t h e

c o n t a i n e r s w e r e i n cu b at e d a t 5 C . D u p l i c a t e

c o n t a i n -

e r s w e r e

s a m p l e d f o r

L .

m o n o c y t o g e n e s a f t e r 0 , 3 ,

7 ,

a n d 1 2

d a y s .

F r e s h

g r e e n c a b b a g e o b t ai n ed

f r o m a l o c a l m a r k e t w a s

p r o c e s s e d

a s

d e s c r i b e d

a b o v e

f o r

l e t t u c e .

D u p l i c a t e

c o n t a i n

e r s w e re s a m p l e d a f t e r 0 , 3 , 7 , 1 2 , 2 0 , 2 7 , 3 4 , 4 1 , a n d 4 8 d a y s .

F r e s h e a r s o f s w e e t c o rn w e r e o b t a i n e d a t

a

l o c a l

m a r k e t ,

a n d k e r n e l s

w e r e

r e m o v e d .

P r o c e d u r e s

f o r

l y s o z y m e ,

EDTA, a n d L . m o n o c y t o g e n e s a d d i t i o n s a n d s a m p l i n g s w e r e

a s

d e s c r i b e d

a b o v e f o r

l e t t u c e .

S a m p l e s w e r e t a k e n a f t e r 0 ,

2 ,

4 ,

9 , 1 1 , a n d 1 5 d a y s .

F r e s h

g r e e n

b e a n s

w e r e

o b t a i n e d f r o m a

l o c a l

m a r k e t

a n d

w e r e s n a p p e d b y h a n d i n t o p i e c e s 1 t o 1 . 5 i n . ( c a . 2 . 5 t o 3 . 8

c m )

l o n g .

O t h e r

p r o c e d u r e s

w e r e

a s

d e s c r i b e d a b o v e

f o r

l e t t u c e . S a m p l e s w e r e t a k e n a f t e r 0 , 2 , 5 , 7 ,

9 ,

a n d

1 5

d a y s .

F r e s h c a r r o t s w e re p ro c es s ed

a s

d e s c r i b e d

f o r

f r e s h

l e t -

t u c e

e x c e p t

t h a t a n i n o c u l u m

o f

1 0 3

C F U

o f

L .

m o n o c y t o -

g e n e s p e r

g

w a s u s e d . S a m p l e s w e r e t a k e n o n

d a y s

0 , 2 , 5 , 9 ,

a n d

1 6 .

F r o z e n

c o r n

a n d f r o z e n

g r e e n

b e a n s

w e r e t r e a t e d

a s

d e s cr i b ed a b o v e .

C o r n s a m p l e s w e r e

t a k e n o n

d a y s

0 , 2 , 4 , 7 ,

a n d

1 0 ;

g r e e n

b e an s w e re

s a m p l e d

a f t e r

0 , 4 , 7 ,

a n d

1 1

d a y s .

F o r b r a t w u r s t

s a m p l e s , c o a r s e l y g r o u n d

f r o z e n

p o r k

t r i m

( 2 5

t o 3 0 f a t )

was o b t a i n e d f r o m t h e

D e p a r t m e n t

o f M u s c l e

B i o l o g y , U n i v e r s i t y

o f

W i s c o n s i n ,

M a d i s o n . S e m i t h a w e d

m e a t

( 1 5 - l b [ c a . 6 . 8 - k g ] s a m p l e s )

w a s

p l a c e d i n a

B u f f a l o

M i x e r

( J o h n

E . S m i t h s

S o n s C o . , B u f f a l o ,

N . Y . ) ;

a n

i c e

s l u r r y

( 7 5 0

m l )

a n d

1 3 6

g

o f b r at w u rs t

s p i c e ( F .

W. W i t t a n d

C o . ,

Y o r k v i l l e ,

I l l .

w e r e

a l s o

a d d e d . T h e n 1 0 0

m l e a c h o f

d i s t i l l e d w a t e r

w i t h

o r

w i t h o u t E D T A

( 5 mM,

f i n a l c o n c e n -

t r a t i o n )

a n d

6 7

mM

p h o s p h a t e

b u f f e r

w i t h o r w i t h o u t

l y s o -

zyme ( 1 0 0 p p m ,

f i n a l

c o n c e n t r a t i o n )

was

a d d e d ,

a n d L .


w as

i n o c u l a t e d

t o

1 0 4 / g .

T h e

s a m p l e s

were

m i x e d

f o r

4

m i n

w i t h i n t e r m i t t e n t

s t o p s

t o s h i f t

t h e

m e a t .

T h e

m e a t

was

t h e n g r o u n d

a n d

s t u f f e d i n t o

r i n s e d 3 2 - t o 35-mm

n a t u r a l

h o g

c a s i n g s

( V i s t a I n t e r n a t i o n a l

P a c k a g i n g ,

K e n o -

s h a ,

W i s . )

w i t h

a

h a n d - c r a n k e d

s t u f f i n g

m a c h i n e .

H a n d -

t w i s t e d l i n k s

( - 6

i n .

[ - 1 5 c m ] )

w e r e c u t

a p a r t

a n d vacuum

p a c k a g e d

i n

6 . 5 - b y - 1 2 - i n . ( c a .

1 6 . 5 - b y - 3 0 . 5 - c m )

C u r l o n

( g r a d e 5 5 0 ) vacuum b a g s

( C u r w o o d , I n c . , C h i c a g o ,

I l 1 .

i n

p o r t i o n s

o f 0 . 7 5

t o

1 l b

( c a .

0 . 3 4

t o 0 . 4 5 4

k g ) .

T h e

s p i c e

m i x

w a s f o r m u l a t e d s u c h t h a t

t h e

p r e p a r e d s a u s a g e s

c o n t a i n e d

a p p r o x i m a t e l y

2 0

o z

( c a .

5 6 7

g )

o f

N a C l

p e r

1 0 0

l b

( c a .

4 5 . 4

k g )

o f m e a t

( F .

W.

W i t t ,

p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) .

T h r o u g h -

o u t


o f

t h e

s au s ag e s , r ea g e n t s

a n d

e q u i p m e n t

w e r e

k e p t

c o l d

a n d

h a n d l i n g

w as

m i n i m i z e d t o

k e e p

t h e f a t

a n d

m u s c l e

p a r t i c u l a t e .

T h e

p a c k a g e s

o f

l i n k s

were s t o r e d a t

5 C

f o r t h e

d u r a t i o n

o f

t h e

e x p e r i m e n t .

D u p l i c a t e p a c k a g e s

w e r e

e x a m i n e d

f o r L .


a s

d e s c r i b e d

a b o v e

a f t e r

0 ,

2 ,

6 ,

9 , 1 5 , 2 3 , 3 3 , 3 7 ,

a n d 4 4

d a y s .

C a m e m b e r t

c h e e s e

was

p r e p a r e d

a c c o r d i n g

t o

a s t a n d a r d

p r o t o c o l

f r o m

t h e

C h e e s e

R e s e a r c h

I n s t i t u t e

( c o u r t e s y

o f

Mark

J o h n s o n ,

C h e e s e

R e s e a r c h

I n s t i t u t e ,

U n i v e r s i t y

o f

W is c o ns i n, M a d i s o n) . S a f e t y p r e c a u t i o n s

i n


o f

t h e c h e e s e w i t h L .


were f o l l o w e d

a s d e -

s c r i b e d

b y R y s e r

a n d

M a r t h

( 1 8 ) .

F r e s h

p a s t e u r i z e d

w h o l e

m i l k

( - 6 0

l b

[ - 2 7 k g ] )

w a s

o b t a i n e d f r o m

t h e

U n i v e r s i t y

D a i r y

P l a n t .

T h e

m i l k w as

p l a c e d

i n a

s m a l l

c h e e s e

v a t ,

a n d t h e

t e m p e r a t u r e

w a s

a d j u s t e d

t o

3 3 C .

A

1 0 - m l

amount

o f

S u p e r s t a r t

s t a r t e r

c u l t u r e

( M i l e s

L a b o r a t o r i e s ,

I n c . , M a d i s o n , W i s . )

a n d 6

m l

o f

M a r z y m e s i n g l e - s t r e n g t h

m i c r o b i a l

r e n n e t

( M i l e s )

were

a d d e d .

L y s o z y m e

i n

6 7 mM

p h o s p h a t e

b u f f e r

a n d

E D T A i n

d i s t i l l e d

w a t e r

were a d d e d t o

d e s i g n a t e d

v a t s

a t 1 0 0

m g / k g

a n d 1

mM , r e s p e c t i v e l y ( 1

mM i n s t e a d o f 5

mM E D T A w a s

u s e d

b e c a u s e

t h e

h i g h e r

c o n c e n t r a t i o n i n h i b i t e d

c u rd f o r ma -

t i o n .

F i n a l l y ,

L .


w a s

s u s p e n d e d

i n 1 0

m l

o f

s t e r i l e

s k i m

m i l k

a n d

a d d e d a t

1 0 4

CFU/ml t o

d e s i g n a t e d

b a t c h e s . T h e c o n t e n t s

o f t h e

v a t s

were w e l l

m i x e d

w i t h

a

s t r a i n i n g s p o o n ,

a n d c u r d

w a s

a l l o w e d

t o f o r m f o r

5 0

m i n .

T h e

c u r d

w a s

c u t

i n t o 0 . 7 5 - i n .

( c a .

1 . 9 - c m )

c u b e s

w i t h

c h e e s e

k n i v e s

a n d a l l o w e d t o h e a l f o r 1 5

t o 2 0

m i n

w h i l e

b e i n g

f r e q u e n t l y

s t i r r e d . T h e

c u r d s we re

p o u r e d

i n t o 1 2 c h e e s e

h o o p s 5

a n d

0 . 5

i n .

[ c a .

1 2 . 7 a n d

1 . 3

c m ] ) ,

w h i c h we re

p l a c e d

on a

d r a i n i n g

b o a r d c o v er ed

w i t h

c h e e s e c l o t h .

T h e

h o o p s

were

c o v e r e d

w i t h c h e es e c l o t h

a n d

t u r n e d

a f t e r

1 a n d

5

h . T h e c o v e r e d

c h e e s e w h e e l s

were

l e f t

o v e r n i g h t

a t

a m b i e n t

t e m p e r a t u r e ,

a n d

t h e n e x t

m o r n i n g

t h e y

were

c o a t e d w i t h c h e e s e s a l t t o a c h i e v e a s a l t

c o n t e n t o f

- 2 . 5 o .

T h e

w h e e l s were

l e f t

c o v e r e d a t

5 C

on

t h e s e c o n d

n i g h t .

On

t h e t h i r d

m o r n i n g ,

t h e w h e e l s were

d i p p e d

i n t o 1 0 0

m l

o f

s t e r i l e s a l i n e

c o n t a i n i n g

P .

c a m e m b e r t i

s p o r e s .

T h e

c h e e s e

w h e e l s were

p l a c e d

on a

c l e a n e d

d r a i n i n g b o a r d ,

c o v e r e d

w i t h f r e s h

c h e e s e c l o t h ,

a n d

i n c u b a t e d

i n

t h e

U n i v e r s i t y

o f

W i s c o n s i n B i o t r o n

f a c i l i t y

i n an

i n c u b a t o r h e l d

a t

1 5 C

a n d

9 0 t o 95

r e l a t i v e

h u m i d i t y .

T h e

w h e e l s

w e r e

t u r n e d

e v e r y

1

t o

2

d a y s

f o r

1 4

d a y s ,

a t

w h i c h

t i m e

t h e w h e e l s

were

i n d i v i d u a l l y w r a p p e d

i n a l u m i n u m f o i l

a n d

s t o r e d a t

5 C

f o r

t h e d u r a t i o n

o f t h e


T h e c u r d s

were

s a m p l e d

on

d a y 0 ,

a n d

d u p l i c a t e

s l i c e s

we re

t a k e n

f r o m

s i n g l e

w h e e l s o f

t h e

r i p e n i n g

c h e e s e s

on

d a y s 2 , 6 ,

1 3 ,

2 0 , 2 7 , 3 4 ,

4 8 ,

5 5 ,

a n d

6 7 .

I n

a d d i t i o n ,

a c h e e s e

w h e e l w a s

r e m o v e d on

d a y

2

j u s t

b e f o r e m o l d

i n o c u l a t i o n

a n d t e s t e d f o r s a l t

a n d m o i s t u r e

c o n t e n t s .

T h e s a l t c o n c e n t r a t i o n s

w e r e d e t e r m i n e d

b y u s i n g

Q u a n t a b

C h l o r i d e T i t r a t o r s

( n o . 1 1 7 6 ;

M i l e s ) ;

i n d i v i d u a l

d e t e r m i n a t i o n s

r a n g e d

f r o m

1 . 5

t o 2 . 7 .

T h e

m o i s t u r e

c o n t e n t w a s

e s t i m a t e d b y c r u m b l i n g

a s l i c e

a n d t h e n

m i x i n g

a n d

p l a c i n g

2 - t o

3 - g p o r t i o n s

i n t o e a c h

o f t h r e e

t a r e d

a l u m i n u m

b o a t s ,

w h i c h

were

d r i e d

o v e r n i g h t

a t

9 4 C

i n

a

vacuum

o v e n ,

a l l o w e d t o c o o l

i n

a

d e s i c c a t o r ,

a n d

w e i g h e d .

M o i s t u r e

c o n t e n t s

r a n g e d

f r o m

4 9 . 6 t o

5 5 . 6 .

S a m p l i n g

a n d

e n u m e r a t i o n

o f

L .


i n

d u p l i c a t e

c h e e s e

s l i c e s

were c a r r i e d o u t

a s d e s c r i b e d

a b o v e f o r t h e o t h e r

f o o d s .

RESULTS

A c t i v i t y

o f

l y s o z y m e

i n

v e g e t a b l e s .

T h e a n t i b a c t e r i a l a c t i v -

i t y

o f

l y s o z y m e a g a i n s t

L .


S c o t t

A was

e v a l u a t e d

i n s e v e r a l

f o o d s ,

e s p e c i a l l y

t h o s e

t h a t h a v e

b e e n

s h o w n o r

s u s p e c t e d

t o t r a n s m i t

l i s t e r i o s i s or t o

h a r b o r t h e

p a t h o g e n .

O f t h e

t h r e e

c o n f i r m e d

f o o d - b o r n e

o u t b r e a k s o f


s i n c e

M a r c h

1 9 8 1

2 8 ,

tw o

r e s u l t e d f r o m

c o n t a m -

i n a t i o n

o f

s o f t - r i p e n e d

c h e e s e s

2 ,

1 0 )

a n d one

w a s

a t t r i b u t e d

t o

c o l e s l a w

c o n t a m i n a t e d

w i t h

i n f e c t e d

c a b b a g e

1 9 .

We

f i r s t

e x a m i n e d

t h e

a c t i v i t y

o f

l y s o z y m e

i n

s e v e r a l

v e g e t a b l e s ,

i n c l u d i n g

c a b b a g e .

L .


g r e w

w e l l

i n s h r e d d e d

c a b b a g e

F i g .

1 ;

i n t h e a b s e nc e o f

i n h i b i t o r y a g e n t s ,

t h e

o r g a n i s m

r a p i d l y

r e a c h e d

3 . 5 x

1 0 6

C F U / g

a n d t h e n f u r t h e r

i n c r e a s e d

t o

1 0 8

C F U / g .

( I n

a l l

s a m p l i n g s ,

we e x a m i n e d

d u p l i c a t e

c o n t a i n e r s

a t e a c h t i m e

p o i n t .

D u p l i c a t e

e n u m e r a t i o n s

o f L .

m o n o c y t o -

g e n e s

f r o m

i n d i v i d u a l

c o n t a i n e r s

v a r i e d

< 2 - f o l d

f r o m

t h e

me a n o f

t h e tw o

d e t e r m i n a t i o n s . )

I n i n c u b a t i o n s

c o n t a i n i n g

c a b b a g e

w i t h

1 0 0

mg

o f

l y s o z y m e p e r k g

or

l y s o z y m e

w i t h

5

mM

E D T A ,

L .


S c o t t

A

( C F U

p e r

g r a m )

d e c l i n e d

b y a p p r o x i m a t e l y

1 0 - or

1 0 0 - f o l d ,

r e s p e c t i v e l y ,

a f t e r

7

d a y s

o f

i n c u b a t i o n a t

5 C .

L .


i n

t h e

c a b b a g e s a m p l e s

w i t h

l y s o z y m e g r e w

m a r g i n a l l y

a f t e r 7

d a y s

V O L .

5 5 ,

1 9 8 9


4/8

6 3 4

HUGHEY E T

AL .

a

b o

0

0 1 0 2 0

3 0 40

5 0

d a y s

F I G .

1 .

E f f e c t o f l y s o z y m e a n d

EDTA

on

g r o w t h

o f

L i s t e r i a

monocytogenes

i n

s h r e d d e d c a b b a g e .

S e e M a t e r i a l s a n d M e t h o d s

f o r


d e t a i l s .

a n d l a t e r

d e c l i n e d ,

w h e r e a s

g r o w t h

i n t h e

i n c u b a t i o n s w i t h

l y s o z y m e a n d

EDTA

d e c l i n e d t h r o u g h o u t

t h e


B a c t e r i a

i n

t h e t r e a t m e n t s c o n t a i n i n g EDTA a l o n e

grew

w e l l

a n d

p a r a l l e l e d

n u m b e r s i n

t h e

c o n t r o l f o r

3 0

d a y s ,

a f t e r

w h i c h t h e p o p u l a t i o n r a p i d l y

d r o p p e d .

The

u n u s u a l g r o w t h

p a t t e r n s

o f

L . monocytogenes

i n

c a b b a g e

c o n t a i n i n g

EDTA

were

o f t e n seen i n o t h e r f o o d s as

w e l l

( s e e

b e l o w ) .

The l o s s

i n

v i a b i l i t y

o f L .

monocytogenes

i n

c a b b a g e

i n

t h e

presence

o f

l y s o z y m e

was n o t d u e

t o

c h a n g e s

i n

p H ,

s i n c e a l l

f o u r i n c u b a t i o n c o n d i t i o n s

g a v e


t h e

same

p H

p r o f i l e s .

T h e i n i t i a l

p H

o f

t h e

c a b b a g e medium was

4 . 8 ,

w h i c h i n c r e a s e d t o 6 . 6 t o 6 . 8 a f t e r 7 d a y s a n d r e ma i n e d at

t h i s

p H

u n t i l

2 0

d a y s o f i n c u b a t i o n . T h e pHs t h e n d r o p p e d t o

4 . 3

t o

4 . 9

i n

t h e

s a m p l e s

c o n t a i n i n g

lysozyme,

w h e r e a s t h e

c o n t r o l s

h a d f i n a l pHs

o f

5 . 8

t o

5 . 8 5

a f t e r 4 0

d a y s .

The

s a m p l es s u p p l e m e n t e d

w i t h

EDTA

a l o n e h a d

pHs

r a n g i n g

f r o m 5 . 0 t o 5 . 5

a f t e r 4 0 d a y s .

T h e u n u s u a l

c h a n g e s

i n

p H

may

h a v e b e e n

c a u s e d

b y c h a n g e s

m e d i a t e d b y

L .

monocyto-

g enes

a n d

o t h e r

b a c t e r i a l

f l o r a

i n t h e

r e f r i g e r a t e d c o n d i t i o n s ,

i n

w h i c h

l a c t i c a c i d f e r m e n t a t i o n may h a v e b e e n

s u p p r e s s e d .

V i s i b l e

c h a n g e s

o f

t h e

c a b b a g e , i n c l u d i n g b r o w n i n g a n d

s o f t e n i n g , were n o t i c e d

a f t e r 1

t o

2

w e e k s .

The

i n c u b at i o n s w i t h

l e t t u c e

( F i g .

2 ) s h o w e d

p a t t e r n s

o f

L .

monocytogenes

s u r v i v a l s i m i l a r t o

t h o s e

seen w i t h

c a b b a g e .

The

c o m b i n a t i o n

o f

lysozyme a n d EDTA was a c t i v e l y

l i s t e r i c i d a l , w h e r e a s

l y s o z y m e

a l o n e

was l i s t e r i s t a t i c . The

c o n t r o l s a n d

t h e

s a m p l e s w i t h EDTA a l o n e grew t o p o p u l a -

t i o n s o f

3 . 4

x

1 0 5 a n d

1 . 6

x

1 0 5 .

I n

c o n t r a s t , s a m p l e s w i t h

EDTA

a n d l y s o z y m e

h a d

no

d e t e c t a b l e

L .

monocytogenes

a f t e r 1 2

d a y s . T h e l y s o z y m e s a m p l e s h a d - 2 . 5

x

1 0 3

o r g a n i s m s ,

a 2 - f o l d

d e c r e a s e f r o m t h e i n i t i a l c e l l c o u n t . I n

t h e

l e t t u c e s a m p l e s , t h e r e

was

l i t t l e v a r i a t i o n

among

t h e p H

0

WW

0 5

1 0

1 5

d a y s

F I G . 2 .

E f f e c t

o f

l y s o z y m e

a n d E D T A o n

g r o w t h

o f L .

m o n o c y -

t o g e n e s i n s h r e d d e d l e t t u c e .

p r o f i l e s

e x c e p t

f o r

t h e

n e g a t i v e

c o n t r o l ,

w h i c h

h a d a

l o w e r

f i n a l p H ( 4 . 8 )

t h a n d i d

t h e

o t h e r i n c u b at i o n s

( p H r a n g e ,

5 . 6 t o

5 . 8 ) . T h e r e f o r e , l y s o z y m e

w as

a c t i v e l y

l i s t e r i c i d a l

i n l e t t u c e .

L y s o z y m e w i t h

E D T A

was b a c t e r i c i d a l

i n

s n a p p e d g r e e n

b e a n s ;

a f t e r 1

w e e k ,

a d e cr ea se o f - 10 0 -f o l d was

o b s e r v e d

( F i g .

3 .

I n

t h e o t h e r


v a r i a t i o n s

g r o w t h

o c -

c u r r e d ,

a l t h o u g h

l y s o z y m e

s l o w e d

g r o w t h

c o n s i d e r a b l y

c o m p a r e d

w i t h r e s u l t s f o r t h e

c o n t r o l

o r

E D T A

i n c u b a t i o n s

( F i g . 3 .

I t

a p p e a r s

t h a t

l y s o z y m e

w i t h

o r

w i t h o u t

E D T A

was

l e s s e f f e c t i v e

i n

g r e e n

b e a n s

t h a n

i n

c a b b a g e

o r l e t t u c e .

T h e

i n i t i a l p H s

o f t h e

g r e e n

b e a n s

v a r i e d

f r o m 5 . 9 4

t o

6 . 0 7 ,

a n d

t h e

f i n a l

pHs

o f

t h e d i f f e r e n t

s a m p l e s c h a n g e d

b y

l e s s t h a n

0 . 4

p H

u n i t s .

P o s s i b l y ,

t h e a b s e n c e o f

p H

s t r e s s

d u r i n g

i n c u b a t i o n s u p p o r t e d s u r v i v a l

o f L .


A l t e r -

n a t i v e l y ,

s i n c e t h e

g r e e n

b e a n s

w e r e

s n a p p e d

i n t o

f a i r l y

l a r g e

p i e c e s ,

i t

i s

p o s s i b l e

t h a t

l y s o z y m e

d i d

n o t

r a p i d l y

p e n e t r a t e

t o

t h e i n t e r i o r

a n d L .


c o u l d c o l o ni ze

t h e

c e n t e r

a n d

g r o w

i n i s o l a t i o n .

T r e a t m e n t

o f f r e s h

c o r n

k e r n e l s

w i t h

l y s o z y m e

w i t h

a n d

w i t h o u t EDTA

r e s u l t e d

i n a p a t t e r n

o f

L .


s u r v i v a l

s i m i l a r

t o t h a t d e s c r i b e d a b o v e f o r

g r e e n

b e a n s .

T h e

d e c l i n e

r a t e s

w e r e much

s l o w e r t h a n o n

l e t t u c e

a n d

c a b b a g e ,

b u t i t

was s t i l l

e v i d e n t t h a t

l y s o z y m e p l u s

E D T A was

l i s t e r i c i d a l

w h e r e a s

l y s o z y m e a l o n e

was

l i s t e r i s t a t i c ( F i g . 4 ) .

I n

c o n t r a s t ,

L .

m o n o c y t o g e n e s i n t h e

n e g a t i v e c o n t r o l s

w i t h o u t

a n y a d d i t i o n s

a n d

t h e

i n c u b at i o n s c o n t ai n i n g

E D T A

a l o n e g r e w t o

1 . 0

x

1 0 7 a n d 1 . 8 x

1 0 5 ,

r e s p e c t i v e l y ,

a f t e r

9

d a y s .

I n i t i a l

pHs o f

t h e f r e s h

c o r n

s a m p l e s

v a r i e d

f r o m

6 . 6 t o

6 . 7

a n d

d i d n o t

c h a n g e t h r o u g h d a y 9 ,

b u t

d r o p p e d

t o

4 . 5

t o

5 . 0 a f t e r 1 5

d a y s

i n t h e

s a m p l e s n o t c o n t a i n i n g

EDTA. W i t h

EDT

p r e s e n t ,

t h e

pHs

d i d n o t

d r o p b e l o w

6 . 0

a f t e r 1 5

d a y s .

E D T A

s e e m e d

t o

a f f e c t

s u b s e q u e n t

b a c t e r i a l

s p o i l a g e

b u t d i d

n o t i n f l u e n c e

s u r v i v a l

o f

L . m o n o c y t o g e n e s . As w i t h

t h e

A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .


5/8

L YS OZ YM E

ACTIVITY A G A I N S T

L . M O N O C Y T O G E N E S I N F O O D S

7

6

5

0

0

4

3

~~~

+ I y s o z y m e

2

+

I

sozyme

+EDTA

0

2 4 6

8 1 0

d a y s

F I G . 3 . E f f e c t o f

lysozyme a n d EDTA on g r o w t h o f L .

monocy-

togenes

i n

f r e s h s n a p p e d g r e en

b e a n s .

o t h e r f r e s h v e g e t a b l e s

t e s t e d , l y s o z y m e

h a d

a n e g a t i v e

e f f e c t

on L .

monocytogenes g r o w t h

i n

f r e s h corn.

T h e

s l o w e r

r a t e s

o f d ec l i n e c o u l d h a v e r e s u l t e d f r o m

d i f f e r e n c e s i n f o o d

c o m p o s i t i o n , s u c h

as t h e

p resence

o f h i g h


o f

c a r b o h y d r a t e s , w h i c h

c o u l d

promote

g r o w t h .

I n

f r e s h

s h r e d d e d

c a r r o t s ,

i n c u b a t i o n o f l y s o z y m e

w i t h

a n d

w i t h o u t

EDTA

a n d

L . monocytogenes

r e s u l t e d

i n

un-

u s u a l

responses o f g r o w t h

a n d

k i l l i n g ( F i g .

5 ) . I n t h i s

e x p e r i m e n t ,

L .

monocytogenes

was u s e d a t l o w e r

i n i t i a l

l e v e l s ( - 1 , 0 0 0

c o l o n i e s

p er

g ) . Lysozyme a l o n e

or w i t h

EDTA

very

r a p i d l y k i l l e d

L . monocytogenes i n t h e

c a r r o t

medium

( F i g . 5 ) . B a c t e r i a

i n t h e c o n t r o l w i t h

no a d d i t i o n s

i n i t i a l l y

grew

f o r a p p r o x i m a t e l y

tw o d o u b l i n g s ,

a n d

t h e n

d e t e c t a b l e

n u m b e r s a l s o f e l l t o zero a f t e r d a y 9 .

I n c o n t r a s t ,

EDTA

i n i t i a l l y s u p p o r t e d

a

l a r g e

i n c r e a s e i n

v i a b l e

c e l l

c o u n t s ,

w h i c h

t h e n

r a p i d l y

d e c l i n e d a f t e r

d a y

9 . T h e s e

r e s u l t s

s u g g e s t

t h a t

t h e r e

may b e f a c t o r s

i n c a r r o t s ,

p e r h a p s

l i m i t i n g

m e t a l

i o n s or

l i s t e r i c i d a l f a c t o r s ,

t h a t

encoura ge t h e

a c t i v i t y

o f

l y s o z y m e

a g a i n s t

L .

monocytogenes.

The

pHs

o f

t h e

c a r r o t s a m p l e s

were i n i t i a l l y

6 . 2 t o

6 . 4 ;

t h e s e

d r o p p e d

s t e a d i l y t o

4 . 1

t o

4 . 4 a f t e r 9

d a y s .

The

c h a n g e

i n

p H

d i d

n o t

a p p e a r

t o

i n f l u e n c e L . monocytogenes

s u r v i v a l .

O v e r a l l , l y s o z y m e

was

very

e f f e c t i v e

i n

k i l l i n g

L .

mono-

cytogenes

i n most f r e s h

v e g e t a b l e

p r o d u c t s .

D u r i n g

t h e

w i n t e r , we a l s o

t e s t e d f r o z e n c o m m e r c i a l g reen

b e a n s a n d

corn;

i n

b o t h cases, l y s o z y m e

d i d

n o t

k i l l

t h e i n o c u l a t e d

L .

monocytogenes, a l t h o u g h

i t

d i d

( i n c o m b i n a t i o n

w i t h

E D T A)

p r e v e n t

g r o w t h ( d a t a

n o t

s h o w n ) .

We n o t i c e d t h a t

w i t h

t h e

f r o z e n

green b e a n s , b u t n o t

w i t h t h e

corn,

t h e

p H

o f t h e

f r o z e n p r o d u c t d r o p p e d

much f a s t e r t h a n

i t d i d w i t h f r e s h

green

b e a n s ,

p e r h a p s

b e c a u s e

o f more r a p i d

g r o w t h

b y

a c i d

f o r m e r s .

The

reasons

t h a t

l y s o z y m e

was

n o t

e f f e c t i v e

i n

t h a w e d

f r o z e n

p r o d u c t s

i s

n o t k n o w n ,

b u t

t h e y may

b e

5

4

+ l y s o z y m e

3

+Iysozyme

+ E D T A

2

0 1 0

2 0

d a y s

F I G . 4 . E f f e c t o f l y s o z y m e

o n

g r o w t h

o f L .


i n

f r e s h

c o r n .

r e l a t e d t o i n a c t i v a t i o n o f e n h a n c i n g

f a c t o r s d u r i n g p r o c e s s -

i n g

o f t h e

f r e s h

v e g e t a b l e s .

A c t i v i t y

o f l y s o z y m e

i n

f r e s h

s a u s a g e s .

We

n e x t

e x a m i n e d

t h e e f f e c t i v e n e s s o f l y s o z y m e

a g a i n s t L . m o n o c y t o g e n e s

i n

b r a t w u r s t , w h i c h

i s

a f r e s h

m e a t

s a u s a g e common

i n W i s -

c o n s i n .

I n i t i a l

c o u n t s o f

L .


i n

t h e

s a u s a g e s

w e r e

4

x

1 0 3 C F U / g .

We f o u n d

t h a t t h e

i n c u b a t i o n s

c o n t a i n -

i n g l y s o z y m e

a l o n e

d i d n o t

a f f e c t

g r o w t h

s i g n i f i c a n t l y

c o m -

p a r e d

w i t h

t h e

n e g a t i v e

c o n t r o l w i t h o u t

l y s o z y m e

( F i g .

6 ) .

B o t h i n c u b a t i o n s g r e w

t o _ - 1 0 7

C F U / g

i n

1

t o

2 w e e k s .

T h e

s a u s a g e s

c o n t a i n i n g

E D T A a l o n e

w e r e l i s t e r i s t a t i c f o r

2

w e e k s ,

a f t e r w h i c h

L .

m o n o c y t o g e n e s g r e w

t o v e r y h i g h

n u m b e r s .

T h e m o s t e f f e c t i v e

v a r i a t i o n t h a t

i n h i b i t e d

L .


was

t h e

c o m b i n a t i o n

o f

l y s o z y m e

a n d

E D T A . When

t h e s e tw o s u b s t a n c e s

w e r e

i n c l u d e d

t o g e t h e r ,

i n i t i a l n u m b e r s

f e l l

f r o m

3 . 9

x

1 0 3 t o

1 . 4

x

1 0 3

a f t e r 9

d a y s ,

a n d

t h e n

L .

m o n o c y t o g e n e s s l o w l y

b e g a n t o

g r o w

o v e r

t h e

4 4 - d a y

d u r a t i o n

o f

t h e


The

p H

r e m a i n e d

a t


6

i n a l l

o f

t h e i n c u b a t i o n s .

I n

c o n t r o l

s a u s a g e s

w i t h o u t i n o c u l a t e d L .


S c o t t

A ,

b u t

n o t

i n

t h e

s a u s a g e s

c o n t a i n i n g

EDTA,

w e

d e t e c t e d

a n d

c o n f i r m e d

L i s t e r i a

c o l o n i e s

i n t h e a b s e n c e

o r

p r e s e n c e

o f

l y s o z y m e .

C a r b o h y d r a t e

t e s t s

s h o w e d

t h a t a

p r o p o r t i o n

o f

t h e s e c o l o n i e s r e a c t e d

d i f f e r e n t l y

t h a n

d i d L .


S c o t t

A , e s p e c i a l l y

i n a s s i m i l a t i o n

o f

m e l e z -

i t o s e .

We a s s u m e t h a t

t h e

p o r k

t r i m

c o n t a i n e d

L i s t e r i a

c e l l s

a s i n h e r e n t c o n t a m i n a n t s .

T h e s e

c o m p r i s e d

< 0 . 1 o f

t h e

i n o c u l a

w e a d d e d a n d

p r o b a b l y

d i d n o t

a f f e c t o u r

r e s u l t s .

I t i s

e v i d e n t

t h a t

i n

f r e s h

p o r k

s a u s a g e s

EDTA

a n d

l y s o z y m e

a c t e d s y n e r g i s t i c a l l y

i n

p r e v e n t i n g g r o w t h .

S i n c e

t h e

s h e l f l i f e o f

f r e s h b r a t w u r s t

i s


6/8

6 3 6

HUGHEY E T A L .

4

3

2

0

b o

1 . 1

+lysozyme\

1 0

2 0

d a y s

F I G .

5 . E f f e c t

o f l y s o z y m e

a n d

E D T A

a n d

l y s o z y m e o n

g r o w t h

o f L .

m o n o c y t o g e n e s i n c a r r o t s .

p r o v i d e

n e e d e d p r o t e c t i o n . We ar e

c u r r e n t l y e x a m i n i n g

o t h e r

m e a t s , i n c l u d i n g

f r e s h

f r a n k f u r t e r s .

V a r i o u s

c h e l a t o r s ,

i n c l u d i n g n a t u r a l

s u b s t a n c e s

s u c h a s c o n a l b u m i n

a n d

l a c t o -

f e r r i n , a r e

a l s o

b e i n g t r i e d i n c o m b i n a t i o n

w i t h l y s o z y m e .

E f f e c t i v e n e s s o f

l y s o z y m e

i n

m o l d - r i p e n e d C a m e m b e r t

c h e e s e .

S o f t - r i p e n e d c h e e s es h a v e

b e e n a s s o c i a t e d w i t h

t r a n s f e r

o f

l i s t e r i o s i s t o

h u m a n s .

T h e s e

p r o d u c t s c o u l d

b e n e f i t

b y i n c l u s i o n o f a s a f e

p r e s e r v a t i v e a c t i v e a g a i n s t L .


We

p r e p a r e d s e v e r a l w h e e l s

o f C a m e m b e r t c h e e s e c o n -

t a i n i n g

l y s o z y m e ,

E D T A , a n d L . m o n o c y t o g e n e s . I n i t i a l

c o u n t s o f L .

m o n o c y t o g e n e s f r o m s e v e n

c h e e s e

w h e e l s made

i n

s e p a r a t e

w e e k s

r a n g e d

f r o m 2 . 9

x

1 0 4

t o

3 . 3

x

1 0 4 .

F i g u r e

7

s h o w s t h e

r e s u l t s o f i n c l u d i n g l y s o z y m e

w i t h a n d w i t h o u t

E D T A

i n t h e

c h e e s e s .

T h e

c o n t r o l

c h e e s e s

h a r b o r i n g

L .


b u t n o t

l y s o z y m e

o r E D T A

i n i t i a l l y s h o w e d

a

s l i g h t

d e c l i n e

i n n u m b e r s

d u r i n g t h e

f i r s t

3 w e e k s

o f

c u r i n g ,

b u t

t h e r e a f t e r L .

m o n o c y t o g e n e s g r e w s t e a d i l y a n d r e a c h e d

5

x

1 0 6

C FU / g

a f t e r 5 5 d ay s . A ft e r t h e

5 5 - d a y s a m p l i n g ,

d e t e c t i o n i n

s e v e r a l

o f

t h e

e x p e r i m e n t a l v a r i a t i o n s

g a v e

s p o r a d i c

n u m b e r s f r o m

s a m p l e t o

s a m p l e ,

p e r h a p s b e c a u s e

o f

n o n u n i f o r m

s p a t i a l

d i s t r i b u t i o n

o f

L .


i n

t h e

c h e e s e s .

T h e c h e e s e s

c o n t a i n i n g L . m o n o c y t o g e n e s a nd l y s o z y m e

a l s o

e x h i b i t e d a n i n i t i a l

d e c l i n e

t h a t

c o n t i n u e d u n t i l t h e

3 1 - d a y

s a m p l i n g . T h e i n i t i a l

n u m b e r s

w e r e 3 . 3

x

1 0 4

C F U / g ,

w h i c h

d r o p p e d t o

4 . 2

x

1 0 3 ( r a n g e , 3 . 4

x

1 0 3

t o

5 . 0 x

1 0 3 )

a f t e r

3 1

d a y s o f a g i n g .

L .


t h e n

s t a r t e d

t o

g r o w a n d r e a c h e d 2 . 5

x

1 0 4 ( r a n g e ,

5 . 0

x 1 0 3 t o 4 . 5

x

1 0 4 )

a f t e r

5 5

d a y s ( r a n g e ,

4 . 5

x

1 0 4 t o 5 . 0

x

1 0 4 ) .

V i a b l e c o u n t s

e v e n t u a l l y

d e c l i n e d t o 2 . 5

x

1 0 4 ( r a n g e , 5 . 0

x

1 0 3

t o

4 . 5

x

1 0 4 )

a f t e r

a c l i m b i n

p o p u l a t i o n

t o 2 . 3

x

1 0 5 t o 3 . 5

x

1 0 5 / g .

T h e w h e e l s

c o n t a i n i n g E D T A s h o w e d a n

u n u s u a l

g r o w t h

p a t t e r n

i n

w h i c h

p o p u l a t i o n s

i n i t i a l l y r o s e a n d

t h e n

f e l l

p r e c i p i t o u s l y . T h e s e r e s u l t s

h a v e b e e n

s e e n w i t h

some

o t h e r

f o o d s . G r o w t h

d u r i n g

t h e i n i t i a l 4 1

d a y s o f

c h e e s e

c u r i n g

w i t h o u t

i n h i b i t o r y

a g e n t s o c c u r r e d s t e a d i l y , a n d - 4 . 9

x

1 0 5

CFU/g

was

o b t a i ne d . A ft e r

t h i s

t i m e ,

v i a b l e c o u n t s d e -

c r e a s e d t o _ 1 0 4

C F U / g .

U n u s u a l

p a t t e r n s

o f

g r o w t h

were

a l s o s e e n i n

t h e w h e e l s c o n t a i n i n g L . m o n o c y t o g e n e s w i t h

E D T A a n d l y s o z y m e . D u r i n g

t h e

i n i t i a l

2 7 d a y s o f c h e e s e

r i p e n i n g ,

c o u n t s

d r o p p e d f r o m

3 . 0

x

1 0 4

t o

6 . 4

x

1 0 3

( r a n g e ,

3 . 7

x

1 0 3

t o

9 . 2

x

1 0 3 ) . A f t e r t h i s p e r i o d ,

L .


g r e w

u n t i l

4 1 d a y s

a n d

t h e n

d r o p p e d a g a i n

t o

-6 x

1 0 3 .

E v e n t u a l l y ,

r e l a t i v e l y

h i g h

c o u n t s

w e r e o b t ai n e d

( 4 . 0

x

1 0 6 ) .

I t i s

e v i d e n t

t h a t n u m b e r s

o f L . m o n o c y t o g e n e s

v a r i e d

c o n s i d e r a b l y a f t e r

3 0

t o

4 0 d a y s o f

a g i n g

i n t h e

c h e e s e s

c o n t a i n i n g

l y s o z y m e w i t h o r

w i t h o u t

EDTA b u t n o t i n

t h e

c o n t r o l .

S o f t - r i p e n e d c h e e s e i s a

c o m p l e x

s u b s t r a t e , a n d

m o r e w o r k i s

n e c e s s a r y

t o e v a l u a t e

t h e

e f f e c t i v e n e s s

o f

l y s o z y m e .

DISCUSSION

An

i m p o r t a n t

c o n t r i b u t i n g

f a c t o r f o r

t h e c o n tr o l

o f L .

m o n o c y t o g e n e s i n f o o d s i s

t h e

a b s e n c e

o f

t e c h n o l o g i e s t o

t h o r o u g h l y

a n d

p e r m a n e n t l y e l i m i n a t e

t h e

p a t h o g e n

f r o m t h e

p r o c e s s i n g

p l a n t e n v i r o n m e n t

( 2 6 , 2 8 ) .

The

p a t h o g e n

t e n a -

c i o u s l y

c o n t a m i n a t e s

p r o c e s s i n g

p l a n t s d e s p i t e

e x t e n s i v e

e f f o r t s t o

e l i m i n a t e i t t h r o u g h

v i g o r o u s

s a n i t a t i o n .

P o s t p r o -

c e s s i n g

c o n t a m i n a t i o n i s a n

i m p o r t a n t

f a c t o r i n

t r a n s m i s s i o n

o f

t h e

p a t h o g e n

t o

f o o d s a n d

i s

c u r r e n t l y t h o u g h t

t o

b e

t h e

m a j o r r o u t e o f


( 1 4 , 1 6 ,

2 6 ,

2 8 ) .

S a f e

p r e s e r -

v a t i v e s

t h a t

c a n b e a d d e d

t o f o o d s

t o k i l l

t h e

o r g a n i s m

i f

p o s t p r o c e s s i n g


o c c u r s

a r e

u r g e n t l y

n e e d e d .

L I

0

0 2 0

3 0 40 50

d a y s

F I G . 6 . E f f e c t

o f

l y s o z y m e

a n d EDTA

o n

g r o w t h

o f

L .

m o n o c y -

t o g e n e s

i n f r e s h

s a u s a g e s ( b r a t w u r s t ) .

A P P L .

E N V I R O N . M I C R O B I O L .


7/8

LYSOZYME

A C T I V I T Y

A G A I N S T L .

M O N O C Y T O G E N E S I N

F O O D S 6 3 7

7

6

* b O

u

0

V-

5

4

-

m

] ysozyme

~ ~ + l y s o z y m e

+EDTA

0 20 4 0 60

d a y s

F I G . 7 . G r o w t h

o f

L .


i n C a m e m b e r t

c h e e s e

c o n t a i n i n g l y s o zy m e a n d E DTA .

The

r e s u l t s o f

t h i s

s t u d y

i n d i c a t e

t h a t

lysozyme

i s

a n

e f f e c t i v e


a g a i n s t

L .

monocytogenes

S c o t t

A

i n

c e r t a i n

f o o d s ,

e s p e c i a l l y f r e s h v e g e t a b l e s .

I n

many

o f

t h e

v e g e t a b l e s we

t e s t e d ,

lysozyme

e f f e c t i v e l y

k i l l e d h i g h

i n i t i a l

n u m b e r s o f L .

monocytogenes. I n

s e v e r a l v e g e t a b l e f o o d s ,

EDTA

e n h a n c e d t h e a c t i v i t y o f

lysozyme

a n d r e s u l t e d

i n

r a p i d a n d c o m p l e t e e x t e rm i n a t i o n o f

L .

monocytogenes.

I n

t h e

tw o f o o d s o f a n i m a l o r i g i n

t h a t

we t e s t e d

( f r e s h

sausage

a n d

Camembert c h e e s e ) , lysozyme

w i t h EDTA was

b a c t e r i o s t a t i c

b u t

d i d n o t r i d

t h e

f o o d s o f

v i a b l e L .

monocy-

t o g e n e s , as

o c c u r r e d

i n many v e g e t a b l e s .

E v i d e n t l y ,

t h e

g r o w t h

s u b s t r a t e s are

c r i t i c a l l y i m p o r t a n t

f o r b ac te ri al

g r o w t h

a n d t h e e f f ec t i v en es s

o f lysozyme.

P e r h a p s

t h e

presence o f r e l a t i v e l y

h i g h

c o n c e n t ra t i o ns o f c e r t a i n

n u t r i -

e n t s

s u c h

as

h e m e , f a t ,

or

o t h e r s

are

h e l p f u l

t o L .

monocy-

t o g e n e s

i n

a v o i d i n g

k i l l i n g

b y

lysozyme.

The i n t e r a c t i o n o f

l y s o z y m e

w i t h c h e l a t o r s n e e d s more

e x t e n s i v e

s t u d y .

The

m e c h a n i s m ( s ) b y

w h i c h

t h e y

i n t e r a c t

i s

n o t

p r e s e n t l y

u n d e r s t o o d .

T h e r e a re

a t l e a s t

tw o

p o s s i b i l i t i e s

f o r

t h e

e n h a n c i n g

e f f e c t o f a c h e l a t o r :

i

i t

may

s l o w

g r o w t h

b y b i n d i n g

a n

i m p o r t a n t

m e t a l

necessary

f o r

g r o w t h ( e . g . ,

i r o n

[ 2 3 ] ) ,

t h u s

a l l o w i n g lysozyme

t o

d i g e s t

t h e c e l l w a l l

f a s t e r t h a n

i t

ca n b e

s y n t h e s i z e d ,

or

i i

i t

may

d i s r u p t

t h e

c e l l

w a l l s t r u c t u r e a n d e n a b l e

b e t t e r

a t t a c k b y lysozyme.

P e r r a u -

d i n

a n d

P r i e e l s

( 1 5 )

h a v e

shown t h a t l a ct o f er ri n

b i n d s

more

r e a d i l y

t o

M.

l u t e u s

c e l l s

t o

w h i c h

lysozyme

h a s

p r e v i o u s l y

b o u n d .

EDTA

was

u s e d as a m o d e l c h e l a t o r

i n

our

s t u d i e s ,

a n d

i t i s

l i k e l y

t h a t

o t h e r

c h e l a t o r s , e s p e c i a l l y

t h o s e

t h a t

occur

n a t u r a l l y

w i t h

lysozyme

i n mammalian

s e c r e t i o n s ,

s u c h as

c o n a l b u m i n , t r a n s f e r r i n , c e r u l o p l a s m i n ,

or l a c t o f e r -

r i n ,

w o u l d work

more

e f f e c t i v e l y .

L a c t o f e r r i n occurs

n a t u -

r a l l y

i n b o v i n e m i l k a t

l o w e r


t h a n i t

occurs

i n

m i l k s

o f

some

o t h e r

mammals.

P r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t s

h a v e

shown

t h a t c o n a l b u m i n

e n h a n c e s

t h e

a c t i v i t y

o f

l y s o -

zyme a g a i n s t

L .

monocytogenes ( V .

L .

H u g h e y ,

P . A .

W i l g e r ,

a n d

E .

A .

J o h n s o n , e x p er i me n t s

i n

p r o g r e s s ) .

Con-

a l b u m i n

s p e c i f i c a l l y

b i n d s

i r o n ,

as

o p p o s e d

t o

E D T A ,

which

p r e f e r s d i v a l e n t

a l k a l i n e

e ar t h m e ta l s .

I r o n

i s q u i t e i m p o r t a n t

f o r

g r o w t h

a n d

v i r u l e n c e o f

L .


( 2 3 ) .

s e c o n d

p o t e n t i a l p r o c e s s i n g

m e t h o d f o r

i n c r e a s i n g

t h e

a c t i v i t y

o f

l y s o z y m e

i s t o

h e a t L .

m o n o c y t o g e n e s d u r i n g o r

b e f o r e

e x p o s u r e

t o

l y s o z y m e . P r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t s

h a v e

s h o w n t h a t t h i s

p r o c e d u r e d r a m a t i c a l l y

i n c r e a s e s t h e

s u s c e p -

t i b i l i t y

o f L .


t o

l y s i s

( A .

D i N a r d o ,

V .

L .

H u g h e y ,

a n d E .

A .

J o h n s o n , u n p u b l i s h e d

d a t a ) .

A l t h o u g h

l y s o z y m e

h a s b e e n

s u g g e s t e d

t o

h a v e

many

r o l e s

a s

a


( s e e

r e f e r e n c e

1 7

f o r

r e v i e w ) ,

i t i s

c u r r e n t l y

u s e d

m a i n l y

i n c e r t a i n

E u r o p e a n

c h e e s e s t o

p r e v e n t b l o w i n g

b y

s p o r e f o r m e r s ( 1 7 ) .

O u r

p r e v i o u s f i n d i n g s

t h a t

e g g

w h i t e

l y s o z y m e

i s

h i g h l y

e f f e c t i v e

a g a i n s t

L .


a n d

some o t h e r

p a t h o g e n s ( 9 ) ,

a n d

t h e r e s u l t s

p r e s e n t e d

h e r e ,

s h o w i n g

t h a t i t

i s a c t i v e i n s e v e r a l

f o o d s , s u g g e s t

t h a t f u r t h e r

a p p l i c a t i o n s

c a n

b e

f o u n d .

B e c a u s e

l y s o z y m e s

o c c u r n a t u -

r a l l y

i n

h u m a n s ,

a n d s i n c e

e g g

w h i t e

l y s o z y m e

i s

d e s t r o y e d

i n t h e human

s t o m a c h

a n d

d u r i n g

c o o k i n g

o f

f o o d s ,

i t

i s

l i k e l y

t h a t

l y s o z y m e

c o u l d s e r v e a s

a s a f e a n d

w i d e l y

u s e d

f o o d


t o

p r o t e c t

a g a i n s t

L .


c o n -

t a m i n a t i o n .

ACKNOWLEDGMENTS

We

t h a n k Mark

J o h n s o n ,

J e a n

S c h o e n i ,

a n d

J e n n i f e r

J o h n s o n

f o r

v a l u a b l e a s s i s t a n c e

d u r i n g

t h i s

s t u d y .

We

a l s o

t h a n k S o c i e t a

P r o -

d o t t i

A n t i b i o t i c i

a n d

M i l e s ,

I n c . ,

f o r

f i n a n c i a l

s u p p o r t

a n d

h e l p f u l

c o m m u n i c a t i o n s .

L I T E R A T U R E

C I T E D

1 .

B e c k e r s ,

H .

J . ,

P .

S .

S .

S o e n t o r o ,

a n d

E .

H . M.

D e l f g o u - v a n

A s c h . 1 9 8 7 . T h e o c c u r r e n c e o f

L i s t e r i a


i n

s o f t

c h e e s e s a n d

raw

m i l k

a n d i t s

r e s i s t a n c e

t o h e a t .

I n t .

J .

F o o d

M i c r o b i o l .

4 : 2 4 9 - 2 5 6 .

2 .

B i l l e , J . ,

a n d M . - P . G l a u s e r .

1 9 8 8 . L i s t e r i o s e

e n

S u i s s e . B u l l .

B u n d e s a m t e s G e s u n d h e i t s we s en . 3 : 2 8 - 2 9 .

3 .

D i J k s t r a ,

R . G .

1 9 8 2 . T h e o c c u r r e n c e o f

L i s t e r i a


i n

s u r f a c e

w a t e r o f c a n a l s

a n d

l a k e s ,

i n d i t c h e s

o f one

b i g p o l d e r

a n d

i n

t h e e f f l u e n t s

a n d

c a n a l s o f

a

s e w a g e

t r e a t m e n t

p l a n t .

Z e n t r a l b l . B a k t e r i o l . P a r a s i t e n k d . I n f e k t i o n s k r .

H y g .

A b t .

1

O r i g .

R e i h e B

1 7 6 : 2 0 2 - 2 0 5 .

4 .

F l e m i n g ,

D .

W . ,

S .

L .

C o c h i ,

L .

L .

M a c D o n a l d ,

J .

B r o n d u m ,

P .

S .

H a y e s ,

B .

D .

P l i k a y t i s ,

M. B .

H o l m e s ,

A .

A u d u r i e r ,

C .

V .

B r o o m e ,

a n d A .

L .

R e i n g o l d .

1 9 8 5 .

P a s t e u r i z e d m i l k a s

a v e h i c l e

o f

i n f e c t i o n

i n

an

o u t b r e a k

o f l i s t e r i o s i s .

N .

E n g l .

J .

M e d .

3 1 2 : 4 0 4 - 4 0 7 .

5 . F o o d a n d

D r u g

A d m i n i s t r a t i o n .

1 9 8 6 .

F DA s

d a i r y

p r o d u c t

s a f e t y

i n i t i a t i v e s .

P r e l i m i n a r y

s t a t u s

r e p o r t .

F o o d

a n d

D r u g

A d m i n i s t r a t i o n ,

W a s h i n g t o n ,

D . C .

6 .

G i t t e r ,

M. 1 9 7 6 . L i s t e r i a


i n oven

r e a d y

p o u l t r y .

V e t .

R e c .

9 9 : 3 3 6 .

7 .

G r a y ,

M .

L . ,

a n d

A .

H .

K i l l i n g e r .

1 9 6 6 .

L i s t e r i a


a n d

l i s t e r i c

i n f e c t i o n s .

B a c t e r i o l .

R e v . 3 0 : 3 0 9 - 3 8 2 .

8 .

H o ,

J . L . ,

K .

N .

S h a n d s ,

G .

F r i e d l a n d ,

P .

E c k i n d ,

a n d D . W.

F r a s e r . 1 9 8 6 . An o u t b r ea k o f

t y p e

4 b L i s t e r i a


i n f e c t i o n

i n v o l v i n g

p a t i e n t s

f r o m

e i g h t

B o s t o n

h o s p i t a l s .

A r c h .

I n t e r n .

M e d .

1 4 6 : 5 2 0 - 5 2 4 .

9 .

H u g h e y ,

V .

L . ,

a n d

E . A .

J o h n s o n .

1 9 8 7 .

A n t i m i c r o b i a l

a c t i v i t y

o f

l y s o z y m e

a g a i n s t

b a c t e r i a

i n v o l v e d

i n

f o o d

s p o i l a g e

a n d

f o o d - b o r n e

d i s e a s e .

A p p l .

E n v i r o n .

M i c r o b i o l . 5 3 : 2 1 6 5 - 2 1 7 0 .

1 0 .

J a m e s ,

S .

M . ,

S . L .

F a n n i n ,

B .

A .

A g e e

B .

H a l l ,

E .

P a r k e r ,

J .

V o g t ,

G .

R u n , J .

W i l l i a m s ,

L .

L i e b ,

C .

S a l m i n e n ,

T .

P e n d e r g a s t ,

S .

B .

W e r n e r ,

a n d

J .

C h i n .

1 9 8 5 . L i s t e r i o s i s o u t b r e a k

a s s o c i a t e d

w i t h

M e x i c a n - s t y l e

c h e e s e - C a l i f o r n i a .

M o r b i d .

M o r t a l .

W e e k l y R e p .

3 4 : 3 5 7 - 3 5 9 .

1 1 .

L e e ,

W.

H . ,

a n d

D . M c C l a i n .

1 9 8 6 .

I m p r o v e d

L i s t e r i a

m o n o c y -

t o g e n e s

s e l e c t i v e

a g a r . A p p l .

E n v i r o n .

M i c r o b i o l . 5 2 : 1 2 1 5 - 1 2 1 7 .

1 2 .

M c C l a i n ,

D . ,

a n d

W. H . L e e .

1 9 8 8 .

D e v e l o p m e n t

o f USDA-FSIS

m e t h o d f o r i s o l a t i o n o f

L i s t e r i a


f r o m

r a w

meat

a n d

p o u l t r y .

J . A s s o c .

O f f .

A n a l . C h e m . 7 1 : 6 6 0 - 6 6 4 .

1 3 .

M c L a u c h l i n ,

J .

1 9 8 7 .

L i s t e r i a

m o n o c y t o g e n e s ,

r e c e n t

a d v a n c e s

V O L .

5 5 ,

1 9 8 9


8/8

A P P L .

E N V I R O N .

M I C R O B I O L .

i n

t h e

taxonomy

a n d

e p i d e m i o l o g y o f


i n h u m a n s .

J .

A p p l . B a c t e r i o l .

6 3 : 1 - 1 1 .

1 4 .

M o s s e l ,

D . A . A . 1 9 8 7 .

M i c r o b i a l

r e c o n t a m i n a t i o n

o f m i l k a n d

d a i r y p r o d u c t s .

M e c h a n i s m s ,

h e a l t h

i m p a c t ,

management

a n d

m o ni t o ri n g. M i cr o bi o l .

A l i m e n t .

N u t r . 5 : 26 7 -2 82 .

1 5 .

P e r r a u d i n ,

J . - P . , a n d

J . - P . P r i e e l s . 1 9 8 2 . L ac t o f er ri n b i n d i n g t o

l y s o z y m e t r e a t e d

M i c r o c o c c u s

l u t e u s . B i o c h i m . B i o p h y s .

A c t a

7 1 8 : 4 2 - 4 8 .

1 6 .

P r e n t i c e , G .

A . , a n d P . N e av e s . 1 98 8. L i s t e r i a monocytogenes

i n

f o o d :

i t s

s i g n i f i c a n c e

a n d m e t h o d s

f o r

i t s

d e t e c t i o n .

B u l l .

I n t .

D ai r y F e d . 2 2 3 : 1 - 1 6 .

1 7 . P r o c t o r ,

V . A . ,

a n d F . E . C u n n i n g h a m .

1 9 8 8 .

Th e

c h e m i s t r y

o f

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Antibacterial Activity of Hen Egg White Lysozyme Against